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Immunology and Infection

Ein Protokoll zum Infect Published: June 26, 2014 doi: 10.3791/51703
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University

Summary

C. elegans hat als neues genetisches Modell zur Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen entstanden. Hier sind wir zu C infizieren beschreiben ein Protokoll elegans mit Salmonella typhimurium in Verbindung mit dem Doppelstrang-RNAi-Interferenz-Technik, um die Rolle der Wirtsgene in der Verteidigung gegen Salmonellen-Infektion zu untersuchen.

Abstract

In den letzten zehn Jahren, C. elegans wurde als wirbellosen Organismus, um Wechselwirkungen zwischen Hosts und Krankheitserregern zu untersuchen entstanden, einschließlich der Wirtsabwehr gegen gram-negative Bakterium Salmonella typhimurium. Salmon stellt eine persistierende Infektion im Darm von C. elegans und führt zu frühen Tod der infizierten Tiere. Eine Anzahl von Immunitätsmechanismen in C identifiziert elegans gegen Salmonellen-Infektionen zu verteidigen. Autophagie ist ein evolutionär konservierten lysosomalen Abbauweg, wurde gezeigt, dass die Salmonellen-Replikation in C zu begrenzen elegans und in Säugern. Hier ist ein Protokoll beschrieben, um C zu infizieren elegans mit Salmonella typhimurium, wobei die Würmer zu Salmon für eine begrenzte Zeit, ähnlich wie Salmonella-Infektion beim Menschen ausgesetzt. Salmonella-Infektion signifikant die Lebensdauer verkürzt C. elegans </ Em>. Mit den wesentlichen Autophagie-Gen bec-1 als Beispiel kombinieren wir diese Infektion mit C. Verfahren elegans RNAi Fütterung Ansatz und zeigte dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Funktion von C zu untersuchen elegans Wirtsgene in der Verteidigung gegen Salmonellen-Infektion. Da C. elegans gesamte Genom RNAi-Bibliotheken zur Verfügung stehen, macht es möglich, dieses Protokoll umfassend Bildschirm für C. elegans Gene, die gegen Salmonellen und andere Krankheitserreger zu schützen, die Darmgenomweiten RNAi-Bibliotheken.

Introduction

Die frei lebenden Nematoden Caenorhabditis elegans Boden ist eine einfache und genetisch manipulierbaren Modellorganismus verwendet, um viele biologische Fragestellungen zu untersuchen. C elegans besteht überwiegend als selbstDünge Hermaphroditen. Männer sind spontan von Nicht-Trennung von dem X-Chromosom während gametogenesis 1,2 erzeugt. In Anwesenheit von reichlich Nahrung, C. elegans kontinuierlich über vier Larvenstadien zum Erwachsenen zu entwickeln. Temperatur beeinflusst auch C. elegans Entwicklung; schnellere Entwicklung bei höheren Temperaturen beobachtet. Im Labor C. elegans ist bei einer Standardtemperatur von 20 ° C auf Agar-Platten mit ausgesät Bakterium Escherichia coli (Stamm OP50) als Lebensmittel 1,2 kultiviert.

In den letzten zehn Jahren, C. elegans wurde als wirbellosen Organismus, Wirt-Pathogen-Interaktionen zu studieren 3-5 entstanden. In der Natur, C. elegans frisst Bakterien als nutrient 1,2 Quelle. Seine normale bakterielle Labor Essen, OP50, kann leicht mit anderen Krankheitserregern ersetzt werden, um die Wechselwirkungen zwischen C untersuchen elegans und jede gewählte Erregers. Unter diesen Bedingungen ist der Darm der primäre Ort der Infektion. In der Tat, eine breite Palette von bakteriellen Krankheitserregern hat sich gezeigt, tödlich infizieren C. elegans 3-5.

Das gram-negative Bakterium Salmonella ist ein Magen-Darm-Erreger, der menschlichen Lebensmittelvergiftungen verursacht weltweit 6,7. C elegans ist ein gutes Modell für die Host-Salmonella typhimurium, wie dieses Bakterium repliziert und zeigt anhaltende Darminfektionen 10.08. C elegans wurde verwendet, um sowohl neue als identifizieren und bisher bekannten Salmon Virulenzfaktoren 11. Interessanterweise ist die C elegans Immunsystem erfolgreich begrenzt Salmonellen-Replikation. Es wurde bereits berichtet, dass INHIBition der Autophagie-Gene macht erhöhte Salmonella-Replikation in C. elegans, was zu frühen Tod der infizierten Würmer 10. Makroautophagie (hierin als Autophagie bezeichnet) ist ein dynamischer Prozess, der die Neuanordnung der subzellulären Membranen Zytoplasma und Organellen für die Lieferung an den Lysosomen zum Abbau 12 zu maskieren. Autophagie wurde berichtet, dass die Salmonellen-Replikation in C zu begrenzen elegans und bei Säugetieren 10,13.

Die C. elegans Genoms war der erste mehrzellige eukaryotische Genom sequenziert; es reagiert auf RNAi-Behandlung 14-16. Außerdem kann RNAi effektiv, indem Würmer, Bakterien, die den doppelsträngigen RNA des Zielgens, wie RNAi Fütterung 16,17 bekannt einnehmen verwaltet werden. Gesamte Genom RNAi Fütterung Bibliotheken für genomweite RNAi Screening 16,18 generiert. Hierbei wird eine Salmonellen-Infektion proProtokoll ist mit RNAi-Zuführung zum Testen C erlauben gekoppelt elegans Gene von Interesse für ihre Fähigkeit, gegen Salmonellen-Infektion zu schützen.

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Protocol

1. XLD (Xylose-Lysin Desoxycholate) Agar-Platten

XLD-Agar ist ein Selektivwachstumsmedium für Salmonellen, die als schwarze Kolonien auf XLD-Agar-Platten erscheint. Falls jedoch keine Bedenken der Verunreinigung kann eine regelmäßige LB-Platte ersetzt werden.

  1. Abwiegen 5,5 g XLD-Agar und Resuspension in 5 ml VE-Wasser.
  2. Gut mischen, bis alle Agar nass ist. In 95 ml VE-Wasser, bis alle Klumpen verschwunden sind und das Medium wird vollständig suspendiert.
  3. Kochen Sie die mittel-bis vollständig auflösen (nicht autoklavieren).
  4. Kühlen des Mediums bei Raumtemperatur bis 50 ° C.
  5. Gießen in 25 ml Agar je 95 x 15 mm (Durchmesser x Höhe) Platte (Platten mit Parafilm verschlossen bei 4 ° C für bis zu 1 Monat gelagert werden.)

2. Nematode Growth Medium (NGM) RNAi Fütterungsplatten

Vorbereitung von C. elegans NGM-Platten wurde bereits beschrieben 19. Hier wird ein Verfahren kurz beschrieben, um das Antibiotikum Ampicillin und die RNAi chemischen Induktors Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) in die NGM-Medien zu den RNAi Vorschubplatten zu machen.

  1. Lösen Sie 3 g NaCl und 2,5 g Bacto Pepton in 1 L VE-Wasser.
  2. In 17 g Bacto-Agar in die Medien.
  3. Autoklavieren das Medium für 45 Minuten und kühlen die Medien auf 50 ° C in einem Wasserbad.
  4. Fügen Sie die folgenden Lösungen: 1 ml Cholesterin (5 mg / ml in 95% Ethanol), 1 ml 1 M CaCl 2, 1 ml 1 M MgSO 4 und 25 ml 1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 6,0). Gut mischen.
  5. 1 ml 1 M IPTG und 500 ul Ampicillin (100 mg / ml in sterilem Wasser).
  6. Mischen Sie die Lösung gut vermischen und in 60 x 15 mm (Durchmesser x Höhe) Petrischalen mit einer Pipette Hilfe und 25 ml serologische Pipette folgende sterile Verfahren. Füllen Sie jede Platte mit 12 ml Agar. Platten können bei 4 ° C für bis zu 1 Monat gelagert werden.

Der wesentliche Autophagie-Gen bec-1 wird als Beispiel verwendet, um die Funktion eines Gens Gastgeber in der Verteidigung gegen Salmonellen-Infektion zu untersuchen. Die Versuchsverfahren sind in Abbildung 1 und Tabelle 1 dargestellt. Das Protokoll für die Herstellung von RNAi-behandelten Tieren Infektion folgt, mit dem Tag der einzelnen Versuchsschritt in Klammern angegeben.

  1. Impfen bec-1 RNAi Fütterung und Kontrolle leeren Vektor L4440 RNAi Fütterung Bakterien, indem eine Flocke von -80 ° C eingefroren Bakterien in 2 ml LB-Medium mit 100 mg / ml Ampicillin (Tag 1) ergänzt. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal pro Woche während des gesamten Experiments an die frische RNAi Bakterien haben. Bewahren Sie die Kultur in der 4 ° C Kühlschrank, wenn nicht verwendet.
  2. Seed 100 ml Bakterienkultur über Nacht auf RNAi RNAi-Platten. Bereiten Sie drei bec-1-RNAi und drei Steuer leer vECTOR RNAi-Platten. Die Inkubation bei 37 ° C über Nacht (Tag 2).
  3. Entfernen Sie die RNAi-Platten aus dem 37 ° C-Inkubator und es ihnen ermöglichen, auf Raumtemperatur auf der Bank abkühlen. Pick-up wohlgenährten L4 Wildtyp N2 Hermaphroditen und übertragen Sie sie auf bec-1-RNAi und steuern leeren Vektor RNAi-Platten. Platzieren Sie drei Würmer pro Platte, dreifach auf Platten. Am gleichen Tag, bereiten RNAi-Platten, wie in Schritt 3.2 (Tag 3) beschrieben.
  4. Die RNAi-Platten inkubieren mit Würmern in der 20 ° C-Inkubator für 36-40 Stunden und Transfer Würmer an die frische entsprechenden RNAi-Platten in Schritt 3.3 vorbereitet. Nach Würmer übertragen werden, brüten die Platten in der 20 ° C-Inkubator für 64 h (Tag 4).

4. Bereiten Salmonellen für Infektions

  1. Streak Salmonellen -80 ° C eingefroren Lager auf 1 XLD-Agar-Platte und Inkubation der Platte bei 37 ° C über Nacht (Tag 5
  2. Wählen Sie eine gut isolierte Kolonie und schwarz Salmonellen impfen es in 2 ml LB-Medium bei 37 ° C mit Schütteln über Nacht (Tag 6).
  3. Seed 80 ml ​​Salmonella-Nacht-Kultur auf 1 C. elegans 60 x 15 mm (Durchmesser x Höhe) NGM-Agar-Platte und bereiten 6 Platten insgesamt. Die Inkubation bei Raumtemperatur für 6 Stunden. Die Bakterienkultur sollte trocknen und eine Rasenfläche auf der Platte (Tag 7).

5. Infect RNAi-behandelten Worms mit Salmonellen

  1. Übertragen bec-1 RNAi-behandelten und unbe leeren Vektor RNAi-behandelten L4 N2 Hermaphroditen (Nachkommen von Würmern in Schritt 3), um Salmonellen-Platten. Die 40 Würmer pro Platte auf 3 Platten für jede Gruppe. Die Schnecken Platten bei 20 ° C für 48 Stunden (Tag 7).
  2. Bereiten Sie eine Reihe von frischen RNAi-Platten wie in den Schritten 3.1 und 3.2 (Tag 7 beschrieben und
  3. Nach 48 Stunden Infektion übertragen Salmonellen-infizierten Würmer zu den entsprechenden RNAi-Platten in Schritt 5.2 vorbereitet und Inkubation bei 20 ° C (Tag 9).

6. Survival-Assay

  1. Stand das Überleben der Würmer täglich und übertragen Würmer an die frische entsprechenden RNAi-Platten während der Eiablage-Zeit. Einen Satz von frischen RNAi-Platten vor jeder Wurm Transfer wie in den Schritten 3.1 und 3.2 beschrieben. Tippen Sie auf das Schneckenkörper (Kopf, Mittelteil und Schwanz) vorsichtig mit einem Ende abgeflachten Platindraht. Eine Schnecke wird als tot gezählt, wenn keine Bewegung des Schneckenkörpers beobachtet.
  2. Stand das Überleben der Würmer täglich oder jeden zweiten Tag, und übertragen Würmer an die frische entsprechenden RNAi-Platten zweimal pro Woche nach Würmern zu stoppen, Eier zu legen.
  3. Nachdem alle Würmer sterben, bündeln die Überlebensdaten aus Dreifachplatten als ein Datensatz. Geben Sie die Überlebensdaten der jeweiligen Gruppe in geeigneter statistischer Software wie GraphPad Pmus, um Überlebenskurven zu generieren und Kaplan-Meier-Überlebensanalyse durchzuführen. Der gesamte Versuch wird mindestens einmal, um den Abschluss zu bestätigen wiederholt.

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Representative Results

Bei 20 ° C ist die mittlere Lebensdauer von Wildtyp N2 Würmer 17 Tage (Abbildung 2A und Tabelle 2). Salmonellen-Infektion deutlich auf 10,5 Tage verringert die mittlere Lebensdauer der Würmer N2 (p = 0,0002, Log-Rank-Test) (2A ).

Wenn ein C elegans Gen spielt eine wichtige Rolle in der Verteidigung gegen Salmonellen-Infektion, wird vorhergesagt, dass seine Hemmung wird die Anfälligkeit für Salmonellen-Infektion zu vermitteln. In der Tat, im Vergleich zu Salmonellen-infizierten Kontroll RNAi-behandelten Tiere N2, die mittlere Lebensdauer von Salmonella-infizierten bec-1-RNAi-behandelten N2 Würmer aus 10,5 Tage bis 9 Tage (p <0,0001, Log-Rank-Test) (Abbildung verringert 2B und Tabelle 2). Die maximale Lebensdauer drastisch um 14 Tage verkürzt (ab 24 Tage bis 10 Tage, 2B und Tabelle 2). Darüber hinaus ist die seinc-1 RNAi hat keinen offensichtlichen Effekt auf die Lebensdauer von N2-Würmer, die nicht durch Salmonella (p = 0,2593, Log-Rank-Test) (2C und Tabelle 2) infiziert sind, was anzeigt, dass Salmonellen-Infektion, nicht bec-1-RNAi-Behandlung, verringert die Lebensdauer von Salmonella-infizierten bec-1-RNAi-behandelten Würmer. Auch bec-1 ist ein essentielles Gen in C. elegans Verteidigung gegen Salmonellen-Infektion.

Figur 1
Fig. 1 ist. Flußdiagramm der experimentellen Verfahren.

Figur 2
Abbildung 2. Hemmung der bec-1-Gens durch RNAi verleiht susfälligkeit zu Salmonellen-Infektion in C. elegans. AC) Überlebenskurven von Wildtyp N2 Tiere entweder mit Steuer leeren Vektor RNAi oder bec-1-Gen RNAi nach einer 2-tägigen Exposition gegenüber Salmonella typhimurium oder nicht-pathogene Escherichia coli bei 20 ° C behandelt Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen diese Zahl.

Tabelle 1
Tabelle 1. Salmonellen-Infektion Protokoll Zeitrahmen.

Tabelle 2
Tabelle 2. Statistische Analyse vonLebensdauer-Daten in Abbildung 2.

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Discussion

C. elegans ist eine einfache genetische Modellorganismus, die Bakterien als Nährstoffquelle isst. Somit ist es einfach, seine normale Bakteriennahrung mit einer Darmerreger ersetzt, um die Wechselwirkungen zwischen C untersuchen elegans und das Pathogen ausgewählt. Hier ein Protokoll beschrieben, um Salmonellen-Infektion und C verbinden elegans RNAi Fütterung Behandlung, um die Rolle der Wirtsgene in der Verteidigung gegen Salmonellen-Infektion zu untersuchen. Zurück Infektion aussetzen Protokolle C. elegans-Würmer auf pathogene Bakterien wie Salmonellen während ihrer Lebenszeit 20. In dem vorliegenden Protokoll, Salmonella infiziert die Würmer in einem Zwei-Tage-Frist. Danach werden die Schnecken nicht mehr auf Salmonellen ausgesetzt. Diese Salmonella-Infektion die Lebensdauer der C deutlich verringert elegans-Wildtyp-Tiere. So drangen Salmonellen replizieren innerhalb Würmer und töten die Tiere 10 Salmonellen ahmt menschliche Salmonellen-Infektion, die helfen sollen, nützliche Informationen aufzudecken, die menschliche Lebensmittelvergiftungen durch Salmonellen-Infektion verursacht zu verstehen. Darüber hinaus verbindet das Protokoll der RNAi-Zuführung Behandlung mit Salmonellen-Infektion, die es ermöglicht, alle Kandidatengene, die in der Wirtsabwehr gegen Salmonellen-Infektion beteiligt sein könnte zu prüfen, vor allem, wenn die genetischen Mutanten sind nicht verfügbar. Die Autophagie-Gen bec-1 bekannt, in der Verteidigung gegen Salmonellen-Infektion beteiligt sein wird als Beispiel in der vorliegenden Studie verwendet. Bec-1-Mutationen tödlich sind 21, die Prüfung seiner Rolle in der Verteidigung gegen Salmonella-Infektionen bei Erwachsenen verhindert. Verwendung des aktuellen Protokoll wurde gezeigt, dass die Hemmung der bec-1 durch RNAi ergibt Anfälligkeit für Salmonella-Infektion in C. elegans. In der vorliegenden Studie, N2 Wildtyp-Würmer fed L4440 mit Bakterien haben eine ähnliche Lebensdauer wie die Tiere mit OP50 zugeführt. Die Tiere beginnen zu sterben, um Tag 6 und die maximale Lebensdauer beträgt etwa vier Wochen. N2 Würmer durch Salmonellen infiziert leben ein paar Tage kürzer. Dagegen bec-1-RNAi-behandelten Würmer mit Salmonellen sterben etwa zwei mal schneller als die Kontrolltiere, obwohl das Anfangsdatum für die Tiere in beiden Gruppen zu sterben, ist nur ein paar Tage auseinander (Abbildung 2). Das gesamte Experiment dauert ca. 1 Monat.

In diesem Protokoll wird die Koordination der RNAi-Zuführung und Salmonella Vorbereitung erforderlich, so dass RNAi-behandelten L4-Stadium Hermaphroditen sind Salmonellen-Infektion unterzogen. Ein typischer Zeitrahmen des in der Autoren Labor verwendete Protokoll ist in Tabelle 1 beschrieben. RNAi Fütterung Bakterien werden wöchentlich hergestellt, und die bakterielle Kultur wird bei 4 ° C gelagert, wenn sie nicht verwendet wird. Zu beachten ist, am Tag 7, die Infektion wird 6 starten0; h nach Salmonellen-Nacht-Kulturen werden auf NGM-Platten gelegt. Während dieser 6 Stunden Zeit werden RNAi-behandelten L4 N2 Zwitter aus entsprechenden bec-1 abgeholt und steuern leeren Vektor RNAi-Platten. Die nicht-infizierten Würmer werden als Kontrollen, um festzustellen, ob Salmonellen-Infektion verkürzt die Lebensdauer der infizierten Würmer und wenn bec-1-RNAi-Behandlung keinen Einfluss auf die Lebensdauer hat Wurm.

Derzeit Überleben von C. elegans nach der Infektion wird häufig verwendet, um den Erreger Virulenz 3-5 messen. Allerdings RNAi Hemmung bestimmter C. elegans Gene führen zu einer verringerten Lebensdauer. Daher sollte man vorsichtig sein bei der Interpretation der Daten. Wenn diese Situation auftritt, unterschiedliche Konzentrationen des RNAi-Induktor IPTG, getestet werden können, um die gewünschte Konzentration, beeinflußt nur die Wirtsreaktion auf die Pathogen-Infektionen ohne Auswirkungen auf die Lebensdauer des Tieres zu identifizieren. Wie bereits berichtet <sup> 10, die 1 nM IPTG-Konzentration wurde erfolgreich eingesetzt, um die Rolle der Autophagie in IGF-vermittelte Signalisierung Pathogenresistenz in C. prüfen elegans.

Da die C elegans-Genom wurde sequenziert und C. elegans RNAi Fütterung Bibliotheken generiert wurden 16,18, es ist möglich, die beschriebenen Protokoll überarbeiten, um eine genomweite RNAi-Screening durchzuführen, um alle in der Verteidigung gegen Salmonella-Infektion beteiligt Wirtsgene zu identifizieren. Beispielsweise kann anstelle der Verwendung der mittleren Überlebens die Virulenz von Salmonella zu messen, wird die maximale Überlebens verwendet. Darüber hinaus können durch Ergänzung Würmern infiziert Platten mit Fluordeoxyuridin, einer DNA-Synthese-Hemmer sterilisiert werden. Damit die Übertragung von Würmern infiziert ist unnötig, solange Nahrung zugeführt wird, um Würmer vor dem Verhungern zu verhindern. Diese Änderungen werden die Arbeitsbelastung für ein Hochdurchsatz-Screening enorm reduzieren. Diese Art von groß angelegten Studie kann shed Licht auf das Verständnis der menschlichen Reaktion auf die Salmonellen-Infektion, wie viele biologische Signalwege in C. elegans sind evolutionär im Menschen konserviert.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgments

Wir danken Dr. Diane Baronas-Lowell für das kritische Lesen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von einem FAU Charles E. Schmidt College of Science Seed Grant und einer alternden Stipendium der Ellison Medical Foundation unterstützt KJ

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth Fisher BP9723-500
XLD agar EMD Chemicals 1.05287.0500
Bacto Agar Fisher DF0140-01-0
Peptone Fisher BP1420-500
Sodium Chloride Fisher S671-500
Calcium Chloride Fisher C69-500
Magnesium Sulfate Fisher M65-500
IPTG Gold Biotechnology 12481C50
Cholesterol Sigma C8667-25G
Ampicillin Fisher BP1760-25
Salmonella typhimurium ATCC ATCC14028
Petri Dish 95 x 15 mm Fisher FB0875714G
Petri Dish 60 x 15 mm  Fisher 08-757-13A
Falcon Serological pipet Fisher 13-668-2
Falcon Express Pipet-Aid Fisher 13-675-42
MaxQ6000 shaking incubator  Thermo Scientific SHKE6000-7
Incubator Percival I-36DL

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References

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