Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En protokoll for å infisere Published: June 26, 2014 doi: 10.3791/51703
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University

Summary

C. elegans har dukket opp som en ny genetisk modell for å studere vert-patogen interaksjoner. Her beskriver vi en protokoll for å infisere C. elegans med Salmonella typhimurium kombinert med dobbel tråd RNAi forstyrrelser teknikk for å undersøke hvilken rolle verts gener i forsvar mot Salmonella-infeksjon.

Abstract

I det siste tiåret, C. elegans har dukket opp som en invertebrate organisme for å studere interaksjoner mellom vertene og patogener, inkludert vertsforsvar mot gram-negative bakterien Salmonella typhimurium. Salmonella etablerer vedvarende infeksjon i tarmen hos C. elegans og resulterer i tidlig død av infiserte dyr. Et antall mekanismer for immunitet har blitt identifisert i C. elegans å forsvare seg mot Salmonella infeksjoner. Autophagy, en evolusjonært konservert lysosomal degradering veien, har vist seg å begrense Salmonella replikasjon i C. elegans og i pattedyr. Her er en protokoll som er beskrevet for å infisere C. elegans med Salmonella typhimurium, hvori ormer er utsatt for Salmonella i en begrenset tid, i likhet med Salmonella-infeksjon hos mennesker. Salmonella-infeksjon i betydelig grad forkorter levetiden for C. elegans </ Em>. Ved hjelp av den essensielle autophagy genet BEC-en som et eksempel, kombinert vi denne infeksjonen metoden med C. elegans RNAi fôring tilnærming og viste denne protokollen kan brukes til å undersøke funksjonen av C. elegans verts gener i forsvar mot Salmonella-infeksjon. Siden C. elegans hele genomet RNAi biblioteker er tilgjengelige, gjør det mulig denne protokollen til omfattende screene for C. elegans gener som beskytter mot Salmonella og andre mage-tarm patogener hjelp genome-wide RNAi biblioteker.

Introduction

Den frittlevende jord nematode Caenorhabditis elegans er en enkel og genetisk medgjørlig modell organisme brukes til å studere mange biologiske spørsmål. C. elegans dominant eksisterer som selvstendig gjødsling hermafroditter. Hannene blir spontant generert av ikke-disjunksjon av X-kromosomet under gametogenesis 1,2. I nærvær av tallrike mat, C. elegans kontinuerlig utvikle seg gjennom fire larvestadier til voksen. Temperaturen påvirker også C. elegans utvikling; raskere utvikling observeres ved høyere temperaturer. I laboratoriet C. elegans dyrkes ved en vanlig temperatur på 20 ° C på agarplater med seeded bakterien Escherichia coli (stamme OP50) som mat 1,2.

I det siste tiåret, C. elegans har dukket opp som en virvelløse organisme å studere vert-patogen interaksjoner 3-5. I naturen C. elegans spiser bakterier som sin nutrient kilde 1,2. Sin normale bakterie laboratorium mat, OP50, kan lett erstattes med andre patogener for å undersøke samspillet mellom C. elegans og en valgt patogen. Under disse forholdene, er tarmen det primære stedet for infeksjonen. Faktisk har et bredt spekter av bakterielle patogener er vist å lethally infisere C. elegans 3-5.

Den gram-negative bakterien Salmonella er en gastrointestinal patogen som forårsaker menneskelig matbåren sykdom på verdensbasis 6,7. C. elegans er en god modell vert for Salmonella typhimurium som denne bakterien gjentak og viser vedvarende tarminfeksjoner 8-10. C. elegans har blitt brukt til å identifisere både nye og tidligere kjente Salmonella virulensfaktorer 11.. Interessant, C. elegans immunsystem vellykket begrenser Salmonella replikering. Det har tidligere blitt rapportert at inhiberingition av autophagy gener gjengir økt Salmonella replikering i C. elegans, som resulterer i tidlig død av infiserte ormer 10. Macroautophagy (heretter kalt autofagi) er en dynamisk prosess som involverer omorganisering av subcellulære membraner til å beslaglegge cytoplasma og organeller for levering til lysosome for degradering 12. Autophagy har blitt rapportert til å begrense Salmonella replikasjon i C. elegans og i pattedyr 10,13.

The C. elegans genom var den første flercellede eukaryote genom sekvensert; det er lydhør overfor RNAi behandling 14-16. Videre kan RNAi administreres effektivt ved å utsette ormer å innta bakterier inneholdende dobbelt-trådet RNA i target-genet, kjent som RNAi foring 16,17. Hele genomet RNAi fôring bibliotekene har blitt generert for genome-wide RNAi screening 16,18. Heri, en salmonellainfeksjon proprotokollen er kombinert med RNAi fôring å tillate testing C. elegans gener av interesse for deres evne til å beskytte mot Salmonella-infeksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. XLD (Xylose Lysine Desoxycholate) Agar Plates

XLD-agar er et selektivt vekstmedium for Salmonella, som vises som sorte kolonier på XLD agarplater. Men hvis det ikke er noen bekymringer av forurensning, en vanlig LB plate kan erstattes.

  1. Vei opp 5,5 g XLD agar og resuspender i 5 ml avionisert vann.
  2. Bland grundig til all agar er våt. Legg 95 ml avionisert vann til alle klumper er borte og mediet er helt resuspendert.
  3. Kok medium å oppløse helt (ikke autoklav).
  4. Avkjøl medium ved romtemperatur til 50 ° C.
  5. Hell 25 ml agar i hvert 95 x 15 mm (diameter x høyde) platen (platene forseglet med Parafilm kan lagres ved 4 ° C i opp til en måned).

2. Nematode Vekst Medium (NGM) RNAi Fôring Plates

Utarbeidelse av C. elegans NGM plater har blitt beskrevet tidligere en9.. Her en fremgangsmåte blir beskrevet for å legge til antibiotikumet ampicillin og RNAi kjemisk inducer isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) inn i NGM media for å gjøre RNAi foringsplatene.

  1. Løs opp 3 g NaCl og 2,5 g Bacto peptone i en L deionisert vann.
  2. Legg 17 g Bacto agar i media.
  3. Autoklaveres mediet i 45 minutter og avkjøles mediet til 50 ° C i et vannbad.
  4. Legg følgende løsninger: 1 ml kolesterol (5 mg / ml i 95% etanol), 1 ml 1 M CaCl 2, 1 ml 1 M MgSO 4, og 25 ml 1 M kaliumfosfatbuffer (pH 6,0). Bland godt.
  5. Tilsett 1 ml 1 M IPTG og 500 mL ampicillin (100 mg / ml i sterilt vann).
  6. Bland løsningen godt og hell i 60 x 15 mm (diameter x høyde) petri plater ved hjelp av en Pipet Aid og 25 ml serologisk pipette følgende sterile prosedyrer. Fyll hver plate med 12 ml agar. Platene kan lagres ved 4 ° C i opp til 1 måned.

Den essensielle autophagy genet bec-en er brukt som et eksempel for å undersøke funksjonen av en vert-genet i forsvaret mot Salmonella-infeksjon. De eksperimentelle fremgangsmåter er illustrert i Figur 1 og Tabell 1.. Protokollen for fremstilling av RNAi-behandlede dyr etter infeksjon følger, med dagen for hver eksperimentelle trinn er gitt i parentes.

  1. Inokuler bec-en RNAi mating og styring tom vektor L4440 RNAi mater bakterier ved å plassere et flak av -80 ° C frosne bakterier i 2 ml LB-medium supplert med 100 mg / ml ampicillin (dag 1). Gjenta dette trinnet en gang i uken under hele forsøket å ha friske RNAi bakterier. Oppbevar kultur i 4 ° C kjøleskapet når den ikke brukes.
  2. Seed 100 ml av natten RNAi bakteriekultur på RNAi plater. Forbered tre BEC-en RNAi og tre kontroll tomt vECTOR RNAi plater. Inkuber platene ved 37 ° C over natten (dag 2).
  3. Fjern RNAi plater fra 37 ° C inkubator og la dem avkjøles til romtemperatur på benken. Plukk opp velfødde L4 vill type N2 hermafroditter og overføre dem til Bec-en RNAi og kontrollere tomme vektor RNAi plater. Plasser tre ormer per plate, på tredoble plater. På samme dag, forberede RNAi plater som beskrevet i trinn 3.2 (Dag 3).
  4. Inkuber RNAi plater med ormer i 20 ° C inkubator for 36-40 hr og overføre ormer til friske tilsvarende RNAi plater utarbeidet i trinn 3.3. Etter ormer er overført, inkuberes platene i 20 ° C inkubator i 64 timer (dag 4).

4. Forbered Salmonella for infeksjon

  1. Serie Salmonella -80 ° C frosset lager på en XLD-agar-plate og Inkuber platen ved 37 ° C over natten (dag 5
  2. Pick en godt isolert sort Salmonella koloni og inokulere det i 2 ml LB-medium ved 37 ° C med risting over natten (dag 6).
  3. Seed 80 ml ​​Salmonella natten kultur på en C. elegans 60 x 15 mm (diameter x høyde) NGM agar plate og forberede seks plater totalt. Inkuber platene ved romtemperatur i 6 timer. Den bakteriekultur skal tørke og danne en plen på plate (dag 7).

5. Infisere RNAi-behandlede Worms med Salmonella

  1. Overfør BEC-en RNAi-behandlet og kontrollere tomme vektor RNAi-behandlet L4 N2 hermafroditter (avkom av ormer satt opp i trinn 3) til Salmonella plater. Plasser 40 ormer per plate på tre plater for hver gruppe. Inkuber snekke platene ved 20 ° C i 48 timer (dag 7).
  2. Forbered ett sett med ferske RNAi plater som beskrevet i trinn 3,1 og 3,2 (Dag 7 og
  3. Etter 48 timers infeksjon, overfører Salmonella-infiserte ormer til de tilsvarende RNAi platene fremstilt i trinn 5.2 og inkuber ved 20 ° C (dag 9).

6. Survival Assay

  1. Resultat overlevelsen av ormer daglig og overføre ormer til ferske tilsvar RNAi plater under egglegging tid. Forbered et sett med nye RNAi plater før hver orm overføring som beskrevet i trinn 3,1 og 3,2. Trykk på ormen kroppen (hodet, midtre del og hale) forsiktig med en slutt-flatet platinatråd. En orm er scoret som død hvis ingen bevegelse av ormen kroppen er observert.
  2. Resultat overlevelsen av ormer daglig eller annenhver dag, og overføre ormer til ferske tilsvar RNAi plater to ganger i uken etter ormer slutte å legge egg.
  3. Etter at alle ormer dø, basseng overlevelsesdata fra tre eksemplarer plater som ett datasett. Inngangsoverlevelsesdata for hver gruppe i passende statistisk programvare som GraphPad Prism å generere overlevelseskurver og å utføre Kaplan-Meier overlevelsesanalyse. Hele forsøket ble gjentatt minst en gang for å bekrefte den konklusjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved 20 ° C, er median levetid på vill type N2 ormer 17 dager (figur 2a og Tabell 2). Salmonella-smitte i betydelig grad reduserer median levetid på N2 ormer til 10,5 dager (p = 0.0002, log-rank test) (Figur 2A ).

Hvis en C. elegans genet spiller en viktig rolle i forsvaret mot Salmonella-infeksjon, er det spådd at dens hemming vil formidle mottakelighet for Salmonella-infeksjon. Faktisk, i forhold til Salmonella-smittet kontroll RNAi-behandlet N2 dyr, er median levetid på Salmonella-smittet BEC-en RNAi-behandlet N2 ormer redusert fra 10,5 dager til ni dager (p <0,0001, log-rank test) (Figur 2B og tabell 2). Den maksimale levetid blir betydelig forkortet ved 14 dager (fra 24 dager til 10 dager, fig 2B og tabell 2). Videre har det værec-en RNAi har ingen åpenbar effekt på levetiden for N2 ormer som ikke er smittet av Salmonella (p = 0,2593, log-rank test) (figur 2C og tabell 2), noe som indikerer at Salmonella-infeksjon, ikke Bec-en RNAi behandling, reduserer levetiden til Salmonella-infiserte BEC-en RNAi-behandlet ormer. Også bec-1 er et essensielt gen i C. elegans forsvar mot Salmonella-infeksjon.

Figur 1
Figur 1. Flytskjema over de eksperimentelle prosedyrer.

Fig. 2
Figur 2. Hemming av BEC-1 genet ved RNAi tildeler susceptibility til Salmonella-infeksjon i C. elegans. AC) Overlevelseskurver av vill type N2 dyr behandlet med enten kontroll tom vektor RNAi eller BEC-1 genet RNAi etter en to dagers eksponering for Salmonella typhimurium eller nonpathogenic Escherichia coli ved 20 ° C. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1
Tabell 1. Salmonella infeksjon protokollen tidsramme.

Tabell 2
Tabell 2. Statistisk analyse avLevetiden av data i figur 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

C. elegans er en enkel genetisk modellorganisme som spiser bakterier som sin næringskilde. Dermed er det lett å erstatte den normale bakterielle mat med en intestinal patogen for å undersøke interaksjonen mellom C. elegans og det valgte patogen. Heri en protokoll er beskrevet å kombinere Salmonella infeksjon og C. elegans RNAi fôring behandling for å undersøke hvilken rolle verts gener i forsvar mot Salmonella-infeksjon. Tidligere infeksjon protokoller utsett C. elegans ormer til sykdomsfremkallende bakterier som salmonella i løpet av livet 20. I den foreliggende protokoll, infiserer Salmonella ormer i en to-dagers periode. Etter at ormene er ikke lenger utsatt for Salmonella. Dette Salmonella-smitte betraktelig reduserer levetiden på C. elegans vill type dyr. Dermed invadert Salmonella replikere inne ormer og drepe dyrene 10 Salmonella etterligner menneskelige Salmonella infeksjon, som skal bidra til å avdekke nyttig informasjon for å forstå menneskelig matbåren sykdom forårsaket av Salmonella-infeksjon. Videre kombinerer denne protokollen RNAi fôring behandling med Salmonella-infeksjon, noe som gjør det mulig å teste eventuelle kandidat gener som kan være involvert i host forsvar mot Salmonella-infeksjon, spesielt når de genetiske mutanter er ikke tilgjengelig. Den autophagy genet BEC-en kjent for å være involvert i forsvaret mot Salmonella-infeksjon blir brukt som et eksempel i denne studien. Bec-1 mutasjoner er dødelige 21, som hindrer testing sin rolle i forsvaret mot Salmonella-infeksjon hos voksne. Ved hjelp av den aktuelle protokollen, ble det vist at hemming av BEC-en ved RNAi gir mottakelighet for Salmonella-infeksjon i C. elegans. I denne studien, N2 villtype ormer fed med L4440 bakterier har en lignende levetid som dyr fôret med OP50. Dyrene begynner å dø rundt dag 6 og maksimal levetid er rundt fire uker. N2 ormer smittet av Salmonella leve et par dager kortere. I motsetning til dette bec-en RNAi-behandlet mark infisert med Salmonella dør omtrent to ganger høyere enn kontrolldyrene, selv om begynnelsen datoen for dyr å dø i begge grupper er bare noen få dager fra hverandre (figur 2). Hele eksperimentet varer ca en måned.

I denne protokollen, er samordning av RNAi fôring og Salmonella forberedelse nødvendig, slik at RNAi-behandlet L4 scenen hermafroditter er utsatt for Salmonella-infeksjon. En typisk tidsramme av protokollen som brukes i forfatternes lab er beskrevet i tabell 1.. RNAi mate bakterier er fremstilt hver uke, og den bakterielle kulturen blir lagret ved 4 ° C når de ikke er i bruk. Av notatet, på dag 7, vil infeksjonen starter 60; time etter Salmonella over natten kulturer er plassert på NGM platene. I løpet av denne 6-timers periode, er RNAi-behandlet L4 N2 hermafroditter plukket fra tilsvarende BEC-en og kontrollere tomme vektor RNAi plater. De ikke-infiserte ormer er brukt som kontroller for å fastslå om salmonellainfeksjon forkorter levetiden av infiserte ormer og hvis BEC-en RNAi behandling har noen innflytelse på ormen levetid.

Foreløpig overlevelse av C. elegans etter infeksjon er vanligvis brukes til å måle patogenet virulens 3-5. Men RNAi hemming av visse C. elegans gener resultere i redusert levetid. Derfor bør man være forsiktig når man tolker dataene. Når denne situasjonen påtreffes, forskjellige konsentrasjoner av RNAi inducer, IPTG, kan bli testet for å identifisere den ønskede konsentrasjon som bare påvirker verten respons på patogen-infeksjoner uten virkning på dyrets levetid. Som rapportert tidligere <sup> 10, den 1 nM IPTG konsentrasjon ble brukt til å undersøke hvilken rolle autofagi i IGF signale-mediert patogen motstand i C. elegans.

Gitt at C. elegans genom er sekvensert og C. elegans RNAi fôring bibliotekene har blitt generert 16,18, det er mulig å revidere den beskrevne protokollen til å utføre et genom-wide RNAi screening for å identifisere alle verts gener som er involvert i forsvaret mot Salmonella-infeksjon. For eksempel, i stedet for å bruke den midlere overlevelsestid for å måle virulens av Salmonella, vil maksimal overlevelse anvendes. Videre kan infiserte ormer bli sterilisert ved å supplere plater med fluorodeoxyuridine, en DNA-syntese-inhibitor. Dermed overføring av infisert ormer er unødvendig så lenge maten er levert for å hindre ormer fra sult. Disse endringene vil redusere arbeidsbelastningen for en high-throughput skjermen enormt. Denne typen storstilt studie kan shed lys på å forstå den menneskelige responsen til Salmonella-smitte så mange biologiske mekanismer i C. elegans er evolusjonært konservert hos mennesker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Diane Baronas-Lowell for kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av en FAU Charles E. Schmidt College of Science Seed Grant og en aldrende stipend fra Ellison Medical Foundation til KJ

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth Fisher BP9723-500
XLD agar EMD Chemicals 1.05287.0500
Bacto Agar Fisher DF0140-01-0
Peptone Fisher BP1420-500
Sodium Chloride Fisher S671-500
Calcium Chloride Fisher C69-500
Magnesium Sulfate Fisher M65-500
IPTG Gold Biotechnology 12481C50
Cholesterol Sigma C8667-25G
Ampicillin Fisher BP1760-25
Salmonella typhimurium ATCC ATCC14028
Petri Dish 95 x 15 mm Fisher FB0875714G
Petri Dish 60 x 15 mm  Fisher 08-757-13A
Falcon Serological pipet Fisher 13-668-2
Falcon Express Pipet-Aid Fisher 13-675-42
MaxQ6000 shaking incubator  Thermo Scientific SHKE6000-7
Incubator Percival I-36DL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
  2. Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  3. Aballay, A., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans as a host for the study of host-pathogen interactions. Curr Opin Microbiol. 5, 97-101 (2002).
  4. Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Caenorhabditis elegans: an emerging genetic model for the study of innate immunity. Nat Rev Genet. 4, 380-390 (2003).
  5. Mylonakis, E., Aballay, A. Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions. Infection and Immunity. 73, 3833-3841 (2005).
  6. Ford, M. W., et al. A descriptive study of human Salmonella serotype typhimurium infections reported in Ontario from 1990 to 1997. Can J Infect Dis. 14, 267-273 (2003).
  7. Voetsch, A. C., et al. FoodNet estimate of the burden of illness caused by nontyphoidal Salmonella infections in the United States. Clin Infect Dis. 38 Suppl 3, (2004).
  8. Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. M. Salmonella typhimurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1539-1542 (2000).
  9. Alegado, R. A., Tan, M. W. Resistance to antimicrobial peptides contributes to persistence of Salmonella typhimurium in the C. elegans intestine. Cell Microbiol. 10, 1259-1273 (2008).
  10. Jia, K., et al. Autophagy genes protect against Salmonella typhimurium infection and mediate insulin signaling-regulated pathogen resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14564-14569 (2009).
  11. Tenor, J. L., McCormick, B. A., Ausubel, F. M., Aballay, A. Caenorhabditis elegans-based screen identifies Salmonella virulence factors required for conserved host-pathogen interactions. Curr Biol. 14, 1018-1024 (2004).
  12. Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).
  13. Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
  14. The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
  15. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  16. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2, 1-10 (2001).
  17. Liang, J., Xiong, S., Savage-Dunn, C. Using RNA-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode C elegans. J. Vis. Exp. (72), (2013).
  18. Fraser, A. G., et al. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
  19. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).
  20. Aballay, A., Ausubel, F. M. Programmed cell death mediated by ced-3 and ced-4 protects Caenorhabditis elegans from Salmonella typhimurium-mediated killing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 2735-2739 (2001).
  21. Melendez, A., et al. Autophagy genes are essential for dauer development and lifespan extension in C. elegans. Science. 301, 1387-1391 (2003).

Tags

Immunologi , Autofagi infeksjon patogen host RNAi
En protokoll for å infisere<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Med<em&gt; Salmonella typhimurium</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, J., Jia, K. A Protocol to… More

Zhang, J., Jia, K. A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium. J. Vis. Exp. (88), e51703, doi:10.3791/51703 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter