Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Un protocolo para infectar Published: June 26, 2014 doi: 10.3791/51703
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University

Summary

C. elegans se ha convertido en un nuevo modelo genético para estudiar las interacciones huésped-patógeno. Aquí se describe un protocolo para infectar C. elegans con Salmonella typhimurium, junto con la técnica de RNAi interferencia de doble hebra para examinar el papel de los genes del huésped en la defensa contra la infección por Salmonella.

Abstract

En la última década, C. elegans se ha convertido en un organismo invertebrado para estudiar las interacciones entre los hosts y patógenos, incluyendo la defensa del huésped contra bacterias gram-negativas bacteria Salmonella typhimurium. Salmonella establece una infección persistente en el intestino de C. elegans y resulta en la muerte temprana de los animales infectados. Un número de mecanismos de la inmunidad se ha identificado en C. elegans para defenderse de las infecciones por Salmonella. La autofagia, una vía de degradación lisosomal conservadas evolutivamente, se ha demostrado que limitar la replicación de Salmonella en C. elegans y en los mamíferos. Aquí, un protocolo se describe para infectar C. elegans con Salmonella typhimurium, en la que los gusanos están expuestos a la Salmonella por un tiempo limitado, similar a la infección por Salmonella en los seres humanos. infección por Salmonella acorta significativamente la vida útil de C. elegans </ Em>. Usando el gen de la autofagia esencial BEC-1 como un ejemplo, se combinaron este método de infección con C. elegans alimentación RNAi enfoque y mostró este protocolo puede ser utilizado para examinar la función de C. genes del huésped elegans en la defensa contra la infección por Salmonella. Desde C. elegans todo el genoma RNAi bibliotecas están disponibles, este protocolo permite a la pantalla exhaustivamente para C. genes elegans que protegen contra la Salmonella y otros patógenos intestinales utilizando RNAi bibliotecas de todo el genoma.

Introduction

La vida libre de nematodos Caenorhabditis elegans suelo es un simple y manejable de forma genética organismo modelo utilizado para estudiar muchas cuestiones biológicas. C. elegans existe predominantemente como hermafroditas autógamas. Los varones son generados espontáneamente por la no disyunción del cromosoma X durante 1,2 gametogénesis. En la presencia de abundante comida, C. elegans desarrollar continuamente a través de cuatro estadios larvarios a adulto. La temperatura también influye en C. desarrollo elegans; desarrollo más rápido se observó a temperaturas más altas. En el laboratorio, C. elegans se cultiva a una temperatura estándar de 20 ° C en placas de agar con cabeza de serie bacteria Escherichia coli (cepa OP50) como alimento 1,2.

En la última década, C. elegans se ha convertido en un organismo invertebrado para estudiar las interacciones huésped-patógeno 3-5. En la naturaleza, C. elegans come bacterias como su nutrien1,2 t fuente. Su comida normal de laboratorio bacteriana, OP50, puede ser fácilmente sustituido con otros patógenos para examinar las interacciones entre C. elegans y cualquier patógeno elegido. En estas condiciones, el intestino es el sitio primario de la infección. De hecho, se ha demostrado una amplia gama de patógenos bacterianos para infectar letalmente C. elegans 3-5.

La bacteria Salmonella gramnegativos es un patógeno gastrointestinal que causa la enfermedad transmitida por los alimentos humanos en todo el mundo 6,7. C. elegans es un buen modelo de acogida de Salmonella typhimurium ya que esta bacteria se replica y exhibe las infecciones intestinales persistentes 8-10. C. elegans ha sido utilizado para identificar tanto novedoso y anteriormente conocido virulencia de Salmonella factores 11. Curiosamente, la C. sistema inmune elegans limita con éxito la replicación de Salmonella. Se ha informado anteriormente de que no habilition de genes autofagia hace que el aumento de la replicación de Salmonella en C. elegans, lo que resulta en la muerte temprana de los gusanos infectados 10. Macroautofagia (aquí referido como la autofagia) es un proceso dinámico que implica la reorganización de las membranas subcelulares para secuestrar citoplasma y orgánulos para la entrega a los lisosomas para degradación 12. La autofagia ha sido reportado para limitar la replicación de Salmonella en C. elegans y en los mamíferos 10,13.

El C. elegans genoma fue el primer genoma eucariota multicelular secuenciado; que es sensible a RNAi tratamiento 14-16. Por otra parte, el ARNi puede ser administrado eficazmente sometiendo gusanos de ingerir las bacterias que contienen el ARN de doble cadena del gen diana, conocido como alimentación RNAi 16,17. Genoma bibliotecas de alimentación RNAi enteras han sido generados para la selección de ARNi de todo el genoma 16,18. En la presente memoria, una infección de Salmonella Proprotocolo es, junto con alimentación RNAi para permitir pruebas de C. genes elegans de interés por su capacidad de proteger contra la infección por Salmonella.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Placas XLD (xilosa lisina desoxicolato) Agar

Agar XLD es un medio de crecimiento selectivo para Salmonella, que aparece como colonias negras en placas de agar XLD. Sin embargo, si no hay problemas de contaminación, una placa regular de LB puede ser sustituido.

  1. Pesar 5,5 g de agar XLD y resuspender en 5 ml de agua desionizada.
  2. Mezclar bien hasta que todo el agar está mojado. Añadir 95 ml de agua desionizada hasta que todos queden grumos y el medio se volvieron a suspender por completo.
  3. Hervir el medio para disolver por completo (no en autoclave).
  4. Enfriar el medio a temperatura ambiente a 50 ° C.
  5. Verter 25 ml de agar de cada 95 x 15 mm (diámetro x altura) de la placa (placas selladas con Parafilm pueden almacenarse a 4 ° C durante un máximo de 1 mes).

2. Nematodo Medio de Crecimiento (NGM) de alimentación RNAi placas

Preparación de C. placas elegans NGM se ha descrito anteriormente 19. Aquí un procedimiento se describe brevemente para añadir el antibiótico ampicilina y el ARNi inductor químico isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) en los medios de comunicación NGM para hacer las placas de alimentación de RNAi.

  1. Disolver 3 g de NaCl y 2,5 g de Bacto peptona en 1 L de agua desionizada.
  2. Añadir 17 g de agar Bacto en los medios de comunicación.
  3. Autoclave los medios de comunicación durante 45 minutos y enfriar el medio a 50 ° C en un baño de agua.
  4. Añadir las siguientes soluciones: 1 ml de colesterol (5 mg / ml en etanol al 95%), 1 ml de 1 M de CaCl2, 1 ml de 1 M MgSO4, y 25 ml de 1 M de tampón de fosfato de potasio (pH 6,0). Mezclar bien.
  5. Añadir 1 ml de 1 M de IPTG y 500 l de ampicilina (100 mg / ml en agua estéril).
  6. Mezcle bien la solución y verter en placas de Petri de 60 x 15 mm (diámetro x altura) utilizando una pipeta de Ayuda y 25 ml de pipeta serológica siguientes procedimientos estériles. Llene cada plato con 12 ml de agar. Las placas se pueden almacenar a 4 ° C durante hasta 1 mes.

El gen esencial autofagia BEC-1 se utiliza como un ejemplo para examinar la función de un gen de acogida en la defensa contra la infección por Salmonella. Los procedimientos experimentales se ilustran en la Figura 1 y la Tabla 1. El protocolo para la preparación de los animales tratados con ARNi para la infección sigue, con el día de cada paso experimentales dados en paréntesis.

  1. Inocular bec-1 RNAi alimentación y el control de vector vacío L4440 alimentación RNAi bacterias mediante la colocación de un copo de -80 ° C las bacterias congeladas en 2 ml de medio LB suplementado con 100 mg / ml de ampicilina (Día 1). Repita este paso una vez a la semana durante todo el experimento de tener bacterias RNAi frescas. Guarde la cultura en el 4 ° C refrigerador cuando no se utiliza.
  2. Seed 100 ml de cultivo bacteriano durante la noche en placas de RNAi RNAi. Prepare de tres bec-1 RNAi y el control de tres v vacíaector placas de RNAi. Incubar las placas a 37 ° C durante la noche (Día 2).
  3. Retire las placas de RNAi de la 37 ° C incubadora y deje que se enfríen a temperatura ambiente en el banquillo. Recoge bien alimentados L4 tipo salvaje hermafroditas N2 y transferirlos a Bec-1 RNAi y controlan placas RNAi vector vacío. Coloque tres gusanos por placa, en placas por triplicado. El mismo día, se preparan platos de RNAi como se describe en el paso 3.2 (día 3).
  4. Incubar las placas de RNAi con gusanos en la incubadora de 20 ° C para 36 a 40 hy de transferencia de los gusanos a las placas de RNAi correspondientes frescos preparados en el paso 3.3. Después de gusanos se transfieren, incubar las placas en el 20 ° C incubadora durante 64 horas (día 4).

4. Preparar para la infección por Salmonella

  1. Salmonella racha de -80 ° C madre congelada en 1 placa de agar XLD e incubar la placa a 37 ° C durante la noche (el día 5
  2. Elige un bien aislada de Salmonella negro colonia e inocular en 2 ml de medio LB a 37 ° C con agitación durante la noche (Día 6).
  3. Seed 80 ml ​​Salmonella cultivo de una noche en 1 C. elegans 60 x 15 mm (diámetro x altura) placa de agar NGM y preparar 6 placas en total. Las placas se incuban a temperatura ambiente durante 6 horas. El cultivo bacteriano debe secarse y formar un césped en la placa (día 7).

5. Worms tratados con RNAi Infect con Salmonella

  1. Traslado bec-1 RNAi tratados y control de vectores hermafroditas L4 N2 vacías RNAi tratados (la progenie de gusanos creados en el paso 3) para placas de Salmonella. Coloque 40 gusanos por placa en 3 placas para cada grupo. Incubar las placas de gusanos a 20 ° C durante 48 horas (día 7).
  2. Prepare un juego de placas de RNAi frescas tal como se describe en los pasos 3.1 y 3.2 (Día 7 y
  3. Después de 48 horas de infección, transferir gusanos infectados por Salmonella en las correspondientes placas de RNAi preparados en la etapa 5.2 y se incuba a 20 ° C (día 9).

6. Ensayo de supervivencia

  1. Puntuación de la supervivencia de los gusanos diario y transferir gusanos correspondientes placas de RNAi frescas durante la época de puesta de huevos. Prepare un conjunto de placas de RNAi frescas antes de cada transferencia de gusano como se describe en los pasos 3.1 y 3.2. Toque el cuerpo del gusano (cabeza, parte media y cola) suavemente con un alambre de platino final aplanado. Un gusano se califica como muerto si no se observa el movimiento del cuerpo del gusano.
  2. Puntuación de la supervivencia de los gusanos al día o cada dos días, y la transferencia de los gusanos de las placas correspondientes RNAi frescas dos veces a la semana después de que los gusanos dejan de poner huevos.
  3. Después de todos los gusanos mueren, agrupar los datos de supervivencia de placas por triplicado como un conjunto de datos. Introduzca los datos de supervivencia de cada grupo en el software estadístico apropiado como GraphPad Prismo para generar curvas de supervivencia y para llevar a cabo el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier. Todo el experimento se repite al menos una vez para confirmar la conclusión.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

A 20 ° C, la esperanza de vida media de tipo salvaje gusanos N2 es de 17 días (Figura 2A y Tabla 2). Infección por Salmonella disminuye significativamente la esperanza de vida media de los gusanos N2 a 10,5 días (p = 0,0002, prueba de log-rank) (Figura 2A ).

Si una C elegans gen desempeña un papel importante en la defensa contra la infección por Salmonella, se prevé que su inhibición impartirá la susceptibilidad a la infección por Salmonella. De hecho, en comparación con el control de RNAi tratados N2 animales infectados por Salmonella, la esperanza de vida media de bec-1 RNAi tratados gusanos N2 infectados por Salmonella se redujo de 10,5 días y 9 días (p <0,0001, prueba de log-rank) (Figura 2B y en la Tabla 2). La vida útil máxima se acorta dramáticamente por 14 días (a partir de 24 a 10 días, la Figura 2B y el Cuadro 2). Por otra parte, el serc-1 RNAi no tiene ningún efecto evidente en la vida de los gusanos N2 que no están infectadas por Salmonella (p = 0,2593, prueba de log-rank) (Figura 2C y Cuadro 2), lo que indica que la infección por Salmonella, no BEC-1 tratamiento de RNAi, disminuye la vida útil de los infectados por Salmonella bec-1 RNAi gusanos tratados. También, BEC-1 es un gen esencial en C. elegans defensa contra la infección por Salmonella.

Figura 1
Figura 1. Diagrama de flujo de los procedimientos experimentales.

Figura 2
Figura 2. Inhibición de bec-1 gen de RNAi confiere sostesusceptibilidad a la infección por Salmonella en C. elegans. curvas AC) de supervivencia de los animales N2 tipo salvaje tratados con control de vector vacío RNAi o bec-1 gen RNAi tras una exposición de 2 días a la Salmonella typhimurium o Escherichia coli no patógena a 20 ° C. Por favor clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

Tabla 1
Tabla 1. Plazo protocolo de la infección por Salmonella.

Tabla 2
Tabla 2. El análisis estadístico de losVida útil de datos en la Figura 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

C. elegans es un simple organismo modelo genético que come bacterias como fuente de nutrientes. Por lo tanto, es fácil de sustituir su alimentaria bacteriana normal con un patógeno intestinal para investigar las interacciones entre C. elegans y el patógeno elegido. En la presente memoria se describe un protocolo para combinar la infección por Salmonella y C. elegans alimentación RNAi tratamiento para examinar el papel de los genes del huésped en la defensa contra la infección por Salmonella. Protocolos de infección previa exponen C. gusanos elegans a bacterias patógenas incluyendo Salmonella durante su vida 20. En el presente protocolo, Salmonella infecta a los gusanos en un período de dos días. Después de eso, los gusanos ya no están expuestos a Salmonella. Esta infección por Salmonella se reduce significativamente el tiempo de vida de C. elegans tipo de animales salvajes. Por lo tanto, invadió Salmonella replicar gusanos dentro y matar a los animales 10 Salmonella imita la infección por Salmonella humana, que debe ayudar a descubrir información útil para comprender las enfermedades transmitidas por los alimentos humanos causada por la infección por Salmonella. Por otra parte, este protocolo combina el tratamiento de alimentación RNAi con la infección por Salmonella, por lo que es posible probar cualquier genes candidatos que pudieran estar implicados en la defensa del huésped contra la infección por Salmonella, especialmente cuando los mutantes genéticos no están disponibles. El gen de la autofagia se utiliza bec-1 se sabe están involucrados en la defensa contra la infección por Salmonella como ejemplo en el presente estudio. Mutaciones bec-1 son letales 21, que impide la comprobación de su papel en la defensa contra la infección por Salmonella en los adultos. Utilizando el protocolo actual, se demostró que la inhibición de BEC-1 por RNAi produce la susceptibilidad a la infección por Salmonella en C. elegans. En el presente estudio, N2 gusanos de tipo salvaje fed con bacterias L4440 tiene una esperanza de vida similar a la de animales alimentados con OP50. Los animales empiezan a morir alrededor del día 6 y la máxima vida útil es de alrededor de cuatro semanas. Gusanos N2 infectadas por Salmonella viven unos pocos días más corto. Por el contrario, bec-1 RNAi gusanos tratados infectados con Salmonella mueren cerca de dos veces más rápido que los animales de control, aunque la fecha de inicio para que los animales mueren en los dos grupos está a sólo unos días de diferencia (Figura 2). Todo el experimento dura aproximadamente 1 mes.

En este protocolo, se requiere la coordinación de la alimentación RNAi y preparación Salmonella para que tratados con RNAi hermafroditas etapa L4 son sometidos a la infección por Salmonella. Un marco de tiempo típico del protocolo utilizado en el laboratorio de los autores, se describe en la Tabla 1. Bacterias se alimentan de RNAi se preparan semanalmente y el cultivo bacteriano se almacenan a 4 ° C cuando no se utiliza. Es de destacar que en el día 7, la infección comienza 60; horas después de Salmonella cultivos de una noche se colocan en placas NGM. Durante este período de 6 horas, tratados con RNAi hermafroditas L4 N2 son recogidos de los correspondientes bec-1 y controlan placas RNAi vector vacío. Los gusanos no infectados se utilizaron como controles para determinar si la infección por Salmonella acorta la vida útil de los gusanos infectados y, si BEC-1 tratamiento ARNi tiene ninguna influencia en la vida útil gusano.

Actualmente, la supervivencia de C. elegans después de la infección se utiliza comúnmente para medir la virulencia del patógeno 3-5. Sin embargo, la inhibición de RNAi de cierta C. genes elegans resultan en la disminución de la vida útil. Por lo tanto, uno debe tener cuidado al interpretar los datos. Cuando se encuentra esta situación, diferentes concentraciones del inductor ARNi, IPTG, pueden ser examinados para identificar la concentración deseada que sólo influye en la respuesta del huésped a las infecciones de patógenos sin impacto en la vida útil de los animales. Como se informó anteriormente <sup> 10, la concentración de 1 nM de IPTG fue utilizado con éxito para examinar el papel de la autofagia en IGF señalización mediada por la resistencia a patógenos en C. elegans.

Dado que la C. elegans genoma ha sido secuenciado y C. bibliotecas de alimentación elegans RNAi se han generado 16,18, es posible revisar el protocolo descrito para llevar a cabo una detección de RNAi en todo el genoma para identificar todos los genes del huésped implicados en la defensa contra la infección por Salmonella. Por ejemplo, en lugar de utilizar la mediana de supervivencia para medir la virulencia de Salmonella, se utiliza la supervivencia máxima. Por otra parte, gusanos infectadas pueden esterilizarse completándolo placas con fluorodesoxiuridina, un inhibidor de la síntesis de ADN. Por lo tanto, la transferencia de los gusanos infectados es necesario, siempre y cuando la alimentación se suministra a evitar que los gusanos de la inanición. Estas modificaciones se reducirá la carga de trabajo para una pantalla de alto rendimiento enormemente. Este tipo de estudio a gran escala puede sluz hed en la comprensión de la respuesta humana a la infección por Salmonella tantas vías biológicas en C. elegans son evolutivamente conservados en humanos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Damos las gracias a la Dra. Diane Baronas-Lowell para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por un Charles E. Schmidt Colegio FAU del Fondo Semilla de Ciencia y una Beca de Envejecimiento de la Fundación Médica Ellison a KJ

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth Fisher BP9723-500
XLD agar EMD Chemicals 1.05287.0500
Bacto Agar Fisher DF0140-01-0
Peptone Fisher BP1420-500
Sodium Chloride Fisher S671-500
Calcium Chloride Fisher C69-500
Magnesium Sulfate Fisher M65-500
IPTG Gold Biotechnology 12481C50
Cholesterol Sigma C8667-25G
Ampicillin Fisher BP1760-25
Salmonella typhimurium ATCC ATCC14028
Petri Dish 95 x 15 mm Fisher FB0875714G
Petri Dish 60 x 15 mm  Fisher 08-757-13A
Falcon Serological pipet Fisher 13-668-2
Falcon Express Pipet-Aid Fisher 13-675-42
MaxQ6000 shaking incubator  Thermo Scientific SHKE6000-7
Incubator Percival I-36DL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
  2. Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  3. Aballay, A., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans as a host for the study of host-pathogen interactions. Curr Opin Microbiol. 5, 97-101 (2002).
  4. Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Caenorhabditis elegans: an emerging genetic model for the study of innate immunity. Nat Rev Genet. 4, 380-390 (2003).
  5. Mylonakis, E., Aballay, A. Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions. Infection and Immunity. 73, 3833-3841 (2005).
  6. Ford, M. W., et al. A descriptive study of human Salmonella serotype typhimurium infections reported in Ontario from 1990 to 1997. Can J Infect Dis. 14, 267-273 (2003).
  7. Voetsch, A. C., et al. FoodNet estimate of the burden of illness caused by nontyphoidal Salmonella infections in the United States. Clin Infect Dis. 38 Suppl 3, (2004).
  8. Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. M. Salmonella typhimurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1539-1542 (2000).
  9. Alegado, R. A., Tan, M. W. Resistance to antimicrobial peptides contributes to persistence of Salmonella typhimurium in the C. elegans intestine. Cell Microbiol. 10, 1259-1273 (2008).
  10. Jia, K., et al. Autophagy genes protect against Salmonella typhimurium infection and mediate insulin signaling-regulated pathogen resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14564-14569 (2009).
  11. Tenor, J. L., McCormick, B. A., Ausubel, F. M., Aballay, A. Caenorhabditis elegans-based screen identifies Salmonella virulence factors required for conserved host-pathogen interactions. Curr Biol. 14, 1018-1024 (2004).
  12. Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).
  13. Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
  14. The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
  15. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  16. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2, 1-10 (2001).
  17. Liang, J., Xiong, S., Savage-Dunn, C. Using RNA-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode C elegans. J. Vis. Exp. (72), (2013).
  18. Fraser, A. G., et al. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
  19. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).
  20. Aballay, A., Ausubel, F. M. Programmed cell death mediated by ced-3 and ced-4 protects Caenorhabditis elegans from Salmonella typhimurium-mediated killing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 2735-2739 (2001).
  21. Melendez, A., et al. Autophagy genes are essential for dauer development and lifespan extension in C. elegans. Science. 301, 1387-1391 (2003).

Tags

Inmunología Número 88, La autofagia las infecciones patógenos huéspedes RNAi
Un protocolo para infectar<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Con<em&gt; Salmonella typhimurium</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, J., Jia, K. A Protocol to… More

Zhang, J., Jia, K. A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium. J. Vis. Exp. (88), e51703, doi:10.3791/51703 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter