Introduction
تراكم داخل الخلايا تاو amyloids يعرف tauopathies مثل مرض الزهايمر. في مراحل المرض المبكرة، يتم ترجمة الأمراض عموما إلى مناطق منفصلة من الدماغ، ولكن مع تطور المرض، والأمراض ينتشر دائما على طول الشبكات العصبية متميزة 1-5. وتشير الأدلة المتراكمة الانتشار العابر للمن المجاميع البروتين السامة راء هذه الأمراض (إعادة النظر في 10/6). في هذا النموذج، يتم الافراج بذور proteopathic (على سبيل المثال، تاو) من الخلايا المانحة، وتدخل الخلايا المجاورة، وتحويل البروتين تاو الأصلي في شكل تتجمع عبر قالب تغيير متعلق بتكوين 11-15. وقد تم تطوير هذا الفحص الموصوفة هنا للكشف عن حساسية هذا النشاط البذر. وهو متوافق مع المؤتلف البروتين والعينات البيولوجية وتمكن الكمي لمستويات دقيقة من النشاط البذر proteopathic 16.
خلايا كلوة 293T التي تعبر عن ثابت تاو تكرار دomain (RD) التي تحتوي على طفرة P301S الأمراض المرتبطة تنصهر فيها إما CFP أو YFP (يشار إليها فيما يلي باسم خلايا تاو-RD-CFP / YFP) بمثابة جهاز الاستشعار البيولوجي مستقر من النشاط البذر. في غياب البذور proteopathic، الخلايا تحافظ تاو كما مونومر القابلة للذوبان، وليس لها أي الحنق خلفية ملموس. امتصاص عفوية أو بوساطة الحويصلية تنبيغ من بذور تاو في الخلايا، ولكن النتائج في RD-CFP وRD-YFP التجميع، التي تنتج إشارة الحنق أن يقاس داخل الخلايا واحدة عن طريق التدفق الخلوي.
تم هندستها مكونات عديدة من هذا الاختبار لتعزيز الحساسية والحد من التقلبات. وقد تم اختيار 1 RD-CFP / YFP نسبة التعبير، كما أنه يوفر إشارة الأمثل:: خط خلية وحيدة النسيلة مع 1 الضوضاء. لزيادة حساسية، وتستخدم الدهون الفوسفاتية لتقديم البذور مباشرة في الخلايا (على الرغم من أن دراسة الآليات البيولوجية للامتصاص، وهذا يمكن أن يتم حذف). وأخيرا، التدفق الخلوي المراقبين الحنق على مستوى السكان وخلية واحدة مستوى، خلافا لغيرها من فحوصات البروتين التجميع. وقياس النتيجة النهائية، والكثافة الحنق متكاملة، كمي للغاية ويمثل على حد سواء لعدد من الخلايا مع التجميع، والدرجة التي حدث التجميع داخل كل خلية. كل هذه المعلمات الأمثل تعزيز حساسية وضمان التكاثر.
كان يعمل هذا النظام مؤخرا في دراسة شاملة في المعدلة وراثيا P301S الفئران tauopathy 17 التي قيمت بداية الزمني وتطور تاو النشاط البذر نسبة إلى أخرى تاو تستخدم عادة علامات مرضية (على سبيل المثال، MC1، AT8، PG5، وThioflavinS). النشاط البذر هو إلى حد بعيد أقرب وأقوى علامة من تاو أمراض تقييمها، وذلك قبل الكشف النسيجي بنسبة 6 أسابيع على الأقل. يبدو النشاط البذر في 1.5 شهر ويزيد تدريجيا مع التقدم في السن، مما يشير إلى دور المسببة للبذور proteopathic في بداية و / أو تقدم من التنكس العصبي 16.
e_content "> الكميات الدقيقة لمستويات دقيقة من المواد البذور من العينات البيولوجية يمكن أن تسهل الدراسات التي ترصد تطور المرض في وقت مبكر. بتقصير مدة المحاكمة وتمكين استخدام الحيوانات الأصغر سنا، وهذا يمكن أن يزيد من كفاءة ودقة التجارب على الحيوانات قبل السريرية. على سبيل المثال، في وP301S الماوس سبق وصفها، يمكن أن يتم تسليم مركبات الرصاص في وقت مبكر من 4-6 أسابيع (مباشرة قبل أو في بداية النشاط البذر)، ورصدت لفعالية 2-4 أسابيع في وقت لاحق. الفحص يجب تحديد بدقة أي تخفيضات في البذر النشاط. الحنق التدفق الخلوي ويمكن اختبارها في المختبر فحص التطبيقات كذلك. على سبيل المثال، الكواشف مكافحة تاو (على سبيل المثال، والأجسام المضادة، والجزيئات الصغيرة، وغيرها) بسرعة لقدرتها على منع البذر تحريض مباشرة في الثقافة، وذلك باستخدام إما تاو المؤتلف المجاميع أو لست] المستمدة من الدماغ كمصدر البذور (الشكل 5). مع هذا الإعداد، بعد الانتهاء من إعداد المواد البذور، وهو رئيس سابقملصقة يأخذ ثلاثة أيام فقط لإكمال، بما في ذلك تحليل البيانات. وبالتالي يمكن تحديد الكميات السريع النشاط البذر proteopathic تسهيل العديد من الدراسات من التنكس العصبي.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يؤكد هذا البروتوكول استخدام الحنق قياس التدفق الخلوي للكشف عن النشاط البذر من العينات البيولوجية الماوس. كما أنه متوافق مع الألياف المؤتلف والعينات البيولوجية البشرية. تم تنفيذ القتل الرحيم الماوس والدماغ الحصاد وفقا للإجراءات المعتمدة IACUC.
1. استخراج الدماغ
- وبعد التخدير العميق مع isoflurane (2٪)، يروي ماوس مع PBS الجليد الباردة التي تحتوي على 0.03٪ الهيبارين، واستخراج الدماغ التالية تفاصيل وصفها في غيج وآخرون 18
- وضع الأنسجة المستخرجة في-قنينة البرد، والمفاجئة تجميد بالوضع في النيتروجين السائل. بدلا من ذلك، وتجميد الأنسجة على الثلج الجاف. مرة واحدة المجمدة، ونقل الأنسجة ل-80 ° C وتخزينها لفترة طويلة من الزمن، إذا لزم الأمر.
ملاحظة: هذا البروتوكول هو متوافق مع الخليط الدماغ كله أو مناطق الدماغ تشريح الصغرى. رؤية Hagihara آخرون لمفصل بروتوكول الدقيقة تشريح 19. 2. إعداد البيولوجية البذور المواد - إعداد العازلة تجانس عن طريق إذابة مثبطات الأنزيم البروتيني (EDTA الحرة) في 1X TBS (1 قرص لكل 10 مل). دوامة بقوة، ومتجر على الجليد. يجب أن تكون مثبطات الأنزيم البروتيني EDTA مجانا من أجل الحفاظ على جهاز الاستشعار البيولوجي بقاء الخلية.
- تزن أنسجة المخ المجمدة في وزن القارب القابل للتصرف، ونقل إلى 5 مل أنبوب مخروطي الشكل. إضافة الجليد الباردة عازلة التجانس مثل أن الحل النهائي هو 10٪ الوزن / الحجم. تخزين مؤقتا على الجليد. سوف كتلة الأنسجة وتجانس لاحقا حجم العازلة تختلف تبعا لحجم الدماغ و / أو المناطق المستخدمة. هنا، يتم تعليق لhemibrain الماوس الكبار وزنها 0.2 غرام في 2 مل 10٪ ث / حل المجلد.
- عينات نقل إلى غرفة باردة، وضبط sonicator التحقيق إلى الإعدادات المناسبة. لجنة التحقيق صوتنة مع أومني Ruptor (كما هو موضح هنا)، تعيين قوة إلى 20٪، وهو ما يعادل حوالي 75 W. استخدام وضع النبض لضمان العينات لا يتم اوفإيه ساخنة خلال صوتنة. ضبط بولسير إلى 30٪، أي ما يعادل حوالي 500 مللي ثانية.
- تنظيف غيض من sonicator التحقيق من قبل الشطف بالماء، الأيزوبروبانول، والماء مرة أخرى، محو التحقيق في ما بين كل حل. تكون على يقين من شطف ومسح كلا الجانبين والجزء السفلي من التحقيق مع مختبر مناديل.
- العمل مع عينة واحدة في وقت واحد، غمر تلميح التحقيق في المخزن المؤقت التجانس، وبدء sonicator. باستخدام إعدادات الطاقة وبولسير المذكورة أعلاه، وتقديم 25 مجموع البقول. تأكد من أن الأنسجة تماما في تعليق. كن حذرا لتجنب الرغوة من العينة خلال هذه الخطوة.
ملاحظة: عينات عرضة للرغوة إذا أ) إجمالي حجم منخفض أو ب) ارتفاع درجة حرارة تصل جناسة. مع هذه الأداة محددة، لا يصوتن مع كميات أقل من 250 ميكرولتر. لضمان البقاء عينات المبردة، قد يتم تخزين أنابيب على الجليد خلال هذه الخطوة. - تنظيف التحقيق من قبل القضاء بعيدا المحللة المتبقية، ثم تقديم 10 البقول إلى س الكأسالمياه النظيفة و. شطف الجانبين والجزء السفلي من التحقيق مع الماء، الأيزوبروبانول، والماء مرة أخرى (كما في الخطوة 2.4)، ومحو تجف بين كل خطوة. لتجنب التلوث، وشطفها جيدا التحقيق في ما بين العينات.
ملاحظة: مع المجاميع تاو، لم نجد أن طرق تنظيف أكثر صرامة ضرورية لمنع تلوث عينة إلى عينة. amyloids الآخرين، ومع ذلك، قد يحتاجون إلى رعاية إضافية التي وصفت على نطاق واسع في الأدب 20،21. - متجر الخليط على الجليد حتى يتم معالجة كافة العينات.
- تدور الخليط في 21300 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- طاف لنقل أنبوب نظيفة، مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه. تجاهل بيليه. قسامة وطاف، ومخزن لست] في -80 درجة مئوية لاستخدامها مرة أخرى. تجنب تجميد / الذوبان دورات من الخليط، ومع ذلك، وهذا يقلل من كفاءة البذر.
- في بيئة معقمة، والثقافة، نضح المتوسطة. شطف الخلايا مع PBS الدافئ، ونضح. يعرض للتريبسين الخلايا (3 مل من التربسين-EDTA (0.05٪)) لمدة 3 دقائق، يطفئ مع ثقافة الحارة المتوسطة (9 مل من DMEM، و 10٪ FBS، 1٪ القلم / بكتيريا، 1٪ GlutaMax)، ونقل على الفور الخلايا إلى أنبوب مخروطي الشكل.
- خلايا الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق على RT. نضح المتوسطة، وبيليه الخلية resuspend في المتوسط الدافئة الثقافة.
- باستخدام عدادة الكريات، وتحديد كثافة الخلية لكل خط الخلية. وتختلف كثافة الخلايا اعتمادا على confluency في وقت الحصاد وحجم إعادة تعليق. Resuspend الخلايا التي تحصد من طبق 10 سم في 90٪ confluency في 10 مل وسائل الإعلام، لكثافة الخلايا لتكون ما يقرب من 1 مليون خلية / مل.
- صنعمزيج الرئيسي للخلايا + وسائل الإعلام بحيث كل بئر من 96 لوحة جيدا سيتضمن 35،000 الخلايا في 130 ميكرولتر وسائل الاعلام (على سبيل المثال، لجعل مزيج الرئيسي ل 100 بئرا، و resuspend 3.5 مليون الخلايا في 13 مل سائل الإعلام). تعديل عدد الخلايا لتتناسب مع التصاميم والجداول الزمنية التجريبية الفردية. لعلاج الخلايا ~ 18 ساعة بعد الطلاء، إضافة 35،000 الخلايا لكل بئر من لوحة 96-جيدا.
- باستخدام الماصة متعدد القنوات، ماصة ببطء 130 ميكرولتر من مزيج الرئيسي تعليق خلية في كل بئر من مسطحة القاع، زراعة الأنسجة المعالجة 96 لوحة جيدا. بينما طلي، ضع طرف الماصة في وسط البئر، وليس لمس الجزء السفلي من لوحة.
ملاحظة: على الرغم من الطلاء شكل يمكن تعديلها، مما ن = 4 آبار لكل من خطوط الخلايا 1-3 في لوحة يوصى. محجوز ما تبقى من لوحة (ن = 84) لخط الخلية رقم 4 (خلايا جهاز الاستشعار البيولوجي). - السماح للخلايا لتسوية من خلال ترك لوحة دون عائق لمدة 10 دقيقة في RT. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، و&# 8805؛ الرطوبة النسبية 80٪.
- في أنبوب واحد، والجمع بين ترنسفكأيشن الكاشف، مثل Lipofectamine، مع وسائل الاعلام خفض المصل، مثل غروب MEM، لجعل مزيج الرئيسي. لكل بئر، إضافة 1.25 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن و 8.75 ميكرولتر وسائل الاعلام خفض المصل. أنبوب نفض الغبار برفق لمزج، لفترة وجيزة تدور باستمرار، واحتضان لمدة 5 دقائق على RT.
- في أنبوب آخر، والجمع بين المواد البذور (قسامة من المحللة من الخطوة 2.9) مع وسائل الاعلام خفض المصل.
ملاحظة: حجم المواد البذور تختلف وفقا لتجربة فردية. عند اختيار حجم البذور، وتأخذ بعين الاعتبار: فرة من البذور في عينة والسمية المحتملة. يمكن الخليط الخام تكون سامة للخلايا. على هذا النحو، استخدم أدنى حجم ممكن لرصد تأثير المطلوب. أحجام التداول في السابق اختبار من المحللة / جيد نطاق الاب OM 1-5 ميكرولتر الموافق البروتين الكلي 5-20 ميكروغرام. ضمان أن الحجم الكلي لكل بئر (بذور + وسائل الاعلام خفض المصل) هو 10 ميكرولتر. - الجمع بين محتويات من الأنابيب المذكورين في 4.1 و 4.2، ونفض الغبار بلطف لمزج، لفترة وجيزة تدور باستمرار (1000 x ج، 5 ثانية)، واحتضان في RT لمدة 20 دقيقة على الأقل، وتصل إلى 2 ساعة.
- ماصة بلطف 20 ميكرولتر من مجمع تنبيغ على الجانب الآبار جهاز الاستشعار البيولوجي الفردية. استخدام ثلاثة مكررات الفنية، إذا كان ذلك ممكنا. العودة الخلايا المعالجة إلى حاضنة لمدة 24-48 ساعة. احتضان تحت نفس الشروط كما هو موضح في الخطوة 3.6.
ملاحظة: حالة سيطرة سلبية المناسبة لهذا الإعداد هو خلايا جهاز الاستشعار البيولوجي تعامل مع الجسيمات الشحمية فارغة (أي الحويصلية كاشف + وسائل الاعلام خفض المصل) لتطبيق الفوسفورية يدخل تحولا طفيفا في ملف تعريف مضان نسبة إلى جهاز الاستشعار البيولوجي خلايا غير معلن لالحويصلية كاشف. - باستخدام الماصة متعدد القنوات، ونضح كل خلية متوسطة (150 ميكرولتر). يعرض للتريبسين (50 ميكرولتر) خلايا لمدة 5 دقائق، وإخماد مع 150 ميكرولتر المبردة متوسطة الثقافة. لا تشمل شطف PBS قبل trypsinization في هذه الخطوة، لأنها قد تسبب رفع الخلايا وفقدان الخلية اللاحقة. استبعاد أي خلايا ميتة تلويث والحطام خلال التدفق الخلوي عبر استراتيجيات النابضة.
- مباشرة بعد التبريد، نقل الخلايا إلى 96 جولة جيدا لوحة أسفل، وأجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 ميلن في RT.
- نضح وتجاهل المتوسطة، مع الحرص على تجنب إزعاج بيليه الخلية.
- بلطف، ولكن بدقة، resuspend الكرية خلية في 50 ميكرولتر 2٪ امتصاص العرق، واحتضان لمدة 10 دقيقة. بدلا من ذلك، قم بتشغيل الخلايا الحية، على الرغم من تثبيت يوفر نتائج أكثر نظافة وأكثر اتساقا.
- خلايا الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق على RT. نضح وتجاهل امتصاص العرق، مع الحرص على تجنب إزعاج بيليه الخلية.
- بلطف، ولكن بدقة، resuspend الكرية الخلية في 200 ميكرولتر تدفق المبرد الخلوي العازلة (HBSS، 1٪ FBS، 1 ملم EDTA) وتشغيل لوحة في أقرب وقت ممكن لتجنب تراكمها الخلية.
- جعل الجانب مبعثر المساحة (SSC-A) مقابل الأمام مبعثر المساحة (FSC-A) مؤامرة ثنائية المتغيرات bivariate، ومع خط الخلية رقم 1 على التوالي، وضبط SSC وFSC الفولتية حتى السكان الخلية في الربع السفلي الأيسر. انقر فوق الأداة مضلع، وتعريف السكان الخلية (بوابة P1). لجميع المعلمات النابضة انظر الشكل 2.
- جعل FSC-H (الارتفاع) مقابل FSC-A ثنائي المتغير المؤامرة، وتطبيق بوابة P1 لهذه المؤامرة بالنقر على "العيش" فوق مؤامرة، واختيار P1. مع خط الخلية # 1تشغيل، انقر فوق أداة المضلع، وتحديد الخلايا واحد (بوابة P2).
- تقديم 3 قطع الرسم البياني، واحدة لكل من المرشحات للاهتمام: الحراجية، YFP، والحنق. تطبيق بوابة P2 إلى كل هذه المؤامرات بالنقر على "العيش" فوق المؤامرات، واختيار P2. مع خط الخلية رقم 1 على التوالي، وضبط الفولتية مثل أن سكان الخلية متوسط في CFP، YFP، والحنق رسوم بيانية كلها بين 0 و 1. قياس CFP والحنق، تثير الخلايا مع ليزر 405 نانومتر، والتقاط مضان مع 450/50 نانومتر و 525/50 نانومتر مرشح، على التوالي. لقياس YFP، تثير الخلايا مع ليزر والقبض مضان 488 نانومتر مع 525/50 نانومتر التصفية. وكذلك وصف إعدادات الليزر والمرشح في الجدول 2.
- أداء التعويض عن CFP امتداده إلى القنوات الحنق وYFP.
ملاحظة: التعويض هو عملية تصحيح مضان غير المباشرة. يحدث مضان غير المباشرة كلما تم الكشف عن الانبعاثات مضان من تألقي واحدة خلال دس مرشحgned لقياس إشارة من تألقي آخر. مع التعويض المناسب، يمكن إزالة امتداد مضان CFP من القنوات الحنق وYFP.
ملاحظة: يتطلب التعويض وجود كل من خلايا -positive و-negative مضان. وهكذا، للتعويض عن الخلايا CFP الإيجابية (خلية خط 2 #)، وخلايا السلبية (خلية خط رقم 1) يجب أن يضاف إلى العينة السابقة للتشغيل.- ارتفاع في 30 ميكرولتر من خط الخلية # 1 تعليق من نفس واحدة بشكل جيد في 200 ميكرولتر من خط الخلية رقم 2 تعليق مسبق على الفور لتعويض.
- انقر على "إعدادات الصك" رمز، ثم علامة التبويب "التعويض"، وتحقق "المصفوفة" لفتح الجدول التعويض.
- جعل الحنق-A مباراة CFP-A مؤامرة ثنائية المتغيرات bivariate، وتطبيق بوابة P2، كما هو موضح في الخطوة 6.3. مع خطوط الخلايا 1 + 2 على التوالي، انقر على أيقونة "رباعي" ورسم الأرباع بحيث يتم فصل مضان -negative و-positive السكان من السفليين الأرباع (غيتس LL3 لالثاني LR3، على التوالي).
- إنشاء جدول الإحصاءات أن يعرض شدة متوسط مضان (MFI) من الحنق لLL3 وبوابات LR3. ضبط المعلمة الحنق في مصفوفة التعويض حتى مؤسسات التمويل الأصغر للإشارة الحنق ما يعادل بين LL3 وLR3. وبعد هذه الخطوة، ومؤسسات التمويل الأصغر للإشارة الحنق تساوي بين الخلايا غير ملوثين والخلايا CFP إيجابية، مما يشير إلى غياب CFP امتداده إلى قناة الحنق.
- جعل YFP-A مباراة CFP-A مؤامرة ثنائية المتغيرات bivariate، وتطبيق بوابة P2، كما هو موضح في الخطوة 6.3. رسم الأرباع (LL4 وLR4) مماثلة لتلك التي فعلت في الخطوة 6.4.3.
- إنشاء جدول الإحصاءات أن يعرض مؤسسات التمويل الأصغر من YFP لLL4 وLR4. ضبط المعلمة YFP في مصفوفة التعويض حتى مؤسسات التمويل الأصغر للإشارة YFP ما يعادل بين LL4 وLR4. وبعد هذه الخطوة، ومؤسسات التمويل الأصغر من إشارة YFP تساوي بين الخلايا غير ملوثين والخلايا CFP إيجابية، مما يشير إلى غياب CFP امتداده إلى القناة YFP.
- الفلبسبب الإعداد بوابة والتعويض، وتسليط الضوء الآبار المصالح وتشغيل ما تبقى من لوحة.
- بعد أن تم تشغيل جميع العينات، وملفات البيانات التصدير عن طريق النقر على 'الملف'، ثم 'نسخة'. حدد علامة التبويب "ملفات البيانات"، تسليط الضوء على التجربة المجلد، ثم انقر 'نسخة'.
- ملفات FCS مفتوحة في التدفق الخلوي برنامج التحليل.
- على أساس الخصائص مبعثر، واستخدام بوابة مضلعة لتعريف السكان الخلية (SSC مقابل FSC) والسكان القميص (FSC-H مقابل FSC-A) من الخلايا المعالجة مع الجسيمات الشحمية فارغة، على غرار تلك التي وصفها في القسم 6.
- إذا تم إجراء تعويض CFP أثناء الإعداد، لا مزيد من ضبط CFP.
- إنشاء الحنق ضد YFP ذات المتغيرين المؤامرة. باستخدام خط الخلية رقم 3وتحديد بوابة الحنق كاذبة عن طريق رسم بوابة متعددة الأضلاع الذي يمتد على طول المنحدر من السكان خلية الحنق إيجابي. هذه البوابة تستثني YFP خلايا وحيدة إيجابية التي تنبعث منها إشارة داخل فلتر الحنق، وضعت مماثلة لتلك التي أظهرت في وقت سابق عن طريق حظر وآخرون 22
- تعريف بوابة الحنق بالتآمر خلايا فارغة المعالجة الحويصلية CFP / YFP على الحنق ضد CFP ذات المتغيرين المؤامرة. إدخال بوابة مضلعة على طول المنحدر من السكان التي تمتد إلى أعلى ونحو اليسار بعيدا عن السكان. هذه البوابة ينبغي أن تستبعد معظم الخلايا (~ 99٪)، مثل هذه الخلفية الحنق هو ≥1٪ من الخلايا. وتعتبر أي أحداث هذا التحول في هذه البوابة الحنق إيجابي.
ملاحظة: يتم تطبيق كل بوابة الفردية المذكورة أعلاه لجميع العينات قبل إنشاء بوابات لاحقة. بعد تحليل، يتم تعريف أربع بوابات الفردية (السكان الخليوي، القميص؛ الحنق كاذبة؛ الحنق). - المعلمات تحليل سجلات المصالح، بما في ذلك: في المئة الإيجابية الحنق ومؤسسات التمويل الأصغرمن الخلايا الحنق إيجابي. حساب يدويا كثافة الحنق متكاملة عن طريق قياس نتاج المئة الإيجابية ومؤسسات التمويل الأصغر.
ملاحظة: إذا تم استخدام كثافة الحنق المتكاملة كتدبير النتيجة، تعيين الحنق الخلفية (كما هو موضح في الخطوة 7.5) ومؤسسة التمويل الأصغر إلى أكبر من أو يساوي 1 من أجل تجنب حساب المنتج الذي هو أقل من العوامل الفردية اثنين.
3. خلايا Replating جهاز الاستشعار البيولوجي
ملاحظة:استخدام أربعة خطوط الخلايا لهذا الاختبار: كلوة 293T (خلية خط رقم 1)، RD-P301S-CFP (خلية خط 2 #)، RD-P301S-YFP (خلية خط # 3)، وRD-P301S-CFP / YFP ( خط الخلية رقم 4). الرجاء الرجوع الجدول رقم 1 لمساهمة كل سطر الخلية إلى الفحص.
4. خلايا علاج
ملاحظة: في اليوم التالي، عندما خلايا جهاز الاستشعار البيولوجي تاو هي 60-65٪ متموجة، وإعداد مجمعات تنبيغ البذور على النحو التالي:
5. الخلايا حصاد لالحنق التدفق الخلوي
الطبقة = "jove_content"> ملاحظة: قبل حصاد الخلايا عموما 24-48 ساعة بعد المعاملة فمن الممكن الحصول على قراءات أولية من النشاط البذر باستخدام فلتر GFP على مستوى مقلوب مضان المجهر. والخلايا المعالجة بدون مواد البذور (أي الجسيمات الشحمية فارغة) تظهر مضان منتشر، في حين أن الخلايا المعالجة بمادة البذور سوف تظهر منقط المكثف والادراج شبكي داخل الخلايا (الشكل 1A - B).
6. الحنق التدفق الخلوي
ملاحظة: استخدام قياس التدفق الخلوي مثل MACSQuant VYB، وهو مجهز الحنق متوافق مع خطوط الليزر ومجموعات فلتر (الجدول 2). لكل خطوة في هذا القسم، انقر فوق البئر ذات الاهتمام باستخدام قالب 96 جيدا البرمجيات، وانقر"مسرحية" لبدء امتصاص العينة والتدفق. جعل المؤامرات أو جداول الإحصاءات بالنقر على "تحليل نافذة جديدة" رمز. تغيير معالم محور على قطع ذات المتغيرين الفردية من خلال النقر على عنوان إما X أو Y محور واختيار المرشح المناسب. لتحويل السكان الخلية أو إشارات مضان، زيادة أو نقصان الفولتية المرتبطة الفلاتر المناسبة. مع هذه الأداة، تشغيل <1000 أحداث / ثانية لضمان دقة الرصد وحيدة الخلية.
تحليل 7. البيانات
ملاحظة: تغيير المعلمات محور على قطع ثنائية المتغيرات bivariate الفردية من خلال النقر على عنوان إما X أو Y محور واختيار المرشح المناسب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التدفق الخلوي الحنق تمكن الحساسة، الكمية، والكشف السريع عن النشاط البذر من عينات المؤتلف أو البيولوجية. إعداد الاختبار هو سطحي: يتم transduced خطوط الخلايا مستقرة وحيدة النسيلة مشتقة من التعبير عن تاو-RD-CFP / YFP مع المواد البذور، والمحتضنة لمدة 24-48 ساعة، وتعرض لتحليل التدفق الخلوي (الشكل 1A). في غياب البذور، وخلايا جهاز الاستشعار البيولوجي الحفاظ تاو في القابلة للذوبان، شكل أحادى (الشكل 1B). في ظل وجود البذور، ولكن خلايا جهاز الاستشعار البيولوجي تحويل تاو الى دولة المجمعة (الشكل 1C)، مما ينتج عنه استجابة الحنق التي تم الكشف عنها على أساس كل خلية مع التدفق الخلوي. ويظهر التقييم الكمي أن خلايا جهاز الاستشعار البيولوجي تستجيب لتركيزات femtomolar المواد البذور وهذا النشاط البذر يمكن قياسها بشكل فعال عبر ثلاث درجات (1D الشكل).
أنشئت المعلمات النابضة لضمان الكشف عن TRرق الحنق إشارة، حتى بتركيزات منخفضة البذور. أولا، واستخدام أساليب النابضة القياسية لعزل السكان الخلية (الشكل 2A) والخلايا واحد (الشكل 2B). كاذبة إشارة الحنق يمكن أن تنشأ من التنشيط المباشر للYFP بواسطة الليزر 405 نانومتر. وبالتالي، يتم رسم بوابة الحنق كاذبة من السكان خلية واحدة إيجابية YFP لاستبعاد تلويث إشارة (الشكل 2C). وأخيرا، يتم تعريف بوابة الحنق من الخلايا غير المصنف CFP / YFP المزدوجة الموجب (الشكل 2D). ويوجه بوابة بالقرب من منحدر من السكان التي تمتد إلى أعلى واليساري بعيدا عن ذلك. يجب أن يكون خلايا Unstimulated خلفية الحنق قيمة لتعيين ما يقرب من 1٪، والخلايا الحنق إيجابي سيتحول إلى هذه البوابة بطريقة تعتمد على الجرعة (قارن الشكل 2E و2F). تؤخذ معلمات متعددة في الاعتبار مع الحنق التدفق الخلوي، بما في ذلك: في المئة إيجابية (أي عدد الخلايا الحنق إيجابية في عدد خلايا الكلي) وكثافة مضان متوسط (أي الدرجة التي تنتج استجابة الحنق في خلية الحنق إيجابي). كثافة الحنق المتكامل هو قياس النتيجة المفضل، لأنه هو نتاج هذين المتغيرين ويمثل درجة من النشاط البذر الناجمة عن أي عينة معينة بالكامل.
تدفق الحنق الخلوي متوافق مع P301S tauopathy لست] الدماغ المستمدة من الماوس، حتى في سن مبكرة، كما هو معروض في الشكل (3). وبعد تسليخ مجهري من أربع مناطق الدماغ المختلفة، الحنق التدفق الخلوي كانت تستخدم لقياس النشاط البذر من جذع الدماغ (الشكل 3A)، القشرة المخية الحديثة (الشكل 3B)، الفص الجبهي (الشكل 3C)، وقرن آمون (الشكل 3D) في الفئران P301S على مجموعة من الأعمار. في كل منطقة، وزيادة النشاط منبذرة مع التقدم في السن ويبدو في أشهر فقط 1.5. ومع ذلك، الفئران تاو خروج المغلوب ("KO")> 12 موس أبدا عرض النشاط البذر. مقارنة حistological التحليلات التي تتم داخل الحيوانات نفسها، وهذا هو ستة أسابيع في وقت أقرب مما ظهور أي علامة أخرى من ترسب تاو (الشكل 3E)، بما في ذلك علامات تاو conformationally-الشاذة (MC1)، تاو hyperphosphorylated (AT8 وPG5)، واميلويد التشكل (ThioflavinS). من وجهة نظر الآلية، والكشف القريب من تاو النشاط بذر بذور تشير كوسيط السببية من بداية tauopathy و / أو التقدم. من وجهة نظر التجريبية، وهذا يشير إلى أن تحليل النشاط البذر قد يكون تكملة مثالية لمقاييس النتائج القياسية ترسب تاو، نظرا مظهره المبكر والقوي.
بالإضافة إلى الفئران المعدلة وراثيا، الحنق التدفق الخلوي متوافق مع لست] الدماغ ويمكن الكشف بسهولة المجاميع تاو معزولة عن المواضيع مرض الزهايمر (الشكل 4). عند المتجانس الأنسجة المجمدة الدماغ البشري بنفس الطريقة كما هو موضح هنا لللست] الدماغ P301S وزرع البذور النشاطتم الكشف بقوة من جميع العينات المستمدة من مواضيع م. في المقابل، هو النشاط البذر الكشف أبدا من لست] من الموضوعات مكافحة الأمراض نفس العمر أو هنتنغتون. وهذا يؤكد خصوصية مقايسة بالنسبة للمجاميع تاو.
في حين أن التركيز في هذه المقالة هو الكشف عن حساسية تاو النشاط البذر باستخدام التسليم بوساطة الحويصلية الركام إلى خلايا كلوة 293T جهاز الاستشعار البيولوجي، وأكثر النماذج الفسيولوجية زراعة الخلايا ويمكن أيضا أن يؤديها مع الحنق التدفق الخلوي لتقييم آليات امتصاص الخلوية الأساسية. على سبيل المثال، الثقافات العصبية الأولية يمكن أن تصاب مع الفيروسة البطيئة معربا عن تاو-RD-CFP وتاو-RD-YFP يبني في وقت من الطلاء. في DIV4، تجميع غائب في الخلايا غير المعالجة (الشكل 5A)، ولكن يمكن كشفها في الخلايا العصبية تعامل مع المواد التي تحتوي على البذور (الشكل 5B). الأهم من ذلك، يتم استبعاد الدهون الفوسفاتية في هذه التجارب، والسماح التحقيق في الفسيولوجية وبات آليات البذر hophysiological. وهكذا، وتطبيق الألياف تاو يؤدي إلى العصبية امتصاص بوساطة HSPG ويحفز التجميع بطريقة تعتمد على الجرعة التي يمكن قياسها كميا مع تدفق الحنق الخلوي (الشكل 5C). بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الفحص لتقييم العلاجي لامتصاص تاو وبذر الحصار في المختبر باستخدام خلايا كلوة 293T تاو جهاز الاستشعار البيولوجي. حتى في حالة عدم وجود الدهون الفوسفاتية، سواء الألياف المؤتلف (الشكل 5D) وP301S لست] الدماغ (الشكل 5E) لحث تاو التجميع. ما قبل الحضانة لهذه البذور تاو مع الهيبارين (كما هو موضح سابقا أن يكون المانع من امكانات HSPG بوساطة امتصاص تاو)، ومع ذلك، يلغي قدرة البذر بهم. ويمكن تطبيق هذا الإعداد التجريبية إلى أي نوع من المخدرات (على سبيل المثال، والأجسام المضادة، جزيئات صغيرة، الخ) وسيمكن تقييم سريع الامتصاص و / أو العلاجات المعدلة للبذور.
جوري 1 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 53205 / 53205fig1.jpg "/>
الشكل 1. التدفق الخلوي الحنق بحساسية بالكشف تاو النشاط البذر 16. تم transduced الخلايا 293T حيدة النسيلة HEK معربا تاو-RD-CFP / YFP مع عينات المؤتلف أو البيولوجية، المحتضنة لمدة 24-48 ساعة، وتحليلها على أساس وحيد الخلية باستخدام التدفق الخلوي (A). خلايا Unstimulated الحفاظ تاو-RD في حالة أحادى (B)، في حين أن الخلايا المعالجة مع عرض المواد الادراج البارزة التي تحتوي على البذور (C). التقييم الكمي (يعني ± SEM) من البرامج النشاط البذر أن الحنق التدفق الخلوي غير حساسة لتركيزات femtomolar (مونومر ما يعادلها) من المواد المصنفة المؤتلف وكشف يمتد ثلاث درجات (D). أي ما يعادل مونومر يمثل المبلغ الإجمالي من البروتين الواردة في رد فعل fibrillization ولا يصحح لغير مكتملة و# 160؛ إدماج مونومر في المواد المجمعة. وبالتالي، يجب أن يكون تركيز المجاميع الفعلية (بذور) أقل من أو يساوي لها "أي ما يعادل مونومر". * التعديل من هولمز وفرمان وآخرون 16 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يتم رسمها الشكل 2. استراتيجية المحاصرة لالحنق التدفق الخلوي. السكان الخلية (A) والقميص / صدرة (B) بوابات مع تدفق قياسي الخلوي المنهجية. ويوجه بوابة الحنق كاذبة (C) من YFP خلايا وحيدة إيجابية للقضاء على YFP bleedthrough في التصفية الحنق. هي التي شيدت بوابة الحنق (D) من الخلايا المعالجة الحويصلية فارغة، مثلأن الحنق الخلفية ≥1٪. تحول السكان إلى البوابة الحنق يظهر بعد العلاج مع مواد ذات البذور الإيجابي (E) والتحول يصبح بارزة على نحو متزايد مع كميات أكبر من المواد المصنفة (F). وتشمل قراءات النهائية: في المئة الحنق الإيجابية، متوسط كثافة مضان (MFI) من الأحداث الحنق إيجابية، وكثافة الحنق المتكاملة (خلايا إيجابية الحنق المتكاملة الكثافة = النسبة المئوية * MFI) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. التقدم من تاو النشاط البذر في الفئران P301S 16. النشاط بذر (يعني ± SEM) من الخليط دماغ الفئران P301S هو واضح في 1.5 شهر في الدماغ (A)، القشرة المخية الحديثة (B)، الفص الجبهي (C)، وقرن آمون (D). ومع ذلك، لوحظ نشاط البذر أبدا في الفئران تاو خروج المغلوب (> 12 شهرا). النشاط بذر يزيد مع التقدم في السن وتسبق ظهور علامات النسيجية المشتركة الأخرى، بما في ذلك MC1، AT8، وPG5 (E). * أعيد طبعها بإذن من هولمز وفرمان وآخرون 16 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. التوافق من الحنق قياس التدفق الخلوي مع عينات بيولوجية الإنسان 16. عندما يتم transduced خلايا جهاز الاستشعار البيولوجي تاو-RD-CFP / YFP مع 20 ميكروغرام المحللة الدماغ البشري، بذر قوية (يعني ± SEM) ويحدث في كل اختبار disea الزهايمرأدمغة حد ذاته، في حين لست] مكافحة الأمراض نفس العمر وهنتنغتون تفتقر إلى النشاط البذر. * التعديل من هولمز وفرمان وآخرون 16 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. التطبيقات البديلة للالحنق التدفق الخلوي 16. الخلايا العصبية الابتدائية transduced مع ترميز الفيروسة البطيئة تاو-CFP وتاو-YFP يبني. في حالة عدم وجود بذور الخارجية لا يوجد تجميع واضح (A)، ولكن هناك في وجود البذور (B). أجهزة الاستشعار العصبية تستجيب الجرعة بشكل تابع للبذور تاو المؤتلف، حتى في غياب تسليم بوساطة فسفوليبيد (C). ما قبل الحضانة لالمؤتلف (D) أو ثنائية(E) مصادر البذور استثارة مع الهيبارين، مثبط لHSPG بوساطة امتصاص البذور تاو، يستنزف الحنق استجابة خلايا جهاز الاستشعار البيولوجي HEK 293T. يعرض التقييم الكمي (يعني ± SEM). * التعديل من هولمز وفرمان وآخرون 16 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: خطوط الخلايا المستخدمة مع الحنق التدفق الخلوي. وتستخدم خلايا كلوة 293T لالتدفق الخلوي الإعداد. تستخدم الخلايا CFP احدة إيجابية للتعويض (*). وتستخدم الخلايا YFP احد إيجابية للقضاء على كاذبة إشارة الحنق بسبب التنشيط المباشر للYFP التي كتبها 405 نانومتر الإثارة. خلايا مزدوجة إيجابية CFP / YFP هي الحنق المتوافقة مع وبمثابةخلايا جهاز الاستشعار البيولوجي. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الجدول.
الجدول 2: تدفق الكريات إعدادات الليزر وتصفية الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الحنق التدفق الخلوي النظام المذكور هنا هو أداة قوية لبسرعة وكميا تقييم النشاط تاو البذر. لا يتطلب سوى المعتدلة تجربة زراعة الخلايا ومعرفة عمل من الحنق والتدفق الخلوي. المقايسات البذر الأخرى، مثل Thioflavin T - الذي يسلك تعزيز مضان عندما يتجهون إلى هيكل رقة بيتا - هي شاقة وتتطلب نقية، البروتين المؤتلف الركيزة. بالإضافة إلى ذلك، فحوصات في المختبر لبذر تاو ليست سوى نصف الكمية ويتأثر عموما إلى مستويات subnanomolar المواد البذور 23،24. الحنق التدفق الخلوي، ومع ذلك، يوفر مقياس كمي وحساسة بشكل رائع من النشاط البذر من العينات إما المؤتلف أو البيولوجية. وعلاوة على ذلك، يمكن لعمليات التكييف إلى إجراء جعلها مفيدة لدراسة مجموعة متنوعة من الاضطرابات البروتين التجميع.
في حين أن بروتوكول الموصوفة هنا يركز على تاو البذر، والمطلوب فقط تعديلات بسيطة رس تمكين المستخدم من مراقبة النشاط منبذرة من أنواع بديلة من بذور proteopathic. كما هو موضح في هولمز وفرمان وآخرون، وإنشاء خط خلية وحيدة النسيلة يعبرون عن ثابت ألفا-synuclein إيواء طفرة A53T الأمراض المرتبطة الموسومة إما CFP أو YFP تمكين الكشف عن حساسية النشاط البذر من طول كامل α synuclein الألياف المؤتلف 16 . وقد أجريت تجارب مماثلة باستخدام خلايا جهاز الاستشعار البيولوجي Huntingtin، والتي أيضا الكشف عن فعالية بروتين التجميع. وهكذا، بمجرد تعديل جهاز الاستشعار البيولوجي البروتين، والحنق التدفق الخلوي متوافق مع مصادر البذور عديدة. تعديلات أخرى إلى الفحص، بما في ذلك نموذج العلاج ونموذج خلية، يمكن أن تستخدم لجعل الحنق التدفق الخلوي أكثر قابلية للتطبيق في تقييم الآليات الفسيولوجية. في هذا البروتوكول، وأدخلت البذور مباشرة إلى خلايا جهاز الاستشعار البيولوجي عبر بوساطة الحويصلية تنبيغ كوسيلة لزيادة الحساسية.
من المهم أن نالمؤسسة التجارية العمانية، مع ذلك، أن هذا ليس شرطا. تاو المجاميع من العينات البيولوجية المؤتلف أو الماوس لا تزال قادرة على بذر خلايا جهاز الاستشعار البيولوجي في غياب الجسيمات الشحمية (الشكل 5). وهكذا، ومختبرات المهتمين بدراسة انتشار الفسيولوجية و / أو آليات امتصاص البذور تاو قد لا تزال تستخدم الفحص. بالإضافة إلى ذلك، الحنق التدفق الخلوي متوافق مع الثقافات العصبية الأولية. عن طريق إصابة الخلايا مع CFP- ويبني lentiviral YFP ترميز في وقت والطلاء، ويتم تحقيق الاستجابة الحنق كفاءة بتركيزات nanomolar بعد العلاج مع الألياف تاو المؤتلف، حتى في حالة عدم وجود الجسيمات الشحمية (الشكل 5). معا، وهذه البيانات تشير إلى أن التدفق الخلوي الحنق هو مفيد لدراسة الآليات الفسيولوجية للالبذر لمجموعة متنوعة من المجاميع البروتين وعدة نماذج ثقافة الخلية.
في حين أن الحنق التدفق الخلوي النظام هو سهل الاستعمال وقابلة للتكيف، وينبغي أن يكون بعض الخطوات الرئيسيةاتباعها لضمان التوافق، بما في ذلك إعداد العينات والخلية confluency الصحيح في وقت من العلاج. عالية الكثافة التحقيق صوتنة العينات الدماغ أمر بالغ الأهمية لعزل الفعالة والمثلى من النشاط البذر. خلال تطوير والتحسين، لوحظ أن أن هذا الأسلوب هو أكثر من 10 مرات أكثر فعالية في عزل النشاط البذر من أدمغة فئران P301S النسبية لتقنيات المشتركة الأخرى، على سبيل المثال التجانس يده. فمن الممكن أن المجاميع تاو كبيرة جدا لديها البذر الميل منخفضة نسبيا، وأن التحقيق صوتنة هو الأكثر فعالية لكسر هذه المجاميع إلى، شظايا أصغر البذور متوافق. مدة وتواتر صوتنة يجوز تعديل إذا لزم الأمر، على الرغم من أن الإعدادات الموضحة أعلاه الموصى بها للكشف حساسة من النشاط البذر.
الخلية confluency في وقت العلاج هو أيضا في غاية الأهمية، لأنها تؤثر على كل من حساسية والصحة الخلية. إذا خلاياإعادة متكدسة جدا، فإنها لا تأخذ بسهولة حتى الفوسفاتية والمواد البذور، مما يقلل بشكل كبير من الحساسية. إذا confluency منخفض جدا، يمكن إضافة الدهون الفوسفاتية والمواد البذور تكون سامة. اختبار تجريبي يظهر أن confluency جهاز الاستشعار البيولوجي من 60-65٪ هو الأمثل لتلقي العلاج والاستجابة لاحقة.
كما لوحظ في البروتوكول، وتستخدم خوارزميات التعويض بانتظام لاستبعاد CFP امتداده إلى YFP الحنق والقنوات، وبالتالي القضاء على إشارات خاطئة وزيادة الحساسية. لتقييم أسرع والنوعي للنشاط البذر، ولكن هذه الخطوة قد تكون أغفلت أو إجراء آخر مخصص باستخدام التدفق الخلوي برامج التحليل. يتم الحصول على إشارة أنظف وأكثر قوة يلي التعويض، ومع ذلك، وبالتالي لتحليل أكثر صرامة والكمي ينصح بشدة هذه الخطوة.
وجود قيود على الفحص هو عدم قدرتها على تقديم تقرير عن الكيمياء الحيوية تكوينبذور proteopathic. النشاط البذر الحالي تدابير الفحص، خاصية وظيفية من البذور. وتحديد طبيعة البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية من بذور يتطلب اقتران المقايسات التقليدية مثل مناعي، اللوني، ازدواج اللون دائرية، مطياف الكتلة، الخ ومع ذلك، فإن هذا الاختبار يكون مفيدا في تقييم البذر رجولية باعتبارها نقطة النهاية من العينات لا تعد ولا تحصى.
وقد استخدم هذا الاختبار في الآونة الأخيرة لتحديد وتوصيف timecourse من بذر تطور وتقدم في الفئران P301S قريبة علامات مشتركة أخرى من ترسب تاو، مثل البقع النسيجية. في هذه الدراسة، كان النشاط تاو البذر واضح على مدى ستة أسابيع قبل أقرب علامة النسيجية (MC1) التي اختبرناها 16. نظرا ظهور في وقت مبكر، بذر النشاط قد تمثل مكملا هاما، أو حتى بديلا، قياس النتيجة لتقييم فعالية التدخلات العلاجية، على الأقل في الدراسات الأولية.بتقصير دورة العلاج ودراسة الأصغر سنا حيوانات، وتكاليف السكن والتجريبية الفترة الزمنية سوف تنخفض. فمن المتصور أن العلاجات يمكن أن تدار على الفئران P301S في 4-6 أسابيع والعقول تقييمها للنشاط البذر في وقت لاحق 2-4 أسابيع. بدلا من ذلك، وتقييم العلاجات المضادة للتاو في الخلايا يمكن أن يؤديها خلال أيام من خلال تقييم قدرتها على منع تحريض النشاط البذر في خلايا جهاز الاستشعار البيولوجي، كما هو موضح في الشكل (5).
في الختام، تدفق الحنق الخلوي البذر الفحص هو وسيلة سهلة وفعالة للكشف عن تاو البذر من مصادر المؤتلف أو البيولوجية. حساسيتها لا مثيل له من قبل البعض في المختبر تاو المقايسات البذر، وأنه يمكن استخدامها للكشف عن أقرب التغيير المرضية في الفئران tauopathy P301S. وعلاوة على ذلك، والمرونة في رصد العديد من البذور proteopathic في ظل ظروف مختلفة العلاج، ومع عدة نماذج ثقافة الخلية، يجعلها مفيدة لأي مختبر البروتين تجميع المهتمين في جمع البيانات الكمية بسرعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TBS | Sigma | T5912 | |
| cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free) | Roche | 4693159001 | |
| Cryo-vials | Sarstedt | 72.694.006 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 105DU | |
| Weighing Boats | Fisher Scientific | 13-735-743 | |
| 15 ml conical tube | USA Scientific | 1475-0501 | |
| Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer | Omni International | 18-000-115 | |
| Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer | Omni International | OR-T-156 | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A451 | |
| Noise Cancelling Ear Muffs | Fisher Scientific | 19-145-412 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | S47299 | |
| 1.5 ml tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 000.215 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 50 ml Conical Tubes | Phenix Research | SS-PH15 | |
| 25 ml reagent resevoirs | VWR | 41428-954 | |
| Multi channel pipet | Fisher Scientific | TI13-690-049 | |
| 96 well flat bottom plates | Corning | 3603 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3788 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |
| Sorvall ST 40 Centrifuge | Thermo Scientific | 75004509 | |
| BIOLiner Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003796 | |
| Hemacytometer | VWR | 15170-172 | |
| MACSQuant VYB Flow Cytomter | Miltenyi Biotec | 130-096-116 | |
| Chill 96 Rack | Miltenyi Biotec | 130-094-459 | |
| Flow Jo analysis software | Flow Jo | ||
| 20 μl pipet tips | Rainin | GPS-L10 | |
| 200 μl pipet tips | Rainin | GPS-250 | |
| 1 ml pipet tips | Rainin | GPS-1000 | |
| 200 μl pipet tips | USA Scientific | 1111-1800 | |
| 5 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-606180 | |
| 10 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-607180 | |
| 25 ml Serological pipett | Phenix Research | SPG-760180 |
References
- Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks. Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).
- Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. Predicting Regional Neurodegeneration from the Healthy Brain Functional Connectome. Neuron. 73 (6), 1216-1227 (2012).
- Raj, A., Kuceyeski, A., Weiner, M. A Network Diffusion Model of Disease Progression in Dementia. Neuron. 73 (6), 1204-1215 (2012).
- Braak, H., Braak, E.
- Braak, H., Braak, E. Staging of Alzheimer's disease-related neurofibrillary changes. Neurobiol Aging. 16 (3), 271-278 (1995).
- Frost, B., Diamond, M. I.
- Holmes, B. B., Diamond, M. I.
- Kaufman, S. K., Diamond, M. I. Prion-like propagation of protein aggregation and related therapeutic strategies. Neurotherapeutics. 10 (3), 371-382 (2013).
- Holmes, B. B., Diamond, M. I. Prion-like properties of Tau protein: the importance of extracellular Tau as a therapeutic target. J Biol Chem. 289 (29), 19855-19861 (2014).
- Guo, J. L., Lee, V. M. Cell-to-cell transmission of pathogenic proteins in neurodegenerative diseases. Nat Med. 20 (2), 130-138 (2014).
- Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
- Guo, J. L., Lee, V. M. Y. Seeding of normal tau by pathological tau conformers drives pathogenesis of Alzheimer-like tangles. Journal of Biological Chemistry. , (2011).
- Holmes, B. B., et al. Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), E3138-E3147 (2013).
- de Calignon, A., et al. Propagation of Tau Pathology in a Model of Early Alzheimer's Disease. Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).
- Liu, L., et al. Trans-Synaptic Spread of Tau Pathology In Vivo. PLoS One. 7 (2), e31302 (2012).
- Holmes, B. B., et al. Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), E4376-E4385 Forthcoming.
- Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65 (65), (2012).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. J Vis Exp. (33), (2009).
- Yan, Z. X., Stitz, L., Heeg, P., Pfaff, E., Roth, K. Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies. Infect Control Hosp Epidemiol. 25 (4), 280-283 (2004).
- McDonnell, G., et al. Cleaning, disinfection and sterilization of surface prion contamination. J Hosp Infect. 85 (4), 268-273 (2013).
- Banning, C., et al. A flow cytometry-based FRET assay to identify and analyse protein-protein interactions in living cells. PLoS One. 5 (2), e9344 (2010).
- Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein. Biochemistry. , (2013).
- Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein. J Vis Exp. (95), e51537 (2015).
