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Bioengineering

झल्लाहट फ्लो के साथ Proteopathic सीडिंग गतिविधि के संवेदनशील पता लगाने

Published: December 8, 2015 doi: 10.3791/53205
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Center for Alzheimer's and Neurodegenerative Diseases, University of Texas Southwestern Medical Center
* These authors contributed equally

Introduction

इंट्रासेल्युलर ताऊ amyloids का संचय अल्जाइमर रोग के रूप में tauopathies परिभाषित करता है। जल्दी रोग के चरणों में, पैथोलॉजी आम तौर पर मस्तिष्क की असतत क्षेत्रों के लिए स्थानीय है, लेकिन रोग प्रगति के साथ, पैथोलॉजी निरपवाद रूप से अलग तंत्रिका नेटवर्क 1-5 के साथ फैलता है। जमते सबूत जहरीले प्रोटीन समुच्चय के transcellular प्रचार (6-10 में समीक्षा) इस विकृति के पीछे भी यही पता चलता है। इस मॉडल में, proteopathic बीज (जैसे, ताऊ) दाता कोशिकाओं से जारी कर रहे हैं और templated गठनात्मक परिवर्तन 11-15 के माध्यम से misfolded रूप में देशी ताऊ प्रोटीन बदलने, कोशिकाओं पड़ोसी दर्ज करें। यहाँ वर्णित परख संवेदनशीलता ऐसे बोने गतिविधि का पता लगाने के लिए विकसित किया गया था। यह पुनः संयोजक प्रोटीन और जैविक नमूनों के साथ संगत है और proteopathic बोने गतिविधि 16 मिनट के स्तर की मात्रा का ठहराव सक्षम बनाता है।

स्थिरतापूर्वक ताऊ दोहराने घ कि एक्सप्रेस HEK 293T कोशिकाओंसीएफपी या YFP या तो के लिए जुड़े हुए रोग से जुड़े P301S उत्परिवर्तन युक्त omain (आरडी) बोने गतिविधि का एक स्थिर biosensor के रूप में सेवा कर (इसके बाद ताऊ-आरडी सीएफपी / YFP कोशिकाओं के रूप में करने के लिए कहा गया है)। Proteopathic बीज के अभाव में, कोशिकाओं को एक घुलनशील मोनोमर के रूप में ताऊ बनाए रखने, और कोई सराहनीय पृष्ठभूमि झल्लाहट है। कोशिकाओं में उठना, तेज या ताऊ बीज की liposome की मध्यस्थता पारगमन, हालांकि, प्रवाह cytometry के माध्यम से एकल कक्षों के भीतर मापा जाता है कि एक संकेत झल्लाहट पैदा करता है जो आरडी सीएफपी और आरडी-YFP एकत्रीकरण, में परिणाम है।

इस परख के कई घटकों के प्रति संवेदनशीलता बढ़ाने और परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए इंजीनियर थे। एक 1 के साथ एक मोनोक्लोनल सेल लाइन: यह इष्टतम संकेत देता है के रूप में एक आरडी सीएफपी / YFP अभिव्यक्ति अनुपात, चयनित किया गया था: शोर। संवेदनशीलता बढ़ाने के लिए, फॉस्फोलिपिड सीधे कोशिकाओं में बीज को पेश करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं (तेज की जैविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए हालांकि, इस छोड़ा जा सकता है)। अंत में, एक जनसंख्या के स्तर पर और एक एकल कोशिका पर नज़र रखता है झल्लाहट प्रवाह cytometry स्तर, अन्य प्रोटीन एकत्रीकरण assays के विपरीत है। अंतिम परिणाम उपाय, एकीकृत झल्लाहट घनत्व, अत्यधिक मात्रात्मक और एकत्रीकरण के साथ कोशिकाओं की संख्या, और एकत्रीकरण प्रत्येक कोशिका के भीतर हुई है, जो करने के लिए डिग्री के लिए दोनों खातों। इन अनुकूलित मापदंडों के सभी संवेदनशीलता बढ़ाने और reproducibility किया जाता है।

इस प्रणाली को हाल ही में अन्य आमतौर पर इस्तेमाल ताऊ रोग मार्करों के लिए अस्थायी शुरुआत और ताऊ बोने गतिविधि रिश्तेदार की प्रगति (जैसे, MC1, AT8, PG5, और ThioflavinS) का मूल्यांकन किया है कि ट्रांसजेनिक P301S tauopathy चूहों 17 में एक व्यापक अध्ययन में कार्यरत था। सीडिंग गतिविधि के द्वारा अब तक कम से कम 6 सप्ताह से ऊतकीय का पता लगाने से ठीक पहले का मूल्यांकन ताऊ विकृति की जल्द से जल्द और सबसे मजबूत मार्कर है। सीडिंग गतिविधि शुरू होने और / या neurodegeneration 16 की प्रगति में proteopathic बीज का एक कारण भूमिका, सुझाव 1.5 महीने और उत्तरोत्तर उम्र के साथ बढ़ जाती है पर दिखाई देता है।

e_content "> जैविक नमूने से बीज सामग्री के मिनट के स्तर के सटीक quantitation। जल्दी रोग प्रगति पर नजर रखने कि अध्ययन की सुविधा कर सकते हैं परीक्षण अवधि को छोटा और छोटे जानवरों के उपयोग को सक्षम करने से, यह प्रीक्लीनिकल पशु परीक्षणों की क्षमता और सटीकता बढ़ सकते हैं। उदाहरण के लिए, में P301S माउस पहले वर्णित, नेतृत्व यौगिकों जल्दी 4-6 सप्ताह के रूप में के रूप में दिया जा सकता है, और 2-4 हफ्ते बाद प्रभावकारिता के लिए नजर रखी। परख सही बोने में कोई कटौती यों चाहिए (या बोने गतिविधि की शुरुआत में करने के तुरंत पहले) गतिविधि। cytometry इन विट्रो स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के रूप में अच्छी तरह से। उदाहरण के लिए, विरोधी ताऊ अभिकर्मकों (जैसे, एंटीबॉडी, छोटे अणुओं, आदि) या तो पुनः संयोजक ताऊ का उपयोग कर, संस्कृति में सीधे प्रेरण बोने ब्लॉक करने के लिए उनकी क्षमता के लिए तेजी से परीक्षण किया जा सकता है प्रवाह झल्लाहट एक बीज स्रोत (चित्रा 5)। इस सेटअप के साथ, बीज सामग्री तैयार किया जाता है, एक बार एक पूर्व के रूप में समुच्चय या मस्तिष्क व्युत्पन्न lysatesperiment डेटा विश्लेषण सहित पूरा करने के लिए सिर्फ तीन दिन लगते हैं। proteopathic बोने गतिविधि के तेजी से quantitation के इस प्रकार neurodegeneration के कई अध्ययन की सुविधा कर सकते हैं।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल झल्लाहट का उपयोग माउस जैविक नमूने से बोने गतिविधि का पता लगाने के लिए प्रवाह cytometry पर जोर दिया। यह भी पुनः संयोजक तंतु और मानव जैविक नमूनों के साथ संगत है। माउस इच्छामृत्यु और मस्तिष्क कटाई IACUC-अनुमोदित प्रक्रियाओं के अनुसार में प्रदर्शन किया गया था।

1. ब्रेन निष्कर्षण

  1. Isoflurane (2%) के साथ गहरी anesthetization बाद, ठंडा पीबीएस 0.03% हेपरिन युक्त के साथ एक माउस छिड़कना, और ललकार एट अल में वर्णित विवरण निम्नलिखित मस्तिष्क निकाल सकते हैं। 18
  2. एक क्रायो शीशी में निकाले ऊतक प्लेस, और तरल नाइट्रोजन में रखकर फ्रीज तस्वीर। वैकल्पिक रूप से, सूखी बर्फ पर ऊतक फ्रीज। एक बार यदि आवश्यक हो, समय की एक विस्तारित अवधि के लिए -80 डिग्री सेल्सियस और स्टोर करने के लिए ऊतक हस्तांतरण, जमे हुए।
    नोट: इस प्रोटोकॉल पूरे दिमाग homogenates या सूक्ष्म विच्छेदित मस्तिष्क क्षेत्रों के साथ संगत है। Hagihara एट अल देखें। एक विस्तृत माइक्रो विच्छेदन प्रोटोकॉल 19 के लिए।
    3. जैविक बीज सामग्री के 2. तैयारी

    1. 1x टीबीएस (10 मिलीलीटर प्रति एक गोली) में प्रोटीज अवरोधकों (मुक्त EDTA) भंग द्वारा homogenization बफर तैयार करें। बर्फ पर सख्ती भंवर, और दुकान। प्रोटीज इनहिबिटर्स biosensor सेल व्यवहार्यता की रक्षा करने के लिए EDTA मुक्त होना चाहिए।
    2. एक डिस्पोजेबल तौलना नाव में जमे हुए मस्तिष्क के ऊतकों वजन, और एक 5 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण। अंतिम समाधान 10% वजन / मात्रा है कि इस तरह ठंडा homogenization बफर जोड़ें। अस्थायी रूप से बर्फ पर दुकान। ऊतक जन और बाद homogenization बफर मात्रा में प्रयोग किया जाता मस्तिष्क के आकार और / या क्षेत्रों के आधार पर अलग अलग होंगे। इधर, 0.2 ग्राम वजन एक वयस्क माउस hemibrain एक 10% डब्ल्यू / खंड के समाधान के लिए 2 मिलीलीटर में निलंबित कर दिया है।
    3. स्थानांतरण एक ठंडे कमरे में नमूने, और उचित सेटिंग्स करने के लिए एक जांच sonicator समायोजित। (यहाँ दिखाया गया है) एक ओमनी Ruptor साथ जांच sonication के लिए, नमूने ov नहीं कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए लगभग 75 डब्ल्यू का प्रयोग करें एक पल्स मोड से मेल खाती है, जो 20% करने के लिए सत्ता स्थापितsonication के दौरान एर-गरम किया जाता है। लगभग 500 मिसे के लिए इसी 30% तक pulser सेट करें।
    4. फिर से पानी, isopropanol, और पानी के साथ rinsing प्रत्येक समाधान के बीच में जांच बंद पोंछते द्वारा जांच sonicator की नोक साफ करें। कुल्ला और पक्षों और प्रयोगशाला-पोंछे के साथ जांच के नीचे दोनों सफाया करने के लिए कुछ खास होगा।
    5. एक समय में एक नमूने के साथ काम करते हुए, homogenization बफर में जांच टिप डूब, और sonicator शुरू करते हैं। ऊपर वर्णित शक्ति और pulser सेटिंग्स का उपयोग करना, 25 कुल दालों देने। ऊतक कि निलंबन में पूरी तरह से सुनिश्चित करें। इस कदम के दौरान नमूने के झाग से बचने के लिए सावधान रहें।
      नोट: क) कुल मात्रा कम है, या ख) homogenate के लिए चला जाता है, तो नमूने झाग के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। इस विशिष्ट साधन के साथ, 250 μl की तुलना में कम मात्रा के साथ sonicate नहीं है। नमूने ठंडा रहने को सुनिश्चित करने, ट्यूब इस कदम के दौरान बर्फ पर संग्रहित किया जा सकता है।
    6. अवशिष्ट lysate दूर पोंछते द्वारा जांच को साफ है, तो एक बीकर ओ में 10 दालों देनेच साफ पानी। प्रत्येक चरण के बीच में सूखे पोंछते (2.4 कदम के रूप में) पक्षों और फिर पानी, isopropanol, और पानी के साथ जांच के नीचे कुल्ला। संक्रमण से बचने के लिए, अच्छी तरह से नमूनों के बीच में जांच कुल्ला।
      नोट: ताऊ समुच्चय के साथ, हम और अधिक कड़े सफाई तरीकों नमूना नमूना प्रदूषण को रोकने के लिए आवश्यक हैं कि नहीं मिला है। अन्य amyloids, हालांकि, बड़े पैमाने पर साहित्य 20,21 में वर्णित किया गया है, जो अतिरिक्त देखभाल की आवश्यकता हो सकती है।
    7. सभी नमूनों को संसाधित किया गया है जब तक स्टोर बर्फ पर homogenates।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 21,300 XG पर homogenates स्पिन।
    9. गोली परेशान नहीं, देखभाल करने के लिए एक साफ ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला। गोली त्यागें। आगे उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर सतह पर तैरनेवाला, और दुकान lysates विभाज्य। इस बोने क्षमता कम कर देता है, तथापि, homogenates के / फ्रीज पिघलना चक्र से बचें।

    3. replating Biosensor प्रकोष्ठों

    ध्यान दें:इस परख के लिए चार सेल लाइनों का उपयोग करें: HEK 293T (सेल लाइन # 1), आरडी-P301S-सीएफपी (सेल लाइन # 2), आरडी-P301S-YFP (3 सेल लाइन #), और आरडी-P301S-सीएफपी / YFP ( सेल लाइन # 4)। परख करने के लिए प्रत्येक कोशिका लाइन के योगदान के लिए 1 टेबल देखें।

    1. एक बाँझ वातावरण में, महाप्राण संस्कृति के माध्यम से। गर्म पीबीएस और महाप्राण के साथ कोशिकाओं कुल्ला। कोशिकाओं Trypsinize 3 मिनट के लिए (trypsin EDTA (0.05%) के 3 एमएल), गर्म संस्कृति मध्यम (DMEM के 9 मिलीलीटर, 10% FBS, 1% कलम / स्ट्रेप, 1% GlutaMAX) के साथ बुझाना, और तुरंत एक कोशिकाओं हस्तांतरण शंक्वाकार ट्यूब।
    2. आरटी पर 5 मिनट के लिए 1000 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। महाप्राण माध्यम है, और गर्म संस्कृति के माध्यम में resuspend सेल गोली।
    3. एक hemocytometer का उपयोग करना, प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए सेल घनत्व निर्धारित करते हैं। सेल घनत्व कटाई और मेजबान मात्रा के समय में confluency के आधार पर अलग अलग होंगे। सेल घनत्व के लिए, 10 मिलीलीटर मीडिया में 90% confluency पर एक 10 सेमी पकवान से काटा Resuspend कोशिकाओं लगभग 1 मिलियन कोशिकाओं / एमएल हो।
    4. बनानाकोशिकाओं के एक मास्टर मिश्रण + मीडिया में इस तरह के एक 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से 130 μl मीडिया में 35,000 कोशिकाओं में शामिल होंगे कि (100 कुओं के लिए एक मास्टर मिश्रण बनाने के लिए, उदाहरण के लिए, 13 मिलीलीटर मीडिया में 3.5 मिलियन कोशिकाओं resuspend)। व्यक्तिगत प्रयोगात्मक डिजाइन और समयसीमा फिट करने के लिए सेल नंबर संशोधित करें। सेल उपचार के लिए ~ चढ़ाना के बाद 18 घंटा, एक 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 35,000 कोशिकाओं जोड़ें।
    5. एक मल्टी चैनल pipet का प्रयोग, धीरे-धीरे एक फ्लैट नीचे के प्रत्येक कुएं में मास्टर मिश्रण सेल निलंबन के 130 μl पिपेट, ऊतक 96 अच्छी तरह से थाली संस्कृति का इलाज। चढ़ाना, वहीं प्लेट के नीचे छू नहीं, अच्छी तरह से केंद्र में pipet टिप जगह है।
      नोट: चढ़ाना प्रारूप को संशोधित किया जा सकता है, सेल लाइनों प्रति प्लेट 1-3 से प्रत्येक के लिए एन = 4 कुओं बनाने की सिफारिश की है। प्लेट (एन = 84) के शेष सेल लाइन # 4 (biosensor कोशिकाओं) के लिए आरक्षित है।
    6. कोशिकाओं आरटी पर 10 मिनट के लिए अबाधित प्लेट छोड़ने से व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, और और हे / एन सेते# 8805; 80% सापेक्ष आर्द्रता।

    4. इलाज प्रकोष्ठों

    नोट: अगले दिन, ताऊ biosensor कोशिकाओं के रूप में निम्नानुसार बीज पारगमन परिसरों तैयार, 60-65% मिला हुआ है जब:

    1. एक ट्यूब में, एक मास्टर मिश्रण बनाने के लिए, इस तरह के ऑप्टी सदस्य के रूप में कम-सीरम मीडिया के साथ इस तरह के Lipofectamine के रूप में, अभिकर्मक अभिकर्मक गठबंधन। प्रति अच्छी तरह से, 1.25 μl अभिकर्मक अभिकर्मक और 8.75 μl कम सीरम मीडिया जोड़ें। झाड़ ट्यूब धीरे संक्षेप में, मिश्रण नीचे स्पिन, और आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
    2. एक और ट्यूब में, कम सीरम मीडिया के साथ बीज सामग्री (2.9 कदम से lysate के विभाज्य) गठबंधन।
      नोट: बीज सामग्री की मात्रा अलग-अलग प्रयोग के अनुसार अलग अलग होंगे। बीज की मात्रा का चयन करते समय ध्यान में रखना: एक नमूना और संभावित विषाक्तता में बीज की बहुतायत है। क्रूड homogenates कोशिकाओं को विषाक्त हो सकता है। जैसे, अपने वांछित प्रभाव पर नजर रखने के लिए संभव सबसे कम मात्रा का उपयोग करें। Lysate / अच्छी रेंज fr के पहले परीक्षण की मात्रा5-20 ग्राम के कुल प्रोटीन के लिए इसी ओम 1-5 μl। अच्छी तरह से प्रति कुल मात्रा (बीज + कम सीरम मीडिया) 10 μl है कि सुनिश्चित करें।
    3. कम से कम 20 मिनट के लिए और 2 घंटा अप करने के लिए आरटी पर संक्षेप में, धीरे मिश्रण करने के लिए 4.1 और 4.2, झाड़ू में वर्णित दो नलियों से सामग्री गठबंधन (1000 XG, 5 सेकंड) नीचे स्पिन, और सेते हैं।
    4. धीरे व्यक्ति biosensor कुओं की तरफ पारगमन परिसर के 20 μl विंदुक। तीन तकनीकी प्रतिकृति, यदि संभव हो तो प्रयोग करें। 24-48 घंटे के लिए इनक्यूबेटर करने के लिए इलाज कोशिकाओं लौटें। कदम 3.6 में वर्णित के रूप में एक ही परिस्थितियों में सेते हैं।
      नोट: फॉस्फोलिपिड के आवेदन liposome अभिकर्मक के लिए unexposed कोशिकाओं biosensor प्रतिदीप्ति प्रोफ़ाइल के सापेक्ष में एक मामूली बदलाव का परिचय क्योंकि इस स्थापना के लिए उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण हालत खाली लिपिड (यानी, liposome अभिकर्मक + कम सीरम मीडिया) के साथ इलाज biosensor कोशिकाओं है।

    झल्लाहट फ्लो के लिए 5. कटाई प्रकोष्ठों

    बी चित्रा 1 ए) दिखाएगा जबकि बीज सामग्री (यानी, खाली लिपिड) के बिना इलाज सेल, फैलाना प्रतिदीप्ति दिखाएगा।

    1. एक मल्टी चैनल pipet का प्रयोग, सभी सेल मध्यम (150 μl) महाप्राण। Trypsinize (50 μl) 5 मिनट के लिए कोशिकाओं, और 150 μl ठंडा संस्कृति के माध्यम से बुझा लेते हैं। यह सेल उठाने और बाद में सेल हानि हो सकती है, के रूप में इस कदम पर trypsinization करने से पहले एक पीबीएस कुल्ला शामिल न करें। Gating रणनीतियों के माध्यम से प्रवाह cytometry के दौरान किसी भी दूषित मृत कोशिकाओं और मलबे को बाहर निकालें।
    2. इसके तत्काल बाद 5 मील के लिए 1000 XG पर, स्थानांतरण एक साथ 96 दौर नीचे की थाली के लिए कोशिकाओं, और सेंट्रीफ्यूज शमन के बादआरटी पर एन।
    3. महाप्राण सेल गोली परेशान करने से बचने के लिए, देखभाल करने के मध्यम त्यागने और।
    4. धीरे, लेकिन अच्छी तरह से, 50 μl 2% paraformaldehyde में सेल गोली resuspend, और 10 मिनट के लिए सेते हैं। निर्धारण क्लीनर और अधिक अनुरूप परिणाम प्रदान करता है, हालांकि वैकल्पिक रूप से चलाने के लिए, कोशिकाओं, रहते हैं।
    5. आरटी पर 5 मिनट के लिए 1000 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। महाप्राण सेल गोली परेशान करने से बचने के लिए, देखभाल करने के paraformaldehyde त्यागने और।
    6. धीरे, लेकिन पूरी तरह, 200 μl में बफर cytometry ठंडा प्रवाह सेल गोली resuspend (HbSS, 1% FBS, 1 मिमी EDTA) और सेल clumping से बचने के लिए जितनी जल्दी हो सके प्लेट चलाते हैं।

    6. झल्लाहट फ्लो

    नोट: लेजर लाइनों और फिल्टर सेट (तालिका 2) झल्लाहट संगत के साथ सुसज्जित है, जो MACSQuant VYB, के रूप में इस तरह के एक प्रवाह cytometer का प्रयोग करें। इस खंड के भीतर प्रत्येक कदम के लिए, सॉफ्टवेयर के साथ 96 टेम्पलेट का उपयोग ब्याज की अच्छी तरह से, क्लिक करें और क्लिक करें"खेल" नमूना तेज और प्रवाह शुरू करने के लिए। 'नए विश्लेषण खिड़की' आइकन पर क्लिक करके भूखंडों या आंकड़े टेबल बनाओ। एक्स या वाई अक्ष पर या तो शीर्षक पर क्लिक करें और उपयुक्त फिल्टर का चयन करके व्यक्तिगत द्विचर भूखंडों पर अक्ष मानकों को बदलें। , सेल आबादी या प्रतिदीप्ति संकेतों शिफ्ट करने या बढ़ाने के लिए उपयुक्त फिल्टर के साथ जुड़े voltages कमी। इस उपकरण के साथ, सही एकल कोशिका निगरानी सुनिश्चित करने के लिए <1,000 घटनाओं / सेकंड चलाते हैं।

    1. सेल की आबादी निचले बाएँ चक्र में है जब तक एक ओर तितर बितर-क्षेत्र आगे तितर बितर-क्षेत्र (एफएससी-ए) द्विचर साजिश बनाम (एसएससी-ए), और सेल लाइन # 1 चलाने के साथ, एसएससी और एफएससी voltages समायोजित करें। बहुभुज उपकरण क्लिक करें, और सेल की आबादी (गेट P1) को परिभाषित। सभी gating के मापदंडों के लिए चित्र 2 देखें।
    2. एक एफएससी-एच (ऊंचाई) एफएससी-ए द्विचर साजिश बनाम, मेकअप और साजिश के ऊपर "जी" क्लिक करें, और P1 का चयन करके इस साजिश को गेट P1 के लागू होते हैं। सेल लाइन # 1 के साथचल रहा है, बहुभुज उपकरण क्लिक करें, और एकल कक्षों (गेट p2) को परिभाषित।
    3. सीएफपी, YFP, और झल्लाहट: 3 हिस्टोग्राम भूखंडों, ब्याज के फिल्टर से प्रत्येक के लिए एक बनाओ। भूखंडों के ऊपर "जी" क्लिक करें, और p2 का चयन करके इन भूखंडों के सभी के लिए गेट के p2 लागू करें। सेल लाइन # 1 चलाने के साथ, वोल्टेज समायोजित कि इस तरह के सीएफपी, YFP में मंझला सेल की आबादी, और histograms 405 एनएम लेजर के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित, सीएफपी और झल्लाहट को मापने के लिए, और एक साथ कब्जा प्रतिदीप्ति के लिए सभी 0 के बीच और 1 हैं झल्लाहट क्रमश: 450/50 एनएम और 525/50 एनएम फिल्टर,। YFP मापने के लिए, एक 525/50 एनएम फिल्टर के साथ एक 488 एनएम लेजर और कब्जा प्रतिदीप्ति के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित। लेजर और फिल्टर सेटिंग्स आगे तालिका 2 में वर्णित हैं।
    4. झल्लाहट और YFP चैनलों में सीएफपी फैलने के लिए मुआवजे का प्रदर्शन करते हैं।
      नोट: मुआवजा प्रतिदीप्ति छलकते सुधार की प्रक्रिया है। एक fluorochrome के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन एक फिल्टर देसी भीतर का पता चला है कि जब भी प्रतिदीप्ति छलकते होता हैएक और fluorochrome से संकेत को मापने के लिए gned। उचित मुआवजा के साथ, सीएफपी छलकते प्रतिदीप्ति झल्लाहट और YFP चैनलों से हटाया जा सकता है।
      नोट: मुआवजा दोनों प्रतिदीप्ति पॉजिटिव और -negative कोशिकाओं की उपस्थिति की आवश्यकता है। इस प्रकार, सीएफपी पॉजिटिव कोशिकाओं (सेल लाइन # 2) चलाने के लिए पूर्व नमूना में जोड़ा जाना चाहिए नकारात्मक कोशिकाओं (1 सेल लाइन #) की भरपाई के लिए।
      1. अच्छी तरह से सेल लाइन # 2 निलंबन के 200 μl में एक एकल से सेल लाइन # 1 निलंबन के 30 μl में स्पाइक प्रतिकारी के लिए तुरंत पहले।
      2. "साधन सेटिंग्स" आइकन, फिर 'मुआवजा' टैब पर क्लिक करें और मुआवजा तालिका खोलने के लिए 'मैट्रिक्स' की जाँच करें।
      3. कदम 6.3 में वर्णित है, सीएफपी-ए द्विचर साजिश बनाम एक झल्लाहट एक बनाने के लिए, और फाटक के p2 लागू होते हैं। सेल लाइनों 1 + 2 के चलने के साथ 'चतुर्थ भाग' आइकन पर क्लिक करें और इस तरह के प्रतिदीप्ति -negative और पॉजिटिव आबादी कम दो quadrants से अलग हो रहे हैं कि (गेट्स LL3 एक चतुर्थ भाग आकर्षितएन डी LR3, क्रमशः)।
      4. LL3 और LR3 फाटकों के लिए झल्लाहट का मंझला प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) को प्रदर्शित करता है कि एक आंकड़ा तालिका बनाएँ। संकेत झल्लाहट के एमएफआई LL3 और LR3 के बीच बराबर है जब तक मुआवजा मैट्रिक्स में झल्लाहट पैरामीटर समायोजित करें। इस कदम के बाद, संकेत झल्लाहट के एमएफआई झल्लाहट चैनल में सीएफपी फैलने का अभाव है, सुझाव बेदाग कोशिकाओं और सीएफपी पॉजिटिव कोशिकाओं के बीच बराबर है।
      5. कदम 6.3 में वर्णित है, सीएफपी-ए द्विचर साजिश बनाम एक YFP-ए करें, और फाटक के p2 लागू होते हैं। कदम 6.4.3 में किया है कि इसी तरह चतुर्थ भाग (LL4 और LR4) ड्रा।
      6. LL4 और LR4 के लिए YFP की एमएफआई को प्रदर्शित करता है कि एक आंकड़ा तालिका बनाएँ। YFP संकेत के एमएफआई LL4 और LR4 के बीच बराबर है जब तक मुआवजा मैट्रिक्स में YFP पैरामीटर समायोजित करें। इस कदम के बाद, एक YFP संकेत के एमएफआई YFP चैनल में सीएफपी फैलने का अभाव है, सुझाव बेदाग कोशिकाओं और सीएफपी पॉजिटिव कोशिकाओं के बीच बराबर है।
    5. Follगेट सेटअप और मुआवजा कारण ब्याज के कुओं पर प्रकाश डाला और प्लेट के शेष चलाते हैं।
    6. सभी नमूनों 'फाइल', फिर 'प्रतिलिपि' पर क्लिक करके, निर्यात डेटा फ़ाइलों को चलाया जा रहा है के बाद। 'डेटा फ़ाइलों को' टैब का चयन करें प्रयोग फ़ोल्डर पर प्रकाश डाला, और 'प्रतिलिपि' पर क्लिक करें।

    7. डेटा विश्लेषण

    नोट: एक्स या वाई अक्ष पर या तो शीर्षक पर क्लिक करें और उपयुक्त फिल्टर का चयन करके व्यक्तिगत द्विचर भूखंडों पर बदलें अक्ष मापदंडों।

    1. विश्लेषण कार्यक्रम प्रवाह cytometry में ओपन एफसीएस फ़ाइलें।
    2. बिखराव गुणों के आधार पर, इसी तरह धारा 6 में वर्णित है कि, खाली लिपिड के साथ इलाज किया कोशिकाओं से (एफएससी-ए बनाम एफएससी-एच) सेल की आबादी (एफएससी बनाम एसएससी) और स्वेटर आबादी को परिभाषित करने के लिए एक बहुभुज गेट का उपयोग करें।
    3. सीएफपी मुआवजा सेटअप के दौरान प्रदर्शन किया गया था, तो आगे सीएफपी समायोजित नहीं है।
    4. YFP द्विचर साजिश बनाम एक झल्लाहट बनाएँ। सेल लाइन # 3 का प्रयोग, झल्लाहट सकारात्मक सेल की आबादी के ढलान के साथ चलाता है कि एक बहुभुज गेट ड्राइंग द्वारा एक झूठी झल्लाहट गेट को परिभाषित। यह फाटक झल्लाहट फिल्टर के भीतर एक संकेत है कि फेंकना YFP एकल पॉजिटिव कोशिकाओं शामिल नहीं है, और पहले एट अल पर प्रतिबंध लगाने से दिखाया है कि इसी तरह तैयार की है। 22
    5. सीएफपी द्विचर साजिश बनाम एक झल्लाहट पर खाली liposome इलाज सीएफपी / YFP कोशिकाओं की साजिश रचने के एक झल्लाहट गेट को परिभाषित करें। ऊपर की ओर फैली हुई है और दूर जनसंख्या से बाई ओर है कि जनसंख्या के ढलान के साथ एक बहुभुज गेट परिचय दें। यह फाटक पृष्ठभूमि कोशिकाओं के ≥1% है झल्लाहट कि इस तरह के सबसे कोशिकाओं (~ 99%), बाहर कर देना चाहिए। इस फाटक में बदलाव है कि किसी भी घटना झल्लाहट सकारात्मक माना जाता है।
      नोट: ऊपर वर्णित प्रत्येक व्यक्ति गेट बाद में फाटक के निर्माण से पहले सभी नमूनों को लागू किया जाता है। विश्लेषण के बाद, चार व्यक्ति फाटकों परिभाषित कर रहे हैं (सेल की आबादी, स्वेटर, झूठी झल्लाहट, झल्लाहट)।
    6. प्रतिशत झल्लाहट सकारात्मकता और एमएफआई: ब्याज सहित रिकार्ड विश्लेषण मापदंडोंझल्लाहट पॉजिटिव कोशिकाओं की। मैन्युअल प्रतिशत सकारात्मकता और एमएफआई के उत्पाद को मापने के द्वारा एकीकृत झल्लाहट घनत्व की गणना।
      नोट: एकीकृत झल्लाहट घनत्व आउटकम अपने दो व्यक्तिगत कारकों की तुलना में कम है कि एक उत्पाद की गणना से बचने के क्रम में एक से अधिक या बराबर करने के लिए और एमएफआई (कदम 7.5 के रूप में परिभाषित) की स्थापना की पृष्ठभूमि झल्लाहट के रूप में प्रयोग किया जाता है।

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Representative Results

झल्लाहट प्रवाह cytometry संवेदनशील, मात्रात्मक, और पुनः संयोजक या जैविक नमूने से बोने गतिविधि का तेजी से पता लगाने में सक्षम बनाता है। परख सेटअप सतही है: ताऊ-आरडी सीएफपी / YFP व्यक्त मोनोक्लोनल व्युत्पन्न स्थिर सेल लाइनों 24-48 घंटे के लिए incubated, बीज सामग्री के साथ transduced, और विश्लेषण (चित्रा 1 ए) प्रवाह cytometry के अधीन हैं। बीज के अभाव में, biosensor कोशिकाओं को एक घुलनशील, मोनोमेरिक फार्म (चित्रा 1 बी) में ताऊ बनाए रखें। बीज की उपस्थिति में, हालांकि, biosensor कोशिकाओं फ्लो के साथ एक प्रति-सेल के आधार पर पता चला है कि एक झल्लाहट प्रतिक्रिया उत्पादन, एक एकत्रित राज्य (चित्रा 1 सी) में ताऊ परिवर्तित। मात्रात्मक मूल्यांकन biosensor कोशिकाओं बीज सामग्री के femtomolar सांद्रता का जवाब और है कि बोने गतिविधि को प्रभावी ढंग से तीन आदेश परिमाण के (चित्रा -1) भर में मापा जा सकता है कि पता चलता है।

Gating मापदंडों के एक टीआर का पता लगाने सुनिश्चित करने के लिए स्थापित किए गए थेUE भी कम बीज सांद्रता में, संकेत झल्लाहट। सबसे पहले, मानक gating के तरीकों सेल की आबादी (2A चित्रा) और एकल कक्षों (चित्रा 2 बी) को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। झूठी संकेत झल्लाहट 405 एनएम लेजर द्वारा YFP के प्रत्यक्ष सक्रियण से उत्पन्न कर सकते। इस प्रकार, एक झूठी झल्लाहट गेट दूषित संकेत (चित्रा -2) बाहर करने के लिए एक YFP एकल सकारात्मक सेल की आबादी से तैयार की है। पिछले है, झल्लाहट गेट गैरवरीय सीएफपी / YFP दोहरे सकारात्मक कोशिकाओं (चित्रा 2 डी) से परिभाषित किया गया है। एक फाटक ऊपर की ओर फैली हुई है कि आबादी के ढलान के पास तैयार की है और इसे दूर से बाई ओर जाता है। Unstimulated कोशिकाओं को एक पृष्ठभूमि लगभग 1% करने के लिए निर्धारित मूल्य झल्लाहट होनी चाहिए, और झल्लाहट पॉजिटिव कोशिकाओं (चित्रा 2 ई और 2 एफ तुलना) एक खुराक पर निर्भर तरीके से इस गेट में बदलाव होगा। यानी प्रतिशत सकारात्मकता (कुल सेल गिनती प्रति झल्लाहट पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या: एकाधिक मापदंडों सहित प्रवाह cytometry झल्लाहट के साथ ध्यान में रखा जाता) और यानी, डिग्री है जो एक झल्लाहट प्रतिक्रिया एक झल्लाहट सकारात्मक सेल में उत्पादन किया है करने के लिए मंझला प्रतिदीप्ति तीव्रता ()। यह इन दो चर का उत्पाद है और पूरी तरह से किसी भी नमूना द्वारा प्रेरित बोने गतिविधि की डिग्री का प्रतिनिधित्व के रूप में एकीकृत झल्लाहट घनत्व, वरीय परिणाम उपाय है।

झल्लाहट प्रवाह cytometry चित्रा 3 में दिखाया के रूप में, यहां तक कि युवा उम्र में, P301S tauopathy माउस व्युत्पन्न मस्तिष्क lysates के साथ संगत है। चार अलग मस्तिष्क क्षेत्रों की microdissection के बाद cytometry, मस्तिष्क से बोने गतिविधि (चित्रा 3) को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था प्रवाह झल्लाहट, नियोकॉर्टेक्स (चित्रा 3 बी), ललाट पालि (चित्रा 3 सी), और उम्र के एक सीमा से अधिक P301S चूहों में हिप्पोकैम्पस (चित्रा 3 डी)। प्रत्येक क्षेत्र में, बोने गतिविधि उम्र के साथ वृद्धि हुई है और सिर्फ 1.5 महीने में दिखाई दिया। हालांकि, ताऊ पीटा चूहों ("को")> 12 राज्यमंत्री बोने गतिविधि का प्रदर्शन कभी नहीं। ज की तुलनाistological इस conformationally-न्यायपालिका ताऊ (MC1), hyperphosphorylated ताऊ (AT8 और PG5), और amyloid रचना की मार्करों सहित ताऊ बयान (चित्रा 3E), के किसी भी अन्य मार्कर की उपस्थिति से छह सप्ताह के लिए जल्दी ही है, एक ही जानवरों के भीतर प्रदर्शन का विश्लेषण करती है (ThioflavinS)। एक यंत्रवत दृश्य से, ताऊ बोने गतिविधि के समीपस्थ पता लगाने tauopathy शुरुआत और / या प्रगति का एक कारण मध्यस्थ के रूप में बीज चलता है। एक प्रयोगात्मक दृश्य से, यह अपनी प्रारंभिक और मजबूत उपस्थिति को देखते हुए बोने गतिविधि का विश्लेषण ताऊ बयान के मानक परिणाम उपाय करने के लिए एक आदर्श के पूरक हो सकता है कि पता चलता है।

ट्रांसजेनिक चूहों के अलावा, प्रवाह cytometry मानव मस्तिष्क lysates के साथ संगत है और आसानी से अल्जाइमर रोग विषयों (चित्रा 4) से अलग ताऊ समुच्चय का पता लगा सकते झल्लाहट। जमे हुए मानव मस्तिष्क के ऊतकों में एक ही तरीके homogenized है जब गतिविधि बोने, P301S मस्तिष्क lysates के लिए यहां के रूप में वर्णितमजबूती के साथ ई विषयों से प्राप्त सभी नमूनों से पता चला है। इसके विपरीत, बोने गतिविधि उम्र से मिलान या हंटिंग्टन रोग नियंत्रण विषयों की lysates से पता चला कभी नहीं है। यह ताऊ समुच्चय के लिए परख की विशिष्टता पर जोर दिया।

इस लेख का ध्यान HEK 293T biosensor कोशिकाओं में समुच्चय के liposome की मध्यस्थता वितरण का उपयोग ताऊ बोने गतिविधि के संवेदनशील पता लगाने है, अधिक शारीरिक सेल संस्कृति मानदंड भी बुनियादी सेलुलर तेज तंत्र का आकलन करने के लिए प्रवाह cytometry झल्लाहट के साथ किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, प्राथमिक neuronal संस्कृतियों lentivirus ताऊ-आरडी सीएफपी व्यक्त करने और ताऊ-आरडी YFP चढ़ाना के समय में constructs से संक्रमित हो सकते हैं। Div4 में एकत्रीकरण बीज युक्त सामग्री (चित्रा 5 ब) के साथ इलाज न्यूरॉन्स में अनुपचारित कोशिकाओं (चित्रा 5 ए) में अनुपस्थित लेकिन detectable है। महत्वपूर्ण बात है, फॉस्फोलिपिड शारीरिक और पैट की जांच की अनुमति देने, इन प्रयोगों में बाहर रखा गया है hophysiological बोने तंत्र। इस प्रकार, ताऊ तंतुओं के आवेदन न्यूरोनल HSPG की मध्यस्थता तेज करने के लिए होता है और झल्लाहट फ्लो (चित्रा 5C) के साथ मात्रा निर्धारित किया जा सकता है कि एक खुराक पर निर्भर तरीके से एकत्रीकरण को उत्तेजित करता है। इसके अतिरिक्त, परख चिकित्सीय ताऊ तेज के मूल्यांकन और HEK 293T ताऊ biosensor कोशिकाओं का उपयोग इन विट्रो में नाकाबंदी बोने के लिए नियोजित किया जा सकता है। यहाँ तक कि फॉस्फोलिपिड के अभाव में, दोनों पुनः संयोजक तंतु (चित्रा 5 डी) और P301S मस्तिष्क lysates (चित्रा 5E) ताऊ एकत्रीकरण प्रेरित। हेपरिन के साथ इन ताऊ बीज की पूर्व ऊष्मायन (पहले HSPG की मध्यस्थता ताऊ तेज की एक शक्तिशाली अवरोध करनेवाला होना करने के लिए दिखाया गया है), लेकिन, उनके बोने क्षमता समाप्त। इस प्रयोगात्मक सेटअप किसी भी दवा (जैसे, एंटीबॉडी, छोटे अणुओं, आदि) के लिए आवेदन किया जा सकता है और तेज और / या बीज को संशोधित चिकित्सा विज्ञान के तेजी से मूल्यांकन के लिए सक्षम होगा।

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1. झल्लाहट cytometry संवेदनशीलता प्रवाह चित्रा ताऊ बोने गतिविधि 16 का पता लगाता है। ताऊ-आरडी सीएफपी / YFP व्यक्त मोनोक्लोनल HEK 293T कोशिकाओं 24-48 घंटे के लिए incubated, पुनः संयोजक या जैविक नमूने के साथ transduced, और प्रवाह cytometry का उपयोग एक एकल कोशिका के आधार पर विश्लेषण किया गया (ए)। Unstimulated कोशिकाओं बीज युक्त सामग्री के प्रदर्शन के प्रमुख समावेशन (सी) के साथ इलाज कोशिकाओं, जबकि एक मोनोमेरिक राज्य (बी) में ताऊ आरडी बनाए रखें। मात्रात्मक मूल्यांकन पुनः संयोजक बीज सामग्री के femtomolar सांद्रता (मोनोमर समकक्ष) के प्रति संवेदनशील है और पता लगाने के परिमाण (डी) के तीन आदेश तक फैला प्रवाह cytometry झल्लाहट कि बोने गतिविधि पता चलता है की (± SEM के मतलब है)। मोनोमर बराबर fibrillization प्रतिक्रिया के भीतर निहित प्रोटीन की कुल राशि का प्रतिनिधित्व करता है और अधूरा और के लिए सही नहीं है# 160; एकत्रित सामग्री में मोनोमर के समावेश। इस प्रकार, वास्तविक समुच्चय (बीज) की एकाग्रता कम होना चाहिए से या अपनी 'मोनोमर बराबर' के बराबर है। * होम्स और Furman एट अल। 16 से संशोधित यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
झल्लाहट प्रवाह cytometry। सेल की आबादी (ए) और स्वेटर / नक़ल (बी) के फाटकों के लिए चित्रा 2. gating रणनीति कार्यप्रणाली cytometry मानक प्रवाह के साथ तैयार कर रहे हैं। एक झूठी झल्लाहट फाटक (सी) YFP खत्म bleedthrough झल्लाहट फिल्टर में करने के लिए YFP एकल सकारात्मक कोशिकाओं से तैयार की है। एक झल्लाहट गेट (डी) खाली liposome इलाज कोशिकाओं से निर्माण किया है, इस तरह केकि पृष्ठभूमि झल्लाहट ≥1% है। झल्लाहट गेट में एक आबादी पारी बीज सकारात्मक सामग्री (ई) के साथ इलाज के बाद दिखाई देता है और बदलाव के बीज सामग्री की उच्च मात्रा (एफ) के साथ तेजी से महत्वपूर्ण हो जाता है। अंतिम readouts में शामिल हैं:। प्रतिशत सकारात्मकता झल्लाहट, मंझला प्रतिदीप्ति तीव्रता झल्लाहट सकारात्मक घटनाओं की (एमएफआई), और एकीकृत झल्लाहट घनत्व (एकीकृत झल्लाहट घनत्व = प्रतिशत सकारात्मक कोशिकाओं एमएफआई *) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
P301S चूहों 16 में ताऊ बोने गतिविधि की चित्रा 3. प्रगति। P301S चूहों के मस्तिष्क homogenates से सीडिंग गतिविधि (मतलब ± SEM) के मस्तिष्क में 1.5 महीने (ए में स्पष्ट है), नियोकॉर्टेक्स (बी), ललाट पालि (सी), और हिप्पोकैम्पस (डी)। हालांकि, बोने गतिविधि ताऊ पीटा चूहों (> 12 महीने) में कभी नहीं देखा गया है। सीडिंग गतिविधि उम्र के साथ बढ़ जाती है और MC1, AT8, और PG5 (ई) सहित अन्य आम ऊतकीय मार्कर की उपस्थिति पछाड़ दिया है। * होम्स और Furman एट अल। 16 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
झल्लाहट की चित्रा 4. संगतता मानव जैविक नमूने 16 के साथ प्रवाह cytometry। ताऊ-आरडी सीएफपी / YFP biosensor कोशिकाओं 20 माइक्रोग्राम प्रति मानव मस्तिष्क lysate साथ transduced कर रहे हैं, मजबूत बोने (± SEM मतलब है) सभी परीक्षण अल्जाइमर disea में होता हैउम्र से मिलान और हंटिंग्टन रोग नियंत्रण lysates बोने गतिविधि की कमी है जबकि एसई दिमाग। * होम्स और Furman एट अल। 16 से संशोधित यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा झल्लाहट के लिए 5. वैकल्पिक अनुप्रयोगों lentivirus एन्कोडिंग ताऊ-सीएफपी साथ transduced cytometry 16। प्राथमिक न्यूरॉन्स प्रवाह और ताऊ-YFP निर्माण करती है। बहिर्जात बीज के अभाव में कोई स्पष्ट एकत्रीकरण (ए) नहीं है, लेकिन बीज की उपस्थिति (बी) में नहीं है। न्यूरोनल biosensors भी फॉस्फोलिपिड की मध्यस्थता वितरण (सी) के अभाव में, खुराक dependently पुनः संयोजक ताऊ बीज का जवाब। पुनः संयोजक (डी) या द्वि के पूर्व ऊष्मायनहेपरिन के साथ ological (ई) बीज स्रोतों, HSPG की मध्यस्थता ताऊ बीज तेज के एक अवरोध, HEK 293T biosensor कोशिकाओं की जवाबदेही झल्लाहट depletes। मात्रात्मक मूल्यांकन प्रदर्शित करता है (± SEM के मतलब है)। * होम्स और Furman एट अल। 16 से संशोधित यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक

तालिका एक: झल्लाहट के साथ प्रयोग किया जाता सेल लाइनों प्रवाह cytometry। HEK 293T कोशिकाओं सेटअप प्रवाह cytometry के लिए उपयोग किया जाता है। सीएफपी एकल पॉजिटिव कोशिकाओं मुआवजा (*) के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। YFP एकल पॉजिटिव कोशिकाओं की वजह से 405 एनएम उत्तेजना से YFP के प्रत्यक्ष सक्रियण के लिए झूठी झल्लाहट संकेत को खत्म करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। सीएफपी / YFP-दोहरी सकारात्मक कोशिकाओं झल्लाहट संगत कर रहे हैं और के रूप में सेवाbiosensor कोशिकाओं। इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सारणी 2

तालिका 2:। लेजर और फिल्टर सेटिंग्स प्रवाह इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहाँ वर्णित झल्लाहट प्रवाह cytometry प्रणाली जल्दी और मात्रात्मक ताऊ बोने गतिविधि का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यह केवल मध्यम सेल संस्कृति का अनुभव है और झल्लाहट का कार्यसाधक ज्ञान और प्रवाह cytometry की आवश्यकता है। बीटा शीट संरचना के लिए बाध्य जब प्रतिदीप्ति बढ़ाया दर्शाती है जो - - जैसे Thioflavin टी के रूप में अन्य बोने assays, श्रमसाध्य हैं और एक शुद्ध, पुनः संयोजक प्रोटीन सब्सट्रेट की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, ताऊ के लिए इन विट्रो बोने assays केवल अर्द्ध मात्रात्मक और बीज सामग्री 23,24 के subnanomolar स्तर के लिए आम तौर पर असंवेदनशील हैं। प्रवाह cytometry झल्लाहट, तथापि, पुनः संयोजक या जैविक या तो नमूनों से बोने गतिविधि का एक मात्रात्मक और नजाकत संवेदनशील उपाय प्रदान करता है। इसके अलावा, प्रक्रिया के रूपांतरों प्रोटीन एकत्रीकरण विकारों की एक किस्म का अध्ययन करने के लिए यह उपयोगी बना सकते हैं।

यहाँ बताया प्रोटोकॉल ताऊ बोने पर केंद्रित है, केवल सरल संशोधनों टी आवश्यक हैंओ proteopathic बीज का वैकल्पिक प्रकार से बोने गतिविधि पर नजर रखने के लिए एक उपयोगकर्ता को सक्षम। होम्स और Furman एट अल। में प्रदर्शन के रूप में, एक मोनोक्लोनल सेल लाइन के निर्माण के स्थिरतापूर्वक रोग से जुड़े A53T उत्परिवर्तन सीएफपी या तो के लिए टैग या YFP पूर्ण लंबाई α-synuclein पुनः संयोजक तंतु 16 से बोने गतिविधि के संवेदनशील पता लगाने सक्षम शरण α-synuclein व्यक्त । इसी तरह के प्रयोगों को भी प्रभावी ढंग से प्रोटीन एकत्रीकरण का पता लगाने के जो हनटिंग्टन biosensor कोशिकाओं का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया गया है। इस प्रकार, केवल प्रोटीन biosensor संशोधित करके, प्रवाह cytometry कई बीज स्रोतों के साथ संगत है झल्लाहट। उपचार के प्रतिमान और सेल मॉडल सहित परख करने के लिए अन्य संशोधनों, झल्लाहट बनाने के शारीरिक तंत्र का आकलन करने के लिए cytometry अधिक लागू प्रवाह करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, बीज सीधे संवेदनशीलता को बढ़ाने के तरीके के रूप liposome की मध्यस्थता पारगमन के माध्यम से biosensor कोशिकाओं में शुरू किए गए थे।

यह n करने के लिए महत्वपूर्ण हैOTE, हालांकि, यह कोई आवश्यकता नहीं है। ताउ पुनः संयोजक या माउस जैविक नमूने अभी भी liposomes की अनुपस्थिति (चित्रा 5) में biosensor कोशिकाओं बोने के लिए सक्षम हैं से समुच्चय। इस प्रकार, प्रयोगशालाओं अभी भी परख काम कर सकते हैं शारीरिक प्रचार और / या ताऊ बीज की तेज तंत्र के अध्ययन में रुचि रखते हैं। इसके अतिरिक्त, प्रवाह cytometry प्राथमिक neuronal संस्कृतियों के साथ संगत है झल्लाहट। चढ़ाना के समय CFP- और YFP इनकोडिंग lentiviral निर्माणों के साथ कोशिकाओं को संक्रमित करते हुए, कुशल झल्लाहट जवाबदेही भी liposomes की अनुपस्थिति (चित्रा 5) में, पुनः संयोजक ताऊ तंतुओं के साथ इलाज के बाद nanomolar मात्रा में उपलब्ध हो जाता है। साथ में ले ली, इन आंकड़ों झल्लाहट फ्लो प्रोटीन समुच्चय की एक किस्म के लिए और कई सेल संस्कृति मॉडल में बोने के शारीरिक तंत्र के अध्ययन के लिए उपयोगी है कि संकेत मिलता है।

झल्लाहट सिस्टम प्रवाह cytometry उपयोगकर्ता के अनुकूल है और अनुकूलनीय है, कुछ महत्वपूर्ण कदम होना चाहिएउपचार के समय नमूना तैयार करने और उचित सेल confluency सहित, संगतता सुनिश्चित करने के लिए पीछा किया। मस्तिष्क नमूनों की उच्च तीव्रता जांच sonication बोने गतिविधि के प्रभावी और इष्टतम अलगाव के लिए महत्वपूर्ण है। विकास और अनुकूलन के दौरान यह देखा गया है कि इस विधि के अन्य आम तकनीकों के सापेक्ष P301S माउस दिमाग, जैसे हाथ में एकरूपता से बोने गतिविधि को अलग-थलग से कम 10 गुना अधिक प्रभावी है। यह बहुत बड़ी ताऊ समुच्चय एक अपेक्षाकृत कम बोने प्रवृत्ति है कि संभव है, और कहा कि जांच के sonication के छोटे, बीज-संगत टुकड़ों में इन समुच्चय को तोड़ने के लिए सबसे प्रभावी है। यदि आवश्यक हो तो ऊपर वर्णित सेटिंग्स बोने गतिविधि के संवेदनशील पता लगाने के लिए सिफारिश कर रहे हैं, हालांकि sonication की अवधि और आवृत्ति, संशोधित किया जा सकता है।

यह संवेदनशीलता और सेल स्वास्थ्य दोनों को प्रभावित करता है के रूप में उपचार के समय पर सेल confluency, अत्यंत महत्व का भी है। यदि कोशिकाओं को एकभी मिला हुआ पुन, वे आसानी से इस तरह नाटकीय रूप से संवेदनशीलता को कम करने, फॉस्फोलिपिड और बीज सामग्री नहीं लेते। Confluency बहुत कम है, फॉस्फोलिपिड और बीज सामग्री के अलावा विषाक्त हो सकता है। अनुभवजन्य परीक्षण के 60-65% की एक biosensor confluency उपचार और बाद में जवाबदेही के लिए इष्टतम है कि पता चलता है।

प्रोटोकॉल में बताया गया है, मुआवजा एल्गोरिदम नियमित रूप से इस तरह की गलत संकेतों को नष्ट करने और संवेदनशीलता बढ़ रही है, चैनलों YFP में सीएफपी छलकते बाहर और झल्लाहट करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। बोने गतिविधि की एक तेज और गुणात्मक मूल्यांकन के लिए, हालांकि, इस कदम पद अस्थायी विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रवाह cytometry का उपयोग छोड़ा गया है या किया जा सकता है। एक क्लीनर और अधिक मजबूत संकेत मुआवजा, तथापि, और इस प्रकार सबसे कठोर और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए यह कदम अत्यधिक की सिफारिश की है निम्नलिखित प्राप्त की है।

परख की एक सीमा जैव रासायनिक पर रिपोर्ट करने के लिए अपनी असमर्थता है की संरचनाproteopathic बीज। वर्तमान परख उपायों बोने गतिविधि, बीज की एक कार्यात्मक संपत्ति। बीज के जैव रासायनिक और biophysical प्रकृति का निर्धारण बहरहाल, इस परख असंख्य नमूनों से एक समापन बिंदु के रूप में बोने शक्ति का मूल्यांकन करने में उपयोगी साबित होगा आदि immunoprecipitation, क्रोमैटोग्राफी, परिपत्र द्विवर्णता, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, के रूप में पारंपरिक assays के लिए युग्मन की आवश्यकता होगी।

इस परख हाल ही में यों और ऐसे ऊतकीय दाग के रूप में ताऊ बयान के अन्य आम मार्कर के सापेक्ष P301S चूहों में विकास और प्रगति बोने की timecourse चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस अध्ययन में, ताऊ बोने गतिविधि से पहले हम 16 परीक्षण किया है कि जल्द से जल्द ऊतकीय मार्कर (MC1) करने के लिए छह सप्ताह से अधिक स्पष्ट किया गया था। अपनी प्रारंभिक उपस्थिति को देखते हुए, गतिविधि बोने कम से कम प्रारंभिक अध्ययन के लिए, उपचारात्मक उपायों की प्रभावकारिता के मूल्यांकन के लिए एक महत्वपूर्ण पूरक, या यहां तक ​​कि विकल्प, परिणाम उपाय प्रतिनिधित्व कर सकते हैं।उपचार पाठ्यक्रम को छोटा करने और छोटे जानवरों, आवास की लागत और कम हो जाएगा प्रयोगात्मक बदलाव के समय का अध्ययन करके। यह चिकित्सा विज्ञान 2-4 हफ्ते बाद बोने गतिविधि के लिए मूल्यांकन 4-6 सप्ताह और दिमाग पर P301S चूहों को नियंत्रित किया जा सकता है कि बोधगम्य है। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं में विरोधी ताऊ चिकित्सा विज्ञान के मूल्यांकन चित्रा 5 में प्रदर्शन के रूप में, biosensor कोशिकाओं में बोने गतिविधि की प्रेरण को ब्लॉक करने के लिए अपनी क्षमता का आकलन करने से दिनों के भीतर किया जा सकता है।

अंत में, झल्लाहट परख बोने पुनः संयोजक या जैविक स्रोतों से ताऊ बोने का पता लगाने के लिए एक आसान और कारगर तरीका है प्रवाह cytometry। अपनी संवेदनशीलता विट्रो ताऊ बोने assays में अन्य द्वारा अद्वितीय है, और यह P301S tauopathy चूहों में जल्द से जल्द रोग परिवर्तन का पता लगाने के लिए नियोजित किया जा सकता है। इसके अलावा, है, और कई सेल संस्कृति मॉडल के साथ अलग-अलग उपचार की शर्तों के तहत कई proteopathic बीज की निगरानी में अपने लचीलापन, के लिए यह उपयोगी बनाता हैजल्दी से मात्रात्मक डेटा एकत्र करने में रुचि किसी भी प्रोटीन एकत्रीकरण प्रयोगशाला।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
TBS Sigma T5912
cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free) Roche 4693159001
Cryo-vials Sarstedt 72.694.006
Analytical Balance Mettler Toledo XSE 105DU
Weighing Boats Fisher Scientific 13-735-743
15 ml conical tube USA Scientific 1475-0501
Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer Omni International 18-000-115
Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer Omni International OR-T-156
2-Propanol Fisher Scientific A451
Noise Cancelling Ear Muffs Fisher Scientific 19-145-412
Kimwipes Fisher Scientific S47299
1.5 ml tubes USA Scientific 1615-5510
Microcentrifuge  Eppendorf 5424 000.215
DPBS Life Technologies 14190-136
DMEM Life Technologies 11965-084
Fetal Bovine Serum HyClone SH30071.03
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122
GlutaMax Life Technologies 35050-061
Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054
50 ml Conical Tubes Phenix Research SS-PH15
25 ml reagent resevoirs VWR 41428-954
Multi channel pipet Fisher Scientific TI13-690-049
96 well flat bottom plates Corning 3603
Opti-MEM Life Technologies 31985-070
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
96 well round bottom plates Corning 3788
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences RT 15710
PBS Sigma-Aldrich P5493
EDTA Sigma-Aldrich ED2SS
HBSS Life Technologies 14185-052
Sorvall ST 40 Centrifuge Thermo Scientific 75004509
BIOLiner Swinging Bucket Rotor Thermo Scientific 75003796
Hemacytometer VWR 15170-172
MACSQuant VYB Flow Cytomter Miltenyi Biotec 130-096-116
Chill 96 Rack Miltenyi Biotec 130-094-459
Flow Jo analysis software Flow Jo
20 μl pipet tips Rainin GPS-L10
200 μl pipet tips Rainin GPS-250
1 ml pipet tips Rainin GPS-1000
200 μl pipet tips USA Scientific 1111-1800
5 ml serological pipett Phenix Research SPG-606180
10 ml serological pipett Phenix Research SPG-607180
25 ml Serological pipett Phenix Research SPG-760180

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 106 झल्लाहट फ्लो बोने प्रोटीन एकत्रीकरण ताऊ Transcellular प्रचार synuclein हनटिंग्टन Prion Neurodegeneration
झल्लाहट फ्लो के साथ Proteopathic सीडिंग गतिविधि के संवेदनशील पता लगाने
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Furman, J. L., Holmes, B. B.,… More

Furman, J. L., Holmes, B. B., Diamond, M. I. Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (106), e53205, doi:10.3791/53205 (2015).

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