Introduction
A acumulação intracelular de tau amilóides define tauopatias, tais como a doença de Alzheimer. Nas fases iniciais da doença, patologia está geralmente localizada em regiões discretas do cérebro, mas com a progressão da doença, patologia invariavelmente se espalha ao longo de redes neuronais distintas 1-5. Evidências sugerem propagação transcelular de agregados de proteínas tóxicas subjacente a esta patologia (revisto em 10/06). Neste modelo, sementes proteopathic (por exemplo, tau) são libertados a partir de células do doador e entrar nas células vizinhas, transformando proteína tau nativo na forma mal dobrada através modelada alteração conformacional 11-15. O ensaio aqui descrito foi desenvolvido para detectar com sensibilidade tal actividade semeadura. É compatível com a proteína recombinante e amostras biológicas e permite a quantificação dos níveis de actividade de semeadura proteopathic 16 minutos.
Células HEK 293T que expressam estavelmente tau d repetiçãoOMain (RD) contendo a mutação P301S associado à doença, quer fundido a PCP ou YFP (daqui em diante referido como células tau-RD-PCP / YFP) servir como um biossensor estável de actividade semeadura. Na ausência de sementes proteopathic, as células manter tau como um monómero solúvel em água, e não têm fundo apreciável de FRET. Absorção espontânea ou transdução mediada por lipossomas de sementes de tau para células, no entanto, resulta em RD-PCP e agregação RD-YFP, que produz um sinal de FRET, que é medida no interior das células individuais através de citometria de fluxo.
Numerosos componentes deste ensaio foram modificadas para aumentar a sensibilidade e reduzir a variabilidade. Uma linha celular monoclonal com uma proporção de 1: expressão RD-PCP / YFP 1 foi seleccionado, uma vez que proporciona melhor sinal: ruído. Para aumentar a sensibilidade, fosfolípidos são usados para introduzir sementes directamente em células (embora para estudar os mecanismos biológicos de captação, esta pode ser omitida). Finalmente, citometria de fluxo monitores FRET ao nível da população e uma única célula nível, ao contrário de outros ensaios de agregação de proteínas. A medida do resultado final, a densidade de FRET integrado, é altamente quantitativa e contabilidade, tanto para o número de células com a agregação, e do grau de agregação que ocorreu dentro de cada célula. Todos estes parâmetros optimizados aumentar a sensibilidade e garantir a reprodutibilidade.
Este sistema foi recentemente empregado em um estudo abrangente em camundongos transgênicos tauopathy P301S 17 que avaliou o aparecimento temporal e progressão da atividade sementeira tau em relação a outros marcadores patológicos de tau utilizada (por exemplo, MC1, AT8, PG5 e ThioflavinS). Sementeira actividade é, de longe, o marcador mais antigo e mais robusta de patologia tau avaliada, precedendo a detecção histológica por pelo menos 6 semanas. Atividade Sementeira aparece em 1.5 meses e aumenta progressivamente com a idade, sugerindo um papel causal de sementes proteopathic no início e / ou progressão da neurodegeneração 16.
e_content "> quantificação precisa dos níveis de material de semente de amostras biológicas hora pode facilitar estudos que monitoram a progressão da doença mais cedo. Ao encurtar a duração julgamento e permitindo o uso de animais mais jovens, isto poderia aumentar a eficiência ea precisão de testes em animais pré-clínicos. Por exemplo, em a P301S rato previamente descrito, os compostos de chumbo pode ser entregue tão cedo quanto 4-6 semanas (imediatamente antes, ou no início da actividade sementeira), e monitorizados quanto à eficácia de 2-4 semanas mais tarde. O ensaio deve quantificar com precisão quaisquer reduções de semeadura actividade. FRET citometria de fluxo tem aplicações in vitro de rastreio bem. Por exemplo, reagentes anti-tau (por exemplo, anticorpos, moléculas pequenas, etc.) pode ser rapidamente testado para a sua capacidade para bloquear a indução sementeira directamente em cultura, utilizando quer a tau recombinante agregados ou lisados derivado do cérebro como uma fonte de sementes (Figura 5). Com esta configuração, quando o material de semente é preparada, um experiment leva apenas três dias para ser concluída, incluindo a análise de dados. A rápida quantificação da actividade de semeadura proteopathic pode, assim, facilitar muitos estudos de neurodegeneração.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Este protocolo enfatiza a utilização de citometria de fluxo de FRET para detectar a actividade de sementeira a partir de amostras biológicas do rato. Também é compatível com fibrilas recombinantes e amostras biológicas humanas. Rato eutanásia e do cérebro da colheita foi realizada em conformidade com os procedimentos IACUC-aprovado.
1. Cérebro Extração
- Após anestesia com isoflurano profunda (2%), perfundir um rato com PBS gelado contendo 0,03% de heparina, e extrair o cérebro seguindo os detalhes descritos nos Gage et al. 18
- Colocar o tecido extraído num crio-frasco, e encaixe congelamento por colocação em azoto líquido. Alternativamente, congelar tecido em gelo seco. Uma vez congelado, se necessário transferir tecido para -80 ° C e armazenar durante um longo período de tempo,.
NOTA: Este protocolo é compatível com homogeneizados de cérebro inteiro ou regiões microdissecadas cerebrais. Veja Hagihara et al. Para um protocolo micro-dissecção detalhada 19. 2. Preparação de material de semente Biológica - Preparar tampão de homogeneização por dissolução de inibidores de protease (EDTA livre) em 1x TBS (1 comprimido por 10 mL). Vortex vigorosamente, e armazenar no gelo. Os inibidores de protease deve ser EDTA livre, a fim de preservar a viabilidade das células de biossensor.
- Pesar tecido cerebral congelado em um barco pesa descartável, e transferir para um tubo cônico de 5 ml. Adicionar tampão de homogeneização arrefecido em gelo de tal forma que a solução final é de 10% peso / volume. Temporariamente armazenar no gelo. A massa de tecido e o volume de tampão de homogeneização subsequente irá variar dependendo do tamanho do cérebro e / ou regiões utilizado. Aqui, um rato adulto hemibrain pesando 0,2 g é suspenso em 2 ml de uma solução a 10% w / v.
- Amostras de transferência em uma sala fria, e ajustar um sonicador de sonda para as configurações apropriadas. Para sonicação com sonda com um ruptor Omni (mostrado aqui), ajustar a potência para 20%, o que corresponde a cerca de 75 W. O uso de um modo de pulso para assegurar as amostras não forem ovER-aquecida durante a sonicação. Defina o pulsador a 30%, o que corresponde a cerca de 500 ms.
- Limpar a ponta da sonda de ultra-sons, por lavagem com água, isopropanol, e novamente com água, retirando a sonda entre em cada solução. Certifique-se de lavar e limpar ambos os lados e fundo da sonda com LAB-toalhetes.
- Trabalhando com uma amostra de cada vez, submergir a ponta da sonda em tampão de homogeneização, e iniciar o sonicador. Usando as configurações de energia e pulser descritos acima, entregar 25 pulsos totais. Assegurar que o tecido está completamente em suspensão. Ter cuidado para evitar a formação de espuma da amostra, durante este passo.
NOTA: As amostras são suscetíveis à formação de espuma, se a) o volume total é baixo ou b) o homogeneizado aquece. Com este instrumento específico, não sonicate com volumes inferiores a 250 mL. Para assegurar amostras ficar refrigeradas, os tubos podem ser armazenados em gelo durante este passo. - Limpe a sonda por enxugando ligado residual, em seguida, entregar 10 pulsos para uma proveta oágua limpa f. Lavar os lados e o fundo da sonda com água, isopropanol, e água de novo (como no passo 2.4), limpando secar entre cada passo. Para evitar a contaminação, lavar abundantemente a sonda entre amostras.
NOTA: Com agregados tau, não encontramos que os métodos de limpeza mais rigorosos são necessários para prevenir a contaminação da amostra-para-amostra. Outros amilóides, no entanto, pode exigir cuidados adicionais que tem sido extensivamente descritos na literatura 20,21. - Loja homogeneizados em gelo até que todas as amostras tiverem sido processados.
- Girar a 21.300 homogenatos xg durante 15 min a 4 ° C.
- Transferir o sobrenadante para um tubo limpo, tomando cuidado para não perturbar o sedimento. Descarte o sedimento. Alíquota o sobrenadante, e armazenar a -80 ° lisados C para posterior utilização. Evitar ciclos de congelamento / descongelamento dos homogeneizados, no entanto, dado que isso reduz a eficiência da semeadura.
- Em um ambiente estéril, meio de cultura aspirado. Lavar as células com PBS quente, e aspirado. Tripsinizar as células (3 ml de tripsina-EDTA (0,05%)) durante 3 min, diluiu-se com meio de cultura quente (9 ml de DMEM, 10% FBS, 1% de pen / strep, 1% de GlutaMax), e transferir imediatamente as células para um tubo cónico.
- Centrifugar a 1.000 células xg durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar médio e ressuspender pellet celular em meio de cultura quente.
- Usando um hemocitómetro, determinar a densidade celular para cada linha celular. A densidade celular irá variar dependendo da confluência no momento da colheita e o volume de ressuspensão. Ressuspender as células colhidas a partir de uma placa de 10 cm a 90% de confluência em 10 ml de meio, para a densidade celular de aproximadamente 1 milhão de células / ml.
- Façouma mistura principal de células + meios de modo a que cada poço de uma placa de 96 poços conterá 35.000 células em 130 ul de meios de comunicação (por exemplo, para fazer uma mistura principal para 100 poços, ressuspender 3,5 milhões de células em 13 ml de meio). Modifique o número de células para caber projetos experimentais individuais e cronogramas. Para o tratamento de células ~ 18 horas após o plaqueamento, adicionar 35.000 células em cada poço de uma placa de 96 poços.
- Usando uma pipeta de multi-canal, lentamente pipetar 130 ul de suspensão de células de mistura principal para cada poço de um fundo plano, de cultura de tecidos tratados com placa de 96 poços. Enquanto o plaqueamento, colocar a ponta da pipeta no centro do poço, não tocar no fundo da placa.
NOTA: Embora o plaqueamento formato pode ser alterado, é recomendado fazer n = 4 para cada um dos poços de linhas de células de 1-3 por placa. O restante da placa (n = 84) é reservado para a linha celular # 4 (células de biossensor). - Permitir que as células se contentar deixando a placa em repouso durante 10 min à temperatura ambiente. Incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO 2, e &# 8805; 80% de umidade relativa.
- Num tubo, combinar o reagente de transfecção, tais como Lipofectamina, com meio de soro reduzido, como Opti-MEM para preparar uma mistura principal. Por bem, adicione 1,25 reagente de transfecção ul e 8,75 mL de mídia de soro reduzido. Flick tubo suavemente para misturar, brevemente girar para baixo, e incubar durante 5 min à TA.
- Em um outro tubo, combinar material de semente (alíquota de lisado do passo 2.9) com meios de soro reduzido.
NOTA: O volume do material de semente irá variar de acordo com a experiência individual. Ao escolher o volume de sementes, levar em consideração: abundância de sementes em uma amostra e toxicidade potencial. Homogenatos brutos pode ser tóxico para as células. Como tal, usar a menor quantidade possível de monitorar o efeito desejado. Anteriormente testados volumes de lisado / poço gama FRom pi 1-5, correspondendo a 5-20 ug de proteína total. Certifique-se que o volume total por poço (sementes + media de soro reduzido) é 10 jul. - Juntar o conteúdo dos dois tubos descritos em 4.1 e 4.2, súbito suavemente para misturar, brevemente girar para baixo (1.000 x g, 5 segundos), e incuba-se à temperatura ambiente durante pelo menos 20 minutos e até 2 horas.
- Pipeta suavemente 20 ul de complexo de transdução no lado de poços individuais de biossensor. Use três repetições técnicos, se possível. Células tratadas e volta para a incubadora durante 24-48 hr. Incubar sob as mesmas condições tal como descrito no passo 3.6.
NOTA: A condição de controle negativo apropriado para esta configuração é células de biossensor tratados com lipossomas vazios (ou seja, reagente lipossoma + media de soro reduzido) porque a aplicação de fosfolipídios introduz uma ligeira mudança no perfil de fluorescência em relação ao biossensor células não expostas ao reagente lipossoma. - Usando uma pipeta multi-canal, aspirar todo o meio celular (150 mL). Trypsinize (50 ul) as células durante 5 min, e diluiu-se com 150 ul de meio de cultura gelado. Não inclua uma lavagem com PBS antes da tripsinização neste passo, uma vez que pode provocar elevação de células e perda de células subsequente. Excluir todas as células mortas e detritos contaminantes durante a citometria de fluxo através de estratégias de propagação.
- Imediatamente após têmpera, as células de transferência para uma placa de fundo bem rodada 96, e centrifugar a 1000 xg durante 5 min TA.
- Aspirar e descartar meio, tomando cuidado para não perturbar o pellet celular.
- Suavemente, mas completamente, ressuspender o sedimento celular em 50 ul de 2% de paraformaldeído, e incubar durante 10 min. Alternativamente, as células são executados ao vivo, embora a fixação fornece resultados mais limpas e mais consistentes.
- Centrifugar a 1.000 células xg durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar e descartar paraformaldeído, tomando cuidado para não perturbar o pellet celular.
- Suavemente, mas completamente, ressuspender o sedimento celular em 200 ul de tampão de citometria de fluxo gelada (HBSS, 1% de FBS, 1 mM de EDTA) e rodar a placa, o mais rapidamente possível para evitar a aglutinação de células.
- Faça um Scatter-Side Area (SSC-A) vs Forward Scatter-Área (FSC-A) gráfico de duas variáveis, e com a linha celular # 1 em execução, ajustar as tensões e FSC SSC até que a população celular está no quadrante inferior esquerdo. Clique na ferramenta polígono, e definir a população de células (Portão P1). Para todos os parâmetros de propagação veja a Figura 2.
- Faça uma FSC-H (altura) vs enredo FSC-A bivariada, e aplicar Portão P1 para este lote, clicando em "ao vivo" acima da trama, e selecionando P1. Com a linha celular # 1execução, clique na ferramenta polígono, e definir células individuais (Portão P2).
- Faça 3 histograma, uma para cada um dos filtros de interesse: PCP, YFP, e FRET. Aplicar Portão P2 a todas estas parcelas, clicando em "ao vivo" acima das parcelas, e selecionando P2. Com a linha celular # 1 em funcionamento, ajustar tensões de tal modo que a população de células intermédias na PCP, YFP, FRET e histogramas são todos entre 0 e 1. Para medir PCP e de FRET, excitar células com o laser de 405 nm, e com uma captura de fluorescência 450/50 nm e 525/50 nm, filtro, respectivamente. Para medir YFP, excitam células com um laser de 488 nm e captura de fluorescência com um filtro 525/50 nm. As configurações de filtro de laser e são descritos mais adiante na Tabela 2.
- Execute a compensação para PCP spillover para os canais FRET e YFP.
NOTA: Compensação é o processo de correção de escape de fluorescência. O escape de fluorescência ocorre quando a emissão de fluorescência de um fluorocromo é detectada dentro de um filtro designed para medir sinal de outro fluorocromo. Com compensação apropriada, o transbordamento de fluorescência PCP pode ser removido a partir dos canais de FRET e YFP.
NOTA: Compensação requer a presença de ambas as células -positivas e negativos de fluorescência. Assim, para compensar em células CFP-positiva (linha celular # 2), células negativas (linha celular # 1) devem ser adicionados à amostra antes da passagem.- Pico de 30 ul de linha celular # 1 de suspensão de um único poço em 200 ul de linha celular # 2 suspensão imediatamente antes da compensação.
- Clique no ícone "Configurações do instrumento", depois no separador "compensação", e verificar "matriz" para abrir a tabela de compensação.
- Adicione uma FRET-A contra-PCP Um gráfico de duas variáveis, e aplicar porta P2, tal como descrito na etapa 6.3. Com linhas celulares 1 + 2 em execução, clique no ícone "quadrante" e desenhar quadrantes tal que os fluorescência -negativas e -positivas populações são separados pelos dois quadrantes inferiores (Portões LL3 umND LR3, respectivamente).
- Criar uma tabela de estatísticas que mostra a intensidade mediana de fluorescência (MFI) de FRET para o LL3 e portões LR3. Ajustar o parâmetro de FRET na matriz de compensação até a MFI do sinal de FRET é equivalente entre LL3 e LR3. Após este passo, o MFI do sinal de FRET é igual entre as células não coradas e células PCP-positivas, sugerindo a ausência de PCP extravasamento para o canal de FRET.
- Adicione uma YFP-A contra-PCP Um gráfico de duas variáveis, e aplicar porta P2, tal como descrito na etapa 6.3. Desenhe quadrantes (LL4 e LR4) semelhante ao que fez no passo 6.4.3.
- Criar uma tabela de estatísticas que mostra o MFI de YFP para LL4 e LR4. Ajustar o parâmetro YFP na matriz de compensação até a MFI do sinal YFP é equivalente entre LL4 e LR4. Após este passo, o MFI de um sinal YFP é igual entre as células não coradas e células PCP-positivas, sugerindo a ausência de PCP extravasamento para o canal de YFP.
- Folldevido configuração do portão e compensação, realce poços de interesse e executar o restante do prato.
- Depois de todas as amostras foram executados, arquivos de dados de exportação clicando em 'arquivo', então 'copiar'. Selecione a guia 'arquivos de dados', realce a pasta experimento, e clique em 'copiar'.
- FCS arquivos abertos na citometria de fluxo programa de análise.
- Com base nas propriedades de dispersão, utilizar uma porta poligonal para definir a população de células (vs SSC FSC) e população singuleto (FSC-H vs FSC-A) a partir de células tratadas com lipossomas vazios, de forma semelhante à que se descreveu na Secção 6.
- Se foi realizada a compensação CFP durante a instalação, não se ajustam mais PCP.
- Criar um traste vs YFP bivariada enredo. Usando linha celular # 3, Definir uma porta de FRET falsa pelo desenho de um portão poligonal que corre ao longo do declive da população de células positiva FRET. Este portão exclui YFP células individuais-positiva que emitem um sinal de FRET dentro do filtro, e é desenhado semelhante ao mostrado anteriormente, proibindo et al. 22
- Definir um portão FRET traçando células CFP / YFP tratados com lipossomas vazios em um FRET vs PCP bivariada enredo. Introduzir um portão poligonal ao longo da inclinação da população que se estende para cima e para a esquerda para longe da população. Esta porta deve excluir a maioria das células (~ 99%), de tal modo que o fundo FRET é ≥1% das células. Todos os eventos que mudam a este portão são considerados FRET-positivo.
NOTA: cada uma das portas anteriormente descrito é aplicado a todas as amostras antes de construir portas posteriores. Após a análise, quatro portas individuais são definidos (população celular; singleto; falsa FRET; FRET). - Parâmetros de análise da ficha de interesse, incluindo: por cento FRET positividade e MFIcélulas de FRET-positiva. Calcular manualmente a densidade FRET integrado medindo o produto de por cento de positividade e MFI.
NOTA: Se a densidade de FRET integrado é usado como uma medida do resultado, definido FRET fundo (tal como definido no passo 7.5) e a maior IMF do que ou igual a 1, a fim de evitar o cálculo de um produto que é menos do que os seus dois factores individuais.
3. repique Biosensor Cells
NOTA:Use quatro linhas de células para este ensaio: HEK 293T (célula linha # 1), RD-P301S-PCP (célula linha # 2), RD-P301S-YFP (célula linha # 3) e RD-P301S-CFP / YFP ( linha celular # 4). Por favor, refira Tabela 1 para a contribuição de cada linha celular para o ensaio.
4. O tratamento de células
NOTA: O dia seguinte, quando as células de biossensor de tau são 60-65% confluentes, preparar complexos de transdução de semente da seguinte forma:
5. As células de colheita para FRET Citometria de Fluxo
6. FRET Citometria de Fluxo
NOTA: Usar um citómetro de fluxo tal como o MACSQuant VYB, que está equipado com FRET compatível com linhas de laser e os conjuntos de filtros (Tabela 2). Para cada passo dentro desta seção, clique no bem de interesse usando o modelo de 96 poços do software e clique em"Jogar" para começar a captação de amostra e fluxo. Faça parcelas ou tabelas de estatísticas, clicando no ícone 'janela nova análise'. Alterar parâmetros do eixo em lotes individuais bivariadas clicando no título em X ou eixo Y e selecionando o filtro apropriado. Para deslocar as populações de células ou de sinais de fluorescência, aumentar ou diminuir as tensões associadas com os filtros apropriados. Com este instrumento, execute <1.000 eventos / seg para assegurar o acompanhamento de uma única célula precisa.
Análise 7. Dados
NOTA: Alterar parâmetros do eixo em lotes individuais bivariadas clicando no título em X ou eixo Y e selecionando o filtro apropriado.
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Representative Results
FRET citometria de fluxo permite sensível, quantitativa e rápida detecção de atividade semeadura a partir de amostras recombinantes ou biológicas. Ensaio de configuração é fácil: As linhas celulares estáveis que expressam monoclonais derivados de tau-RD-PCP / YFP são transduzidas com material de semente, incubou-se durante 24-48 h, e submeteu-se a análise de citometria de fluxo (Figura 1A). Na ausência de sementes, as células de biossensor manter tau numa forma solúvel, monomérica (Figura 1B). Na presença de sementes, no entanto, as células de biossensor converter tau num estado agregado (Figura 1C), a produção de uma resposta de FRET, que é detectada em uma base por-célula com citometria de fluxo. Avaliação quantitativa mostra que as células de biossensor responder a concentrações fentomolar de material de semente e a semeadura que a actividade pode ser medida de forma eficaz através de três ordens de grandeza (Figura 1D).
Foram estabelecidos parâmetros de propagação para garantir a detecção de uma de true sinal de FRET, mesmo em baixas concentrações de sementes. Em primeiro lugar, os métodos de propagação padrão são usadas para isolar a população de células (Figura 2A) e as células individuais (Figura 2B). FRET sinal falso pode surgir de ativação direta da YFP pelo laser de 405 nm. Assim, um portão de FRET Falso é desenhado a partir de uma única população de células-YFP positiva para excluir contaminantes sinal (Figura 2C). Por último, o portão de FRET é definido a partir de células não semeadas PCP / YFP dupla-positivo (Figura 2D). Um portão é aproximado a inclinação da população que se estende para cima e para a esquerda para longe dele. Células não estimuladas deve ter um fundo FRET valor definido como aproximadamente 1%, e células-FRET positiva irá mudar para este portão de uma forma dependente da dose (comparar com a figura 2E e 2F). Vários parâmetros são tidas em conta FRET com citometria de fluxo, incluindo: positividade por cento (isto é, o número de células positivas por FRET contagem total de células) E a intensidade de fluorescência média (ou seja, o grau em que uma resposta de FRET é produzido numa célula de FRET-positivo). Densidade integrada de FRET é a medida do resultado preferida, uma vez que é o produto de duas variáveis e totalmente representa o grau de actividade de semeadura induzida por uma dada amostra.
FRET citometria de fluxo é compatível com P301S taupatia lisados cerebrais derivadas de rato, mesmo em idades jovens, como exibido na Figura 3. Após microdissecação de quatro regiões diferentes do cérebro, fricção citometria de fluxo foi usada para medir a actividade de sementeira a partir do tronco cerebral (Figura 3A), neocórtex (Figura 3B), lobo frontal (Figura 3C), e hipocampo (Figura 3D) em ratinhos P301S mais de uma gama de idades. Em cada região, a atividade semeadura aumentou com a idade e apareceu em apenas 1,5 meses. No entanto, os ratos knockout tau ("KO")> 12 mos nunca exibido atividade semeadura. Em comparação com hAs análises istological realizada dentro dos mesmos animais, esta é de seis semanas mais cedo do que o aparecimento de qualquer outro marcador de deposição de tau (Figura 3E), incluindo marcadores de tau conformacionalmente aberrante (MC1), Tau hiperfosforilada (AT8 e PG5), e amilóide conformação (ThioflavinS). Do ponto de vista mecânico, a detecção de actividade proximal semeadura tau sugere sementes como um mediador causal do aparecimento e / ou progressão taupatia. A partir de uma vista experimental, isto sugere que a análise da actividade de sementeira pode ser um suplemento ideal para medidas dos resultados normalizados de deposição de tau, dado o seu aparecimento precoce e robusta.
Além de ratinhos transgénicos, fricção citometria de fluxo é compatível com lisados de cérebro humano e podem facilmente detectar agregados de tau isolados de sujeitos com Doença de Alzheimer (Figura 4). Quando o tecido do cérebro humano congelado é homogeneizado no mesmo modo que o descrito aqui para P301S lisados cerebrais, actividade sementeirarobustamente é detectado a partir de todas as amostras derivadas de pacientes com AD. Em contraste, a atividade de semeadura nunca é detectada a partir de lisados de sujeitos de controlo de doenças da mesma idade ou Huntington. Isto enfatiza a especificidade do ensaio para os agregados tau.
Embora o foco deste artigo é a detecção sensível de actividade semeadura tau utilizando a entrega mediada por lipossomas de agregados em células HEK 293T biossensores, mais fisiológicas paradigmas de cultura de células também pode ser realizada com FRET citometria de fluxo para avaliar os mecanismos básicos absorção celular. Por exemplo, as culturas neuronais primárias podem ser infectadas com lentivírus expressando tau-RD-PCP e tau-RD-YFP constrói na altura do plaqueamento. No DIV4, agregação está ausente em células não tratadas (Figura 5A), mas detectável nos neurónios tratados com material contendo sementes (Figura 5B). Importante, fosfolípidos são excluídos nestas experiências, permitindo a investigação da fisiológico e Pat mecanismos de semeadura hophysiological. Assim, a aplicação de fibrilas de tau leva a absorção mediada por HSPG neuronal e estimula a agregação de uma forma dependente da dose que pode ser quantificado com citometria de fluxo de FRET (Figura 5C). Além disso, o ensaio pode ser utilizado na avaliação da terapêutica de absorção de tau e semeando bloqueio in vitro utilizando células HEK 293T tau biossensor. Mesmo na ausência de fosfolípidos, ambas as fibrilas recombinantes (Figura 5D) e P301S lisados cérebro (Figura 5E) induzir a agregação tau. Pré-incubação dessas sementes tau com heparina (previamente mostrado como sendo um inibidor potente da absorção de tau PGHS-mediada), no entanto, elimina a sua capacidade de semeadura. Esta configuração experimental poderia ser aplicada a qualquer droga (por exemplo, anticorpos, pequenas moléculas, etc.) e permitiria a avaliação rápida de absorção e / ou terapêutica de modificação de sementes.
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Figura 1. FRET citometria de fluxo sensível detecta atividade semeadura tau 16. 293T Monoclonal HEK expressando tau-RD-CFP / YFP foram transduzidas com amostras recombinantes ou biológicos, incubadas por 24-48 h, e analisadas em uma base única célula utilizando citometria de fluxo (A). Células não estimuladas manter tau-RD em estado monomérico (B), enquanto que as células tratadas com o material de visualização contendo inclusões proeminentes da semente (C). Avaliação quantitativa (média ± SEM) de shows de atividade sementeira que traste citometria de fluxo é sensível a concentrações fentomolar (monômero equivalentes) de material de semente recombinante e detecção se estende por três ordens de magnitude (D). Equivalente monómero representa a quantidade total de proteína contida na reacção fibrillization e não corrige para a incompleta &# 160; incorporação de monómero em material agregado. Assim, a concentração de agregados reais (sementes) deve ser inferior ou igual à sua «equivalente monómero". * Modificado de Holmes e Furman et al. 16 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Supressão estratégia para FRET citometria de fluxo. População celular (A) e / singlet dupleto (B) portões são desenhados com citometria de fluxo padrão metodologia. Um portão de FRET falso (C) é traçada a partir de um único células positivas para eliminar YFP YFP exsudação dentro do filtro de FRET. Um portão de FRET (D) é construída a partir de células tratadas com lipossomas vazios, taisNeste contexto FRET é ≥1%. A mudança da população para o portão FRET aparece após o tratamento com material de semente-positivo (E) ea mudança torna-se cada vez mais proeminente com maior quantidade de material de semente (F). Leituras finais incluem:. Cento FRET positividade, intensidade de fluorescência mediana (MFI) de eventos FRET-positivos, ea densidade FRET integrado (Integrated células positivas FRET Densidade = percentagem * MFI) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A progressão da actividade semeadura tau em ratinhos P301S 16. Actividade Sementeira (média ± SEM) a partir de homogeneizados de cérebro de ratos P301S resulta em 1,5 meses em tronco cerebral (A), Neocórtex (B), lobo frontal (C), e hipocampo (D). No entanto, a actividade de semeadura nunca é observada em ratinhos knockout tau (> 12 meses). Sementeira atividade aumenta com a idade e precede o aparecimento de outros marcadores histológicos comuns, incluindo MC1, AT8, e PG5 (E). * Reproduzido com permissão de Holmes e Furman et al. 16 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Compatibilidade de FRET citometria de fluxo com amostras biológicas humanas 16. Quando as células de biossensor tau-RD-PCP / YFP são transduzidas com 20 ug de lisado cérebro humano, a semeadura robusta (média ± SEM) ocorre em todos testados disea de Alzheimercérebros si, enquanto lisados de controlo de doenças da mesma idade e Huntington não têm atividade de semeadura. * Modificado de Holmes e Furman et al. 16 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. aplicações alternativas para FRET citometria de fluxo 16. Neurónios primárias transduzidas com codificação lentivírus tau-tau-PCP e YFP constrói. Na ausência de sementes exógenos não há agregação aparente (A), mas não há, na presença de sementes (B). Biossensores neuronais responder dependente da dose, a sementes de tau recombinante, mesmo na ausência de entrega mediada por fosfolípido (C). A pré-incubação de recombinante (D) ou bifisiológicos (E) fontes de sementes com heparina, um inibidor de absorção de PGHS-mediada semente tau, FRET esgota a capacidade de resposta das células de biossensor HEK 293T. De avaliação exibe quantitativas (média ± SEM). * Modificado de Holmes e Furman et al. 16 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: As linhas celulares usados com FRET citometria de fluxo. Células HEK 293T são usados para citometria de fluxo de configuração. PCP células single-positivos são utilizados para a compensação (*). Células single-YFP positivos são usados para eliminar FRET sinal falso devido à ativação direta de YFP por 405 nm de excitação. Células duplo-positivas CFP / YFP são compatíveis com FRET e servir comoas células de biossensor. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.
Tabela 2:. Citômetro de fluxo configurações de laser e filtros Clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.
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Discussion
A citometria de fluxo sistema FRET aqui descrito é uma ferramenta poderosa para a rápida e quantitativamente avaliar a atividade tau semeadura. Ela exige apenas a experiência de cultura celular moderada e um conhecimento prático de FRET e citometria de fluxo. Outros ensaios de semeadura, como Tioflavina T - que exibe fluorescência aumentada quando obrigado a estrutura de folha beta - são trabalhosos e requerem um substrato de proteína pura, recombinante. Além disso, os ensaios in vitro de semeadura para tau são apenas semi-quantitativos e geralmente insensível a níveis de material de semente subnanomolares 23,24. Traste citometria de fluxo, no entanto, fornece uma medida quantitativa e extremamente sensível de actividade semeadura a partir de amostras, quer recombinantes ou biológicas. Além disso, as adaptações ao procedimento pode torná-lo útil para o estudo de uma variedade de desordens de agregação de proteína.
Embora o protocolo aqui descrito concentra-se em tau semeadura, apenas são necessárias modificações simples to permitir que um usuário para monitorar a atividade de semeadura de tipos alternativos de sementes proteopathic. Como demonstrado em Holmes e Furman et ai., A criação de uma linha celular monoclonal que expressa estavelmente α-sinucleína portador da mutação A53T associada à doença marcados para qualquer PCP ou YFP permitiu a detecção sensível de actividade semeadura a partir de comprimento completo sinucleína-ct fibrilas recombinantes 16 . Experiências semelhantes foram realizadas usando células de biossensor huntingtina, que também detectam eficazmente a agregação de proteínas. Assim, por simples modificação da proteína biossensor, fricção citometria de fluxo é compatível com diversas fontes de sementes. Outras modificações do ensaio, incluindo paradigma de tratamento e modelo de células, podem ser usadas para fazer FRET citometria de fluxo mais aplicável à avaliação de mecanismos fisiológicos. Neste protocolo, as sementes foram directamente introduzidos em células de biossensor através de transdução mediada por lipossomas como uma maneira para aumentar a sensibilidade.
É importante para nota, no entanto, que isto não é um requisito. Tau agrega a partir de amostras biológicas ou recombinantes de ratinho são ainda capazes de semear as células de biossensor na ausência de lipossomas (Figura 5). Assim, laboratórios interessados em estudar propagação fisiológica e / ou mecanismos de absorção de sementes de tau pode ainda empregar o ensaio. Além disso, fricção citometria de fluxo é compatível com culturas primárias neuronais. Ao infectar células com construções CFP- e lentivirais YFP-codificados no momento do plaqueamento, eficiente resposta de FRET é alcançado em concentrações nanomolar a seguir ao tratamento com fibrilas de tau recombinante, mesmo na ausência de lipossomas (Figura 5). Tomados em conjunto, estes dados indicam que a citometria de fluxo de FRET é útil para o estudo dos mecanismos fisiológicos de sementeira para uma variedade de agregados de proteína e em vários modelos de cultura celular.
Enquanto o FRET citometria de fluxo do sistema é fácil de usar e adaptável, determinados passos fundamentais deve serseguido para assegurar a compatibilidade, incluindo a preparação da amostra e de confluência de células adequada no momento do tratamento. Alta intensidade de sonda de ultra-sons de espécimes do cérebro é fundamental para o isolamento eficaz e óptima da actividade semeadura. Durante o desenvolvimento e optimização, observou-se que este método é que mais de 10 vezes mais eficaz a isolar actividade semeadura a partir de cérebros de rato P301S relativos a outras técnicas comuns, por exemplo, a homogeneização de mão. É possível que muito grandes agregados de tau tem uma relativamente baixa propensão semeadura, e sonicação com sonda, que é mais eficaz para quebrar estes agregados, em fragmentos menores de semente-compatível. A duração ea frequência de sonicação pode ser modificada, se necessário, embora as configurações acima descritas são recomendadas para a detecção sensível de actividade semeadura.
Confluência celular no momento do tratamento também é de extrema importância, uma vez que afecta tanto a sensibilidade ea saúde celular. Se uma célulasre também confluentes, eles não são facilmente levar até fosfolipídios e material de semente, diminuindo assim drasticamente a sensibilidade. Se confluência é demasiado baixa, a adição de material de semente fosfolípidos e podem ser tóxicos. Testes empíricos mostra que uma confluência de 60-65% biossensor é ideal para o tratamento e capacidade de resposta subseqüente.
Como observado no protocolo, algoritmos de compensação são usados regularmente para excluir PCP spillover no YFP FRET e canais, eliminando assim falsos sinais e aumentando a sensibilidade. Para uma avaliação mais rápida e qualitativa de actividade de sementeira, no entanto, este passo pode ser omitido ou post hoc realizada usando software de análise de citometria de fluxo. Um sinal mais limpo e mais robusto é obtido na sequência de compensação, no entanto, e, portanto, para a análise quantitativa e mais rigorosa este passo é altamente recomendável.
Uma limitação do ensaio é a sua incapacidade para informar sobre a bioquímica composição deas sementes proteopathic. A corrente de semeadura ensaio mede a actividade, uma propriedade funcional de sementes. A determinação da natureza bioquímicas e biofísicas das sementes exigirá acoplamento para ensaios de imunoprecipitação tradicionais, tais como, cromatografia, dicroismo circular, espectroscopia de massa, etc. No entanto, este ensaio será útil na avaliação de semeadura potência como um ponto de extremidade de uma miríade de espécimes.
Este ensaio foi recentemente utilizada para quantificar e caracterizar o curso temporal de semear desenvolvimento e progressão em ratinhos P301S em relação a outros marcadores comuns de tau deposição, tais como manchas histológicas. Neste estudo, a atividade tau semeadura foi evidente ao longo de seis semanas antes do mais antigo marcador histológico (MC1) que testamos 16. Dada a sua rápida aparição, atividade semeadura pode representar um suplemento importante, ou mesmo alternativa, medida de desfecho para avaliar a eficácia de intervenções terapêuticas, pelo menos para estudos preliminares.Ao encurtar o curso do tratamento e estudar mais jovens animais, os custos de habitação e tempo de resposta experimental irá diminuir. É concebível que a terapêutica pode ser administrada a ratos P301S em 4-6 semanas e avaliadas quanto à actividade cérebros semeadura 2-4 semanas mais tarde. Alternativamente, a avaliação da terapêutica anti-tau em células pode ser realizada dentro de alguns dias, avaliando a sua capacidade para bloquear a indução da actividade de sementeira em células de biossensor, como demonstrado na Figura 5.
Em conclusão, o FRET citometria de fluxo semeadura ensaio é uma maneira fácil e eficiente para detectar tau semeadura a partir de fontes recombinantes ou biológicas. A sensibilidade deste método é incomparável por outros em ensaios in vitro de semeadura de tau, e pode ser empregue para detectar a alteração patológica mais rapidamente em ratinhos taupatia P301S. Além disso, a sua flexibilidade no controlo numerosas sementes proteopathic sob diferentes condições de tratamento, e com vários modelos de cultura celular, o torna útil paraqualquer laboratório agregação de proteínas interessado em reunir rapidamente os dados quantitativos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TBS | Sigma | T5912 | |
| cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free) | Roche | 4693159001 | |
| Cryo-vials | Sarstedt | 72.694.006 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 105DU | |
| Weighing Boats | Fisher Scientific | 13-735-743 | |
| 15 ml conical tube | USA Scientific | 1475-0501 | |
| Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer | Omni International | 18-000-115 | |
| Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer | Omni International | OR-T-156 | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A451 | |
| Noise Cancelling Ear Muffs | Fisher Scientific | 19-145-412 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | S47299 | |
| 1.5 ml tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 000.215 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 50 ml Conical Tubes | Phenix Research | SS-PH15 | |
| 25 ml reagent resevoirs | VWR | 41428-954 | |
| Multi channel pipet | Fisher Scientific | TI13-690-049 | |
| 96 well flat bottom plates | Corning | 3603 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3788 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |
| Sorvall ST 40 Centrifuge | Thermo Scientific | 75004509 | |
| BIOLiner Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003796 | |
| Hemacytometer | VWR | 15170-172 | |
| MACSQuant VYB Flow Cytomter | Miltenyi Biotec | 130-096-116 | |
| Chill 96 Rack | Miltenyi Biotec | 130-094-459 | |
| Flow Jo analysis software | Flow Jo | ||
| 20 μl pipet tips | Rainin | GPS-L10 | |
| 200 μl pipet tips | Rainin | GPS-250 | |
| 1 ml pipet tips | Rainin | GPS-1000 | |
| 200 μl pipet tips | USA Scientific | 1111-1800 | |
| 5 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-606180 | |
| 10 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-607180 | |
| 25 ml Serological pipett | Phenix Research | SPG-760180 |
References
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