Introduction
L'accumulation intracellulaire de la protéine tau amyloïdes tauopathies définit comme la maladie d'Alzheimer. Dans les stades précoces de la maladie, la pathologie est généralement localisée à des régions discrètes du cerveau, mais avec la progression de la maladie, la pathologie se propage le long de invariablement réseaux neuronaux distincts 1-5. L'accumulation de preuves suggère transcellulaire propagation d'agrégats de protéines toxiques à la base de cette pathologie (revue dans 10/06). Dans ce modèle, les graines proteopathic (par exemple, tau) sont libérés de cellules du donneur et pénètrent dans les cellules voisines, la transformation de la protéine tau natif dans le formulaire mal repliées via templated changement conformationnel 11-15. L'essai décrit ici a été développé pour détecter sensibilité telle activité d'ensemencement. Il est compatible avec la protéine recombinante et des échantillons biologiques et permet la quantification des niveaux d'activité minute d'ensemencement proteopathic 16.
Des cellules HEK 293T qui expriment de manière stable la protéine tau répétition dOMAINE (RD) contenant le P301S mutation associée à la maladie soit fusionnée à PCP ou YFP (ci-après dénommé cellules tau-RD-CFP / YFP) servir un biocapteur stable de l'activité d'ensemencement. En l'absence de graines proteopathic, maintenir les cellules tau en tant que monomère soluble, pas de fond et ont FRET appréciable. L'absorption spontanée ou transduction médiée par des liposomes de graines de tau dans les cellules, cependant, conduit à RD-CFP et YFP-agrégation RD, qui produit un signal de FRET qui est mesurée dans des cellules individuelles par cytométrie en flux.
De nombreux composants de cet essai ont été conçus pour améliorer la sensibilité et de réduire la variabilité. Une lignée cellulaire monoclonal avec un 1: RD-CFP / YFP 1 ratio d'expression a été choisi, car il fournit un signal optimal: le bruit. Pour augmenter la sensibilité, les phospholipides sont utilisés pour introduire les graines directement dans les cellules (bien que d'étudier les mécanismes biologiques de l'absorption, cela peut être omise). Enfin, la cytométrie de flux moniteurs FRET au niveau de la population et une seule cellule niveau, contrairement à d'autres essais d'agrégation des protéines. Le critère d'évaluation finale, la densité de FRET intégré, est hautement quantitative et représente à la fois pour le nombre de cellules présentant l'agrégation, et la mesure dans laquelle l'agrégation a eu lieu au sein de chaque cellule. Tous ces paramètres optimisés améliorer la sensibilité et de garantir la reproductibilité.
Ce système a été récemment utilisé dans une étude approfondie dans les souris transgéniques tauopathie P301S 17 qui a évalué l'apparition temporelle et la progression de l'activité d'ensemencement de tau par rapport à d'autres marqueurs pathologiques de la protéine tau couramment utilisés (par exemple, MC1, AT8, PG5, et thioflavines). L'activité de semis est de loin le marqueur précoce et le plus robuste de la pathologie tau évalué, précédant la détection histologique par au moins 6 semaines. Semis activité apparaît à 1,5 mois et augmente progressivement avec l'âge, ce qui suggère un rôle causal de graines proteopathic dans l'apparition et / ou la progression de la neurodégénérescence 16.
e_content "> quantification précise des niveaux infimes de matériel de semence à partir d'échantillons biologiques peut faciliter les études qui surveillent la progression de la maladie au stade précoce. En raccourcissant la durée du procès et permettant l'utilisation d'animaux plus jeunes, ce qui pourrait accroître l'efficacité et la précision des essais précliniques animales. Par exemple, dans P301S la souris décrit ci-dessus, les composés du plomb peuvent être fournis aussi tôt que 4-6 semaines (juste avant, ou au début de l'activité d'ensemencement), et pour surveiller l'efficacité 2-4 semaines plus tard. Le dosage devrait quantifier avec précision toute réduction des semis activité. FRET cytométrie en flux a in vitro applications de criblage ainsi. Par exemple, des réactifs anti-tau (par exemple, des anticorps, de petites molécules, etc.) peut être testé rapidement pour leur capacité à bloquer l'ensemencement induction directement dans la culture, en utilisant soit la protéine tau recombinante agrégats ou lysats dérivé du cerveau comme une source de graines (figure 5). Avec cette configuration, une fois matériel de semence est préparé, un exexpé- prend seulement trois jours pour compléter, y compris l'analyse de données. La quantification rapide de l'activité d'ensemencement proteopathic peut donc faciliter de nombreuses études de la neurodégénérescence.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTE: Ce protocole met l'accent sur l'utilisation de FRET cytométrie en flux pour détecter l'activité d'ensemencement à partir d'échantillons biologiques de la souris. Il est également compatible avec des fibrilles recombinantes et des échantillons biologiques humains. Souris l'euthanasie et le cerveau la récolte a été effectuée conformément aux procédures IACUC approuvés.
1. Extraction cerveau
- À la suite de l'anesthésie profonde avec de l'isoflurane (2%), perfuser une souris avec du PBS glacé contenant 0,03% de l'héparine, et extraire le cerveau en suivant les indications de Gage et al. 18
- Placez le tissu extrait dans un cryo-fiole, et enclenchez gel en plaçant dans l'azote liquide. Alternativement, geler les tissus sur glace sèche. Une fois congelés, transférer tissu à -80 ° C et magasin pour une période de temps prolongée, si nécessaire.
Remarque: Ce protocole est compatible avec des homogénats de cerveaux entiers ou de régions du cerveau micro-disséqué. Voir Hagihara et al. Pour un protocole détaillé micro-dissection 19. 2. Préparation des semences du matériel biologique - Préparation du tampon d'homogénéisation par dissolution d'inhibiteurs de la protéase (EDTA libre) dans TBS 1x (1 comprimé pour 10 ml). Vortex vigoureusement, et conserver dans la glace. Les inhibiteurs de protéase doivent être EDTA libre afin de préserver la viabilité des cellules biocapteur.
- Peser le tissu cérébral congelé dans un bateau peser jetable, et la transfère dans un tube conique de 5 ml. Ajouter du tampon d'homogénéisation glacé de telle sorte que la solution finale est de 10% poids / volume. Stocker temporairement sur la glace. Masse tissulaire et le volume de tampon d'homogénéisation subséquente varient en fonction de la taille du cerveau et / ou des régions utilisées. Ici, un hemibrain de la souris adulte pesant 0,2 g est mis en suspension dans 2 ml d'une solution à 10% p / vol.
- Les échantillons dans une chambre froide de transfert, et ajuster un sonicateur à sonde pour les réglages appropriés. Pour sonde ultrasons avec un Ruptor Omni (illustré ici), régler la puissance à 20%, ce qui correspond à environ 75 W. L'utilisation d'un mode d'impulsion afin que les échantillons ne sont pas OVer-chauffé pendant la sonication. Régler le générateur d'impulsions de 30%, correspondant à environ 500 msec.
- Nettoyer la pointe de l'appareil à ultrasons de la sonde par rinçage à l'eau, de l'isopropanol, et de l'eau à nouveau, en essuyant la sonde entre chaque solution. Soyez certain d'Rincer et essuyer les deux côtés et le fond de la sonde avec Lab-lingettes.
- Travailler avec un échantillon à la fois, plonger la pointe de la sonde dans le tampon d'homogénéisation, et démarrer le traitement ultrasonique. Utilisation des paramètres de puissance et de pulseur décrites ci-dessus, de livrer 25 impulsions totales. Assurez-vous que le tissu est complètement en suspension. Soyez prudent pour éviter de faire mousser l'échantillon lors de cette étape.
REMARQUE: Les échantillons sont sensibles à la formation de mousse si a) le volume total est faible ou b) l'homogénat réchauffe. Avec cet instrument spécifique, ne soniquer avec des volumes inférieurs à 250 pi. Pour assurer que les échantillons restent réfrigérés, les tubes peuvent être stockés sur la glace lors de cette étape. - Nettoyez la sonde en essuyant lysat résiduelle, puis livrer 10 impulsions dans un bécher of l'eau propre. Rincer les côtés et le fond de la sonde avec de l'eau, de l'isopropanol, et de l'eau à nouveau (comme dans l'étape 2.4), essuyage à sec entre chaque étape. Pour éviter la contamination, rincer abondamment la sonde entre les échantillons.
NOTE: Avec agrégats de tau, on n'a pas constaté que les méthodes de nettoyage plus strictes sont nécessaires pour prévenir la contamination échantillon à échantillon. Autres amyloïdes, cependant, peuvent nécessiter des soins supplémentaires qui a été largement décrite dans la littérature 20,21. - Magasin homogénats sur de la glace jusqu'à ce que tous les échantillons ont été traités.
- Spin homogénats à 21 300 g pendant 15 min à 4 ° C.
- Transférer le surnageant dans un tube propre, en prenant soin de ne pas perturber le culot. Jeter le culot. Aliquoter le surnageant, et les lysats de conserver à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. Éviter les cycles de gel / dégel des broyats, cependant, car cela réduit l'efficacité de l'ensemencement.
- Dans un environnement stérile, le milieu de culture par aspiration. Rincer les cellules avec du PBS chaud, et aspirer. Trypsiniser les cellules (3 ml de trypsine-EDTA (0,05%)) pendant 3 minutes, éteindre avec du milieu de culture chaud (9 ml de DMEM, 10% de FBS, 1% de pen / strep, 1% Glutamax), et la transfère immédiatement les cellules à une tube conique.
- Centrifuger les cellules à 1000 g pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le milieu, et le culot de cellules de remettre en suspension dans un milieu de culture chaud.
- L'utilisation d'un hémocytomètre, déterminer la densité de cellules pour chaque lignée cellulaire. La densité cellulaire sera variable en fonction de confluence au moment de la récolte et le volume de remise en suspension. Resuspendre les cellules récoltées à partir d'un plat de 10 cm à 90% de confluence dans 10 ml de milieu, à une densité cellulaire d'être environ 1 million de cellules / ml.
- Faireun mélange maître de cellules + médias tels que chaque puits d'une plaque de 96 puits contiendra 35.000 cellules dans 130 ul médias (par exemple, pour faire un mélange maître pour 100 puits, remettre en suspension 3,5 millions de cellules dans 13 ml de milieu). Modifier le nombre de cellules en fonction des dessins et des échéanciers expérimentales individuelles. Pour le traitement de cellules environ 18 heures après l'étalement, ajouter 35.000 cellules dans chaque puits d'une plaque de 96 puits.
- En utilisant une pipette multi-canal, une pipette lentement 130 pi de mélange maître suspension cellulaire dans chaque puits d'un fond plat, la culture de tissus traité plaque de 96 puits. Alors que le placage, placer la pointe de la pipette dans le centre du puits, ne pas toucher le fond de la plaque.
REMARQUE: Bien que le format de placage peut être modifiée, ce qui rend n = 4 puits pour chacune des lignées cellulaires par 1-3 plaque est recommandée. Le reste de la plaque (n = 84) est réservé pour une lignée cellulaire # 4 (cellules de biocapteurs). - Laisser les cellules sédimenter en laissant la plaque au repos pendant 10 min à température ambiante. Incuber O / N à 37 ° C, 5% CO 2, et &# 8805; 80% d'humidité relative.
- Dans un tube, mélanger réactif de transfection, comme Lipofectamine, avec les médias-sérum réduite, comme Opti-MEM, pour faire un mélange maître. Par puits, ajouter 1,25 ul réactif de transfection et 8,75 pi médias-sérum réduite. Tube de Flick légèrement pour bien mélanger, brièvement tourner vers le bas, et incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Dans un autre tube, combiner du matériel de semences (aliquote de lysat de l'étape 2.9) avec les médias-sérum réduite.
REMARQUE: Le volume de matériau d'ensemencement varie en fonction de l'expérience individuelle. Au moment de choisir le volume de semences, prendre en considération: l'abondance de graines dans un échantillon et la toxicité potentielle. Homogénats bruts peuvent être toxiques pour les cellules. En tant que tel, utilisez le volume le plus bas possible pour surveiller l'effet désiré. Volumes testés précédemment de lysat / puits gamme frOM 1-5 pi, correspondant à 5-20 pg de protéine totale. Assurez-vous que le volume total par puits (Seeds + des médias-sérum réduit) est de 10 pi. - Mélanger le contenu des deux tubes décrits en 4.1 et 4.2, film doucement pour mélanger, centrifuger brièvement (1000 xg, 5 sec), et incuber à température ambiante pendant au moins 20 min et jusqu'à 2 h.
- Pipeter doucement 20 ul de complexe de transduction sur le côté du puits de biocapteurs individuels. Utilisez trois répétitions techniques, si possible. Retour cellules traitées à l'incubateur pendant 24-48 h. Incuber dans les mêmes conditions que celles décrites à l'étape 3.6.
NOTE: La condition de contrôle négative appropriée pour cette configuration est cellules de biocapteurs traitées avec des liposomes vides (c.-à-réactif de liposome + médias sérique réduite) parce que l'application de phospholipides introduit un léger changement dans le profil de fluorescence par rapport à biocapteurs cellules non exposées au réactif de liposome. - En utilisant une pipette à canaux multiples, aspirer tout moyen de cellules (150 ul). Trypsiniser (50 ul) de cellules pendant 5 minutes, et trempe refroidie avec 150 ul du milieu de culture. Ne pas inclure un rinçage PBS avant trypsinisation à cette étape, car il peut causer de levage cellulaire et la perte cellulaire ultérieure. Exclure les cellules mortes et les débris contaminants lors de la cytométrie de flux par l'intermédiaire de stratégies de déclenchement.
- Immédiatement après la trempe, les cellules de transfert à une plaque de fond du puits tour 96, et centrifuger à 1000 g pendant 5 min à température ambiante.
- Aspirer et jeter moyen en prenant soin d'éviter de perturber le culot cellulaire.
- Doucement, mais à fond, remettre en suspension le culot cellulaire dans 50 ul de 2% de paraformaldehyde, et incuber pendant 10 min. Alternativement, les cellules lancez Live, bien que la fixation fournit des résultats plus propres et plus cohérentes.
- Centrifuger les cellules à 1000 g pendant 5 min à température ambiante. Aspirer et jeter paraformaldéhyde, en prenant soin d'éviter de perturber le culot cellulaire.
- Doucement, mais à fond, remettre le culot cellulaire dans 200 pi flux refroidi cytométrie tampon (HBSS, 1% de FBS, EDTA 1 mM) et exécuter la plaque dès que possible afin d'éviter l'agglutination des cellules.
- Faire un Scatter-Side Area (SSC-A) vs Forward Scatter-Zone (FSC-A) graphe bivarié, et avec la ligne de la cellule n ° 1 en marche, régler les tensions SSC et FSC jusqu'à ce que la population de cellules est dans le quadrant inférieur gauche. Cliquez sur l'outil polygone, et de définir la population de cellules (Porte P1). Pour tous les paramètres de déclenchement voir la figure 2.
- Faire une FSC-H (hauteur) vs parcelle de FSC-A bivariées, et appliquer Porte P1 à ce complot en cliquant sur "live" au-dessus du terrain, et en sélectionnant P1. Avec lignée cellulaire # 1exécution, cliquez sur l'outil polygone, et de définir des cellules individuelles (porte P2).
- Faire 3 parcelles d'histogramme, une pour chacun des filtres d'intérêt: CFP, YFP, et le FRET. Appliquer porte P2 à l'ensemble de ces parcelles en cliquant sur "live" au-dessus des parcelles, et en sélectionnant P2. Avec lignée cellulaire # 1 en marche, régler les tensions de sorte que la population de cellule médiane dans la PCP, YFP, et FRET histogrammes sont toutes comprises entre 0 et 1. Pour mesurer la PCP et le FRET, exciter les cellules avec le laser de 405 nm, et la capture de fluorescence avec un 450/50 et 525/50 nm nm filtre, respectivement. Pour mesurer YFP, exciter les cellules avec un laser et la capture de fluorescence à 488 nm avec un filtre 525/50 nm. Les paramètres de laser et de filtrage sont en outre décrits dans le tableau 2.
- Effectuer une compensation pour PCP débordement dans les canaux de FRET et YFP.
REMARQUE: La compensation est le processus de correction de fluorescence de débordement. Fluorescence débordement se produit chaque fois que l'émission de fluorescence d'un fluorochrome est détecté dans un filtre desitiné à mesurer le signal d'un autre fluorochrome. Avec une compensation adéquate, le débordement fluorescence PCP peut être retiré à partir des canaux de FRET et YFP.
REMARQUE: Compensation nécessite la présence de deux cellules -positifs et séronégatifs fluorescence. Ainsi, pour compenser sur les cellules de la PCP-positive (lignée cellulaire n ° 2), les cellules négatives (lignée cellulaire N ° 1) doit être ajouté à l'échantillon avant la course.- Spike à 30 pi de la lignée cellulaire # 1 suspension à partir d'un seul puits dans 200 pi de la lignée cellulaire # 2 suspension immédiatement avant compensation.
- Cliquez sur l'icône «Réglages de l'appareil", onglet puis «de compensation», et vérifier «matrice» pour ouvrir la table de compensation.
- Faire un FRET-A vs PCP-Un complot bivariées, et appliquer porte P2, comme décrit dans l'étape 6.3. Avec lignées cellulaires 1 + 2 en cours d'exécution, cliquez sur l'icône «quadrant» et d'en tirer quadrants tels que les populations fluorescence séronégatifs et séropositifs pour sont séparés par les deux quadrants inférieurs (Portes LL3 unee LR3, respectivement).
- Créer une table de statistiques qui affiche l'intensité médiane de fluorescence (MFI) de FRET pour la LL3 et portes LR3. Réglez le paramètre FRET dans la matrice de rémunération jusqu'à ce que le MFI du signal de FRET est équivalent entre LL3 et LR3. Après cette étape, le MFI du signal de FRET est égale entre les cellules non colorées et les cellules PCP-positifs, suggérant l'absence de PCP débordement dans le canal FRET.
- Faire un YFP-A vs PCP-Un complot bivariées, et appliquer porte P2, comme décrit dans l'étape 6.3. Dessinez quadrants (LL4 et LR4) semblable à celui fait à l'étape 6.4.3.
- Créer une table de statistiques qui affiche l'IMF de la YFP pour LL4 et LR4. Réglez le paramètre YFP dans la matrice de rémunération jusqu'à ce que le MFI du signal YFP est équivalent entre LL4 et LR4. Après cette étape, l'IMF d'un signal YFP est égale entre les cellules non colorées et les cellules PCP-positifs, suggérant l'absence de PCP débordement dans le canal YFP.
- Follen raison configuration de grille et la rémunération, mettre en évidence les puits d'intérêt et exécuter le reste de la plaque.
- Lorsque tous les échantillons ont été exécutés, des fichiers de données d'exportation en cliquant sur «fichier», puis «copie». Sélectionnez l'onglet "fichiers de données", sélectionnez le dossier de l'expérience, et cliquez sur «copie».
- FCS fichiers ouverts dans la cytométrie de flux programme d'analyse.
- Basé sur les propriétés de dispersion, utiliser une grille polygonale à définir la population de cellules (SSC vs FSC) et de la population de singlet (FSC-H vs FSC-A) à partir de cellules traitées avec des liposomes vides, de façon similaire à celle décrite dans la section 6.
- Si la compensation de la PCP a été réalisée lors de l'installation, ne pas régler plus PCP.
- Créer un FRET vs YFP parcelle bivariées. En utilisant la lignée cellulaire # 3, Définir une grille de FRET faux en dessinant une grille polygonale qui court le long de la pente de la population de cellules-FRET positive. Cette porte exclut YFP cellules individuelles positif qui émettent un signal dans le filtre de FRET, et est attirée similaire à celui montré précédemment par Banning et al. 22
- Définir une grille de FRET en traçant des cellules vides de liposomes traités CFP / YFP sur un FRET vs PCP parcelle bivariées. L'introduction d'un grille polygonale le long de la pente de la population qui se prolonge vers le haut et vers la gauche à partir de la population de distance. Cette porte doit exclure la plupart des cellules (~ 99%), de telle sorte que fond FRET est ≥1% des cellules. Tous les événements qui changent dans cette porte sont considérées FRET positif.
NOTE: chaque porte décrit ci-dessus est appliquée à tous les échantillons avant de construire des portes suivantes. Suite à l'analyse, quatre portes individuels sont définis (la population de la Cellule; singlet; fausse FRET; FRET). - Paramètres de l'analyse du dossier d'intérêt, y compris: pour cent FRET positivité et IMFdes cellules de FRET positif. Calculer manuellement la densité de FRET intégré en mesurant le produit de pour cent la positivité et IMF.
NOTE: Si la densité de FRET intégré est utilisé comme une mesure des résultats, mis FRET de fond (tel que défini dans l'étape 7.5) et IMF supérieur ou égal à 1 afin d'éviter de calculer un produit qui est moins que ses deux facteurs individuels.
3. Cellules replacage Biocapteur
NOTER:Utilisez quatre lignées cellulaires pour cet essai: HEK 293T (lignée cellulaire n ° 1), RD-P301S-PCP (lignée cellulaire n ° 2), RD-P301S-YFP (lignée cellulaire 3 #), et RD-P301S-CFP / YFP ( lignée cellulaire n ° 4). S'il vous plaît référencer le tableau 1 pour la contribution de chaque lignée cellulaire à l'essai.
4. le traitement de cellules
NOTE: Le jour suivant, lorsque les cellules de biocapteurs tau sont 60-65% de confluence, préparer des complexes de transduction de semences comme suit:
5. la récolte de cellules pour FRET cytométrie en flux
6. FRET Flow Cytometry
REMARQUE: Utiliser un cytomètre en flux tel que la MACSQuant výb, qui est équipé de FRET compatible laser et les lignes de jeux de filtres (tableau 2). Pour chaque étape de cette section, cliquez sur le bien d'intérêt en utilisant le modèle à 96 puits du logiciel, puis cliquez sur"Play" pour commencer à l'absorption de l'échantillon et le débit. Faire des parcelles ou des tableaux statistiques en cliquant sur l'icône «nouvelle fenêtre d'analyse". Changer les paramètres de l'axe sur des parcelles individuelles bivariées en cliquant sur le titre sur X ou l'axe Y et en sélectionnant le filtre approprié. Pour déplacer des populations de cellules ou des signaux de fluorescence, augmenter ou diminuer les tensions associées aux filtres appropriés. Avec cet instrument, exécutez <1000 événements / sec pour assurer un suivi précis cellule unique.
Analyse des données 7.
NOTE: Changer axe paramètres sur des parcelles individuelles bivariées en cliquant sur le titre sur X ou l'axe Y et en sélectionnant le filtre approprié.
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Representative Results
FRET cytométrie en flux permet sensible, quantitative, et la détection rapide de l'activité de l'ensemencement à partir d'échantillons recombinantes ou biologiques. Configuration de test est facile: lignées cellulaires stables monoclonaux dérivés exprimant la protéine tau-RD-CFP / YFP sont transduites avec du matériel de semences, incubées pendant 24-48 h, et soumis à l'analyse par cytométrie de flux (figure 1A). En l'absence de semences, les cellules de biocapteurs maintenir tau sous une forme monomère soluble (figure 1B). En présence de semences, cependant, les cellules de biocapteurs convertir tau dans un état agrégé (figure 1C), en produisant une réponse de FRET qui est détecté sur une base par cellule avec la cytométrie de flux. L'évaluation quantitative montre que les cellules de biocapteurs répondent à des concentrations femtomolaires de matériel de semences et que l'activité de semis peuvent être efficacement mesurés à travers trois ordres de grandeur (figure 1D).
Paramètres d'ouverture de porte ont été établis pour assurer la détection d'un true FRET signaux, même à de faibles concentrations de semences. Tout d'abord, les méthodes de déclenchement standard sont utilisés pour isoler la population de cellules (figure 2A) et des cellules individuelles (figure 2B). Faux signal de FRET peut provenir de l'activation directe de la YFP par le laser à 405 nm. Ainsi, une porte de FRET Faux est tiré d'une population de cellules simple positif YFP à exclure signal de contamination (figure 2C). Enfin, la porte de FRET est définie à partir de cellules non ensemencés CFP / YFP double-positif (figure 2D). Une porte est attirée près de la pente de la population qui se prolonge vers le haut et vers la gauche loin de lui. Les cellules non stimulées devraient avoir un fond FRET valeur fixée à environ 1%, et les cellules de FRET positif se déplacera dans cette porte d'une manière dose-dépendante (comparer Figure 2E et 2F). Plusieurs paramètres sont pris en compte avec FRET cytométrie de flux, y compris: la positivité pour cent (à savoir, le nombre de cellules FRET-positifs par nombre total de cellules) Et l'intensité de fluorescence médiane (à savoir, le degré auquel une réponse de FRET est produit dans une cellule-FRET positif). FRET densité intégrée est la mesure du résultat préféré, car il est le produit de ces deux variables et représente le degré d'activité d'ensemencement induite par un échantillon donné entièrement.
FRET cytométrie en flux est compatible avec P301S tauopathie lysats de cerveau de souris dérivées, même à un jeune âge, comme affiché dans la figure 3. Après microdissection de quatre régions différentes du cerveau, FRET cytométrie de flux a été utilisée pour mesurer l'activité d'ensemencement du tronc cérébral (figure 3A), néocortex (figure 3B), lobe frontal (figure 3C), et de l'hippocampe (figure 3D) chez la souris P301S sur une gamme d'âges. Dans chaque région, l'activité ensemencement augmente avec l'âge et est apparu à seulement 1,5 mois. Cependant, les souris knock-out (tau "KO")> 12 mos jamais affichés activité d'ensemencement. Par rapport à histological analyses effectuées dans les mêmes animaux, ce est de six semaines plus tôt que l'apparition de tout autre marqueur de la protéine tau dépôt (Figure 3E), y compris les marqueurs de la protéine tau conformation aberrante (MC1), tau hyperphosphorylée (AT8 et PG5), et amyloïde conformation (thioflavines). D'un point de vue mécaniste, la détection proximale de l'activité d'ensemencement tau suggère graines comme un médiateur causal de l'apparition et / ou la progression tauopathie. D'un point de vue expérimental, ce qui suggère que l'analyse de l'activité de semis peut être un complément idéal aux mesures des résultats classiques de dépôt de la protéine tau, compte tenu de son apparition précoce et robuste.
En plus des souris transgéniques, frette cytométrie en flux est compatible avec des lysats de cerveau humain et peut facilement détecter tau agrégats isolés de la maladie d'Alzheimer sujets (figure 4). Quand tissu congelé du cerveau humain est homogénéisé dans la même manière que celle décrite ici pour P301S lysats de cerveau, l'ensemencement activitéest robuste détecté à partir de tous les échantillons provenant de sujets AD. En revanche, l'activité d'ensemencement est jamais détecté à partir de lysats des sujets de contrôle de la maladie de même âge ou de Huntington. Ceci souligne la spécificité de l'essai pour les agrégats de la protéine tau.
Bien que l'accent de cet article est la détection sensible de l'activité d'ensemencement de la protéine tau en utilisant la livraison de liposome d'agrégats dans les cellules HEK 293T de biocapteurs, plus physiologiques paradigmes de culture cellulaire peuvent également être effectuées avec FRET cytométrie de flux pour évaluer les mécanismes de l'absorption cellulaire de base. Par exemple, des cultures de neurones primaires peuvent être infectés par le lentivirus exprimant la protéine tau-RD-PCP et tau-RD-YFP construit au moment de l'étalement. Au DIV4, l'agrégation est absente dans les cellules non traitées (Figure 5A) mais détectable dans les neurones traités par la matière contenant les pépins (figure 5B). Surtout, les phospholipides sont exclus dans ces expériences, permettant l'enquête du physiologique et pat mécanismes d'ensemencement hophysiological. Ainsi, la demande de fibrilles de protéine tau conduit à l'absorption de HSPG médiée neuronale et stimule l'agrégation d'une manière dépendante de la dose qui peut être quantifiée par cytométrie en flux FRET (figure 5C). En outre, le dosage peut être utilisé pour l'évaluation thérapeutique de la protéine tau et l'absorption blocage ensemencement in vitro en utilisant des cellules HEK tau de biocapteurs 293T. Même en l'absence de phospholipides, les deux fibrilles recombinantes (Figure 5D) et P301S lysats cérébraux (figure 5E) induisent l'agrégation tau. La pré-incubation de ces graines avec de l'héparine tau (précédemment révélé être un puissant inhibiteur de l'absorption de la protéine tau à médiation HSPG), cependant, élimine leur capacité d'ensemencement. Cette configuration expérimentale pourrait être appliquée à tout médicament (par exemple, des anticorps, de petites molécules, etc.) et permettrait une évaluation rapide de l'absorption et / ou thérapeutiques de semences modification.
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Figure 1. FRET cytométrie en flux sensible détecte tau activité d'ensemencement 16. Cellules 293T monoclonaux HEK exprimant la protéine tau-RD-CFP / YFP ont été transduites avec des échantillons de recombinaison ou biologiques, on a incubé pendant 24 à 48 heures, et analysés sur une base de cellule unique en utilisant la cytométrie de flux (A). Les cellules non stimulées maintenir tau-RD dans un état monomère (B), tandis que les cellules traitées avec affichage de matériel contenant des inclusions importantes de semences (C). L'évaluation quantitative (moyenne ± SEM) des activités d'ensemencement montre que FRET cytométrie en flux est sensible à des concentrations femtomolaires (monomère équivalent) de matériel de semence recombinant et la détection couvre trois ordres de grandeur (D). Monomère équivalent représente la quantité totale de protéine contenue dans la réaction de fibrillation et ne résout pas pour la incomplet et# 160; incorporation de monomère en matière agrégée. Ainsi, la concentration des agrégats réels (graines) doit être inférieure ou égale à son «équivalent monomère. * Modifié à partir de Holmes et Furman et al. 16 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Stratégie Gating FRET cytométrie de flux. Population cellulaire (A) et singlet / doublet (B) portes sont dessinés avec débit standard cytométrie méthodologie. Une porte de FRET faux (C) est tirée de cellules unique positifs YFP pour éliminer YFP bleedthrough dans le filtre de FRET. Une porte de FRET (D) est réalisé à partir de cellules traitées à des liposomes vides, par exempleDans ce contexte FRET est ≥1%. Un déplacement de la population dans la porte de FRET apparaît suite à un traitement avec du matériel de semences positif (E) et le décalage devient plus en plus important avec des quantités supérieures de matière de semences (F). Lectures finales comprennent:. Pour cent FRET positivité, la médiane intensité de fluorescence (MFI) des événements FRET-positifs, et la densité de FRET intégré (cellules positives FRET intégré Densité = de cent * IMF) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Progression de l'activité d'ensemencement de tau chez les souris P301S 16. L'activité de semis (moyenne ± SEM) à partir d'homogénats de cerveau de souris P301S est apparente à 1,5 mois dans le tronc cérébral (A), Néocortex (B), le lobe frontal (C), et de l'hippocampe (D). Cependant, l'activité d'ensemencement est jamais observée chez les souris knock-out tau (> 12 mois). Semis activité augmente avec l'âge et précède l'apparition d'autres marqueurs histologiques communs, y compris MC1, AT8, et PG5 (E). * Reproduit avec la permission de Holmes et Furman et al. 16 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Compatibilité du FRET cytométrie de flux avec des échantillons biologiques humains 16. Lorsque les cellules de biocapteurs tau-RD-CFP / YFP sont transduites avec 20 pg de lysat cerveau humain, l'ensemencement robuste (moyenne ± SEM) se produit dans tous diseà Alzheimer testécerveaux soi, alors que les lysats de contrôle de la maladie de même âge et de Huntington dépourvues d'activité d'ensemencement. * Modifié à partir de Holmes et Furman et al. 16 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. applications alternatives pour FRET cytométrie de flux 16. Neurones primaires transduction avec encodage lentivirus tau-PCP et tau-YFP constructions. En l'absence de germes exogènes il n'y a aucune agrégation visible (A), mais il y a en présence de graines (B). Biocapteurs neuronales répondent façon dose-dépendante à des semences de tau recombinantes, même en l'absence de phospholipide de livraison médiée par (C). La pré-incubation de recombinant (D) ou bigiques (E) sources de semences avec l'héparine, un inhibiteur de HSPG médiée absorption de graines de tau, épuise FRET réactivité des cellules de biocapteurs HEK 293T. Évaluation quantitatives affiche (moyenne ± SEM). * Modifié à partir de Holmes et Furman et al. 16 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Table 1: Les lignées cellulaires utilisés avec FRET cytométrie en flux. Cellules HEK 293T sont utilisés pour la cytométrie en flux installation. Cellules mono-positifs de la PCP sont utilisés pour la compensation (*). Cellules mono-positifs YFP sont utilisés pour éliminer signal de FRET fausse due à l'activation directe de la YFP par 405 nm excitation. CFP / YFP cellules doubles-positives sont FRET compatible et serventles cellules de biocapteurs. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.
Tableau 2:. Cytomètre de flux réglages du laser et de filtrage S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.
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Discussion
La cytométrie en flux système de FRET décrit ici est un outil puissant pour évaluer rapidement et quantitativement l'activité de la protéine tau ensemencement. Elle exige seulement une expérience de culture cellulaire modérée et une connaissance pratique de FRET et cytométrie de flux. D'autres essais de semis, comme Thioflavine T - qui présente une fluorescence améliorée lorsqu'il est lié à la structure de feuillet bêta - sont laborieux et nécessitent un substrat de protéine pure, recombinant. En outre, des essais in vitro de semis pour tau ne sont que semi-quantitative et généralement insensible aux niveaux sous-nanomolaires de matériel de semence 23,24. FRET cytométrie de flux, cependant, fournit une mesure quantitative et extrêmement sensible de l'activité de l'ensemencement à partir d'échantillons soit recombinantes ou biologiques. En outre, des adaptations à la procédure, il peut être utile d'étudier une variété de troubles de l'agrégation des protéines.
Bien que le protocole décrit ici se concentre sur tau ensemencement, seules des modifications simples sont nécessaires to permettre à un utilisateur de surveiller l'activité du semis depuis suppléants types de graines proteopathic. Comme démontré dans Holmes et Furman et al., Création d'une lignée cellulaire monoclonal exprimant de façon stable α-synucléine hébergeant le A53T mutation associée à la maladie étiqueté soit PCP ou YFP a permis la détection sensible de l'activité de semis de pleine longueur alpha-synucléine fibrilles recombinantes 16 . Des expériences similaires ont été effectuées en utilisant des cellules de biocapteurs huntingtine, qui a également détecter efficacement l'agrégation des protéines. Ainsi, en modifiant seulement le biocapteur de protéines, FRET cytométrie en flux est compatible avec de nombreuses sources de semences. D'autres modifications de l'essai, y compris le paradigme de traitement et le modèle de cellule, peuvent être utilisées pour faire FRET cytométrie de flux pour évaluer plus applicable mécanismes physiologiques. Dans ce protocole, les graines ont été directement introduits dans des cellules de biocapteurs via transduction médiée par des liposomes comme moyen pour augmenter la sensibilité.
Il est important de note, cependant, que ce ne soit pas obligatoire. Tau agrégats à partir de prélèvements biologiques ou de souris recombinantes sont encore capables de ensemencer des cellules de biocapteur en l'absence de liposomes (figure 5). Ainsi, les laboratoires intéressés à étudier la propagation physiologique et / ou les mécanismes de prise de graines de tau peut encore employer le dosage. En outre, FRET cytométrie en flux est compatible avec des cultures de neurones primaires. Par infection de cellules avec des constructions lentivirales et CFP-YFP-codées au moment du dépôt, FRET réactivité efficace est atteint à des concentrations nanomolaires après le traitement avec des fibrilles de tau recombinantes, même en l'absence de liposomes (figure 5). Prises ensemble, ces données indiquent que la cytométrie en flux FRET est utile pour étudier les mécanismes physiologiques de semis pour une variété d'agrégats de protéines et de multiples modèles de culture cellulaire.
Alors que le FRET cytométrie de flux système est adaptable et conviviale, certaines étapes clés doivent êtresuivie pour assurer la compatibilité, y compris la préparation de l'échantillon et la confluence de la cellule appropriée au moment du traitement. Haute intensité sonde ultrasons de spécimens du cerveau est essentielle pour une isolation efficace et optimale de l'activité d'ensemencement. Pendant le développement et l'optimisation, il a été observé que ce procédé est que plus de 10 fois plus efficace pour isoler l'activité d'ensemencement à partir de cerveaux de souris P301S rapport à d'autres techniques courantes, par exemple l'homogénéisation de poche. Il est possible que de très grands agrégats de tau ont une relativement faible propension de semis, et que la sonde ultrasons est plus efficace pour casser ces agrégats en fragments plus petits, semences compatible. Durée et fréquence du traitement par ultrasons peuvent être modifiés si nécessaire, bien que les paramètres décrits ci-dessus sont recommandées pour la détection sensible de l'activité d'ensemencement.
Cellule de confluence au moment du traitement est également d'une importance capitale, car elle affecte à la fois la sensibilité et de la santé cellulaire. Si des cellules d'unre trop confluentes, ils ne prennent pas facilement jusqu'à phospholipides et de matériel de semences, ce qui diminue considérablement la sensibilité. Si confluence est trop faible, l'addition de phospholipides et de matériel de semence peut être toxique. Les tests empiriques montre qu'une confluence de biocapteur de 60-65% est optimal pour le traitement et la réactivité subséquente.
Comme indiqué dans le protocole, des algorithmes de compensation sont régulièrement utilisées pour exclure PCP débordement dans la YFP et FRET canaux, éliminant ainsi les faux signaux et l'augmentation de la sensibilité. Pour une évaluation plus rapide et qualitative de l'activité d'ensemencement, cependant, cette étape peut être omise ou post hoc effectuée en utilisant la cytométrie de flux logiciel d'analyse. Un signal plus propre et plus robuste est obtenu suite à la compensation, cependant, et donc pour l'analyse la plus rigoureuse et quantitative de cette étape est fortement recommandé.
Une limitation de l'essai est son incapacité à rendre compte de la biochimique Composition selon lales graines proteopathic. L'activité d'ensemencement des mesures d'analyse actuelle, une propriété fonctionnelle de graines. Détermination de la nature biochimique et biophysique des semences nécessitera le couplage à des tests traditionnels tels que immunoprécipitation, chromatographie, dichroïsme circulaire, la spectrométrie de masse, etc. Néanmoins, ce test sera utile dans l'évaluation de l'ensemencement puissance comme un point final à partir de spécimens innombrables.
Cet essai a été récemment utilisée pour quantifier et de caractériser la timecourse d'ensemencement développement et la progression chez des souris P301S rapport à d'autres marqueurs communs de dépôt de la protéine tau, comme les taches histologiques. Dans cette étude, l'activité de la protéine tau ensemencement était apparente sur six semaines avant le premier marqueur histologique (MC1) que nous avons testé 16. Compte tenu de son apparition précoce, l'ensemencement activité peut représenter une importante supplémentaire, ou même de remplacement, mesure des résultats pour évaluer l'efficacité des interventions thérapeutiques, au moins pour les études préliminaires.En raccourcissant cours de traitement et l'étude des animaux plus jeunes, les coûts de logement et le délai d'exécution expérimentale va diminuer. Il est concevable que thérapeutiques peuvent être administrés à des souris à P301S 4-6 semaines et le cerveau évaluées pour l'activité d'ensemencement 2-4 semaines plus tard. En variante, l'évaluation d'agents thérapeutiques anti-tau dans les cellules peut être effectuée en quelques jours, en évaluant leur capacité à bloquer l'activité de l'induction de l'ensemencement des cellules de biocapteurs, comme le montre la figure 5.
En conclusion, le FRET cytométrie de flux ensemencement test est un moyen facile et efficace pour détecter la protéine tau ensemencement à partir de sources recombinantes ou biologiques. Sa sensibilité est inégalée par d'autres dans le tau de tests in vitro de semis, et il peut être utilisé pour détecter le plus tôt changement pathologique chez la souris tauopathie P301S. En outre, sa flexibilité dans le contrôle de nombreuses graines proteopathic dans différentes conditions de traitement, et avec plusieurs modèles de culture cellulaire, le rend utile pourtout laboratoire de l'agrégation des protéines intéressé à recueillir rapidement des données quantitatives.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TBS | Sigma | T5912 | |
| cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free) | Roche | 4693159001 | |
| Cryo-vials | Sarstedt | 72.694.006 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 105DU | |
| Weighing Boats | Fisher Scientific | 13-735-743 | |
| 15 ml conical tube | USA Scientific | 1475-0501 | |
| Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer | Omni International | 18-000-115 | |
| Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer | Omni International | OR-T-156 | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A451 | |
| Noise Cancelling Ear Muffs | Fisher Scientific | 19-145-412 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | S47299 | |
| 1.5 ml tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 000.215 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 50 ml Conical Tubes | Phenix Research | SS-PH15 | |
| 25 ml reagent resevoirs | VWR | 41428-954 | |
| Multi channel pipet | Fisher Scientific | TI13-690-049 | |
| 96 well flat bottom plates | Corning | 3603 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3788 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |
| Sorvall ST 40 Centrifuge | Thermo Scientific | 75004509 | |
| BIOLiner Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003796 | |
| Hemacytometer | VWR | 15170-172 | |
| MACSQuant VYB Flow Cytomter | Miltenyi Biotec | 130-096-116 | |
| Chill 96 Rack | Miltenyi Biotec | 130-094-459 | |
| Flow Jo analysis software | Flow Jo | ||
| 20 μl pipet tips | Rainin | GPS-L10 | |
| 200 μl pipet tips | Rainin | GPS-250 | |
| 1 ml pipet tips | Rainin | GPS-1000 | |
| 200 μl pipet tips | USA Scientific | 1111-1800 | |
| 5 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-606180 | |
| 10 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-607180 | |
| 25 ml Serological pipett | Phenix Research | SPG-760180 |
References
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