Introduction
細胞内のタウアミロイドの蓄積がアルツハイマー病などのタウオパチーを定義します。疾患の早期段階で、病理学は、一般的に脳の別々の領域に局在しているが、疾患の進行と、病理学は、常に明確なニューラルネットワーク1-5に沿って広がります。証拠の蓄積は毒性タンパク質凝集体の細胞間伝播が（6-10のレビュー）この病理学の根底を示唆しています。このモデルでは、proteopathic種子（ 例えば 、タウ）は、テンプレートコンホメーション変化を経て11月15日ミスフォールド形式にネイティブタウタンパク質を変換する、ドナー細胞から放出され、隣接するセルを入力されています。ここに記載のアッセイは敏感にそのようなシーディング活性を検出するために開発されました。これは、組換えタンパク質および生物学的サンプルと互換性があり、proteopathic播種アクティビティ16の微小レベルの定量を可能にします。
安定タウ繰り返しdを表現するHEK 293T細胞CFPまたはYFPのいずれかに融合された疾患関連P301Sの突然変異を含むomain（RD）は、播種活性の安定したバイオセンサーとして機能する（以下、タウ-RD-CFP / YFP細胞と呼ばれます）。 proteopathic種子の非存在下では、細胞は、可溶性単量体としてタウを維持し、感知できるバックグラウンドFRETがありません。細胞への自発的な取り込みまたはタウ種のリポソーム媒介形質導入、しかし、フローサイトメトリーを介して、単一の細胞内で測定されるFRETシグナルを生成RD-CFPとRD-YFPの集約、で結果。
このアッセイの多数の構成要素は、感度を高め、ばらつきを低減するように設計されました。 1を有するモノクローナル細胞株：それは最適な信号を提供するよう1 RD-CFP / YFP発現率は、選択された：ノイズを。感度を高めるために、リン脂質は、直接細胞内に種子を導入するために使用された（取り込みの生物学的機構を研究するが、これを省略することができます）。最後に、フローサイトメトリーモニタは集団レベル、単一細胞にFRETレベル、他のタンパク質凝集アッセイとは異なり。最終アウトカム指標、統合されたFRET密度は、高度に定量的であり、両方の集合を有する細胞の数、及び凝集は、各セル内で発生した程度を占めます。これらの最適化されたパラメータのすべては、感度を向上させ、再現性を確保します。
このシステムは、最近、他の一般的に使用されるタウ病理学的マーカー （例えば、MC1、AT8、PG5、およびチオフラビンS）にタウ播種活動の相対的な時間的な発症と進行を評価するトランスジェニックマウスP301Sタウオパチー17に包括的な研究で用いました。シーディング活性は、少なくとも6週間の組織学的検出の前に、これまでで評価しタウ病理の初期の、最も堅牢なマーカーです。種まき活動が発症および/ または神経変性16の進行におけるproteopathic種子の因果的役割を示唆し、年齢とともに徐々に1.5ヶ月と増加に表示されます。
e_content ">生物学的サンプルからのシード材料の微細なレベルの正確な定量化は、初期の疾患の進行をモニターする研究を容易にすることができる試験の期間を短縮し、より若い動物の使用を可能にすることで、これは前臨床動物試験の効率及び精度を高めることができる。例えば、でP301Sマウス先に述べた、鉛化合物は、初期の4〜6週間ほどお届けすることができ、2〜4週間後に有効性について監視。アッセイが正確に播種内の任意の削減を定量化する必要があります（または播種活動の開始時の直前に）アクティビティ。フローサイトメトリーFRETは、同様にインビトロスクリーニングの用途を有する。例えば、抗タウ試薬（ 例えば、抗体 、小分子など ）、組換えタウを使用して、培養物中に直接播種誘導をブロックする能力について迅速に試験することができますシード源（ 図5）。このセットアップでは、シード材料を準備したら、元のような凝集体または脳由来の溶解物perimentは、データ分析など、完了するまでにわずか3日かかります。 proteopathic播種活動の急速な定量化は、このように神経変性の多くの研究を容易にすることができます。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注：このプロトコルは、マウスの生体サンプルから播種活性を検出するためのFRETフローサイトメトリーの使用を強調しています。それはまた、組換え原線維と人間の生物学的サンプルと互換性があります。マウスを安楽死させ、脳を収穫はIACUC承認手順に従って実施しました。
1.脳抽出
- イソフルラン（2％）との深い麻酔の後、0.03％のヘパリンを含む氷冷PBSでマウスを灌流し、ゲージら詳細後の脳を抽出します。18
- クライオバイアル中で抽出された組織を置き、液体窒素中に配置することによって、凍結スナップ。また、ドライアイス上の組織を凍結します。一度、必要であれば、長期間にわたって-80℃とストアに組織を転送し、凍結しました。
注：このプロトコルは、全脳ホモジネートまたはマイクロ解剖脳領域と互換性があります。萩原らを参照してください。詳細な顕微解剖プロトコル19のために。 生物種材料の作製 - 1×TBS（10ミリリットルあたり1錠）にプロテアーゼ阻害剤（EDTA無料）を溶解することにより、均質化緩衝液を準備します。勢いよくボルテックスし、氷上で保存します。プロテアーゼ阻害剤は、バイオセンサーの細胞生存率を維持するためにEDTAを含まないものでなければなりません。
- 使い捨て計量ボートに凍結した脳組織を秤量し、5ミリリットルコニカルチューブに移します。最終溶液は、10％重量/体積であるように氷冷ホモジナイゼーションバッファーを加えます。一時的に氷の上に保管してください。組織塊とそれに続く均質化緩衝液量を用いる脳の大きさおよび/または地域に依存して変化します。ここでは、0.2グラムの体重の成体マウスhemibrainは10％重量/体積溶液2 ml中に懸濁させます。
- 低温室にサンプルを移し、適切な設定にプローブ音波処理を調整します。 （ここに示されている）オムニRuptor有するプローブ超音波処理のために、サンプルがOVされないように、約75 W.使用パルスモードに対応して20％に電力を設定超音波処理中のER-加熱しました。約500ミリ秒に対応し、30％にパルサーを設定します。
- 各溶液との間にプローブを拭き取り、再び水、イソプロパノール、水ですすぐことにより、プローブ超音波処理装置の先端を清掃してください。ラボ・ワイプで側面およびプローブの下部の両方をすすぎ、ワイプするようにして。
- 一度に一つのサンプルと協力して、均質化緩衝液にプローブ先端を沈めて、超音波処理装置を起動します。上記の電源とパルサーの設定を使用して、合計25パルスを提供します。組織が完全に懸濁液中であることを確認してください。このステップの間に、サンプルの発泡を避けるように注意してください。
注：a）は全体積が低いまたはb）ホモジネートはウォームアップ場合、試料は、発泡性の影響を受けやすいです。この特定の機器を用いて、250μl以下で超音波処理しません。サンプルが冷却した滞在を保証するために、チューブは、このステップの間、氷上に保存してもよいです。 - その後、ビーカーOに10パルスを送出、残留溶解液を拭き取ることにより、プローブを清掃してくださいFきれいな水。各ステップの間で乾拭き、（ステップ2.4のように）再び水、イソプロパノール、水で側面およびプローブの底を洗い流します。汚染を避けるために、徹底的にサンプル間でプローブをすすいでください。
注：タウ凝集体では、我々はより厳格な洗浄方法は、サンプル間の汚染を防ぐために必要であることを発見していません。他のアミロイドは、しかし、広く文献20,21に記載されている追加のケアが必要な場合があります。 - すべてのサンプルが処理されるまで、ストアを氷上にホモジネート。
- 4℃で15分間21,300×gでホモジネートをスピン。
- ペレットを乱さないように注意しながら、清潔なチューブに上清を移します。ペレットを廃棄します。さらなる使用のために-80℃で上清、およびストア溶解物アリコート。これは播種効率を低下させるように、しかし、ホモジネートの凍結/解凍サイクルを避けてください。
- 無菌環境で、吸引培地。温かいPBSで細胞を洗浄し、吸引。トリプシン処理細胞を3分間（トリプシンEDTA（0.05％）の3 ml）を、温かい培地（DMEM 9mlを、10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、1％のGlutamax）でクエンチし、そして直ちにに細胞を移しますコニカルチューブ。
- RTで5分間1,000×gで遠心分離細胞。培地を吸引し、暖かい培地で再懸濁細胞ペレット。
- 血球計数器を用いて、各細胞株についての細胞密度を決定します。細胞密度は、収穫し、再懸濁体積時コンフルエンスに依存して変化します。細胞密度が約100万細胞/ mlで再懸濁する細胞を、10 mlの培地中で90％の集密度で10cmディッシュから回収しました。
- メイク細胞+各ウェルの96ウェルプレートを130μlの培地中に35,000細胞を含有するようなメディアのマスターミックス（100井戸のためのマスターミックスを作るために例えば 、13ミリリットルのメディアで350万細胞を再懸濁）。個々の実験計画とスケジュールに合わせて、細胞数を変更します。細胞治療のためにプレーティングした後〜18時間、96ウェルプレートの各ウェルに35,000細胞を加えます。
- 96ウェルプレートを、マルチチャンネルピペットをゆっくり平底の各ウェルにマスターミックスを細胞懸濁液130μLをピペットで、組織培養処理された使っ。メッキが、プレートの底に触れていない、ウェルの中央にピペットチップを置きます。
注：メッキ形式を変更することができるが、細胞株プレート当たり1-3のそれぞれについて、n = 4の井戸を作ることをお勧めします。プレート（N = 84）の残りの部分は、細胞株＃4（バイオセンサー細胞）用に予約されています。 - 細胞を室温で10分間邪魔されずにプレートを残すことによって解決することができます。 37℃、5％CO 2、および＆でO / Nインキュベート＃8805;相対湿度80％。
- 一本のチューブに、マスター混合物を作るために、そのようなのOpti-MEMとして低減血清培地を用いて、例えば、リポフェクタミンのように、トランスフェクション試薬を組み合わせます。ウェルごとに、1.25μlのトランスフェクション試薬と8.75μlの低減血清培地を追加します。フリックチューブ軽くスピンダウンし、そして室温で5分間インキュベート簡単に、混合します。
- 別のチューブでは、減少した血清培地でシード材料（ステップ2.9からの溶解物のアリコート）を兼ね備えています。
注：シード材料の体積は、個々の実験に応じて変化するであろう。シードボリュームを選択する場合、考慮に入れる：サンプル中の種の豊富さと潜在的な毒性を。粗製のホモジネートは、細胞に対して毒性であり得ます。このように、ご希望の効果を監視することができる最低のボリュームを使用しています。溶解液/ウェルの範囲frの以前テストしたボリューム5-20μgの全タンパク質に対応するオム1-5μlを、。ウェルあたりの総容量（種子+低減血清培地）を10μLであることを確認してください。 - 4.1と4.2で説明した2つの管からのコンテンツを組み合わせて、フリック優しく（千XG、5秒）をスピンダウンし、少なくとも20分間、2時間まで室温でインキュベート簡単に、混合します。
- 静かに、個々のバイオセンサーウェルの側に伝達複合体の20μLをピペット。可能な場合は、3つの技術の複製を使用してください。 24〜48時間インキュベーターに処理した細胞を返します。ステップ3.6で説明したのと同じ条件でインキュベートします。
注：リン脂質のアプリケーションは、リポソーム試薬に未露光の細胞をバイオセンサーに蛍光プロファイルがわずかにシフトを導入するので、このセットアップのための適切な負の制御条件は、空のリポソーム（ すなわち 、リポソーム試薬+低減血清培地）で処理されたバイオセンサー細胞です。 - マルチチャンネルピペットを使用して、すべての細胞培地（150μl）を吸引します。トリプシン処理（50μl）を5分間細胞、および150μlの冷やした培養液でクエンチしました。それは、細胞リフティングとその後の細胞の損失を引き起こす可能性があるとして、この段階でトリプシン処理する前に、PBSリンスを含めないでください。ゲーティング戦略を経由して、フローサイトメトリー中に混入し、死細胞および残骸を除外します。
- すぐに96ウェル丸底プレートに、転送細胞を急冷し、5マイル1,000×gで遠心分離した後RTでのn。
- 細胞ペレットを乱さないように注意しながら、培地を吸引し、廃棄します。
- 静かに、しかし完全に、50μlの2％パラホルムアルデヒド中で細胞ペレットを再懸濁し、10分間インキュベートします。固定はよりクリーンで一貫性のある結果を提供するがまた、実行した細胞は、住んでいます。
- RTで5分間1,000×gで遠心分離細胞。細胞ペレットを乱さないように注意しながら、パラホルムアルデヒドを吸引し、廃棄します。
- 静かに、しかし完全に、200μlのバッファサイトメトリーチルド流れを細胞ペレットを再懸濁（HBSS、1％のFBS、1mMのEDTA）および細胞凝集を避けるために、できるだけ早くプレートを実行します。
- 細胞集団は、左下の象限になるまで、側方散乱-エリア前方散乱-エリア（FSC-A）の二変量プロット対（SSC-A）、および細胞株＃1の走行では、SSCおよびFSCの電圧を調整してください。ポリゴンツールをクリックして、細胞集団（ゲートP1）を定義します。すべてのゲーティングのためのパラメータは、 図2を参照してください 。
- FSC-二変量プロット対FSC-H（高さ）を行い、プロット上に「ライブ」をクリックし、P1を選択することで、このプロットにゲートP1を適用します。細胞株＃1では実行している、多角形ツールをクリックし、単一細胞（ゲートP2）を定義します。
- CFP、YFP、およびFRET：3ヒストグラムプロット、関心のフィルタのそれぞれに1つずつ作成します。プロット上に「ライブ」をクリックし、P2を選択することにより、これらのプロットのすべてにゲートP2を適用します。細胞株＃1動作している状態で、電圧を調整するように、CFP、YFPにおける中央値細胞集団、およびヒストグラムは405 nmのレーザーで細胞を励起し、CFPとFRETを測定し、とキャプチャ蛍光するには、すべての0と1の間にあるFRETそれぞれ450/50 nmおよび50分の525 nmのフィルター。 YFPを測定するために、50分の525 nmのフィルターで488 nmのレーザー、キャプチャ蛍光で細胞を興奮させます。レーザーおよびフィルターの設定はさらに、表2に記載されています。
- FRETとYFPチャネルにCFPスピルオーバーの補償を行います。
注：補償は蛍光スピルオーバー補正する処理のことです。 1蛍光色素の蛍光発光は、フィルタデジ内で検出されたときに蛍光スピルオーバーが発生別の蛍光色素からの信号を測定するgned。適切な補償では、CFPの波及蛍光は、FRETとYFPチャンネルから削除することができます。
注：報酬は、蛍光陽性と陰性細胞の両方の存在を必要とします。このように、CFP陽性細胞（細胞株＃2）、陰性細胞（細胞株＃1）に補償する前に実行するためにサンプルに追加する必要があります。- よく細胞株＃2懸濁液200μlに、単一の細胞株＃1懸濁液の30μlの中でスパイクを補償する直前。
- 「機器の設定」アイコンは、「補償」タブをクリックし、補正テーブルを開くために「マトリックス」をご確認ください。
- CFP-二変量プロット対 FRET-Aを作成し、ステップ6.3で説明したように、ゲートP2を適用します。細胞株1 + 2動作している状態で、「象限」アイコンをクリックして蛍光陰性と陽性集団が低い2つの象限（ゲイツLL3 Aによって分離されるよう象限を描きますND。LR3、それぞれ）。
- LL3とLR3ゲートのためのFRETの蛍光強度中央値（MFI）が表示された統計表を作成します。 FRETシグナルのMFIがLL3とLR3の間で同等になるまで補償行列にFRETパラメータを調整します。このステップに続いて、FRETシグナルのMFIは、FRETチャネルにCFPスピルオーバーが存在しないことを示唆し、未染色細胞およびCFP陽性細胞の間で同じです。
- CFP-二変量プロット対 YFP-Aを作成し、ステップ6.3で説明したように、ゲートP2を適用します。ステップ6.4.3で行われたものと同様の象限（LL4とLR4）を描画します。
- LL4とLR4のためにYFPのMFIを表示する統計情報の表を作成します。 YFP信号のMFIがLL4とLR4間の等価になるまで補償行列にYFPのパラメータを調整します。このステップに続いて、YFP信号のMFIは、YFPチャネルにCFPスピルオーバーが存在しないことを示唆し、未染色細胞およびCFP陽性細胞の間で同じです。
- Follゲートの設定と補償を起因して、関心のウエルを強調表示し、プレートの残りの部分を実行します。
- すべてのサンプルの後、エクスポートデータファイルは、「コピー」、「ファイル」をクリックすることで、実行されています。 「データファイル」タブを選択し、実験のフォルダを選択し、「コピー」をクリックします。
- フローサイトメトリー解析プログラムで開くFCSファイル。
- 散乱特性に基づいて、同様に第6節に記載されたものと、空のリポソームで処理した細胞から（FSC-A VS FSC-H）細胞集団（FSC 対 SSC）と一集団を定義する多角形のゲートを使用しています。
- CFP補償がセットアップ時に実行された場合、さらにCFPを調整しないでください。
- YFPの二変量プロット対 FRETを作成します。細胞株＃3を使用しました、FRET陽性細胞集団の斜面に沿って走る多角形ゲートを描くことによって偽のFRETゲートを定義します。このゲートは、FRETフィルター内の信号を発する単一YFP陽性細胞を除外し、そして以前ら禁止することにより示されたものと同様描かれている。22
- CFPの二変量プロット対 FRETに空のリポソームで処理したCFP / YFP細胞をプロットすることにより、FRETゲートを定義します。上向きと集団から離れて左に拡張し、人口の斜面に沿って多角形ゲートを導入します。このゲートは、ほとんどの細胞（〜99％）を除外する必要があり、その結果、バックグラウンドFRETは≥1細胞の％です。このゲートにシフトする任意のイベントは、FRET陽性と考えられています。
注：上述の個々のゲートは、後続のゲートを構成する前に、すべてのサンプルに適用されます。分析に続いて、4つの個別のゲートが（;一;偽のFRET; FRET細胞集団）が定義されています。 - パーセントのFRET陽性とMFI：含む関心のレコード解析パラメータ、FRET陽性細胞の。手動パーセント陽性とMFIの製品を測定することにより、統合されたFRET密度を計算します。
注：統合FRET密度はアウトカム指標として使用される場合、セットバックグラウンドFRET（ステップ7.5で定義されている）およびMFI、その2つの個々の要素よりも少ない製品を計算回避するために1以上です。
3.再播種バイオセンサー細胞
注意：このアッセイのための4つの細胞株を使用してください：HEK 293T（細胞株＃1）、RD-P301S-CFP（細胞株＃2）、RD-P301S-YFP（細胞株＃3）、およびRD-P301S-CFP / YFP（細胞株＃4）。アッセイの各細胞株の寄与については、表1を参照してください。
4.細胞を処理します
注：次の日、タウバイオセンサー細胞は、次のようにシード伝達複合体を準備する60〜65％コンフルエントのとおりです。
FRETフローサイトメトリー用5細胞を収集します
6. FRETフローサイトメトリー
注：レーザーラインとフィルターセット（ 表2）FRET互換が装備されてMACSQuant VYB、このようなフローサイトメーターを使用してください。このセクション内の各ステップについては、ソフトウェアの96ウェルテンプレートを使用して、関心の井戸をクリックし、[OK]をクリックします「再生」のサンプルの取り込み、フローを開始します。 「新しい分析ウィンドウ」アイコンをクリックしてプロットまたは統計表を作成します。 X軸またはY軸のいずれかのタイトルをクリックし、適切なフィルタを選択することで、個々の二変量プロットの軸のパラメータを変更します。適切なフィルタに関連した電圧を、細胞集団または蛍光シグナルをシフトが増減します。この楽器では、正確な単一セルの監視を確実にするために、<千のイベント/秒を実行します。
7.データ解析
注：XまたはY軸のいずれかのタイトルをクリックし、適切なフィルタを選択することにより、個々の二変量プロットの変更軸パラメータ。
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Representative Results
FRETフローサイトメトリー敏感、定量、および組換えまたは生物学的サンプルからの播種活動の迅速な検出を可能にします。アッセイセットアップが容易である：タウ- RD-CFP / YFPを発現しているモノクローナル由来の安定な細胞株は、24〜48時間インキュベートし、シード材料を用いて形質導入し、分析（ 図1A）、フローサイトメトリーに供しています。種子の不在下では、バイオセンサセルは、可溶性、モノマー形態（ 図1B）でタウを維持します。シードの存在下で、しかしながら、バイオセンサ細胞はフローサイトメトリーを用いてセル単位で検出されたFRET応答を生成し、凝集状態（ 図1C）にτを変えます。定量的評価は、バイオセンサセルは、シード材料のフェムトモル濃度に応答し、そのシード活動が効果的に3桁の大きさ（ 図1D）にわたって測定することができることを示しています。
ゲーティングパラメータは、TRの検出を確実にするために確立されましたUEは、低シード濃度で、信号をFRET。まず、標準的なゲーティング法は、細胞集団（ 図2A）および単一細胞（ 図2B）を単離するために使用されます。偽FRETシグナルは、405 nmレーザーによってYFPの直接的な活性化から生じる可能性があります。したがって、偽FRETゲートは汚染信号（ 図2C）を除外するYFP単一陽性細胞集団から引き出されます。最後に、FRETのゲートは、非シードCFP / YFPデュアル陽性細胞（ 図2D）から定義されます。ゲートが上方に延びる人口の斜面付近で描かれ、そこから離れて左にされています。非刺激細胞は、バックグラウンドは約1％に設定した値をFRETているはず、とFRET陽性細胞（図2Eおよび2Fを比較 ）は、用量依存的にこのゲートにシフトします。複数のパラメータは、FRETに考慮されるなど、フローサイトメトリー：パーセント陽性（ すなわち 、全細胞数あたりのFRET陽性細胞数）と、すなわち 、程度はFRET応答はFRET陽性細胞で生産された中央値蛍光強度（）。それは、これらの2つの変数の積であり、完全に任意のサンプルによって誘導さ播種活性の程度を表すように統合されたFRET密度は、好ましい転帰尺度です。
4つの異なる脳領域の顕微解剖後。フローサイトメトリーは、図3に表示されているように、でも若い年齢で、P301Sタウオパチーマウス由来の脳溶解物と互換性のあるFRETフローサイトメトリー脳幹（ 図3A）から播種活性を測定するために使用されたFRET、新皮質（ 図3B）、前頭葉（ 図3C）、および年齢の範囲にわたってP301Sマウスにおける海馬（ 図3D）。各地域では、播種活性は年齢とともに増加し、ちょうど1.5ヶ月で現れました。しかし、タウノックアウトマウス（「KO」）> 12モスは播種活性を示したことはありません。時間と比較すると同じ動物内で行わistological分析は、これはすぐにコンホメーション異常なタウ（MC1）、過リン酸化タウ（AT8とPG5）、およびアミロイド立体構造のマーカーを含むタウ沈着（ 図3E）のいずれかの他のマーカーの出現、より6週間です（チオフラビンS）。機構的な観点からは、タウ播種活動の近位検出は、タウオパチーの発症および/または進行の原因メディエーターとして種子を示唆しています。実験的な観点から、これは播種活性の分析は、その早期かつ堅牢な外観を与えられたタウ沈着の標準アウトカム指標に理想的なサプリメントであることを示唆しています。
トランスジェニックマウスに加えて、フローサイトメトリーFRET人間の脳溶解物と互換性があり、容易にアルツハイマー病被験者（ 図4）から単離されたタウ凝集体を検出することができます。 P301S脳溶解物のために、ここで説明したように凍結ヒト脳組織を活性播種、同様に均質化された場合ロバストAD被験者から派生したすべての試料から検出されました。これとは対照的に、シーディング活性は、年齢が一致するか、ハンチントン病対照被験者の溶解物から検出されることはありません。これは、タウ凝集体のためのアッセイの特異性を強調しています。
この論文の焦点は、HEKの293Tバイオセンサーセルに凝集体のリポソーム媒介送達を使用したタウ播種活性の高感度検出であるが、多くの生理学的な細胞培養パラダイムは、基本的な細胞取り込みメカニズムを評価するためにフローサイトメトリーFRETを用いて行うことができます。例えば、一次神経細胞培養物は、タウ - RD-CFPとタウ-RD-YFPを発現するレンチウイルスに感染させることができる、めっき時に作成します。 DIV4で、凝集が未処理細胞（ 図5A）には存在しないが、種子を含有材料（ 図5B）で処理した神経細胞で検出可能です。重要なことは、リン脂質は、生理学的およびPATの調査を可能にして、これらの実験で除外されています hophysiological播種メカニズム。従って、タウ原線維の適用は、神経HSPG媒介取り込みをもたらし、FRETのフローサイトメトリー（ 図5C）を用いて定量することができる用量依存的に凝集を刺激します。さらに、アッセイは、タウの取り込みの治療の評価のために使用し、HEK 293Tタウバイオセンサセルを使用してインビトロで遮断を播種することができます。偶数リン脂質の非存在下での、組換え線維（ 図5D）とP301S脳溶解物（ 図5E）の両方は、タウ凝集を誘導します。ヘパリンこれらのタウ種のプレインキュベーションは、（以前HSPG媒介タウ取り込みの強力な阻害剤であることが示されている）、ただし、それらの播種能力を排除します。この実験は、任意の薬剤（ 例えば、抗体 、小分子など ）に適用することができ、取り込みおよび/ または種子修飾治療薬の迅速な評価を可能にします。
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1. FRETは、フローサイトメトリーの図は、敏感タウ播種アクティビティ16を検出する 。タウ-RD-CFP / YFPを発現するモノクローナルHEK 293T細胞を、フローサイトメトリーを使用して、組換えまたは生物学的サンプルを用いて形質導入24-48時間インキュベートし、そして単一細胞に基づいて分析しました（A）。非刺激細胞は、シード含有材料表示目立つインクルージョン（C）で処理した細胞に対し、単量体状態（B）におけるタウ-RDを維持します。播種活動の定量的評価は、（平均±SEM）のFRETフローサイトメトリーは、組換えシード材料のフェムトモル濃度（モノマー換算）に敏感であり、検出は三桁（D）をまたがっていることを示しています。モノマーと同等の線維化反応中に含まれるタンパク質の総量を表し、不完全な＆のために修正されません。＃160;凝集物質へのモノマーの取り込み。したがって、実際の骨材（種子）の濃度は、以下の「モノマー同等」に等しくなければなりません。 *ホームズとファーマンら 16から変更されたこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
FRETフローサイトメトリー。細胞集団（A）と一重/二重（B）ゲートの図2.ゲーティング戦略は、方法論標準的なフローサイトメトリーで描画されます。偽FRETゲート（C）は、FRETフィルターにYFPのbleedthroughを排除するために、単一のYFP陽性細胞から引き出されます。 FRETゲート（D）のような、空のリポソームで処理した細胞から構成されていますその背景FRETは≥1％です。 FRETゲートへの人口移動は、シード陽性物質（E）で処理した後で表示されており、シフトは、シード材料のより高い量（F）と、ますます顕著になります。最終的な読み出しは、次のとおりです。％のFRET陽性のイベント、および統合されたFRET密 度（統合FRET密 度=パーセント陽性細胞がMFIの*）の陽性、蛍光強度中央値（MFI）をFRET この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
P301Sマウス16におけるタウ播種アクティビティ図3.進行。 P301Sマウスの脳ホモジネートからの種まき活動は、（平均±SEM）脳幹で1.5ヶ月で明らかです（）、新皮質（B）、前頭葉（C）、および海馬（D）。しかし、播種活性がタウノックアウトマウス（> 12ヶ月）で観察されることはありません。種まき活動は、年齢とともに増加し、MC1、AT8、およびPG5（E）を含む他の一般的な組織学的マーカーの出現に先行します。 *ホームズとファーマンら 16から許可を得て転載。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
FRETの図4の互換性は、ヒトの生体試料16とフローサイトメトリー 。タウ-RD-CFP / YFPバイオセンサー細胞を20μgのヒト脳の溶解物で形質導入された場合には、堅牢な播種（平均±SEM）試験したすべてのアルツハイマーdiseaで発生年齢をマッチさせたとハンチントン病のコントロール溶解物に対し、SEの頭脳は、播種活性を欠きます。 *ホームズとファーマンら 16から変更されたこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図FRET 5.別の用途は、レンチウイルスエンコーディングタウ-CFPを形質導入したフローサイトメトリー16。一次ニューロンを流れ、タウ-YFP構築物。外因性の種子がない場合には、明らかな凝集（A）はありませんが、種子（B）の存在下にあります。ニューロンのバイオセンサーも、リン脂質媒介送達（C）の非存在下で、組換えタウ種子に用量依存的に応答します。組換えのプレインキュベーション（D）または双方向ヘパリンと学的（E）シード源は、HSPG媒介タウ種の取り込みの阻害剤は、HEK 293Tバイオセンサー細胞の応答性をFRET枯渇します。定量的評価が表示されます（平均±SEM）。 *ホームズとファーマンら 16から変更されたこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表1： FRETと共に使用される細胞株は、フローサイトメトリー。HEK 293T細胞を、フローサイトメトリーのセットアップのために使用されます。 CFP単一陽性細胞は補償（*）のために使用されます。 YFP単一陽性細胞を405nm励起によるYFPの直接活性化に起因する誤ったFRETシグナルを除去するために使用されます。 CFP / YFPデュアル陽性細胞は、FRET互換性があり、として機能バイオセンサーセル。 この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表2：レーザーとフィルタの設定フローサイトメーター このテーブルの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
FRETは、ここで説明するフローサイトメトリーシステムを迅速かつ定量的にタウ播種活性を評価するための強力なツールです。これは、中程度の細胞培養の経験とFRETの実用的な知識を必要とし、フローサイトメトリー。このようチオフラビンTのような他の播種アッセイ、 - βシート構造に結合したときに増強された蛍光を示す - 面倒であり、純粋な、組換えタンパク質基質を必要とします。さらに、タウのためのin vitroアッセイは、播種のみ半定量的およびシード材料23,24のナノモル以下のレベルに一般的に鈍感です。フローサイトメトリーFRETしかし、組換えまたは生物学的サンプルのいずれかから播種活性の定量と絶妙に敏感な尺度を提供します。また、プロシージャの適応は、タンパク質凝集疾患の様々な検討することが有用なものにすることができます。
本明細書に記載されたプロトコルは、タウの播種に焦点を当てているが、単純な修正が必要とされるトンO proteopathic種子の別のタイプから播種アクティビティを監視することを可能に。ホームズとファーマンらが実証された。、CFPまたはYFPのいずれかにタグ付けされた安定的疾患関連A53T変異を保有するαシヌクレインを発現するモノクローナル細胞株の作成 は、完全長のαシヌクレイン組換え原繊維16から播種活動の高感度検出を可能にしたよう。同様の実験はまた、効果的にタンパク質凝集を検出した、ハンチンチンのバイオセンサセルを使用して行われてきました。したがって、単にタンパク質バイオセンサーを変更することによって、フローサイトメトリー、多数の種子源と互換性がありFRET。治療パラダイムと細胞モデルを含むアッセイの他の変形例は、FRET生理学的メカニズムを評価する多くの適用可能なフローサイトメトリーを作製するために使用することができます。このプロトコルでは、種子を直接感度を向上させる方法として、リポソーム媒介形質導入を介してバイオセンサ細胞に導入しました。
これは、nに重要ですOTE、しかし、これは必要条件ではないこと。組換えまたはマウスの生物学的サンプルはまだリポソーム（ 図5）の不存在下でバイオセンサーの細胞を播種することができるから、タウが集約されます。したがって、生理的伝播および/またはタウ種子の取り込み機構を研究に興味を持ってラボはまだアッセイを使用することができます。さらに、フローサイトメトリーの一次神経細胞培養と互換性がありFRET。メッキ時CFP-とYFP符号化されたレンチウイルス構築物を細胞に感染させることによって、効率的なFRET応答性であっても、リポソーム（ 図5）の非存在下で、組換えタウ原線維を用いた治療の後に、ナノモル濃度で達成されます。まとめると、これらのデータは、FRETのフローサイトメトリーは、タンパク質凝集体の様々な複数の細胞培養モデルにおける播種の生理学的メカニズムを研究するために有用であることを示しています。
FRETのフローサイトメトリーシステムはユーザーフレンドリーで適応可能であるが、特定の重要なステップは次のようになります処理時の試料調製および適切な細胞集密度を含む、互換性を確保するために行きました。脳標本の高輝度プローブ超音波処理は、播種の活動を効果的かつ最適な分離のために重要です。開発と最適化の間に、それは、この方法は、他の一般的な技術 、例えばハンドヘルド均質化に比べてP301Sマウスの脳から播種の活動を隔離で10倍以上効果的であることが観察されました。これは、非常に大規模なタウ凝集物は、比較的低い播種傾向があり、そのプローブ超音波処理が小さく、種子互換フラグメントにこれらの凝集体を破壊するために最も有効であることが可能です。必要に応じて、上記の設定は播種活動の高感度検出のために推奨されているが、超音波処理の持続時間と頻度は、変更することがあります。
それは感度と細胞の健康の両方に影響を与えるとして処理時の細胞の密集度は、最も重要でもあります。セルAの場合あまりにコンフルエント再、彼らは容易にそれによって劇的に感度を減少させ、リン脂質とシード材料を取ることはありません。密集度が低すぎると、リン脂質およびシード材料の添加は、毒性であり得ます。実証試験は60から65までパーセントのバイオセンサーの密集度は、治療とその後の反応のために最適であることを示しています。
プロトコルで述べたように、補償アルゴリズムは、定期的に、それによって偽信号を除去し、感度を増加させ、YFPおよびFRETチャネルにCFPのスピルオーバーを除外するために使用されます。播種活性の迅速かつ定性的な評価のために、しかし、この工程は、フローサイトメトリー分析ソフトウェアを用いて事後省略または実行されてもよいです。クリーンでより強固な信号は、しかし、補正後に得されるため、最も厳しいと定量分析のために、この手順を強くお勧めします。
アッセイの制限は、生化学的に報告することができないことです 物の組成proteopathic種子。現在のアッセイは、播種活動、種子の機能特性。種子の生化学的および生物物理学的性質の決意はそれにもかかわらず、このアッセイは無数の標本からエンドポイントとして播種効力を評価するのに有用であることを証明しますなど免疫沈降、クロマトグラフィー、円偏光二色性、質量分析法、などの従来のアッセイとの結合が必要になります。
このアッセイは、最近、このような組織学的染色などのタウ沈着の他の一般的なマーカーを基準とする相対P301Sマウスに発症と進行を播種の時間経過を定量化し、特徴づけるために使用されました。本研究では、タウ播種活性は前に私達は16をテストした最も初期の組織学的マーカー（MC1）に6週間にわたって明らかでした。その初期の外観を考えると、活動を播種することは、少なくとも予備的な研究のために、治療的介入の有効性を評価するための重要な補足、あるいは代替、アウトカム指標を表すことができます。治療コースを短縮し、若い動物を研究することによって、住宅費、実験所要時間が減少します。これは、治療薬は、2-4週間後に播種活性について評価した4-6週間後、脳におけるP301Sマウスに投与することができると考えられます。あるいは、細胞における抗タウ治療の評価は、図5に示すように、バイオセンサ細胞で播種活性の誘導をブロックする能力を評価することによって日以内に実行することができます。
結論として、アッセイを播種FRETのフローサイトメトリーは、組換えまたは生物学的供給源からのタウの播種を検出するための簡単かつ効率的な方法です。その感度は、 インビトロでのタウ播種アッセイによって比類のない他のであり、P301Sタウオパチーマウスにおいて最も早い病変を検出するために使用することができます。さらに、異なる処理条件の下で、複数の細胞培養モデルで多数のproteopathic種子をモニタリングにおけるその柔軟性は、それのために有用です迅速に定量的データの収集に興味を持って任意のタンパク質凝集実験室。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TBS | Sigma | T5912 | |
| cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free) | Roche | 4693159001 | |
| Cryo-vials | Sarstedt | 72.694.006 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 105DU | |
| Weighing Boats | Fisher Scientific | 13-735-743 | |
| 15 ml conical tube | USA Scientific | 1475-0501 | |
| Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer | Omni International | 18-000-115 | |
| Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer | Omni International | OR-T-156 | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A451 | |
| Noise Cancelling Ear Muffs | Fisher Scientific | 19-145-412 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | S47299 | |
| 1.5 ml tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 000.215 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 50 ml Conical Tubes | Phenix Research | SS-PH15 | |
| 25 ml reagent resevoirs | VWR | 41428-954 | |
| Multi channel pipet | Fisher Scientific | TI13-690-049 | |
| 96 well flat bottom plates | Corning | 3603 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3788 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |
| Sorvall ST 40 Centrifuge | Thermo Scientific | 75004509 | |
| BIOLiner Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003796 | |
| Hemacytometer | VWR | 15170-172 | |
| MACSQuant VYB Flow Cytomter | Miltenyi Biotec | 130-096-116 | |
| Chill 96 Rack | Miltenyi Biotec | 130-094-459 | |
| Flow Jo analysis software | Flow Jo | ||
| 20 μl pipet tips | Rainin | GPS-L10 | |
| 200 μl pipet tips | Rainin | GPS-250 | |
| 1 ml pipet tips | Rainin | GPS-1000 | |
| 200 μl pipet tips | USA Scientific | 1111-1800 | |
| 5 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-606180 | |
| 10 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-607180 | |
| 25 ml Serological pipett | Phenix Research | SPG-760180 |
References
- Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks. Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).
- Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. Predicting Regional Neurodegeneration from the Healthy Brain Functional Connectome. Neuron. 73 (6), 1216-1227 (2012).
- Raj, A., Kuceyeski, A., Weiner, M. A Network Diffusion Model of Disease Progression in Dementia. Neuron. 73 (6), 1204-1215 (2012).
- Braak, H., Braak, E.
- Braak, H., Braak, E. Staging of Alzheimer's disease-related neurofibrillary changes. Neurobiol Aging. 16 (3), 271-278 (1995).
- Frost, B., Diamond, M. I.
- Holmes, B. B., Diamond, M. I.
- Kaufman, S. K., Diamond, M. I. Prion-like propagation of protein aggregation and related therapeutic strategies. Neurotherapeutics. 10 (3), 371-382 (2013).
- Holmes, B. B., Diamond, M. I. Prion-like properties of Tau protein: the importance of extracellular Tau as a therapeutic target. J Biol Chem. 289 (29), 19855-19861 (2014).
- Guo, J. L., Lee, V. M. Cell-to-cell transmission of pathogenic proteins in neurodegenerative diseases. Nat Med. 20 (2), 130-138 (2014).
- Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
- Guo, J. L., Lee, V. M. Y. Seeding of normal tau by pathological tau conformers drives pathogenesis of Alzheimer-like tangles. Journal of Biological Chemistry. , (2011).
- Holmes, B. B., et al. Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), E3138-E3147 (2013).
- de Calignon, A., et al. Propagation of Tau Pathology in a Model of Early Alzheimer's Disease. Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).
- Liu, L., et al. Trans-Synaptic Spread of Tau Pathology In Vivo. PLoS One. 7 (2), e31302 (2012).
- Holmes, B. B., et al. Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), E4376-E4385 Forthcoming.
- Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65 (65), (2012).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. J Vis Exp. (33), (2009).
- Yan, Z. X., Stitz, L., Heeg, P., Pfaff, E., Roth, K. Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies. Infect Control Hosp Epidemiol. 25 (4), 280-283 (2004).
- McDonnell, G., et al. Cleaning, disinfection and sterilization of surface prion contamination. J Hosp Infect. 85 (4), 268-273 (2013).
- Banning, C., et al. A flow cytometry-based FRET assay to identify and analyse protein-protein interactions in living cells. PLoS One. 5 (2), e9344 (2010).
- Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein. Biochemistry. , (2013).
- Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein. J Vis Exp. (95), e51537 (2015).
