Introduction
ההצטברות של amyloids טאו תאיים מגדירה tauopathies כגון מחלת אלצהיימר. בשלבים המוקדמים של מחלה, פתולוגיה בדרך כלל מקומית לאזורים הנפרדים של המוח, אך עם התקדמות מחלה, פתולוגיה תמיד מתפשטת לאורך רשתות עצביות שונות 1-5. ראיות מצטברות מצביעות על התפשטות transcellular של אגרגטים חלבון רעילים בבסיס הפתולוגיה זה (שנסקר ב6-10). במודל זה, זרעי proteopathic (למשל, באוניברסיטת תל אביב) משתחררים מתאי תורם ולהיכנס תאי שכנים, הפיכת חלבון טאו ילידים לטופס misfolded באמצעות שינוי קונפורמציה בתבניות 11-15. Assay המתואר כאן פותח כדי לזהות פעילות זריעה כגון רגישות. זה תואם עם חלבון רקומביננטי ודגימות ביולוגיות ומאפשר כימות של רמות דקות של פעילות זריעת proteopathic 16.
תאי HEK 293T שיציבות להביע ד חוזר טאוomain (RD) המכיל את המוטציה P301S הקשורים למחלות התמזגו או CFP או YFP (להלן כתאי טאו-RD-CFP / YFP) לשמש כbiosensor יציב של פעילות זריעה. בהעדר זרעי proteopathic, התאים לשמור על טאו כמונומר מסיס, ואין להם סריג רקע ניכר. ספיגה ספונטנית או התמרה תיווך liposome של זרעי טאו לתאים, עם זאת, תוצאות בRD-CFP וצבירת RD-YFP, אשר מייצר אות סריג שנמדד בתוך תאים בודדים באמצעות cytometry זרימה.
רכיבים רבים של assay זה הונדסו כדי לשפר את הרגישות ולהפחית השתנות. שורת תאים חד שבטי עם יחס של 1: ביטוי RD-CFP / YFP 1 נבחרה, כפי שהיא מספקת אות אופטימלית: רעש. כדי להגביר את הרגישות, פוספוליפידים משמשים להציג זרעים ישירות לתוך תאים (למרות ללמוד מנגנונים ביולוגיים של ספיגה, זה יכול להיות מושמט). לבסוף, cytometry זרימת צגי סריג ברמת אוכלוסייה ותא בודד רמה, שלא כמו מבחני צבירת חלבון אחרים. מדד התוצאה הסופי, צפיפות סריג משולבת, היא כמותי מאוד והחשבונות הן למספר תאים עם צבירה, והמידה שבה צבירה התרחשה בתוך כל תא. כל פרמטרים האופטימליים אלה לשפר את הרגישות ולהבטיח שחזור.
מערכת זו הועסקה לאחרונה במחקר מקיף בעכברים מהונדסים tauopathy P301S 17 שהעריך את תחילת הזמן והתקדמות של פעילות ביחס זריעת טאו לסמנים פתולוגיים טאו הנפוץ אחרים (לדוגמא, MC1, AT8, PG5, וThioflavinS). פעילות זריעה היא רחוקה סמן המוקדם וחזק ביותר של פתולוגיה באוניברסיטת תל אביב העריך, שקדמו לגילוי היסטולוגית על ידי לפחות 6 שבועות. פעילות זריעה מופיעה ב 1.5 חודשים ועליות בהדרגה עם גיל, מה שמרמז תפקיד סיבתי של זרעי proteopathic בתחילה ו / או ההתקדמות של ניוון מוחיים 16.
e_content "> כימות מדויק של רמות דקות של חומר זרע מדגימות ביולוגיות יכול להקל על מחקרים העוקבים אחר התקדמות מחלה מוקדמת. על ידי קיצור משך משפט ומאפשר שימוש בבעלי החיים צעירים, זה יכול להגביר את היעילות והדיוק של ניסויים בבעלי חיים פרה-קליניים. לדוגמא, ב עכבר P301S שתואר קודם לכן, תרכובות עופרת יכולות להיות מועברות מוקדם ככל 4-6 שבועות (מייד לפני, או בתחילתה של פעילות זריעה), ופיקוח על יעילות 2-4 שבועות לאחר מכן. assay צריך במדויק לכמת הפחתה כלשהי בזריעה פעילות. סריג cytometry זרימה שניתן לבדוק במבחנה יישומי הקרנה גם כן. לדוגמא, ריאגנטים אנטי-טאו (למשל, נוגדנים, מולקולות קטנות, וכו ') במהירות ליכולתם לחסום זריעת אינדוקציה ישירות בתרבות, או באמצעות טאו רקומביננטי אגרגטים או lysates נגזר מוח כמקור זרע (איור 5). עם התקנה זו, מהרגע שחומר זרע מוכן, לשעברperiment לוקח רק שלושה ימים כדי להשלים, כולל ניתוח נתונים. הכימות המהיר של פעילות זריעת proteopathic יכול כך להקל על מחקרים רבים של ניוון של מערכת עצבים.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: פרוטוקול זה מדגיש את השימוש בסריג cytometry זרימה לאיתור פעילות זריעה מדגימות ביולוגיות עכבר. זה גם תואם עם סיבי רקומביננטי ודגימות ביולוגיות אנושיות. קציר המתת חסד ומוח עכבר בוצע בהתאם לנהלים שאושרו על-IACUC.
1. מוח הפקה
- בעקבות הרדמה עמוקה עם isoflurane (2%), perfuse עכבר עם PBS קר כקרח המכיל הפרין 0.03%, ולחלץ את המוח בעקבות הפרטים שתוארו בet al גייג. 18
- מניחים רקמות חולצו בcryo-בקבוקון, ולהצמיד הקפאה על ידי הצבת בחנקן נוזלי. לחלופין, להקפיא רקמה על קרח יבש. ברגע קפוא, להעביר רקמות -80 ° C וחנות לתקופה ארוכה של זמן, במידת צורך.
הערה: פרוטוקול זה תואם homogenates המוח כולו או אזורים במוח-גזור מיקרו. ראה אל Hagihara et. לפרוטוקול מיקרו לנתיחה מפורט 19. 2. הכנת חומר זרע הביולוגי - הכן חיץ הומוגניזציה ידי המסת מעכבי פרוטאז (EDTA חינם) לTBS 1x (לוח 1 לכל 10 מיליליטר). וורטקס במרץ, וחנות על קרח. מעכבי פרוטאז חייבים להיות EDTA חופשי כדי לשמור על כדאיות תא biosensor.
- שוקל רקמת מוח קפוא בסירה לשקול חד פעמית, ולהעביר צינור חרוטי 5 מיליליטר. הוסף חוצץ הומוגניזציה קר כקרח, כך שהפתרון הסופי הוא 10% במשקל / נפח. באופן זמני לאחסן על קרח. מסת רקמה ויצירת הומוגניות הבאה חיץ נפח ישתנה בהתאם לגודל המוח ו / או האזורים בשימוש. כאן, hemibrain עכבר בוגר במשקל 0.2 גרם מושעה ב 2 מיליליטר ל- 10% w / פתרון כרך.
- העברת דגימות לחדר קר, ולהתאים sonicator בדיקה להגדרות המתאימות. עבור sonication בדיקה עם Ruptor Omni (המוצג כאן), להגדיר את הכח ל -20%, אשר תואם את כ -75 W. השתמש מצב דופק כדי להבטיח דגימות לא OVאה-מחומם במהלך sonication. הגדר את Pulser 30%, המקביל לכ 500 אלפיות שניים.
- נקה את קצה sonicator הבדיקה על ידי שטיפה במים, isopropanol, ומים שוב, מנגבים את הבדיקה בין כל פתרון. להיות בטוח כדי לשטוף ולנגב את שני הצדדים ותחתונים של הבדיקה עם מעבדה-מגבונים.
- עבודה עם מדגם אחד בכל פעם, להטביע את קצה הבדיקה למאגר הומוגניות, ולהתחיל sonicator. שימוש בהגדרות צריכת החשמל וPulser שתוארו לעיל, לספק 25 פולסים כולל. ודא רקמה שהיא לגמרי בהשעיה. להיות זהיר, כדי למנוע הקצפה של המדגם במהלך שלב זה.
הערה: דוגמאות רגישות להקצפה אם) הנפח הכולל הוא נמוך או ב) homogenate מתחמם. עם המכשיר הספציפי הזה, לא sonicate עם כמויות פחות מ -250 μl. כדי להבטיח דגימות להישאר קרות, צינורות עשויים להיות מאוחסנים על קרח במהלך שלב זה. - נקה את הבדיקה על ידי מוחה lysate שייר, אז לספק 10 פעימות לo כוסמים נקיים ו. יש לשטוף את הצדדים ותחתונים של הבדיקה עם מים, isopropanol, ומים שוב (כמו בשלב 2.4), ניגוב היבש בין כל שלב. כדי למנוע זיהום, לשטוף ביסודיות את הבדיקה בין דגימות.
הערה: עם אגרגטים טאו, לא מצאה כי שיטות ניקוי מחמירות יותר נחוצות למניעת זיהום מדגם למדגם. amyloids אחר, לעומת זאת, עשוי לדרוש טיפול נוסף אשר תואר בהרחבה בספרות 20,21. - חנות homogenates על קרח עד שכל הדגימות עובדו.
- ספין homogenates ב21,300 XG במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- מעבירים את supernatant לצינור נקי, נזהר שלא להפריע את הכדור. זורק את הכדור. Aliquot supernatant, וlysates החנות ב -80 ° C לשימוש נוסף. הימנע מחזורי הקפאה / הפשרה של homogenates, עם זאת, כפי שזה מפחית את יעילות זריעה.
- בסביבת סטרילית, תרבות בינונית לשאוב. יש לשטוף את תאים עם PBS החם, ולשאוב. Trypsinize תאים (3 מיליליטר של טריפסין EDTA (0.05%)) במשך 3 דקות, להרוות עם מדיום תרבות החמה (9 מיליליטר של DMEM, 10% FBS, 1% עט / סטרפטוקוקוס, 1% Glutamax), ולהעביר מייד לתאים צינור חרוטי.
- תאי צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 5 דקות ב RT. בינוני לשאוב, ותא גלולה גלול במדיום התרבות החם.
- באמצעות hemocytometer, לקבוע את צפיפות תאים לכל שורת תא. צפיפות תאים תשתנה בהתאם confluency בזמן קציר וresuspension הנפח. תאי Resuspend נקטפו מצלחת 10 סנטימטרים בconfluency 90% ב 10 מיליליטר תקשורת, לצפיפות תאים להיות כ 1 מיליון תאים / מיליליטר.
- לַעֲשׂוֹתתערובת אב של תאים + תקשורת באופן שכל גם צלחת גם 96 תכיל 35,000 תאים בתקשורת 130 μl (למשל, כדי להפוך את תערובת אב 100 בארות, resuspend 3.5 מיליון תאים בתקשורת 13 מיליליטר). לשנות את מספר התא כדי להתאים עיצובים ניסיוניים בודדים ולוחות זמנים. לטיפול בתא ~ 18 שעות לאחר ציפוי, להוסיף 35,000 תאים היטב בכל צלחת 96-היטב.
- באמצעות pipet רב ערוצית, פיפטה לאט 130 μl של השעיה תא תערובת האמן לבאר כל תחתית שטוחה, שטופלה בתרבית רקמת 96 צלחת גם. בעוד ציפוי, למקם את קצה pipet במרכז הבאר, לא נוגע בתחתית הצלחת.
הערה: למרות שניתן לשנות פורמט ציפוי, מה שהופך את n = 4 בארות לכל אחת משורות תאי 1-3 לכל צלחת מומלצת. שארית הפלטה (n = 84) שמורה לקו תא # 4 (תאי biosensor). - אפשר התאים להתיישב על ידי השארת הצלחת ללא הפרעה במשך 10 דקות ב RT. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, ו# 8805; 80% לחות יחסית.
- בצינור אחד, לשלב מגיב transfection, כגון Lipofectamine, עם תקשורת מופחתת בסרום, כגון Opti-ממ, כדי להפוך את תערובת אמן. בכל טוב, להוסיף 1.25 מגיב transfection μl ו8.75 μl תקשורת מופחת בסרום. צינור קפיצי בעדינות לתערובת, בקצרה ספין למטה, ודגירה של 5 דקות על RT.
- בצינור אחר, לשלב חומרי זרע (aliquot של lysate מהשלב 2.9) עם תקשורת מופחתת בסרום.
הערה: כרך של חומר זרע ישתנה בהתאם לניסוי הבודד. בעת בחירת זרע נפח, לקחת בחשבון: שפע של זרעים במדגם ורעילות פוטנציאלית. homogenates הגולמי יכולה להיות רעילה לתאים. ככזה, להשתמש בנפח הנמוך ביותר האפשרי לעקוב אחר ההשפעה הרצויה. כרכים נבדקו בעבר של lysate / גם מגוון fr אום 1-5 μl, מתאים לחלבון כולל 5-20 מיקרוגרם. ודא שהנפח הכולל לכל גם (זרעים + התקשורת מופחתת בסרום) הוא 10 μl. - לשלב תוכן משני הצינורות שתוארו ב4.1 ו -4.2, קפיצי בעדינות לתערובת, בקצרה ספין למטה (1,000 XG, 5 שניות), ולדגור על RT לפחות 20 דקות ועד שעה 2.
- בעדינות פיפטה 20 μl של התמרה מורכבת בצד של בארות biosensor בודדות. להשתמש בשלוש משכפל טכני, אם אפשר. חזור תאים שטופלו לחממה עבור 24-48 שעות. דגירה באותם תנאים כפי שתואר בשלב 3.6.
הערה: מצב השליטה השלילי המתאים להתקנה זו היא תאים שטופלו בbiosensor יפוזומים ריקים (כלומר, מגיב liposome + תקשורת מופחתת בסרום) כי יישום של פוספוליפידים מציג שינוי קל בביחס פרופיל הקרינה לתאים שלא נחשפו לbiosensor מגיב יפוזום. - באמצעות pipet רב ערוצית, לשאוב את כל המדיום הסלולרי (150 μl). Trypsinize (50 μl) תאים למשך 5 דקות, ולהרוות עם 150 μl מדיום תרבות מצונן. אינו כולל שטיפת PBS לפני trypsinization בשלב זה, כפי שהוא עלול לגרום להרמת תא ואובדן תא שלאחר מכן. תכלול כל תאים מתים זיהום ופסולת במהלך cytometry זרימה באמצעות אסטרטגיות gating.
- מייד לאחר מרווה, תאי העברה לצלחת תחתונה גם עגולה 96, ו צנטריפוגות XG ב 1000 עבור 5 ק"מn ב RT.
- לשאוב ולזרוק בינוני, לטפל כדי למנוע הפרעה לתא גלולה.
- בעדינות, אך ביסודיות, resuspend תא גלולה בparaformaldehyde 50 μl 2%, ודגירה של 10 דקות. לחלופין, תאים לרוץ לחיות, אם כי קיבעון מספק תוצאות נקיות ועקביות יותר.
- תאי צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 5 דקות ב RT. לשאוב ולזרוק paraformaldehyde, לטפל כדי למנוע הפרעה לתא גלולה.
- בעדינות, אך ביסודיות, resuspend התא גלולה ב200 μl זרימה מצוננת cytometry חיץ (HBSS, FBS 1%, 1 mM EDTA) ולהפעיל את הצלחת בהקדם האפשרי, כדי למנוע clumping תא.
- הפוך פיזור-פינת צד (SSC-) לעומת קדימה פיזור-פינת (FSC-) עלילת bivariate, ועם ריצת # 1 שורת תאים, להתאים את מתחי SSC וFSC עד אוכלוסיית התא היא ברבע השמאלי התחתון. לחץ על כלי המצולע, ולהגדיר את אוכלוסיית התא (שער P1). לכל הפרמטרים gating ראה איור 2.
- הפוך FSC-H (גובה) לעומת עלילת FSC-bivariate, ולהחיל שער P1 לעלילה זו על ידי לחיצה על "חי" לעיל העלילה, ובחירת P1. עם קו תא מס '1פועל, לחץ על כלי המצולע, ולהגדיר תאים בודדים (שער P2).
- לעשות 3 חלקות היסטוגרמה, אחד לכל אחד מהמסננים של עניין: CFP, YFP, והסריג. החל השער P2 לכל חלקות אלה על ידי לחיצה על "חי" מעל החלקות, ובחירת P2. עם ריצת # 1 שורת תאים, להתאים מתחים כך שאוכלוסיית תאים החציוני בCFP, YFP, וסריג היסטוגרמות כל בין 0 ל -1 כדי למדוד CFP וסריג, לרגש תאים עם לייזר 405 ננומטר, וקרינת לכידה עם 450/50 ננומטר ומסנן 525/50 ננומטר, בהתאמה. כדי למדוד YFP, לרגש תאים עם הקרינה לייזר ולכיד 488 ננומטר עם 525/50 ננומטר מסנן. הגדרות לייזר ומסנן מתוארות נוספות בלוח 2.
- בצע פיצוי לגלישת CFP לתוך ערוצי סריג וYFP.
הערה: פיצוי הוא התהליך של תיקון זליגת הקרינה. זליגת הקרינה מתרחשת בכל פעם פליטת הקרינה של fluorochrome אחד מזוהה בתוך desi מסנןgned למדוד אות מfluorochrome אחר. עם פיצוי הולם, הקרינה גלישת CFP ניתן להסיר מערוצי סריג וYFP.
הערה: פיצויים מחייבים הנוכחות של שני תאים החיוביים ול-שלילי הקרינה. לכן, כדי לפצות על תאי CFP-חיובי (קו # תא 2), תאים שליליים (# קו תא 1) יש להוסיף למדגם לפני הריצה.- ספייק בμl 30 של השעיה # 1 שורת תאים מאחד גם לתוך 200 μl של השעיה # 2 קו התא מייד לפני הפיצוי.
- לחץ על סמל "הגדרות מכשיר", ולאחר מכן כרטיסייה 'פיצוי', וסמן את "מטריקס" לפתוח שולחן הפיצוי.
- הפוך סריג-לעומת-CFP עלילת bivariate, ולהחיל P2 שער, כמתואר בשלב 6.3. עם ריצת 1 + 2 שורות תאים, לחץ על הסמל 'ברבע ולצייר רביעים (כך שקרינת -שלילי וחיובי לאוכלוסיות מופרדות על ידי שני רביעים הנמוכים גייטס LL3ND LR3, בהתאמה).
- צור טבלת הנתונים הסטטיסטיים המציגה את עוצמת הקרינה החציונית (MFI) של סריג לLL3 והשערים LR3. התאם את פרמטר סריג במטריצת הפיצויים עד MFI של אות סריג שווה בין LL3 וLR3. בעקבות צעד זה, MFI של אות סריג שווה בין תאים בלא כתם ותאי CFP-חיוביים, המצביע על היעדר גלישת CFP לתוך תעלת סריג.
- הפוך YFP-לעומת-CFP עלילת bivariate, ולהחיל P2 שער, כמתואר בשלב 6.3. לצייר רביעים (LL4 וLR4) דומים לזו שנעשתה בשלב 6.4.3.
- צור טבלת הנתונים הסטטיסטיים המציגה את MFI של YFP לLL4 וLR4. התאם את פרמטר YFP במטריצת הפיצויים עד MFI של אות YFP שווה בין LL4 וLR4. בעקבות צעד זה, MFI של אות YFP שווה בין תאים בלא כתם ותאי CFP-חיוביים, המצביע על היעדר גלישת CFP לתוך תעלת YFP.
- Follבשל התקנת שער ופיצוי, לסמן בארות של עניין ולהפעיל את שארית הצלחת.
- לאחר כל הדגימות כבר לרוץ, קבצי נתוני יצוא ידי לחיצה על 'קובץ', אז 'העתק'. בחר בכרטיסייה 'קבצי נתונים', סמן את תיקיית הניסוי, ולחץ על 'עותק'.
- קבצי FCS פתוחים בcytometry זרימת תכנית ניתוח.
- בהתבסס על מאפייני פיזור, להשתמש שער מצולעים להגדיר את אוכלוסיית התא (SSC לעומת FSC) ואוכלוסיית גופייה (FSC-H לעומת FSC-A) מהתאים שטופלו ביפוזומים ריקים, באופן דומה לזה שתואר בסעיף 6.
- אם פיצוי CFP בוצע במהלך התקנה, לא להתאים נוסף CFP.
- צור סריג לעומת עלילת bivariate YFP. שימוש בקו תא מס '3, מגדיר את שער סריג שווא על ידי ציור שער מצולעים המשתרע לאורך המדרון של אוכלוסיית תאי סריג-חיובי. שער זה אינו כולל תאים בודדים חיוביים YFP שפולטים אות בתוך מסנן סריג, והוא נמשך דומה לזה שהראה בעבר על ידי איסור et al. 22
- להגדיר שער סריג על ידי התוויית תאי CFP / YFP טופל liposome ריקים על סריג לעומת עלילת bivariate CFP. להציג את שער מצולעים במדרון של האוכלוסייה המשתרעת כלפי מעלה ושמאלה מן האוכלוסייה. שער זה צריך לכלול את רוב התאים (~ 99%), כך שרקע סריג הוא ≥1% מתאים. כל אירועים שיעברו לשער הזה נחשבים סריג-חיובי.
הערה: כל שער בודד שתואר לעיל חל על כל הדגימות לפני הקמת שערים שלאחר מכן. בעקבות ניתוח, ארבעה שערים בודדים מוגדרים (אוכלוסיית תא; גופייה; סריג כוזב; סריג). - פרמטרים שיא ניתוח של עניין, ובכלל זה: חיוביות סריג אחוזים וMFIשל תאי סריג-חיובי. באופן ידני לחשב את צפיפות סריג המשולבת על ידי מדידת המוצר של חיוביות אחוזים וMFI.
הערה: אם צפיפות סריג משולבת משמשת כמדד תוצאה, סריג רקע להגדיר (כהגדרתו בשלב 7.5) וMFI לגדול או שווה ל -1 על מנת להימנע מחישוב מוצר שהוא פחות משני גורמים הבודדים שלה.
3. תאי replating biosensor
הערה:השתמש בארבע שורות תאים לassay זה: HEK 293T (# קו תא 1), RD-P301S-CFP (קו # תא 2), RD-P301S-YFP (קו מס '3 תאים), וRD-P301S-CFP / YFP ( קו תא מס '4). אנא טבלת עזר 1 לתרומתו של כל קו תא assay.
4. תאי טיפול
הערה: היום הבא, כאשר תאי biosensor טאו הם 60-65% ומחוברות, להכין מתחמי התמרה זרע כדלקמן:
5. תאי קציר לסריג cytometry הזרימה
class = "jove_content"> הערה: לפני קצירת תאים-כלל 24-48 שעות שלאחר טיפול-אפשר לקבל קריאת נתונים ראשוניות של פעילות זריעה באמצעות מסנן GFP במיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי הפוך. תאים שטופלו ללא חומר זרע (כלומר, ליפוזומים ריקים) יציגו הקרינה מפוזרת, ואילו תאים שטופלו בחומר זרע יציגו punctate אינטנסיבית ותכלילים רשתי תאיים (איור 1 א - ב).
6. סריג cytometry הזרימה
הערה: השתמש cytometer זרימה כגון MACSQuant VYB, אשר מצויד בסריג תואם קווי לייזר ומערכות סינון (טבלה 2). לכל שלב בסעיף זה, לחץ גם עניין באמצעות תבנית 96 גם של התוכנה, ולחץ על"לשחק" כדי להתחיל ספיגת מדגם וזרימה. הפוך חלקות או טבלאות סטטיסטיקה על ידי לחיצה על הסמל 'חלון הניתוח החדש ". לשנות פרמטרים ציר על מגרשי bivariate בודדים על ידי לחיצה על הכותרת על X או ציר Y ובחירת המסנן המתאים. להעביר אוכלוסיות תאים או אותות הקרינה, להגדיל או להקטין את המתחים הקשורים למסננים המתאימים. עם המכשיר הזה, לרוץ <1,000 אירועים / sec כדי להבטיח ניטור תא בודד מדויק.
ניתוח 7. נתונים
הערה: פרמטרים ציר שינוי על מגרשי bivariate בודדים על ידי לחיצה על הכותרת על X או ציר Y ובחירת המסנן המתאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סריג cytometry זרימה מאפשר רגיש, כמותי, וזיהוי מהיר של פעילות זריעה מדגימות רקומביננטי או ביולוגיות. התקנת assay היא קלילה: שורות תאי יציבות הנגזר חד שבטיים להביע טאו-RD-CFP / YFP הם transduced עם חומר זרע, טופח במשך 24-48 שעות, ונתונים לניתוח תזרים cytometry (איור 1 א). בהעדר זרעים, תאי biosensor לשמור טאו בצורה מסיסה, monomeric (איור 1). בנוכחות של זרעים, לעומת זאת, תאי biosensor להמיר טאו למדינה מצטברת (איור 1 ג), ייצור תגובת סריג שהוא זוהה על בסיס לכל תא עם cytometry זרימה. הערכה כמותית מראה כי תאי biosensor להגיב לריכוזי femtomolar חומר זרע וכי פעילות הזריעה ניתן למדוד בצורה יעילה על פני שלושה סדרי הגודל (1D איור).
הפרמטרים gating הוקמו כדי להבטיח זיהוי של TRUE סריג אות, גם בריכוזים נמוכים זרע. ראשית, שיטות gating סטנדרטיים משמשות כדי לבודד את אוכלוסיית התא (איור 2 א) ותאים בודדים (איור 2). אות סריג שווא יכולה לנבוע מהפעלה ישירה של YFP על ידי לייזר 405 ננומטר. לפיכך, שער סריג False נמשך מאוכלוסיית תא בודדת חיובית YFP להוציא אות זיהום (איור 2 ג). אחרון, שער סריג מוגדר מתאי unseeded CFP / YFP הכפול חיוביים (איור 2 ד). שער מצויר ליד המדרון של האוכלוסייה המשתרעת כלפי מעלה ושמאלה ממנה. תאי unstimulated צריכים רקע סריג הערך מוגדר כ 1%, ותאי סריג חיובי יעברו לשער הזה באופן תלוי-מינון (השווה איור 2E ו2F). מספר פרמטרים נלקחים בחשבון עם סריג cytometry זרימה, ובם: חיוביות אחוזים (כלומר, מספר תאי סריג-חיוביים לכלל ספירת תאים) ובעוצמת הקרינה החציונית (כלומר, המידה שבה תגובת סריג מיוצרת בתאי סריג-חיובי). צפיפות משולבת סריג היא מדד התוצאה המועדף, כפי שהוא התוצר של שני משתנה אלה ומלאים מייצג את מידת פעילות זריעה הנגרמת על ידי כל מדגם נתון.
סריג cytometry זרימה תואם lysates מוח P301S tauopathy נגזר עכבר, אפילו בגילים צעירים, כמוצג באיור 3. בעקבות microdissection של ארבעה אזורים שונים במוח, סריג cytometry זרימה שימש למדידת פעילות זריעה מגזע המוח (איור 3 א), הניאוקורטקס (איור 3), אונה קדמית (איור 3 ג), וההיפוקמפוס (איור 3D) בעכברי P301S על פני טווח של גילים. בכל אזור, פעילות זריעה עלתה עם גיל ונראית במרחק של 1.5 חודשים. עם זאת, עכברי נוקאאוט טאו ("KO")> 12 mos לא מוצגים פעילות זריעה. בהשוואה לשעותistological ניתוחים שבוצע באותה חיות, זה שישה שבועות מוקדם יותר מהמראה של כל סמן אחר של בתצהיר טאו (איור 3E), כוללים סמנים של טאו conformationally-הסוטה (MC1), טאו hyperphosphorylated קונפורמציה (AT8 וPG5), ועמילואיד (ThioflavinS). ממבט מכניסטית, זיהוי הפרוקסימלי של פעילות זריעת זרעי טאו מציע כמתווך סיבתי של תחילת ו / או התקדמות tauopathy. ממבט ניסויי, זה מצביע על כך שניתוח של פעילות זריעה עשוי להיות תוספת אידיאלית למדדי תוצאה סטנדרטיים של תצהיר טאו, נתן הופעתה המוקדמת וחזקה.
בנוסף לעכברים הטרנסגניים, סריג cytometry זרימה תואם lysates המוח האנושי וקלות יכולה לזהות אגרגטים טאו המבודדים מנושאי מחלת אלצהיימר (איור 4). כאשר רקמת מוח אנושית קפואה הומוגני באותו אופן כפי שתואר כאן לlysates מוח P301S, זריעת פעילותהוא זוהה וחסונה מכל המדגמים נגזרו מנושאים לספירה. לעומת זאת, פעילות זריעה לא זוהתה מlysates של נושאי בקרת מחלות של התאמה-גיל או הנטינגטון. זה מדגיש את הייחוד של assay לאגרגטים טאו.
למרות ההתמקדות של מאמר זה הוא גילוי רגיש של פעילות זריעת טאו באמצעות משלוח בתיווך liposome של אגרגטים לתאי biosensor 293T HEK, יכולות גם להתבצע פרדיגמות תרבית תאים פיסיולוגיות יותר עם סריג cytometry זרימה להעריך מנגנוני קליטה סלולרית בסיסיים. לדוגמא, יכולות להיות נגועות תרבויות עצביות עיקריות עם lentivirus להביע טאו-RD-CFP וטאו-RD-YFP בונה בזמן של ציפוי. בDIV4, צבירה נעדר בתאים שלא טופלו (איור 5 א), אבל לזיהוי בתאי עצב שטופלו בחומרים המכילים זרעים (איור 5). חשוב לציין, פוספוליפידים אינם נכללים בניסויים אלה, המתירים את החקירה של פיסיולוגי וטפיחה מנגנוני זריעת hophysiological. לפיכך, יישום של סיבי טאו מוביל לספיגה בתיווך HSPG עצבית וממגר צבירה באופן תלוי-מינון שניתן לכמת עם זרימת סריג cytometry (איור 5 ג). בנוסף, assay יכול להיות מועסק להערכה טיפולית של ספיגת טאו וזריעת מצור במבחנה באמצעות תאי biosensor טאו 293T HEK. גם בהיעדרו של פוספוליפידים, שני סיבי רקומביננטי (איור 5D) וlysates המוח P301S (5E איור) לגרום לצבירת טאו. טרום דגירה של זרעים אלה טאו עם הפרין (הראתה בעבר להיות מעכב חזק של ספיגת טאו תיווך HSPG), עם זאת, מבטל את יכולת זריעתם. הגדרת ניסוי זה יכול להיות מיושמת על כל תרופה (למשל, נוגדנים, מולקולות קטנות, וכו ') ותאפשר הערכה מהירה של ספיגה ו / או תרופות המשנה את הזרע.
"Src =" איור 1 "/> / קבצים / ftp_upload / 53,205 / 53205fig1.jpg
איור 1. סריג cytometry זרימת רגישות מזהה פעילות זריעת טאו 16. תאי 293T חד שבטיים HEK להביע טאו-RD-CFP / YFP היו transduced עם דגימות רקומביננטי או ביולוגיות, טופחו במשך 24-48 שעות, ונותחו על בסיס תא בודד באמצעות cytometry זרימה (). תאי unstimulated לשמור טאו-RD במדינה (B) monomeric, ואילו תאים שטופלו עם תכלילים המכילים זרעי תצוגת חומר בולטים (C). הערכה כמותית (ממוצע ± SEM) של מופעי פעילות הזריעה שסריג cytometry זרימה היא רגיש לריכוזי femtomolar (שווה ערך מונומר) של חומר זרע רקומביננטי וגילוי משתרע על פני שלושה סדרי הגודל (ד '). שווה ערך מונומר מייצג את הכמות הכוללת של חלבון בתוך תגובת fibrillization ולא לתקן שלם ו# 160; התאגדות של מונומר לחומר מצטבר. לפיכך, הריכוז של אגרגטים בפועל (זרעים) חייב להיות קטן או שווה ל'שווה ערך מונומר "שלה. * השתנה מהולמס ופורמן ואח '. 16 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. אסטרטגית gating לסריג cytometry זרימה. אוכלוסיית תא () וגופיית כפיל שערים / (ב) נמשכות עם זרימה סטנדרטית cytometry המתודולוגיה. שער סריג שווא (C) נמשך מהתאים בודדים חיוביים YFP לחסל YFP bleedthrough לתוך מסנן סריג. שער סריג (ד ') בנוי מהתאים שטופל liposome ריקים, כגוןשסריג הרקע הוא ≥1%. שינוי אוכלוסייה לשער סריג מופיע לאחר טיפול בחומר הזרע חיובי (E) והמשמרת הופכת בולטת יותר ויותר עם כמויות גדולות יותר של חומר זרע (F). קריאות סופיות כוללות:. אחוז סריג חיובי, עוצמת הקרינה החציונית (MFI) של אירועי סריג-חיוביים, וצפיפות סריג המשולבת (תאים חיוביים אחוז הצפיפות המשולב סריג = * MFI) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
התקדמות איור 3. פעילות זריעת טאו בעכברי P301S 16. פעילות זריעה (± אומר SEM) מhomogenates המוח של עכברי P301S ניכר בחודשים 1.5 בגזע המוח (), הניאוקורטקס (ב '), באונה הפרונטלית (C), וההיפוקמפוס (ד'). עם זאת, פעילות זריעה מעולם לא נצפתה בעכברי נוקאאוט טאו (> 12 חודשים). פעילות זריעה עולה עם גיל ומקדימה את ההופעה של סמנים אחרים נפוצים היסטולוגית, כולל MC1, AT8, וPG5 (E). * הודפס מחדש באישור מהולמס ופורמן ואח '. 16 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. תאימות של סריג cytometry זרימה עם דגימות ביולוגיות אנושיות 16. כאשר תאי biosensor טאו-RD-CFP / YFP הם transduced עם 20 מיקרוגרם lysate המוח אנושי, זריעה חזקה (ממוצע ± SEM) מתרחש בכל disea אלצהיימר נבדקמוח se, ואילו lysates שליטת מחלת מותאם-הגיל והנטינגטון חסר פעילות זריעה. * השתנה מהולמס ופורמן ואח '. 16 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. יישומים אלטרנטיביים לסריג cytometry זרימת 16. נוירונים יסודיים transduced עם קידוד lentivirus טאו-טאו וCFP-YFP בונה. בהעדר זרעים אקסוגניים אין צבירה לכאורה (), אבל יש בנוכחות של זרעים (B). חיישנים עצביים להגיב מינון dependently לזרעי טאו רקומביננטי, גם בהיעדרו של משלוח בתיווך פוספוליפידים (C). טרום דגירה של רקומביננטי (ד) או דומקורות זרע (E) ological עם הפרין, מעכב ספיגה של זרע טאו תיווך HSPG, מכלה את סריג תגובה של תאי biosensor HEK 293T. מציג הערכה כמותית (ממוצע ± SEM). * השתנה מהולמס ופורמן ואח '. 16 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
שולחן 1: שורות תאים בשימוש עם סריג cytometry זרימה. תאי 293T HEK משמשים לזרימה cytometry התקנה. תאים בודדים חיוביים CFP משמשים לפיצוי (*). תאים בודדים חיוביים YFP משמשים לחסל אות סריג שווא בשל הפעלה ישירה של YFP על ידי 405 עירור ננומטר. תאים כפולים חיוביים CFP / YFP הם סריג תואמים וישמשו כתאי biosensor. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של השולחן הזה.
טבלה 2:. Cytometer זרימת הגדרות לייזר ומסנן אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של השולחן הזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מערכת cytometry זרימת סריג המתוארת כאן היא כלי רב עוצמה להערכת פעילות זריעת טאו במהירות ובכמותית. זה דורש רק ניסיון מתון תרבית תאים וידע בסיסי של סריג וcytometry זרימה. מבחני זריעה אחרים, כגון Thioflavin T - אשר מציגה משופר הקרינה כאשר חייב מבנה גיליון בטא - הם מייגע ודורשים מצע חלבון טהור, רקומביננטי. בנוסף, במבחנה מבחני זריעה לטאו הם חצי כמותית בלבד, ובדרך כלל רגישים לרמות subnanomolar חומר זרע 23,24. סריג cytometry זרימה, לעומת זאת, מספק מדד כמותי ורגיש להפליא של פעילות זריעה מדגימות או רקומביננטי או ביולוגיות. יתר על כן, עיבודים להליך יכולים לעשות את זה שימושי ללמוד מגוון רחב של הפרעות צבירת חלבון.
בעוד הפרוטוקול המתואר במסמך זה מתמקד בזריעת טאו, רק שינויים פשוטים נדרשים to לאפשר למשתמש לעקוב אחר פעילות זריעה מסוגים חלופיים של זרעי proteopathic. כפי שהודגם בהולמס ופורמן ואח '., יצירת קו תא חד שבטי יציבות להביע α-סינוקלאין מחסה המוטציה A53T הקשורים למחלות מתויגת לאו CFP או YFP אפשר זיהוי רגיש של פעילות זריעה מסיבי α-סינוקלאין באורך מלא רקומביננטי 16 . ניסויים דומים בוצעו באמצעות תאי biosensor Huntingtin, שגם ביעילות לזהות צבירת חלבון. לפיכך, רק על ידי שינוי biosensor החלבון, סריג cytometry זרימה תואם מקורות זרע רבים. שינויים אחרים לassay, כולל פרדיגמה טיפול ומודל תא, ניתן להשתמש כדי להפוך את סריג cytometry זרימה יותר ישים להערכת מנגנונים פיסיולוגיים. בפרוטוקול זה, זרעים הוכנסו ישירות לתאי biosensor באמצעות התמרה תיווך liposome כדרך להגביר את הרגישות.
חשוב nOTE, עם זאת, כי זה לא דרישה. טאו אגרגטים מדגימות ביולוגיות רקומביננטי או עכבר עדיין מסוגלת זריעת תאי biosensor בהעדר יפוזומים (איור 5). כך, מעבדות מעוניינות ללמוד התפשטות פיזיולוגית ו / או מנגנוני קליטה של זרעי טאו עדיין עשויה להעסיק את assay. בנוסף, סריג cytometry זרימה תואם תרבויות עצביות עיקריות. על ידי הדבקה של תאים עם CFP- ומבני lentiviral קידוד YFP בזמן של ציפוי, היענות סריג יעילה מושגת בריכוזים של ננו-מולר בעקבות טיפול בסיבי טאו רקומביננטי, גם בהיעדרו של יפוזומים (איור 5). יחדיו, נתונים אלה מצביעים על כך שזרימת סריג cytometry הוא שימושי לחקר מנגנונים פיסיולוגיים של זריעה עבור מגוון רחב של אגרגטים חלבון ובדגמי תרבית תאים מרובים.
בעוד סריג cytometry זרימת המערכת הוא ידידותי למשתמש והתאמה, צעדי מפתח מסוימים צריכים להיותאחריו כדי להבטיח תאימות, כולל הכנת מדגם וconfluency תאים התקין בזמן טיפול. sonication בדיקה בעצימות גבוהות של דגימות מוח הוא קריטי עבור בידוד יעיל ואופטימלי של פעילות זריעה. במהלך פיתוח ואופטימיזציה, זה היה ציין כי כי שיטה זו היא מעל 10 פעמים יעילה יותר בבידוד פעילות זריעה ממוח P301S עכבר ביחס לטכניקות נפוצות אחרות, למשל הומוגניזציה כף יד. ייתכן שיש לי אגרגטים טאו גדולים מאוד נטיית זריעה נמוכה יחסית, וכי sonication הבדיקה הוא יעיל ביותר לשבירת אגרגטים אלה לרסיסים קטנים, זרע תואם. משך ותדירות של sonication ניתן לשנות במידת צורך, אם כי ההגדרות שתוארו לעיל מומלצות לזיהוי רגיש של פעילות זריעה.
confluency הסלולרי בעת הטיפול גם הוא בעל חשיבות עליונה, כפי שהוא משפיע על רגישות ובריאות תא. אם תאיםמחדש ומחוברות מדי, הם לא בקלות לקחת את פוספוליפידים וחומר זרע, וכך באופן דרמטי הפחתת רגישות. אם confluency הוא נמוך מדי, תוספת של פוספוליפידים וחומר זרע יכולה להיות רעילה. בדיקות אמפיריות מראה כי confluency biosensor של 60-65% הוא אופטימלי לטיפול והיענות שלאחר מכן.
כפי שצוין בפרוטוקול, אלגוריתמי פיצוי משמשים באופן קבוע להוציא גלישת CFP לתוך YFP וסריג ערוצים, ובכך למנוע אותות כוזבים והגברת רגישות. להערכה איכותית ומהיר של פעילות זריעה, עם זאת, צעד זה עשוי להיות מושמט או שבוצע לאחר מעשה באמצעות cytometry זרימת תוכנת ניתוח. אות נקיה וחזקה יותר מתקבלת בעקבות פיצוי, לעומת זאת, ובכך לניתוח הקפדני וכמותיים ביותר בשלב זה מומלץ מאוד.
הגבלה של assay היא חוסר היכולת שלה לדווח על יוכימיים הרכבזרעי proteopathic. הפעילות השוטפת אמצעי assay הזריעה, רכוש פונקציונלי של זרעים. קביעת הטבע ביוכימיים וbiophysical של הזרעים תדרוש צימוד למבחנים מסורתיים כגון immunoprecipitation, כרומטוגרפיה, dichroism המעגלי, ספקטרוסקופיית מסות, וכו 'עם זאת, assay זה יהיה שימושי בהערכת עצמת זריעה כנקודת סיום מדגימות עצום.
assay זה היה בשימוש לאחרונה לכמת ולאפיין את timecourse של זריעת התפתחות והתקדמות בעכברי P301S ביחס לסמנים אחרים נפוצים בתצהיר טאו, כגון כתמים היסטולוגית. במחקר זה, פעילות זריעת טאו הייתה ברורה יותר משישה שבועות לפני הסמן המוקדם היסטולוגית (MC1) שבדקנו 16. בהתחשב במראה שלה מוקדם, זריעת פעילות עשויה לייצג משלימה חשוב, או אפילו חלופי, מדד תוצאה להערכת יעילות של התערבויות טיפוליות, לפחות למחקרים ראשוניים.על ידי קיצור כמובן טיפול ולומדים בעלי חיים, עלויות דיור צעירות וזמן אספקה ניסיוני יקטן. זה מתקבל על הדעת כי תרופות יכולות להיות מנוהלות על עכברי P301S ב4-6 שבועות ומוח הערכה לפעילות זריעה 2-4 שבועות לאחר מכן. לחלופין, הערכה של תרופות אנטי-טאו בתאים יכולה להתבצע בתוך ימים על ידי הערכת יכולתם כדי לחסום אינדוקציה של פעילות זריעה בתאי biosensor, כפי שמודגם באיור 5.
לסיכום, סריג cytometry זרימת זריעת assay היא דרך קלה ויעילה לגילוי זריעת טאו ממקורות רקומביננטי או ביולוגיים. הרגישות שלה היא שאין כמותו על ידי אחרים במבחני זריעת טאו מבחנה, וזה יכול להיות מועסק על מנת לזהות את שינוי פתולוגי המוקדם בעכברי tauopathy P301S. יתר על כן, הגמישות שלה בניטור זרעי proteopathic רבים בתנאי טיפול שונים, ועם מודלים תרבות תאים מרובים, עושה את זה שימושי לכל מעבדה צבירת חלבון מעוניינת באיסוף נתונים כמותיים במהירות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TBS | Sigma | T5912 | |
| cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free) | Roche | 4693159001 | |
| Cryo-vials | Sarstedt | 72.694.006 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 105DU | |
| Weighing Boats | Fisher Scientific | 13-735-743 | |
| 15 ml conical tube | USA Scientific | 1475-0501 | |
| Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer | Omni International | 18-000-115 | |
| Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer | Omni International | OR-T-156 | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A451 | |
| Noise Cancelling Ear Muffs | Fisher Scientific | 19-145-412 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | S47299 | |
| 1.5 ml tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 000.215 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 50 ml Conical Tubes | Phenix Research | SS-PH15 | |
| 25 ml reagent resevoirs | VWR | 41428-954 | |
| Multi channel pipet | Fisher Scientific | TI13-690-049 | |
| 96 well flat bottom plates | Corning | 3603 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3788 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |
| Sorvall ST 40 Centrifuge | Thermo Scientific | 75004509 | |
| BIOLiner Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003796 | |
| Hemacytometer | VWR | 15170-172 | |
| MACSQuant VYB Flow Cytomter | Miltenyi Biotec | 130-096-116 | |
| Chill 96 Rack | Miltenyi Biotec | 130-094-459 | |
| Flow Jo analysis software | Flow Jo | ||
| 20 μl pipet tips | Rainin | GPS-L10 | |
| 200 μl pipet tips | Rainin | GPS-250 | |
| 1 ml pipet tips | Rainin | GPS-1000 | |
| 200 μl pipet tips | USA Scientific | 1111-1800 | |
| 5 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-606180 | |
| 10 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-607180 | |
| 25 ml Serological pipett | Phenix Research | SPG-760180 |
References
- Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks. Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).
- Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. Predicting Regional Neurodegeneration from the Healthy Brain Functional Connectome. Neuron. 73 (6), 1216-1227 (2012).
- Raj, A., Kuceyeski, A., Weiner, M. A Network Diffusion Model of Disease Progression in Dementia. Neuron. 73 (6), 1204-1215 (2012).
- Braak, H., Braak, E.
- Braak, H., Braak, E. Staging of Alzheimer's disease-related neurofibrillary changes. Neurobiol Aging. 16 (3), 271-278 (1995).
- Frost, B., Diamond, M. I.
- Holmes, B. B., Diamond, M. I.
- Kaufman, S. K., Diamond, M. I. Prion-like propagation of protein aggregation and related therapeutic strategies. Neurotherapeutics. 10 (3), 371-382 (2013).
- Holmes, B. B., Diamond, M. I. Prion-like properties of Tau protein: the importance of extracellular Tau as a therapeutic target. J Biol Chem. 289 (29), 19855-19861 (2014).
- Guo, J. L., Lee, V. M. Cell-to-cell transmission of pathogenic proteins in neurodegenerative diseases. Nat Med. 20 (2), 130-138 (2014).
- Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
- Guo, J. L., Lee, V. M. Y. Seeding of normal tau by pathological tau conformers drives pathogenesis of Alzheimer-like tangles. Journal of Biological Chemistry. , (2011).
- Holmes, B. B., et al. Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), E3138-E3147 (2013).
- de Calignon, A., et al. Propagation of Tau Pathology in a Model of Early Alzheimer's Disease. Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).
- Liu, L., et al. Trans-Synaptic Spread of Tau Pathology In Vivo. PLoS One. 7 (2), e31302 (2012).
- Holmes, B. B., et al. Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), E4376-E4385 Forthcoming.
- Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65 (65), (2012).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. J Vis Exp. (33), (2009).
- Yan, Z. X., Stitz, L., Heeg, P., Pfaff, E., Roth, K. Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies. Infect Control Hosp Epidemiol. 25 (4), 280-283 (2004).
- McDonnell, G., et al. Cleaning, disinfection and sterilization of surface prion contamination. J Hosp Infect. 85 (4), 268-273 (2013).
- Banning, C., et al. A flow cytometry-based FRET assay to identify and analyse protein-protein interactions in living cells. PLoS One. 5 (2), e9344 (2010).
- Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein. Biochemistry. , (2013).
- Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein. J Vis Exp. (95), e51537 (2015).
