Introduction
Den intracellulære akkumulering av tau amyloids definerer tauopatier, for eksempel Alzheimers sykdom. I tidlige sykdomsstadier, er patologi generelt lokalisert til diskrete regioner av hjernen, men med sykdomsprogresjon, patologi alltid spres langs adskilte nevrale nettverk 1-5. Akkumulere bevis tyder transcellulær spredning av giftige proteinaggregater ligger til grunn for denne patologi (anmeldt i 6-10). I denne modellen er proteopathic frø (f.eks tau) løslatt fra donorceller og skriv naboceller, trans innfødte tau protein i misfolded form via malbasert konformasjonsendringen 11-15. Analysen som beskrives her ble utviklet for å detektere en slik omhyggelig seeding aktivitet. Den er kompatibel med rekombinant protein og biologiske prøver og muliggjør kvantifisering av liten grad av proteopathic seeding aktivitet 16.
HEK 293T celler som stabilt uttrykker tau gjenta domain (RD) inneholdende det sykdomsassosierte P301S mutasjon fusjonert til enten CFP eller YFP (heretter kalt tau-RD-CFP / YFP celler) tjener som en stabil biosensor for såing aktivitet. I fravær av proteopathic frø, cellene opprettholde tau som et oppløselig monomer, og har ingen nevneverdig bakgrunn FRET. Spontan opptak eller liposom-mediert transduksjon av tau-frø i celler, resulterer imidlertid i RD-CFP og RD-YFP aggregering, som frembringer et FRET signal som er målt i løpet av enkeltceller via flowcytometri.
Mange komponenter av denne analysen ble konstruert for å øke følsomheten og redusere variabilitet. Et monoklonalt cellelinje med en 1: 1 RD-CFP / YFP uttrykk ratio ble valgt, da det gir optimal signal: støy. For å øke sensitiviteten, blir fosfolipider anvendt for å innføre frø direkte inn i cellene (selv om å studere biologiske mekanismer for opptak, kan dette utelates). Endelig flowcytometri skjermer FRET på befolkningsnivå og en enkelt celle nivå, i motsetning til andre protein aggregasjon analyser. Det endelige endepunktet, integrert FRET tetthet, er meget kvantitativ og står både for antall celler med aggregering, og i hvilken grad aggregering har forekommet i hver celle. Alle disse parameterne er optimalisert øke følsomheten og sikre reproduserbarhet.
Dette systemet ble nylig ansatt i en omfattende studie i transgen P301S tauopati mus 17 som evaluerte den timelige utbruddet og progresjon av tau seeding aktivitet i forhold til andre brukte tau patologiske markører (f.eks MC1, AT8, PG5 og ThioflavinS). Seeding aktivitet er langt den tidligste og mest robuste markør av tau patologi evaluert, foregående histologisk påvisning av minst 6 uker. Seeding aktivitet vises på 1,5 måneder og øker gradvis med alderen, noe som tyder på en årsaks rolle proteopathic frø i utbruddet og / eller progresjon av neurodegenerasjon 16.
e_content "> Presis kvantifisering av liten grad av frø materiale fra biologiske prøver kan tilrettelegge studier som overvåker tidlig sykdomsutvikling. Ved å forkorte rettssaken varighet og muliggjør bruk av yngre dyr, kan dette øke effektivitet og nøyaktighet prekliniske dyreforsøk. For eksempel i den P301S mus som tidligere er beskrevet, kan blyforbindelser leveres så tidlig som 4-6 uker (umiddelbart før eller ved inntreden av poding aktivitet) og overvåket med hensyn til effektivitet 2-4 uker senere. Analysen bør nøyaktig kvantifisere eventuelle reduksjoner i seeding aktivitet. FRET flowcytometri har in vitro screening programmer også. For eksempel kan anti-tau-reagenser (f.eks, antistoffer, små molekyler, etc.) kan testes for sin evne til hurtig å blokkere såing induksjon direkte i kultur, ved hjelp av enten rekombinant tau aggregater eller hjerne-avledet lysater som et frø kilde (figur 5). Med dette oppsettet, når frø materiale fremstilles, en exForsøket tar bare tre dager å fullføre, herunder dataanalyse. Den raske kvantifisering av proteopathic seeding aktivitet kan dermed legge til rette for mange studier av neurodegeneration.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NB: Denne protokollen fremhever bruken av FRET flow-cytometri for å detektere seeding aktivitet fra mus biologiske prøver. Det er også kompatibelt med rekombinante fibriller og menneskelige biologiske prøver. Mus eutanasi og hjernen høsting ble utført i samsvar med IACUC-godkjente prosedyrer.
1. Brain Extraction
- Etter dyp anesthetization med isofluran (2%), perfuse en mus med iskald PBS inneholdende 0,03% heparin, og trekke ut hjernen følgende detaljene beskrevet i Gage et al. 18
- Plasser hentet vev i en cryo-hetteglass, og knipse fryse ved å plassere i flytende nitrogen. Alternativt kan fryse vevet på tørris. Når frosset, overføres vev til -80 ° C og oppbevares i en lengre periode, hvis det er nødvendig.
MERK: Denne protokollen er kompatibel med hele hjernen homogenates eller mikro-dissekert hjerneregioner. Se Hagihara et al. For en detaljert mikro-disseksjon protokoll 19. 2. Utarbeidelse av biologisk Seed Material - Forbered homogeniseringsbuffer ved oppløsning av proteasehemmere (EDTA-fri) inn 1x TBS (en tablett per 10 ml). Vortex kraftig, og butikken på is. Proteasehemmere må være EDTA gratis for å bevare biosensorcelle levedyktighet.
- Veie frossen hjernevev i en engangs veie båt, og overføre til en 5 ml konisk tube. Legg iskald homogeniseringsbuffer slik at den endelige oppløsningen er 10% vekt / volum. Midlertidig lagre på is. Tissue masse og etterfølgende homogenisering buffervolum vil variere avhengig av størrelsen på hjernen og / eller områder som brukes. Her blir en voksen mus hemibrain veide 0,2 g ble suspendert i 2 ml av en 10% vekt / volum løsning.
- Overfør prøvene i et kaldt rom, og justere en probesonikator til de riktige innstillingene. For sonde lydbehandling med en Omni Ruptor (vist her), sette kraft til 20%, noe som tilsvarer ca 75 W. Bruk en pulsmodus for å sikre prøvene er ikke over-oppvarmet om lydbehandling. Sett pulserer til 30%, tilsvarende ca 500 msek.
- Rens spissen sonikator ved skylling med vann, isopropanol og vann igjen, tørker av sonden mellom hver løsning. Vær sikker på å skylle og tørke begge sidene og bunnen av sonden med lab-våtservietter.
- Arbeide med en sample av gangen, senke sondespissen i homogeniseringsbufferen, og starte sonikator. Ved hjelp av kraften og Pulser innstillingene som er beskrevet ovenfor, levere 25 totalt pulser. Sørg for at vevet er helt i suspensjon. Vær forsiktig for å unngå skumming av prøven under dette trinnet.
MERK: Prøver er utsatt for skumming dersom a) totalvolum er lavt, eller b) homogenatet varmes opp. Med dette spesifikt instrument, ikke sonicate med volum mindre enn 250 fil. For å sikre at prøvene bli avkjølt, kan rørene være lagret på is i løpet av dette trinnet. - Rengjør sonden ved å tørke bort rest lysat, deretter levere 10 pulser i et beger of rent vann. Skyll sidene og bunnen av sonden med vann, isopropanol og vann igjen (som i trinn 2.4), det tørkes mellom hver trinn. For å unngå forurensning, skyll grundig sonden i mellom prøvene.
MERK: Med tau aggregater, vi har ikke funnet at strengere rensemetoder er nødvendig for å hindre sample-to-sample forurensning. Andre amyloids kan imidlertid kreve ekstra omsorg som har blitt grundig beskrevet i litteraturen 20,21. - Butikken homogenater på is inntil alle prøvene har blitt behandlet.
- Spin homogenater på 21 300 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
- Overfør supernatanten til et rent rør, tar seg ikke å forstyrre pelleten. Kast pelleten. Alikvot av supernatanten, og lagre lysatene ved -80 ° C for videre bruk. Unngå å fryse / tine sykluser av homogenater, men, da dette forringer seeding effektivitet.
- I et sterilt miljø, aspirere kulturmediet. Skyll celler med varm PBS, og aspirer. Cellene trypsineres (3 ml trypsin-EDTA (0,05%)) i 3 minutter, slukke med varmt kulturmedium (9 ml DMEM, 10% FBS, 1% pen / strep, 1% Glutamax), og øyeblikkelig overføre cellene til en konisk tube.
- Sentrifuger cellene ved 1000 xg i 5 min ved RT. Aspirer medium, og resuspender cellepelleten i varmt kulturmedium.
- Ved hjelp av et hemocytometer, bestemme celletettheten for hver cellelinje. Celletetthet vil variere avhengig av confluency på tidspunktet for høsting og resuspensjon volum. Resuspender celler høstet fra en 10 cm plate ved 90% konfluens i 10 ml media for celletettheten til å være omtrent 1 million celler / ml.
- Lageen konsentrat-blanding av celler + medium slik at hver brønn i en 96-brønners plate vil inneholde 35.000 celler i 130 ul medium (for eksempel, for å lage en masterblanding for 100 brønner, resuspender 3,5 millioner celler i 13 ml medium). Endre celle nummer for å passe individuelle eksperimentelle design og tidslinjer. For cellen behandling ~ 18 timer etter plating, tilsett 35.000 celler til hver brønn i en 96-brønns plate.
- Ved hjelp av en flerkanals pipette, langsomt pipette 130 ul masterblanding cellesuspensjon til hver brønn i en flat bunn, vevskultur-behandlede 96-brønners plate. Mens plating, plasserer pipette tips i sentrum av brønnen, ikke berøre bunnen av tallerkenen.
MERK: Selv om platekledning format kan bli endret, er å lage n = 4 brønner for hver av cellelinjer 1-3 per plate anbefales. Resten av platen (n = 84) er reservert for cellelinje # 4 (biosensorceller). - La cellene for å gjøre opp ved å la platen uforstyrret i 10 minutter ved RT. Inkuber O / N ved 37 ° C, 5% CO2, og &# 8805, 80% relativ fuktighet.
- Ved en tube, kombinere transfeksjon reagens, så som Lipofectamine, med redusert serum medier, som Opti-MEM, for å gjøre en masterblanding. Per godt, tilsett 1,25 mL transfeksjon reagens og 8,75 mL redusert serum medier. Flick rør forsiktig for å blande, kort spinne ned, og inkuberes i 5 min ved RT.
- I en annen tube, kombinere frø materiale (delmengde av lysat fra trinn 2.9) med redusert serum media.
MERK: Volum av frø materiale vil variere i forhold til den enkelte eksperimentet. Når du velger frø volum, ta hensyn til: overflod av frø i en prøve og potensielle toksisitet. Crude homogenater kan være giftig for cellene. Som sådan, må du bruke den laveste volum mulig å overvåke ønsket effekt. Tidligere testet mengder lysatet / godt utvalg from 1-5 ul, svarende til 5 til 20 ug totalt protein. Sørg for at det totale volumet per brønn (frø + redusert serum media) er 10 pl. - Kombiner innholdet fra de to rørene som er beskrevet i 4.1 og 4.2, flick forsiktig for å blande, kort spinne ned (1000 xg, 5 sekunder), og inkuber ved romtemperatur i minst 20 minutter og opp til 2 timer.
- Forsiktig pipette 20 ul av transduksjon kompleks på siden av de enkelte brønner biosensor. Bruk tre tekniske replikater, hvis mulig. Returner behandlede celler til inkubatoren i 24-48 timer. Inkuber under de samme betingelser som beskrevet i trinn 3.6.
MERK: egnet negativ kontroll betingelse for dette oppsettet er biosensorceller behandlet med tomme liposomer (dvs. Liposomet reagent + redusert serum media) fordi anvendelsen av fosfolipider introduserer en liten endring i fluorescens profil i forhold til biosensorceller ueksponerte å Liposomet reagens. - Ved hjelp av en flerkanals pipette, aspirer alle celle medium (150 mL). Trypsineres (50 pl) celler i 5 min og tilsett 150 pl avkjølt kulturmediet. Ikke ta med en PBS skylling før trypsinering på dette trinnet, da det kan føre til celle løfting og påfølgende celle tap. Utelukke eventuelle forurensende døde celler og rusk under flowcytometri via port strategier.
- Umiddelbart etter bråkjøling, overføre celler til en 96-brønners rundbunnet plate, og sentrifuger ved 1000 xg i 5 min ved RT.
- Aspirer og kast medium, ta vare å unngå å forstyrre cellen pellet.
- Forsiktig, men grundig, cellepelleten suspenderes i 50 ul 2% paraformaldehyd, og inkuber i 10 min. Alternativt kjører celler leve, selv om fiksering gir renere og mer konsistente resultater.
- Sentrifuger cellene ved 1000 xg i 5 min ved RT. Aspirer og kast paraformaldehyde, ta vare å unngå å forstyrre cellen pellet.
- Forsiktig, men grundig, cellepelleten suspenderes i 200 mL avkjølt flowcytometri buffer (HBSS, 1% FBS, 1 mM EDTA) og drives platen så snart som mulig for å unngå celleklumpdannelse.
- Lag en Side Scatter-området (SSC-A) vs Forward Scatter-området (FSC-A) bivariate tomt, og med cellelinje # 1 kjører, justere SSC og FSC spenninger inntil cellen befolkningen er i nedre venstre kvadrant. Klikk polygonverktøyet, og definere cellepopulasjon (Gate P1). For alle portparametere se figur 2.
- Lag en FSC-H (høyde) vs FSC-A bivariate plot, og gjelder Gate P1 til denne tomten ved å klikke "live" over tomten, og velge P1. Med cellelinje # 1kjører, klikker polygonverktøyet, og definere enkeltceller (Gate P2).
- Gjør 3 histogram plott, en for hver av filtrene av interesse: CFP, YFP, og gnage. Påfør Gate P2 til alle disse tomter ved å klikke på "live" over tomter, og velge P2. Med cellelinje # 1 kjører, justere spenninger slik at median cellepopulasjon i CFP, YFP, og FRET histogrammer er alle mellom 0 og 1. For å måle CFP og slite, opphisse celler med 405 nm laser, og fange fluorescens med en 450/50 nm og 525/50 nm filter, henholdsvis. For å måle YFP, opphisse celler med en 488 nm laser og fangst fluorescens med en 525/50 nm filter. Laser og filterinnstillinger er nærmere beskrevet i tabell 2.
- Utfør kompensasjon for CFP ringvirkninger i de gnage og YFP kanaler.
MERK: Kompensasjon er prosessen med fluorescenslekkasjer korreksjon. Fluorescenslekkasjer oppstår når fluorescens utslipp av én fluorokromkonjugerte blir oppdaget i løpet av filter designed å måle signal fra en annen fluorokrom. Med riktig kompensasjon, kan CFP ringvirkninger fluorescens fjernes fra gnage og YFP kanaler.
MERK: Kompensasjon krever tilstedeværelse av både fluorescens-positive og -negative cellene. Derfor, for å kompensere på CFP-positive celler (cellelinje # 2), negative celler (cellelinje # 1) legges til prøven før kjøringen.- Topp i 30 pl av cellelinje # 1 suspensjon fra en enkelt brønn til 200 ul av cellelinjen # 2 suspensjon umiddelbart før kompensere.
- Klikk på "Apparatinnstillinger" -ikonet, deretter "kompensasjon" -kategorien, og sjekk "matrix" for å åpne kompensasjon tabellen.
- Lag en FRET-A vs CFP-A bivariate plot, og gjelder gate P2, som beskrevet i trinn 6.3. Med cellelinjer 1 + 2 kjører, klikker du på "kvadranten" -ikonet og tegne kvadranter slik at fluorescens -negative og -positive bestandene er atskilt med de nedre to kvadranter (Gates LL3 ennd LR3, henholdsvis).
- Lag en statistikk tabell som viser median fluorescensintensitet (MFI) av FRET for LL3 og LR3 porter. Juster FRET parameter i kompensasjon matrisen til MFI av FRET signal tilsvarer mellom LL3 og LR3. Etter dette trinnet, MFI av FRET-signalet er lik mellom ufargede celler og CFP-positive celler, noe som tyder på fravær av CFP spillover inn i FRET kanalen.
- Lag en YFP-A vs CFP-A bivariate plot, og gjelder gate P2, som beskrevet i trinn 6.3. Tegn kvadranter (LL4 og LR4) som ligner på det som gjøres i trinn 6.4.3.
- Lag en statistikk tabell som viser MFI av YFP for LL4 og LR4. Juster YFP parameter i kompensasjon matrisen til MFI av YFP signal tilsvarer mellom LL4 og LR4. Etter dette trinnet, MFI på en YFP signal er lik mellom ufargede celler og CFP-positive celler, noe som tyder på fravær av CFP spillover inn i YFP kanalen.
- Føllgrunn gate oppsett og kompensasjon, markere brønner av interesse og kjøre resten av platen.
- Etter at alle prøver er kjørt, eksportere datafiler ved å klikke "fil", deretter "kopi". Velg 'datafiler-fanen, marker eksperimentet mappen, og klikk "kopi".
- Åpne FCS filer i flowcytometri analyseprogram.
- Basert på spredningsegenskaper, bruker en polygonal port for å definere cellepopulasjonen (SSC vs FSC) og sing populasjonen (FSC-H vs FSC-A) fra celler behandlet med tomme liposomer, i likhet med den som er beskrevet i avsnitt 6.
- Hvis CFP kompensasjon ble utført under oppsettet, ikke lenger justere CFP.
- Lag en FRET vs YFP bivariat plot. Ved hjelp av cellelinje # 3Definerer en falsk FRET port ved å tegne en polygonal port som går langs skråningen av FRET-positive cellepopulasjon. Denne port utelukker YFP enkelt-positive celler som avgir et signal i FRET filteret, og trekkes lik den som tidligere er vist av Banning et al. 22
- Definer en FRET gate ved å plotte tomme liposombehandlede CFP / YFP celler på en FRET vs CFP bivariat plot. Innføre en polygonal port langs skråningen av befolkningen som strekker seg oppover og mot venstre bort fra populasjonen. Denne port skal utelukke de fleste celler (~ 99%), slik at bakgrunns FRET er ≥1% av cellene. Ingen hendelser som flytter inn i denne porten regnes FRET-positive.
MERK: Hver enkelt gate beskrevet ovenfor gjelder for alle prøvene før bygging følgende porter. Følgende analysen, er fire individuelle porter definert (Cell befolkningen, singlet; falsk FRET; FRET). - Postanalyseparametere av interesse, inkludert: prosent FRET positivitet og MFIav FRET-positive celler. Manuelt beregne den integrerte FRET ved å måle tettheten av produktet i prosent positivitet og MFI.
MERK: Hvis integrerte FRET densitet anvendes som et endepunktet, satt bakgrunn FRET (som definert i trinn 7.5) og MFI til større enn eller lik 1 for å unngå beregning av et produkt som er mindre enn dens to enkeltfaktorer.
3. replating biosensorceller
NOTAT:Bruke fire cellelinjer for denne analysen: HEK 293T (cellelinje # 1), RD-P301S-CFP (cellelinje # 2), RD-P301S-YFP (cellelinje # 3), og RD-P301S-CFP / YFP ( cellelinje # 4). Vær referanse Tabell 1 for hver cellelinje bidrag til analysen.
4. Behandling Cells
MERK: Følgende dag, når tau biosensorceller er 60-65% konfluent, forberede frø transduksjon komplekser som følger:
5. Høsting Cells for FRET flowcytometrisystemer
6. FRET flowcytometrisystemer
MERK: Bruk en strømningscytometer som MACSQuant VYB, som er utstyrt med FRET-kompatibel laserlinjer og filtersett (tabell 2). For hvert trinn i dette avsnittet, klikker godt av interesse å bruke programvaren 96 brønnrammen, og klikk"Play" for å starte prøveopptak og flyt. Gjør tomter eller statistikktabellene ved å klikke på ikonet "ny analyse vindu". Endre aksen parametere på enkelt bivariate tomter ved å klikke på tittelen på enten X eller Y-aksen og velge riktig filter. Å skifte celle populasjoner eller fluorescenssignaler, øke eller minske spenningene knyttet til de aktuelle filtre. Med dette instrumentet, kjøre <1.000 hendelser / sek for å sikre nøyaktig encellede overvåking.
7. Data Analysis
MERK: Endre aksen parametre på enkelt bivariate tomter ved å klikke på tittelen på enten X eller Y-aksen og velge riktig filter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FRET flowcytometri muliggjør sensitiv, kvantitativ og rask påvisning av poding aktivitet fra rekombinante eller biologiske prøver. Assay oppsettet er lettvinte: monoklonale-avledet stabile cellelinjer som uttrykker tau-RD-CFP / YFP er transdusert med frø materiale, inkubert i 24-48 timer, og utsatt for strømningscytometri-analyse (figur 1A). I fravær av frø, biosensorceller opprettholde tau i en løselig, monomer form (figur 1B). I nærvær av frø, men biosensorceller konvertere tau til en aggregert tilstand (figur 1C), som produserer en FRET respons som blir detektert på en per-celle-basis sammen med flowcytometri. Kvantitativ vurdering viser at biosensorceller svare på femtomolar konsentrasjoner av frø materiale og at seeding aktivitet kan være effektivt målt over tre størrelsesordener (figur 1D).
Gating parametre ble etablert for å sikre påvisning av et true FRET signal, selv ved lave frø konsentrasjoner. Først blir standard gating metoder som brukes for å isolere cellepopulasjon (figur 2A) og enkeltceller (figur 2B). Falske FRET signal kan oppstå fra direkte aktivering av YFP ved 405 nm laser. Dermed er en falsk FRET gate trekkes fra en YFP enkelt-positive cellepopulasjon for å utelukke kontaminerende signal (figur 2C). Sist, er gnage gate definert fra uanriket CFP / YFP dual-positive celler (figur 2D). En port er trukket nær skråningen av befolkningen som strekker seg oppover og mot venstre bort fra den. Ustimulerte celler bør ha en bakgrunn FRET verdi innstilt til omtrent 1%, og FRET-positive celler vil skifte til denne porten på en doseavhengig måte (sammenlign figur 2E og 2F). Flere parametere er tatt hensyn til med FRET flowcytometri, inkludert: prosent positivitet (dvs. antallet FRET-positive celler per totalt celletall) Og median fluorescensintensitet (dvs. i hvilken grad en FRET reaksjon er produsert i et FRET-positiv celle). Integrert FRET tetthet er den foretrukne endepunktet, da det er et produkt av disse to variablene og helt representerer graden av poding aktivitet indusert av en hvilken som helst gitt prøve.
FRET flowcytometri er kompatibel med P301S tauopati mus-avledet hjernelysatene, selv på unge voksne, som vist i figur 3. Etter microdissection av fire forskjellige hjerneregioner, gnage strømningscytometri ble anvendt for å måle seeding aktivitet fra hjernestammen (figur 3A), neocortex (Figur 3B), frontallappen (Figur 3C), og hippocampus (Figur 3D) i P301S mus over et spekter av aldre. I hver region, økt seeding aktivitet med alder og så ut på bare 1,5 måneder. Men tau knockout mus ("KO")> 12 mos vises aldri seeding aktivitet. Sammenlignet med histological analyser utført i løpet av de samme dyrene, dette er seks uker tidligere enn utseendet på noen annen markør av tau nedfall (Figur 3E), inkludert markører for konformasjonelt-avvikende tau (MC1), hyperfosforylert tau (AT8 og PG5), og amyloid konformasjon (ThioflavinS). Fra et mekanistisk syn, den proksimale påvisning av tau seeding aktivitet tyder frø som en årsaks formidler av tauopati utbruddet og / eller progresjon. Fra en eksperimentell visning, tyder dette på at analysen av seeding aktivitet kan være et ideelt supplement til standard utfallsmål tau deponering, gitt sin tidlig og robust utseende.
I tillegg til transgene mus, gnage flowcytometri er kompatibel med menneskelige hjerne lysatene og kan lett gjenkjenne tau tilslag isolert fra Alzheimers sykdom fag (figur 4). Når frosset humant hjernevev homogenisert på samme måte som beskrevet her for P301S hjerne lysater, såing aktiviteter robust oppdaget fra alle prøvene stammer fra AD fag. I kontrast er seeding aktivitet aldri oppdaget fra lysatene av alderstilpassede eller Huntingtons sykdom kontrollpersoner. Dette understreker spesifisiteten av analysen for tau-aggregater.
Mens fokuset i denne artikkelen er sensitiv deteksjon av tau seeding aktivitet ved hjelp liposom-mediert levering av aggregater i HEK 293T biosensorceller, kan flere fysiologiske cellekultur paradigmer også utføres med FRET flowcytometri for å vurdere grunnleggende mobilopptaksmekanismer. For eksempel kan primære nevronkulturer være infisert med lentivirus uttrykker tau-RD-CFP og tau-RD-YFP konstruerer på tidspunktet for plating. Ved DIV4 er aggregering fraværende i ubehandlede celler (figur 5A), men påvisbar i nerveceller behandlet med frø-inneholdende materiale (figur 5B). Viktigere er fosfolipider utelukket i disse forsøkene, noe som tillater undersøkelse av fysiologiske og pat hophysiological seeding mekanismer. Således fører anvendelsen av tau-fibriller til neuronal HSPG-mediert opptak og stimulerer aggregering på en doseavhengig måte som kan kvantifiseres med FRET flowcytometri (figur 5C). I tillegg kan analysen benyttes for terapeutisk evaluering av tau opptak og såing blokkade in vitro ved anvendelse av HEK 293T tau biosensorceller. Selv i fravær av fosfolipider, både rekombinante fibriller (figur 5D) og P301S hjerne lysater (figur 5E) tau indusere aggregering. Pre-inkubering av disse tau frø med heparin (tidligere vist å være en potent inhibitor av HSPG-mediert opptak tau), men eliminerer deres seeding kapasitet. Dette eksperimentelle oppsettet kan brukes til noe narkotika (f.eks antistoffer, små molekyler, etc.) og vil muliggjøre rask evaluering av opptak og / eller frø modifiserende terapi.
gur 1 "src =" / filer / ftp_upload / 53205 / 53205fig1.jpg "/>
Figur 1. FRET flowcytometri følsomt oppdager tau seeding aktivitet 16. Monoklonale HEK 293T celler som uttrykker tau-RD-CFP / YFP ble transdusert med rekombinante eller biologiske prøver, ruges i 24-48 timer, og analysert på en enkelt celle basis ved hjelp av flowcytometri (A). Ustimulerte celler opprett tau-RD i en monomerisk tilstand (B), mens celler behandlet med frø-inneholdende materiale visnings fremtredende slutninger (C). Kvantitativ vurdering (gjennomsnitt ± SEM) av seeding aktivitet viser at gnage flowcytometri er følsom for femtomolar konsentrasjoner (monomer tilsvarende) av rekombinant frø materiale og deteksjon går over tre størrelsesordener (D). Monomer ekvivalent representerer den totale mengden av protein som inneholdes i fibrillization reaksjonen og løser ikke for den ufullstendige &# 160; inkorporering av monomer i aggregert materiale. Således, må konsentrasjonen av virkelige aggregater (frø) være mindre enn eller lik dens 'monomer ekvivalent ". * Modifisert fra Holmes og Furman et al. 16 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. gating strategi for FRET strømningscytometri. Cellepopulasjon (A) og / singlett dublett (B) porter er tegnet med standard flowcytometri metodikk. En falsk FRET-porten (C) er trukket fra YFP single-positive celler for å eliminere YFP bleedthrough inn i FRET filteret. En FRET port (D) er konstruert av tomme liposombehandlede celler, f.ekssom bakgrunn FRET er ≥1%. En befolkning skift i gnage gate vises etter behandling med seed-positive materiale (E) og skiftet blir stadig mer fremtredende med høyere mengder frø materiale (F). Endelige leselig inkluderer:. Prosent FRET positivitet, median fluorescens intensitet (MFI) av FRET-positive hendelser, og den integrerte FRET tetthet (Integrated FRET Density = prosent positive celler * MFI) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Progresjon av tau seeding aktivitet i P301S mus 16. Seeding aktivitet (gjennomsnitt ± SEM) fra hjerne homogenates av P301S mus er tydelig på 1,5 måneder i hjernestammen (A), Neocortex (B), frontallappen (C), og hippocampus (D). Imidlertid er seeding aktivitet aldri observert i tau knockout mus (> 12 måneder). Poding aktivitet øker med alderen, og går forut for fremkomsten av andre vanlige histologiske markører, inkludert MC1, AT8, og PG5 (E). * Gjengitt med tillatelse fra Holmes og Furman et al. 16 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Kompatibilitet av FRET flowcytometri med menneskelige biologiske prøver 16. Når tau-RD-CFP / YFP biosensorceller er transdusert med 20 mikrogram menneskelige hjerne lysat, robust seeding (gjennomsnitt ± SEM) forekommer i alle testet Alzheimers diseaSE hjerner, mens alderstilpassede og Huntingtons sykdom kontrolllysatene mangler seeding aktivitet. * Modifisert fra Holmes og Furman et al. 16 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Alternative søknader om FRET flowcytometri 16. Primære nevroner transduserte med lentivirus koding tau-CFP og tau-YFP konstruerer. I fravær av eksogene frø er det ingen åpenbar aggregering (A), men det er i nærvær av frø (B). Neuronal biosensorer svare doseavhengig rekombinante tau frø, selv i fravær av fosfolipid-formidlet leverings (C). Pre-inkubering av rekombinant (D) eller biological (E) frø kilder med heparin, en hemmer av HSPG-mediert tau frø opptak, utarmer FRET responsen HEK 293T biosensorceller. Kvantitative vurderings skjermer (gjennomsnitt ± SEM). * Modifisert fra Holmes og Furman et al. 16 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: Cellelinjer som brukes med FRET strømningscytometri. HEK 293T celler brukes for flowcytometri oppsett. CFP enkelt-positive celler brukes for kompensering (*). YFP enkelt-positive celler blir brukt til å eliminere falske FRET-signalet på grunn av direkte aktivering av YFP ved 405 nm eksitasjon. CFP / YFP dual-positive celler er FRET-kompatible og fungerer somde biosensorceller. Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Tabell 2:. Flowcytometer laser og filterinnstillingene Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den FRET flowcytometri system som er beskrevet her er et kraftig verktøy for hurtig og kvantitativ vurdering av tau seeding aktivitet. Det krever bare moderat cellekultur erfaring og relevant kunnskap om gnage og flowcytometri. Andre seeding assays, for eksempel Thioflavin T - som utviser forbedret fluorescens når de er bundet til beta sheet struktur - er arbeidskrevende og krever en ren, rekombinant protein substrat. I tillegg har in vitro-analyser for planting tau er bare semi-kvantitative og generelt ufølsom for subnanomolar nivåer av kimmaterialet 23,24. FRET flowcytometri, men gir en kvantitativ og utsøkt sensitive mål for såing aktivitet fra enten rekombinante eller biologiske prøver. Videre kan tilpasninger til fremgangsmåten gjør det nyttig for å studere en rekke protein aggregering lidelser.
Mens den protokoll som er beskrevet heri, fokuserer på tau såing, kreves kun enkle modifikasjoner to mulig for en bruker å overvåke seeding aktivitet fra alternative typer proteopathic frø. Som vist i Holmes og Furman et al., Opprettelse av en monoklonal cellelinje som stabilt uttrykker α-synuclein skjuler den sykdomsassosierte A53T mutasjon, knyttes til enten CFP eller YFP aktivert sensitiv påvisning av poding aktivitet fra full-lengde a-synuclein rekombinante fibriller 16 . Lignende forsøk er blitt utført ved hjelp av huntingtin biosensorceller, som også effektivt detekterer protein aggregasjon. Således, ved bare å endre protein biosensor, gnage flowcytometri er kompatibel med en rekke frø kilder. Andre modifikasjoner av den assay, inkludert behandling paradigme og cellemodell, kan brukes til å lage FRET flowcytometri mer aktuelt å vurdere fysiologiske mekanismer. I denne protokollen, ble frø direkte innført i biosensorceller via liposom-mediert transduksjon som en måte å øke følsomheten.
Det er viktig å note, men at dette er ikke et krav. Tau tilslag fra rekombinante mus eller biologiske prøver som fremdeles er i stand til såing biosensorceller i fravær av liposomer (figur 5). Dermed labs interessert i å studere fysiologiske forplantning og / eller opptaksmekanismer for Tau frø kan fortsatt benytte analysen. I tillegg FRET strømningscytometri er kompatibel med primære nevronale kulturer. Ved å infisere celler med CFP- og YFP-kodet lentivirale konstruksjoner ved plettering, er effektiv FRET respons oppnås ved nanomolare konsentrasjoner etter behandling med rekombinante tau fibriller, selv i fravær av liposomer (figur 5). Tatt sammen indikerer disse data at FRET flowcytometri er nyttige for å studere fysiologiske mekanismer for poding av en rekke proteinaggregater og i flere cellekulturmodeller.
Mens FRET flowcytometri systemet er brukervennlig og tilpasningsdyktig, bør visse viktige skritt værefølges for å sikre kompatibilitet, inkludert prøveopparbeidelse og riktig celle confluency på tidspunktet for behandling. Høy intensitet probe ultralydbehandling av hjerneprøver er kritisk for effektiv og optimal isolering av seeding aktivitet. I løpet av utvikling og optimalisering, ble det observert at denne fremgangsmåten er at over 10 ganger mer effektiv på å isolere seeding aktivitet fra P301S mus hjerner i forhold til andre vanlige teknikker, for eksempel håndholdte homogenisering. Det er mulig at meget store tau aggregater har en forholdsvis lav tilbøyelighet såing, og at sonden sonication er mest effektive for å bryte disse aggregater i mindre, frø-kompatibel fragmenter. Varighet og frekvens av sonikering kan modifiseres dersom det er nødvendig, selv om innstillingene som er beskrevet ovenfor, er anbefalt for sensitiv påvisning av seeding aktivitet.
Celle konfluens ved behandling er også av største betydning, da det påvirker både følsomhet og celle helse. Hvis cellene enre også sammenflytende, har de ikke lett ta opp fosfolipider og frø materiale, og dermed dramatisk redusere følsomheten. Ved konfluens er for lav, kan tilsetning av fosfolipider og frø materiale være giftig. Empirisk tester viser at en biosensor sammenflytning på 60-65% er optimal for behandling og etterfølgende reaksjonsevne.
Som nevnt i protokollen, er kompensasjonsalgoritmer regelmessig brukt til å utelukke CFP spillover inn i YFP og FRET kanaler, for derved å eliminere falske signaler og øke følsomheten. For en raskere og kvalitativ vurdering av poding aktivitet, men dette trinnet kan utelates eller utført post hoc ved hjelp av strømningscytometri-analyse-programvare. En renere og mer robust signal oppnås følgende kompensasjon, imidlertid, og dermed for den mest grundige og kvantitativ analyse dette trinnet er sterkt anbefalt.
En begrensning av analysen er dens manglende evne til å rapportere om biokjemiske Sammensetningen avde proteopathic frø. Den nåværende analyse tiltak seeding aktivitet, en funksjonell egenskap av frø. Bestemmelse av den biokjemiske og biofysiske egenskapene til de frø vil kreve kopling til tradisjonelle analyser slik som immunutfelling, kromatografi, sirkulær dikroisme, massespektrometri, etc. Ikke desto mindre vil denne analysen vise seg å være nyttig for å vurdere seeding potens som et endepunkt fra utallige prøver.
Denne analysen ble nylig brukt til å kvantifisere og karakterisere tidsforløpet av seeding utvikling og progresjon i P301S mus i forhold til andre vanlige markører for tau deponering, som histologiske flekker. I denne studien, tau seeding aktiviteten var tydelig over seks uker før tidligst histologiske markør (MC1) som vi testet 16. Gitt sin tidlig utseende, kan seeding aktivitet representere et viktig supplerende, eller alternativ, effektmål for å evaluere effekten av terapeutiske intervensjoner, i hvert fall for forstudier.Ved å forkorte behandlingsforløpet og studere yngre dyr, bokostnader og eksperimentell behandlingstid vil avta. Det er tenkelig at terapeutiske midler kan bli administrert til mus ved P301S 4-6 uker og hjerne evalueres for såing aktivitet 2-4 uker senere. Alternativt kan evalueringen av anti-tau-terapeutika i celler bli utført i løpet av dager ved å vurdere deres evne til å blokkere induksjonen av seeding aktivitet i biosensorceller, som vist i figur 5.
I konklusjonen, gnage flowcytometri seeding analysen er en enkel og effektiv måte å oppdage tau seeding fra rekombinante eller biologiske kilder. Dens følsomhet er uten sidestykke ved andre in vitro-såing assays tau, og den kan bli anvendt for å detektere den tidligste patologiske endringer i P301S tauopati mus. Videre sin fleksibilitet i å overvåke mange proteopathic frø under forskjellige behandlingsforhold, og med flere cellekultur modeller, gjør det nyttig fornoen protein aggregering laboratorium interessert i raskt samle kvantitative data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TBS | Sigma | T5912 | |
| cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free) | Roche | 4693159001 | |
| Cryo-vials | Sarstedt | 72.694.006 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 105DU | |
| Weighing Boats | Fisher Scientific | 13-735-743 | |
| 15 ml conical tube | USA Scientific | 1475-0501 | |
| Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer | Omni International | 18-000-115 | |
| Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer | Omni International | OR-T-156 | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A451 | |
| Noise Cancelling Ear Muffs | Fisher Scientific | 19-145-412 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | S47299 | |
| 1.5 ml tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 000.215 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 50 ml Conical Tubes | Phenix Research | SS-PH15 | |
| 25 ml reagent resevoirs | VWR | 41428-954 | |
| Multi channel pipet | Fisher Scientific | TI13-690-049 | |
| 96 well flat bottom plates | Corning | 3603 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3788 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |
| Sorvall ST 40 Centrifuge | Thermo Scientific | 75004509 | |
| BIOLiner Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003796 | |
| Hemacytometer | VWR | 15170-172 | |
| MACSQuant VYB Flow Cytomter | Miltenyi Biotec | 130-096-116 | |
| Chill 96 Rack | Miltenyi Biotec | 130-094-459 | |
| Flow Jo analysis software | Flow Jo | ||
| 20 μl pipet tips | Rainin | GPS-L10 | |
| 200 μl pipet tips | Rainin | GPS-250 | |
| 1 ml pipet tips | Rainin | GPS-1000 | |
| 200 μl pipet tips | USA Scientific | 1111-1800 | |
| 5 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-606180 | |
| 10 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-607180 | |
| 25 ml Serological pipett | Phenix Research | SPG-760180 |
References
- Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks. Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).
- Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. Predicting Regional Neurodegeneration from the Healthy Brain Functional Connectome. Neuron. 73 (6), 1216-1227 (2012).
- Raj, A., Kuceyeski, A., Weiner, M. A Network Diffusion Model of Disease Progression in Dementia. Neuron. 73 (6), 1204-1215 (2012).
- Braak, H., Braak, E.
- Braak, H., Braak, E. Staging of Alzheimer's disease-related neurofibrillary changes. Neurobiol Aging. 16 (3), 271-278 (1995).
- Frost, B., Diamond, M. I.
- Holmes, B. B., Diamond, M. I.
- Kaufman, S. K., Diamond, M. I. Prion-like propagation of protein aggregation and related therapeutic strategies. Neurotherapeutics. 10 (3), 371-382 (2013).
- Holmes, B. B., Diamond, M. I. Prion-like properties of Tau protein: the importance of extracellular Tau as a therapeutic target. J Biol Chem. 289 (29), 19855-19861 (2014).
- Guo, J. L., Lee, V. M. Cell-to-cell transmission of pathogenic proteins in neurodegenerative diseases. Nat Med. 20 (2), 130-138 (2014).
- Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
- Guo, J. L., Lee, V. M. Y. Seeding of normal tau by pathological tau conformers drives pathogenesis of Alzheimer-like tangles. Journal of Biological Chemistry. , (2011).
- Holmes, B. B., et al. Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), E3138-E3147 (2013).
- de Calignon, A., et al. Propagation of Tau Pathology in a Model of Early Alzheimer's Disease. Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).
- Liu, L., et al. Trans-Synaptic Spread of Tau Pathology In Vivo. PLoS One. 7 (2), e31302 (2012).
- Holmes, B. B., et al. Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), E4376-E4385 Forthcoming.
- Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65 (65), (2012).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. J Vis Exp. (33), (2009).
- Yan, Z. X., Stitz, L., Heeg, P., Pfaff, E., Roth, K. Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies. Infect Control Hosp Epidemiol. 25 (4), 280-283 (2004).
- McDonnell, G., et al. Cleaning, disinfection and sterilization of surface prion contamination. J Hosp Infect. 85 (4), 268-273 (2013).
- Banning, C., et al. A flow cytometry-based FRET assay to identify and analyse protein-protein interactions in living cells. PLoS One. 5 (2), e9344 (2010).
- Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein. Biochemistry. , (2013).
- Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein. J Vis Exp. (95), e51537 (2015).
