Introduction
세포 내 타우 아밀로이드의 축적은 알츠하이머 질환과 같은 퇴행성 신경을 정의한다. 초기 질병 단계에서, 병리학은 일반적으로 뇌의 이산 지역 언어로 번역되어 있지만, 질병의 진행과 함께, 병리는 변함없이 별개의 신경망 1-5을 따라 확산. 축적 증거가 독성 단백질 응집체의 세포 횡단 전파가 (6-10에서 검토)이 병리의 기초가 제안합니다. 이 모델에서, proteopathic 종자 (예 타우) 공여 세포로부터 방출되고, 주형 형태 변화 11-15 비아 미스 폴딩 형태로 네이티브 타우 단백질을 변형, 인접 셀 입력. 여기에 설명 된 분석은 이러한 민감 시딩 활성을 검출하기 위해 개발되었다. 그것은 재조합 단백질 및 생체 시료와 호환되며 proteopathic 시드 활동 16 분 수준의 정량화 할 수 있습니다.
안정적 타우 반복 D를 표현하는 HEK 293T 세포CFP 또는 YFP 하나에 융합 된 질병 - 관련 돌연변이 P301S 함유 omain (RD)는 시딩 활성의 안정적 바이오 센서로서 기능 (이하 타우 RD-CFP / YFP 셀이라 함). proteopathic 씨의 부재 하에서, 세포는 수용성 단량체로서 타우을 유지하고 뚜렷한 배경 FRET 없다. 세포에 자발적 흡수 또는 타우 씨의 리포좀 - 매개 형질 그러나, 유동 세포 계측법을 통해 단일 세포 내에서 측정 FRET 신호를 생성 RD-CFP 및 RD-YFP 집계, 결과.
이 분석의 다수의 구성 요소는 감도를 향상시키고 변동을 줄일 수 있도록 설계되었다. 1 단일 클론 세포주 : 그것은 최적의 신호를 제공하기 때문에 1 RD-CFP / YFP 발현 비율이 선정되었다 : 소음. 감도를 높이기 위해, 인지질은 세포 내로 직접 도입하는 종자를 사용하는 (흡수 생물학적 메커니즘을 연구하는 있지만, 이는 생략 될 수있다). 마지막으로, 인구 수준 및 단일 셀에서 모니터 FRET 유동 세포 계측법 레벨, 다른 단백질 응집 분석법 달리. 최종 결과 측정, FRET 집적 밀도가 높은 정량하고 응집 세포의 수, 각 집합은 셀 내에서 발생하는 정도 모두를 차지한다. 이러한 최적화는 모든 파라미터 감도 향상 및 재현성을 보장한다.
이 시스템은 최근에 일반적으로 사용되는 타우 병리학 마커 시간 발병과 타우 시드 활동 상대의 진행 (예를 들어, MC1, AT8, PG5 및 ThioflavinS)을 평가 형질 전환 P301S 타우 병증 마우스 (17)의 포괄적 인 연구에 사용 하였다. 시드 활동으로 지금까지 최소한 6 주까지 조직 학적 검색을 이전 평가 타우 병리학의 초기와 가장 강력한 마커입니다. 시드 활동 개시 및 / 또는 신경 퇴행 (16)의 진행에 proteopathic 씨의 인과 적 역할을 제안, 1.5 개월 점진적으로 연령 증가에 나타납니다.
e_content "> 생물학적 시료에서 시드 물질의 미세한 수준의 정확한 정량. 초기 질병 진행을 모니터링 연구를 용이하게 할 수있는 시험 기간을 단축하고 어린 동물들의 사용을 가능하게함으로써,이 전임상 동물 실험의 효율성 및 정확성을 증가시킬 수있다. 예를 들면, P301S 마우스 전술 납 화합물은 초기 4~6주만큼 제공 될 수있는, 2-4 주 후에 효능을 모니터링. 분석 정확하게 파종 어떠한 감소를 정량화한다 (또는 시딩 활성의 발병 직전) 활성. 계측법 관내 스크리닝 응용뿐만. 예를 들어, 항 - 타우 시약 (예, 항체, 소분자 등) 중 재조합 타우를 사용하여, 배양에서 직접 유도 시드 차단하는 그들의 능력에 대해 신속하게 시험 될 수있다 흐름 FRET 시드 소스 (그림 5).이 설정으로, 씨앗 재료가 준비되면, 전으로 집계 또는 뇌 유래 해물periment 데이터 분석을 포함, 완료하는 데 사흘이 걸립니다. proteopathic 시딩 활성의 신속한 정량 따라서 신경 퇴행의 많은 연구를 용이하게 할 수있다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
주 :이 프로토콜은 FRET의 사용은 마우스 생물학적 시료에서 시딩 활성을 검출하기위한 유세포 강조한다. 또한, 피 브릴과 재조합 인간 생물학적 시료와 호환된다. 마우스를 안락사 뇌 수확은 IACUC 승인 절차에 따라 수행 하였다.
1. 뇌 추출
- 이소 플루 란 (2 %)와 깊은 마취를 따르는 것은, 얼음처럼 차가운 PBS는 0.03 %의 헤파린을 포함와 마우스를 관류하고, 게이지 등에 기술 된 사항은 다음 뇌의 압축을 풉니 다. (18)
- 극저온 유리 병에서 추출한 조직을 배치하고 액체 질소에 배치하여 동결 웁니다. 또한, 드라이 아이스에 조직을 동결. 일단 필요한 경우, 장시간 동안 -80 ° C에 저장 조직을 전송 냉동.
참고 :이 프로토콜은 전체 뇌 균질 또는 마이크로 해부 뇌 영역과 호환됩니다. Hagihara 등의 알을 참조하십시오. 자세한 마이크로 해부 프로토콜 19. 생물 종자 소재 2. 준비 - 1X의 TBS (10 ㎖ 당 1 정제)에 단백질 분해 효소 억제제를 (무료 EDTA)을 용해하여 균질화 버퍼를 준비합니다. 얼음에 적극적으로 소용돌이 및 저장. 단백질 분해 효소 억제제는 바이오 센서 세포 생존을 유지하기 위해 EDTA가 없어야합니다.
- 일회용 무게 보트에 고정 된 뇌 조직의 무게를 측정하고, 5 ML 원뿔 튜브에 전송할 수 있습니다. 최종 솔루션은 10 % 중량 / 부피가되도록 얼음처럼 차가운 균질화 버퍼를 추가합니다. 일시적으로 얼음에 저장합니다. 조직 덩어리와 후속 균질화 완충액 용적 사용 뇌의 크기 및 / 또는 지역에 따라 달라질 것이다. 여기에, 0.2 g의 무게 성인 마우스 hemibrain은 10 % W / 부피 솔루션 2 ㎖에 일시 중단됩니다.
- 전송 추운 방에 샘플 및 적절한 설정으로 프로브 초음파기를 조정합니다. (여기에 도시 된) 옴니 Ruptor과 초음파 프로브의 경우, 샘플이 OV되지 않도록 약 75 W. 사용하여 펄스 모드에 해당하는 20 %로 전력을 설정할초음파 동안 ER-가열. 약 500 밀리 초에 해당하는 30 % 펄스 발생기를 설정합니다.
- 다시 물, 이소프로판올, 물과 린스 각 솔루션 사이에 프로브를 닦아 프로브 소니 케이의 끝을 청소합니다. 씻어 측면과 실험실 와이프와 프로브의 바닥을 모두 닦아 특정합니다.
- 한번에 하나의 샘플로 작업, 균질화 완충액에 프로브 팁 잠수함 및 초음파기를 시작한다. 전술 한 전력과 펄서 설정을 사용하여 총 25 펄스를 제공한다. 그 조직이 서스펜션에 완전히 확인합니다. 이 단계에서 샘플의 거품을 피하기 위해주의해야합니다.
주 : a) 총 부피가 낮은 또는 B)가 파쇄 예열하면 샘플이 발포에 민감하다. 이 특정 악기로, 250 μL 미만의 볼륨과 초음파 처리하지 않습니다. 샘플이 냉각 유지되도록하기 위해, 튜브는이 단계 동안 얼음 상에 저장 될 수있다. - 잔류 해물을 멀리 닦아 프로브를 청소 한 다음 비커 오에 (10) 펄스를 제공F 깨끗한 물. 각 단계 사이에 건조 와이 핑 (단계 2.4에서와 같이) 양쪽 다시 물, 이소프로판올, 물과 프로브의 바닥을 헹군다. 오염을 방지하기 위해 철저하게 샘플 사이에 프로브를 헹군다.
주 : 타우 응집체, 우리는보다 엄격한 세척 방법은 샘플 간 오염을 방지하기 위해 필요한 것을 발견되지 않았다. 기타 아밀로이드 그러나, 광범위 문학 (20, 21)에 설명 된 추가 치료가 필요할 수 있습니다. - 모든 샘플이 처리 될 때까지 얼음 상에 저장 균질.
- 4 ℃에서 15 분 동안 21,300 XG에서 균질 스핀.
- 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 깨끗한 튜브에 뜨는을 전송합니다. 펠렛을 폐기하십시오. 상기 용도 -80 ° C에서 상등액 및 저장 용 해물 나누어지는. 이 시딩 효율을 감소시키기 때문에, 그러나, 균질의 동결 / 해동 사이클을 피하십시오.
- 무균 환경에서, 흡 배지. 따뜻한 PBS 및 기음과 세포를 씻어. 를 Trypsinize 셀 3 분간 (트립신 EDTA (0.05 %) 3 mL)를, 따뜻한 배양 배지 (DMEM 9 ㎖, 10 % FBS, 1 % 펜 / 패 혈성, 1 % 루타)로 급냉하고, 즉시에 셀을 전송할 원뿔 튜브.
- 실온에서 5 분 1,000 XG에 원심 분리기 세포. 대기음 매체와 따뜻한 문화 매체에 resuspend 세포 펠렛.
- 혈구를 이용하여 각 세포주에 대한 세포 밀도를 결정한다. 세포 밀도는 수확 및 재 부유 볼륨시 포화 상태에 따라 달라질 수 있습니다. 세포 밀도, 10 ㎖ 배지에서 90 % 컨 플루 언시 10cm 접시에서 수확 재현 탁 된 세포를 약 1 백만 세포 / ml이어야한다.
- 하다세포의 마스터 믹스 + 미디어는 96 웰 플레이트의 각 웰을 130 ㎕의 매질에서 35,000 세포 포함될 것이다 (100 웰위한 마스터 믹스를 만들기 위해, 예를 13 ml의 배지에서 350 만 세포를 재현 탁). 각각의 실험적인 디자인과 일정에 맞게 휴대폰 번호를 수정합니다. 세포 처리를 위해 도금 후 ~ 18 시간은 96 웰 플레이트에 35,000 세포를 추가한다.
- 멀티 채널 피펫을 사용하여 천천히 평평한 바닥의 각 웰에 마스터 믹스 세포 현탁액 130 μl를 피펫, 96 웰 조직 배양 플레이트를 처리. 도금하는 동안, 플레이트의 바닥에 닿지 않으면, 웰의 중심에 피펫 팁을 배치했다.
주 : 도금 포맷이 변경 될 수 있지만, 세포주 접시 당 1-3의 각각에 대해, N = 4 웰을 만드는 것이 권장된다. 플레이트 (N = 84)의 나머지 세포주 # 4 (바이오 센서 셀)를 위해 예약된다. - 세포가 실온에서 10 분 동안 그대로 접시를 남겨 정착하도록 허용합니다. 37 ° C, 5 % CO 2, 및에서 O / N을 부화# 8805; 80 % 상대 습도.
- 하나의 튜브에서, 마스터 믹스를 만드는 등의 Opti-MEM과 같은 감소 된 혈청 배지와 같은 리포 펙 타민으로, 형질 감염 시약을 결합한다. 당은 물론, 1.25 μL 형질 전환 시약 및 8.75 μL 감소 혈청 미디어를 추가 할 수 있습니다. 톡 튜브 부드럽게 짧게, 혼합 스핀 다운, 그리고 실온에서 5 분 동안 품어합니다.
- 다른 관에서, 감소 된 혈청 미디어 시드 물질 (단계 2.9에서 해물의 분취 량)을 결합한다.
참고 : 씨앗 재료의 볼륨은 개별 실험에 따라 달라질 수 있습니다. 종자 볼륨을 선택할 때, 고려 : 샘플과 잠재적 인 독성 씨의 풍부. 원유 균질 세포에 독성이 될 수 있습니다. 따라서, 원하는 효과를 모니터링 할 수 가장 낮은 볼륨을 사용합니다. 해물 / 웰 범위 FR의 이전 테스트 볼륨5 ~ 20 μg의 총 단백질에 해당하는 톰 1-5 μL. 물론 당 전체 볼륨 (씨앗 + 감소 혈청 미디어) 10 μL 있는지 확인하십시오. - 적어도 20 분 동안 2 시간까지 실온에서 간단하게, 부드럽게 혼합 4.1 및 4.2, 영화에서 설명하는 두 개의 튜브에서 내용을 결합 (1,000 XG, 5 초)를 스핀 다운, 그리고 품어.
- 부드럽게 개별 바이오 웰의 측면에 전달 복합체의 20 μL 피펫. 세 기술 복제, 가능하면 사용하십시오. 24 ~ 48 시간 동안 인큐베이터에 처리 된 세포를 돌려줍니다. 단계 3.6에 기재된 것과 동일한 조건 하에서 배양한다.
참고 : 인지질의 응용 프로그램이 리포좀 시약에 노출되지 않은 세포를 바이오 센서에 형광 프로파일 상대적으로 약간의 변화를 소개하고 있기 때문에이 설정에 대한 적절한 음성 대조군 조건은 빈 리포좀 (즉, 리포좀 시약 + 감소 혈청 미디어)로 처리 바이오 센서 세포이다. - 멀티 채널 피펫을 사용하여 모든 세포 배지 (150 μL)를 대기음. 를 Trypsinize (50 μL)에서 5 분 동안 세포를 150 ㎕의 냉각 된 배양 배지로 켄 칭한다. 이 셀 리프팅과 이후의 세포 손실이 발생할 수 있으므로,이 단계에서 트립신하기 전에 PBS 린스를 포함하지 마십시오. 게이팅 전략을 통해 유동 세포 계측법 중에 오염 죽은 세포와 파편을 제외합니다.
- 즉시 5 마일 1,000 XG에서, 전송 96 웰 둥근 바닥 플레이트 세포와 원심 분리기를 담금질 후실온에서 N.
- 대기음은 세포 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 매체를 버리고.
- 온화하지만 충분히 50 μL를 2 % 파라 포름 알데히드에서 세포 펠렛을 재현 탁하고, 10 분 동안 배양한다. 고정이보다 깨끗하고 일관된 결과를 제공하지만 다른 방법으로, 실행 세포는 살고있다.
- 실온에서 5 분 1,000 XG에 원심 분리기 세포. 대기음은 세포 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서, 파라 포름 알데히드를 버리고.
- 온화하지만 충분히 완충액 200 μL 계측법 냉장 유동 세포 펠렛을 재현 탁 (HBSS, 1 % FBS, 1 mM의 EDTA) 및 세포 응집을 피하기 위해 가능한 한 빨리 실행 판.
- 세포 인구가 왼쪽 사분면가 될 때까지 사이드 스 캐터 영역 앞으로 캐터 지역 (FSC-A) 이변 량 플롯 대 (SSC-A) 및 셀 라인 # 1 실행으로는, SSC 및 FSC 전압을 조정합니다. 다각형 도구를 클릭하고 세포 인구 (문 P1)을 정의합니다. 모든 게이팅 매개 변수의 그림 2를 참조하십시오.
- FSC-H (높이) FSC-이변 량 플롯 대를 확인하고 그래프 위의 "라이브"를 클릭하고, P1을 선택하여이 음모에 게이트 (P1)을 적용합니다. 세포주 # 1실행, 다각형 도구를 클릭 한 단일 세포 (게이트 P2)를 정의합니다.
- CFP, YFP 및 FRET : 3 히스토그램 플롯, 관심있는 필터의 각 하나를 확인합니다. 그래프 위의 "라이브"를 클릭하고, P2를 선택하여 이러한 플롯의 모든 게이트 (P2)를 적용합니다. 세포주 # 1 실행으로 전압을 조정하도록 CFP, YFP의 중간 세포 인구 및 히스토그램은 405 nm의 레이저로 세포를 자극, CFP과 FRET을 측정하고, 함께 캡처 형광 모든 0과 1이다 FRET 각각 50분의 450 nm의 50분의 525 nm의 필터. YFP를 측정하기 위해, 50분의 525 nm의 필터와 488 nm의 레이저 캡처 형광으로 세포를 자극. 레이저 및 필터 설정은 상기 표 2에 기재되어있다.
- FRET와 YFP 채널로 CFP의 유출에 대한 보상을 수행합니다.
주 : 보상 형광 파급 보정 과정이다. 하나의 형광 색소의 형광 방출은 필터 DESI 내에서 검출 될 때마다 형광 스필 오버가 발생다른 형광 색소에서 신호를 측정 할 수 gned. 적절한 보상, CFP 파급 형광 FRET과 YFP 채널로부터 제거 될 수있다.
참고 : 보상이 모두 형광 양성 및 -negative 세포의 존재를 필요로한다. 따라서, CFP 양성 세포 (셀 라인 # 2), 실행하기 전에 샘플에 추가해야합니다 음성 세포 (1 세포주 #)를 보상합니다.- 잘 세포주 # 2 서스펜션의 200 μL에 하나의 세포 라인 # 1 현탁액의 30 μL의 스파이크 보상 직전.
- "장비 설정"아이콘을 한 후 '보상'탭을 클릭하고 보정 테이블을 열 '매트릭스'를 선택합니다.
- 단계 6.3에 설명 된대로, CFP-이변 량 플롯 대 무서워-을 확인하고 게이트 (P2)를 적용합니다. 세포주 1 + 2 실행으로, '상한'아이콘을 클릭하고 같은 형광 -negative 및 양성 집단이 낮은 두 개의 사분면으로 구분됩니다 (빌 게이츠 LL3의 사분면을 그립니다차 LR3, 각각).
- LL3과 LR3 게이트에 대한 FRET의 평균 형광 강도 (MFI)를 표시하는 통계 테이블을 만듭니다. FRET 신호의 MFI가 LL3과 LR3 사이의 동등한 때까지 보상 매트릭스의 FRET 매개 변수를 조정합니다. 이 단계에 이어, FRET 신호의 MFI는 FRET 채널로 스필 CFP의 부재를 시사 흠 세포 및 CFP 양성 세포 사이에서 동일하다.
- 단계 6.3에 설명 된대로, CFP-이변 량 플롯 대 YFP-을 확인하고 게이트 (P2)를 적용합니다. 단계 6.4.3에서 수행 한 것과 유사한 사분면 (LL4과 LR4)를 그립니다.
- LL4과 LR4에 대한 YFP의 MFI를 표시하는 통계 테이블을 만듭니다. YFP 신호의 MFI가 LL4과 LR4 사이의 동등한 때까지 보상 매트릭스의 YFP 매개 변수를 조정합니다. 이 단계에 이어, YFP 신호의 MFI는 YFP 채널에 CFP 스필의 부재를 시사 흠 세포 및 CFP 양성 세포 사이에서 동일하다.
- FOLL게이트 설치 및 보상 때문에, 관심의 우물을 선택하고 판의 나머지 부분을 실행합니다.
- 모든 샘플은 '파일'다음 '복사'를 클릭하여, 수출 데이터 파일을 실행 한 후. , '데이터 파일'탭을 선택 실험 폴더를 선택하고 '복사'를 클릭합니다.
- 분석 프로그램 유동 세포 계측법에서 열기 FCS 파일.
- 산란 특성들에 기초하여, 유사 제 6 항에 기재된 것과, 빈 리포좀으로 처리 한 세포에서 (FSC-VS FSC-H) 세포 집단 (FSC VS SSC) 및 중항 인구를 정의하는 다각형 게이트를 사용한다.
- CFP 보상을 설치하는 동안 수행 된 경우, 추가 CFP를 조정하지 않습니다.
- YFP의 이변 량 플롯 대 FRET을 만듭니다. 세포주 # 3를 사용하여, FRET 양성 세포 인구의 경사를 따라 실행되는 다각형 게이트를 그려 거짓 무서워 게이트를 정의합니다. 이 게이트는 FRET 필터 내의 신호를 방출 YFP 단일 양성 세포를 제외하고 이전에 외 금지하여 도시 된 것과 유사 그려. 22
- CFP의 이변 량 플롯 대 FRET에 빈 리포좀 처리 CFP / YFP 세포를 플롯에 의해 무서워 게이트를 정의합니다. 위쪽으로 확장하고 멀리 인구에서 좌측으로 인구의 경사를 따라 다각형 게이트를 소개합니다. 이 게이트는 배경이 세포의 ≥1 %로 FRET 있도록 대부분의 세포 (~ 99 %)을 제외한다. 이 게이트로 이동 모든 이벤트는 FRET 양성 간주됩니다.
참고 : 위에서 설명한 각각의 게이트는 다음 게이트를 구성하기 전에 모든 샘플에 적용됩니다. 분석에 따라, 네 개의 개별 게이트가 정의 (세포 인구, 단일 거짓 무서워, 무서워). - %의 FRET 양성 및 MFI 등 : 관심의 기록 분석 매개 변수,FRET 양성 세포. 수동 퍼센트 양성 및 MFI의 생성물을 측정함으로써 FRET 집적 밀도를 계산한다.
주 : 집적 FRET 밀도 측정 결과는, 두 개의 개별 요소 미만인 곱을 계산 피하기 위하여 1보다 크거나 같다 및 MFI (단계 7.5에서 정의 된 바와 같이) 설정 배경 FRET로 사용되는 경우.
3. Replating 바이오 센서 세포
노트:이 분석을 위해 네 개의 세포주를 사용하여 HEK 293T (셀 라인 # 1), RD-P301S-CFP (셀 라인 # 2), RD-P301S-YFP (3 세포주 #) 및 RD-P301S-CFP / YFP ( 세포주 # 4). 분석 각 세포주의 공헌은 표 1을 참조하십시오.
4. 치료 세포
참고 : 다음 날, 타우 바이오 센서 세포가 다음과 같이 종자 전달 복합체를 제조, 60~65% 합류 있습니다 :
FRET 유동 세포 계측법 5. 수확 세포
6. FRET 유동 세포 계측법
참고 : 레이저 라인 필터 세트 (표 2) FRET 호환 장착되어 MACSQuant VYB, 같은 사이토 흐름을 사용합니다. 이 섹션 내에서 각 단계의 경우, 소프트웨어의 96 웰 템플릿을 사용하여 관심의 복지를 클릭 클릭"재생"샘플 이해와 흐름을 시작합니다. '새로운 분석 창'아이콘을 클릭하여 플롯 또는 통계 테이블을 확인합니다. X 또는 Y 축 중 하나의 제목을 클릭하고 적절한 필터를 선택하여 개별 이변 량 플롯에 축 매개 변수를 변경합니다. 세포 집단 또는 형광 신호를 교대로 증가 또는 적절한 필터와 연관된 전압을 감소시킨다. 이 악기로, 정확한 단일 셀 모니터링을 보장하기 위해 <1000 이벤트 / 초를 실행합니다.
7. 데이터 분석
참고 : X 또는 Y 축 중 하나의 제목을 클릭하고 적절한 필터를 선택하여 개별 이변 량 플롯에 변경 축 매개 변수를 설정합니다.
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Representative Results
FRET 유동 세포 계측법에 민감한, 양적, 재조합 또는 생물학적 시료에서 파종 작업을 신속하게 검출 할 수 있습니다. 분석 설치가 용이 한 것입니다 : 타우-RD-CFP / YFP을 표현하는 단일 클론 유래 안정적인 세포주는 24 ~ 48 시간 동안 배양, 종자 물질로 형질 도입 및 분석 (그림 1A) 유동 세포 계측법의 대상이된다. 씨의 부재에서, 바이오 센서 셀 가용성, 단량체 형태 (도 1b) 타우를 유지한다. 종자의 존재하에 그러나, 바이오 센서는 유동 세포 계측법으로 셀당 기초 FRET 검출 응답을 생성하는, 응집 된 상태 (도 1C) 타우로 변환한다. 정량적 인 평가는 바이오 센서 셀 시드 물질의 펨토 몰 농도에 반응하고 시딩 활성을 효과적으로 세 오더의 크기 (도 1D)에 걸쳐 측정 될 수 있다는 것을 보여준다.
게이팅 파라미터 (TR)의 검출을 보장하기 위해 설립되었다UE는 심지어 낮은 시드 농도에서, 신호를 FRET. 먼저, 표준 게이팅 방법이 세포 집단 (도 2A) 및 단일 셀 (도 2b)을 분리하는데 사용된다. 거짓 FRET 신호는 405 nm의 레이저에 의해 YFP 직접 활성화에서 발생할 수 있습니다. 따라서, 거짓 FRET 게이트 오염 신호 (그림 2C)를 제외 YFP 단일 양성 세포 인구에서 그려집니다. 마지막으로, FRET 게이트 시드 화 CFP / YFP 이중 양성 세포 (그림 2D)에서 정의됩니다. 게이트 위쪽으로 확장 인구의 기울기 근처에 그린과 멀리에서 좌측으로한다. 자극되지 않은 세포는 배경이 약 1 %로 설정 값을 가져야 FRET 및 FRET 양성 세포 (도 2E 및 2F)와 비교 용량 의존적 방식으로이 게이트로 이동할 것이다. 즉 %의 양성 (총 세포 수에 따라 FRET 양성 세포의 수 : 여러 매개 변수를 포함하여, 유동 세포 계측법 FRET으로 고려) 및 예 정도 FRET 응답은 FRET 양성 세포에서 생산되는 형광 강도 중앙값 (). 그것은 이들 두 변수의 곱이며 전적으로 주어진 샘플에 의한 시드 활동의 정도를 나타내는로서 통합 FRET 밀도는 바람직한 결과 척도이다.
FRET 유동 세포 계측법 그림 3에 표시된대로, 심지어 젊은 나이에, P301S 타우 병증 마우스 유래 뇌 해물과 호환됩니다. 네 개의 다른 뇌 영역의 미세 절제 후, 세포 계측법 뇌간에서 시드 활동 (그림 3A)를 측정하는 데 사용 된 흐름 프렛, 신피질 (그림 3B), 전두엽 (그림 3C), 그리고 연령의 범위 P301S 생쥐의 해마 (그림 3D). 각 지역에서 시드 활동은 연령이 증가 1.5 개월에 나타났다. 그러나, 타우 녹아웃 마우스 ( "코")은> 12 MOS는 시드 활동을 표시하지 않습니다. 시간에 비해istological이 입체 형태 - 비정상적인 타우 (MC1), hyperphosphorylated 타우 (AT8 및 PG5)과 아밀로이드 형태의 마커를 포함 타우 증착 (그림 3E)의 다른 마커의 모양보다 육주 빨리이며, 같은 동물 내에서 수행 분석 (ThioflavinS). 기계 론적 관점에서, 타우 시드 활동의 근위 검출 타우 병증 발병 및 / 또는 진행의 원인 매개체로 씨앗을 제안한다. 실험보기에서,이 초기 견고한 외관 주어진, 파종 활동의 분석은 타우 증착의 표준 결과 측정에 이상적인 보충 할 수 있음을 시사한다.
형질 전환 마우스뿐만 아니라, 유동 세포 계측법 인간의 뇌 해물과 호환되며 쉽게 알츠하이머 병 과목 (그림 4)에서 분리 된 타우 집계를 검색 할 수 있습니다 무서워. 냉동 된 인간 뇌 조직을 동일한 방법으로 균질화 될 때 활성 시드, P301S 뇌 해물 여기 기술 된 바와 같이견고 AD 피험자로부터 도출 모든 샘플에서 검출된다. 반면, 시딩 활성 연령대 또는 헌팅턴병 제어 대상의 용 해물로부터 검출되지 않는다. 이것은 타우 응집체 대한 분석의 특이성을 강조한다.
이 문서의 포커스가 HEK의 293T 바이오 센서 셀에 골재 리포좀 - 매개 전달을 이용 타우 시딩 활성 민감한 검출이 있지만, 이상의 생체 세포 배양 패러다임은 또한 염기성 세포 흡수 메카니즘을 평가하기 위해 유세포 FRET 수행 될 수있다. 예를 들어, 기본의 연결을 문화가 렌티 바이러스는 타우-RD-CFP를 표현하고 타우-RD-YFP은 도금시 구축에 감염 될 수있다. DIV4에서 집계 종자 함유 물질 (그림 5B)로 처리 신경 세포에 처리되지 않은 세포 (그림 5A)에 존재하지만 탐지입니다. 중요한 것은, 인지질은 생리와 팻의 조사를 허용,이 실험에서 제외됩니다 hophysiological 시드 메커니즘. 따라서, 타우 브릴의 애플리케이션은 신경 HSPG 매개 흡수 리드 FRET 및 유동 세포 계측법 (도 5c)로 정량화 될 수있는 용량 - 의존적으로 응집을 자극한다. 또한, 분석은 치료 타우 흡수의 평가 및 HEK 293T 타우의 바이오 센서를 이용하여 세포를 시험관 내에서 폐색을 시드에 이용 될 수있다. 심지어 인지질의 부재 모두 재조합 브릴 (도 5d) 및 P301S 뇌 해물 (도 5E)은 타우 응집을 유도한다. 헤파린이 타우 씨의 전 배양이 (이전 HSPG 매개 타우 흡수의 강력한 억제제로 표시), 그러나, 그들의 파종 용량을 제거한다. 이 실험 장치는 약물 (예, 항체, 소분자 등)에 적용 할 수 있고, 흡수 및 / 또는 종자 수정 치료제의 신속한 평가를 가능하게한다.
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1. FRET 계측법 민감 유동도는 타우 시딩 활성 (16)을 검출한다. 타우 RD-CFP / YFP를 발현하는 단일 클론하는 HEK 293T 세포를 24-48 시간 동안 배양하여, 재조합 또는 생물학적 시료 형질 도입하고, 유동 세포 계측법하여 단일 세포 기초 분석 하였다 (A). 자극되지 않은 세포는 시드 - 함유 물질 표시 두드러진 흠 (C)로 처리 된 세포 반면, 단량체 상태 (B)에서 타우-RD를 유지한다. 정량적 평가 재조합 종자 재료의 펨토 몰 농도 (단량체 상당)에 민감하고 검출 크기 (D)의 세 가지 주문을 걸쳐 유동 세포 계측법 FRET 시드 활동 쇼 (SEM 평균 ±). 모노머 상당 fibrillization 반응에 포함 된 단백질의 총량을 나타내고 불완전한 및 보정하지 않습니다# 160; 집계 자료에 모노머의 결합. 따라서, 실제 집계 (씨앗)의 농도가 작아야합니다보다 또는 '모노머 해당하는'동일. * 홈즈와 퍼먼 등. (16)에서 수정 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
FRET 유동 세포 계측법. 세포 인구 (A) 및 단일 / 이중 (B) 게이트 그림 2. 게이팅 전략 방법론 세포 계측법 표준 흐름을 그려집니다. 거짓 FRET 게이트 (C)가 YFP을 제거 bleedthrough FRET 필터로 할 YFP 단일 양성 세포에서 그려집니다. FRET 게이트 (D)가 빈 리포좀 처리 된 세포로 구성되며, 이러한그 배경 FRET는 ≥1 %이다. FRET 게이트로 모집단 시프트 시드 양성 물질 (E)를 다음과 치료 및 나타나는 시프트 시드보다 많은 양의 재료 (F)와 함께 더욱 두드러진다. 최종 판독 값은 다음과 같습니다. %가 양성을 FRET, 평균 형광 강도 무서워 양성 이벤트 (MFI) 및 통합 FRET 밀도 (통합 FRET 밀도 = 퍼센트 양성 세포가 MFI를 *) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
P301S 마우스 16 타우 시드 활동의 그림 3. 진행. P301S 쥐의 뇌 균질에서 시드 활동 (평균 ± SEM)은 뇌간에서 1.5 개월 (에 알 수있다) 신피질 (B), 전두엽 (C) 및 해마 (D). 그러나, 시드 활성은 타우 녹아웃 마우스 (> 12개월)에서 관찰되지 않는다. 시딩 활성은 연령이 증가 MC1, AT8, PG5 및 (E)를 포함하는 다른 일반적인 조직 학적 마커의 출현에 선행. * 홈즈와 퍼먼 등. (16)로부터의 허가 재판 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
FRET 그림 4. 호환성 인간의 생체 시료 (16) 유동 세포 계측법. 타우-RD-CFP / YFP 바이오 센서 세포를 20 μg의 인간의 뇌 해물로 형질 도입하는 경우, 강력한 시드 (± SEM을 의미) 모든 테스트 알츠하이머 disea 발생연령대와 헌팅턴의 질병 통제 용 해물은 시드 활동이 부족한 반면, 자체 뇌,. * 홈즈와 퍼먼 등. (16)에서 수정 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 FRET 5. 대체 응용 프로그램은 렌티 바이러스 인코딩 타우 - CFP와 형질 세포 계측법 (16). 주 뉴런 흐름과 타우-YFP는 구성한다. 외인성 씨의 부재하에 명백한 집합 (A)가 없으나, 씨앗의 존재 (B)에있다. 바이오 센서의 연결도 인지질 - 매개 전달 (C)의 부재 하에서, 농도 의존적 재조합 타우 씨앗 응답. 재조합 (D) 또는 양방향의 사전 배양헤파린 론적 (E) 시드 소스는 HSPG 매개 타우 시드 흡수 억제제는 HEK 293T 세포를 바이오 센서의 응답 성을 FRET 고갈. 정량적 평가 표시 (SEM 평균 ±). * 홈즈와 퍼먼 등. (16)에서 수정 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 : FRET에 사용 된 세포주는 유동 세포 계측법. HEK 293T 세포에가 설치 유세포 사용된다. CFP 단일 양성 세포는 보상 (*)에 사용됩니다. YFP 단일 양성 세포 인해 405 nm의 여기로 YFP 직접 활성화에 거짓 FRET 신호를 제거하는 데 사용됩니다. CFP / YFP-이중 양성 세포는 FRET - 호환 및 역할바이오 센서 세포. 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 2 :. 레이저 및 필터 설정 사이토 흐름 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 FRET 유동 세포 계측법 시스템은 신속하고 정량적 타우 파종 활동을 평가하기위한 강력한 도구입니다. 그것은 단지 적당한 세포 배양 경험과 FRET에 대한 실무 지식과 유동 세포 계측법을 필요로한다. 베타 시트 구조에 결합하면 형광을 강화 전시 - - 등 Thioflavin T와 같은 다른 시드 분석은, 수고하고 순수한, 재조합 단백질 기판을 필요로한다. 또한, 타우에 대한 시험 관내 시드 분석은 반 정량과 종자 재료 (23, 24)의 subnanomolar 수준으로 일반적으로 문자를 구분하지 않는다. 유동 세포 계측법 프렛 그러나, 재조합 또는 생물학적 중 샘플에서 시드 활동의 양적, 정교하게 민감한 측정을 제공합니다. 또한, 적응 절차는 단백질 응집 질환의 다양한 연구에 유용 할 수있다.
본원에 기술 된 프로토콜은 타우 시드에 집중되지만, 단순 수정은 t 필요O proteopathic 씨의 다른 유형에서 파종 활동을 감시하기 위해 사용자 수 있습니다. 홈즈 퍼먼 외.에서 입증 된 바와 같이, 모노클로 날 세포주의 생성을 안정 질병 - 관련 A53T 돌연변이 CFP 하나에 태그 또는 YFP 전체 길이 α-synuclein의 재조합 브릴 (16)으로부터 시딩 활성 민감한 검출을 가능 형질 α-synuclein의 발현 . 유사한 실험이 효과적으로 단백질 응집을 검출 헌팅 바이오 센서 셀을 이용하여 수행되었다. 따라서, 단순히 단백질 바이오 센서를 수정하여, 유동 세포 계측법 수많은 씨앗 소스와 호환 무서워. 치료 패러다임과 셀 모델을 포함한 분석, 다른 변형은, FRET하게 생리적 메커니즘을 평가하는 유동 세포 계측법에 더 적용하기 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜에서, 종자는 직접 감도를 증가하는 방법으로 리포좀 - 매개 형질 도입을 통해 바이오 센서를 세포 내로 도입 하였다.
그것은 N에 중요하다OTE 그러나, 이것은 필요 조건이 아니라고. 타우 재조합 마우스 또는 생물학적 시료 여전히 리포좀 부재 (도 5)에서 바이오 센서 세포를 시딩 할 수있다에서 집계. 따라서, 실험실은 아직 분석을 사용할 수있다 생리 전파 및 / 또는 타우 씨의 흡수 메커니즘을 공부에 관심. 또한, 유동 세포 계측법 차의 연결을 문화와 호환 FRET. 도금시 CFP-와 YFP 인코딩 된 렌티 바이러스 구조와 세포를 감염시켜, 효율적인 FRET 응답도 리포좀의 부재 (그림 5)에서, 재조합 타우 섬유와 치료 다음과 같은 나노 몰 농도에 도달한다. 함께 찍은, 이러한 데이터는 FRET 유동 세포 계측법 단백질 집합체의 다양한 여러 세포 배양 모델에서 시드의 생리 학적 메커니즘을 연구하는데 유용하다는 것을 나타냅니다.
FRET 시스템 유동 세포 계측법은 사용자 친화적이고 적응력이 있지만, 특정 주요 단계는해야한다치료시 샘플 준비 및 적당한 세포 생장 등의 호환성을 보장하기 위해 따랐다. 뇌 시료의 고강도 초음파 프로브는 시딩 활성의 효과적인 분리를위한 최적 중요하다. 개발 및 최적화하는 동안, 그것은 관찰하는이 방법은 다른 일반적인 기술에 대해 P301S 마우스의 뇌, 예를 들어, 휴대용 균질화에서 시드 활동을 분리 10 배 이상 더 효과적이다. 그것은 매우 큰 타우 집계가 상대적으로 낮은 시드 성향을 가지고있다, 그 프로브 초음파는 작은 씨앗 호환 조각으로 이러한 집계를 깨는에 가장 효과적이다. 필요한 경우, 상기 설정 시딩 활성 민감한 검출 권장되지만 초음파의 주파수 및 지속 시간은 변경 될 수있다.
이 감도 및 셀 상태에 모두 영향으로 처리시 세포의 생장은 또한 매우 중요하다. 만약 세포너무 합류 재, 그들은 쉽게되어 감도가 크게 감소, 인지질 및 종자 물질을 차지하지 않습니다. 포화 상태가 너무 낮 으면, 인지질 및 시드 물질의 첨가는 독성이있을 수있다. 실증 시험은 60-65%의 바이오 센서 컨 플루 치료 및 후속 대응을위한 최적임을 보여줍니다.
프로토콜에서 언급 한 바와 같이, 보상 알고리즘은 정기적으로하여 잘못된 신호를 제거하고 감도를 증가, 채널을 YFP에 CFP의 유출을 제외하고 FRET하는 데 사용됩니다. 시딩 활성 빠르고 질적 평가, 그러나,이 단계는 사후 분석 소프트웨어를 이용하여 유세포 생략되거나 수행 될 수있다. 깨끗하고보다 강력한 신호를 보상하지만, 따라서 가장 엄격한 정량적 분석을 위해이 단계는 고도로 추천 다음이 얻어진다.
분석의 한계는 생화학에보고 할 수는 없다는 것이다 조성proteopathic 씨. 현재 분석 측정 시드 활동, 씨앗의 기능 속성입니다. 씨앗의 생화학 및 생물 물리학 적 특성의 결정은 그럼에도 불구하고,이 분석은 수많은 표본에서 엔드 포인트로 시드 효능 평가에 유용 할 것 등 면역 크로마토 그래피, 원 편광 이색, 질량 분석, 전통적인 분석에 커플 링을 필요로 할 것이다.
이 분석은 최근 정량화 및 조직학 얼룩 등 타우 증착의 다른 일반적인 마커에 대하여 P301S 마우스에서 발생과 진행 시딩 timecourse을 특성화하는 데 사용되었다. 본 연구에서는, 타우 시드 활동은 이전에 우리가 16을 테스트 한 최초의 조직 학적 마커 (MC1) 6 주 이상 분명했다. 초기 외관 주어진 활성을 시드하는 것은 적어도 예비 연구를 위해, 치료 적 개입의 효능을 평가하기위한 중요한 추가, 또는 대안으로서, 측정 결과를 나타낼 수있다.처리 과정을 단축 이하의 동물, 주거 비용과 감소 실험 소요 시간을 공부. 이 치료제 2 ~ 4 주 후에 시드 활동에 대해 평가 4~6주과 두뇌에 P301S 쥐에게 투여 될 수 있음을 생각할 수있다. 대안 적으로, 세포에서 항 - 타우 치료제의 평가는도 5에 입증 된 바와 같이, 바이오 센서 셀 시딩 활성의 유도를 차단하는 능력을 평가하여 일 내에 수행 될 수있다.
결론적으로, FRET는 분석을 파종하는 재조합 또는 생물학적 소스에서 타우 파종을 감지 할 수있는 쉽고 효율적인 방법입니다 유동 세포 계측법. 감도는 시험 관내 타우 시딩 다른 분석법에 의해 비교할 수 있으며, 이는 타우 병증 P301S 마우스에서 초기 병리학 적 변화를 검출하는 데 사용될 수있다. 또한, 복수의 세포 배양 모델과 다른 처리 조건하에 여러 proteopathic 종자 모니터링에서의 유연성을 위해 유용하게신속하게 정량 데이터를 수집에 관심이있는 단백질 응집 실험실.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TBS | Sigma | T5912 | |
| cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free) | Roche | 4693159001 | |
| Cryo-vials | Sarstedt | 72.694.006 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 105DU | |
| Weighing Boats | Fisher Scientific | 13-735-743 | |
| 15 ml conical tube | USA Scientific | 1475-0501 | |
| Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer | Omni International | 18-000-115 | |
| Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer | Omni International | OR-T-156 | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A451 | |
| Noise Cancelling Ear Muffs | Fisher Scientific | 19-145-412 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | S47299 | |
| 1.5 ml tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 000.215 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 50 ml Conical Tubes | Phenix Research | SS-PH15 | |
| 25 ml reagent resevoirs | VWR | 41428-954 | |
| Multi channel pipet | Fisher Scientific | TI13-690-049 | |
| 96 well flat bottom plates | Corning | 3603 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3788 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |
| Sorvall ST 40 Centrifuge | Thermo Scientific | 75004509 | |
| BIOLiner Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003796 | |
| Hemacytometer | VWR | 15170-172 | |
| MACSQuant VYB Flow Cytomter | Miltenyi Biotec | 130-096-116 | |
| Chill 96 Rack | Miltenyi Biotec | 130-094-459 | |
| Flow Jo analysis software | Flow Jo | ||
| 20 μl pipet tips | Rainin | GPS-L10 | |
| 200 μl pipet tips | Rainin | GPS-250 | |
| 1 ml pipet tips | Rainin | GPS-1000 | |
| 200 μl pipet tips | USA Scientific | 1111-1800 | |
| 5 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-606180 | |
| 10 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-607180 | |
| 25 ml Serological pipett | Phenix Research | SPG-760180 |
References
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