Introduction
Die intrazelluläre Akkumulation von tau Amyloide definiert Tauopathien, wie Alzheimer-Krankheit. In frühen Krankheitsstadien, wird Pathologie allgemein auf diskreten Bereichen des Gehirns lokalisiert ist, aber mit Fortschreiten der Krankheit, Pathologie sind immer an unterschiedliche neuronale Netzwerke 1-5 ausbreitet. Mehr deutet darauf hin transzellulären Ausbreitung toxischer Proteinaggregaten zugrunde liegt diese Pathologie (in 6-10 prüft). In diesem Modell werden proteopathic Samen (zB tau) von Spenderzellen freigesetzt und geben Nachbarzellen, die Umwandlung nativen Tau-Protein in die fehlgefalteten Form über templated Konformationsänderung 11-15. Der hier beschriebene Assay wurde entwickelt, um solche Aussaat Aktivität empfindlich detektieren. Es ist mit einem rekombinanten Protein und biologischen Proben kompatibel und ermöglicht die Quantifizierung von Minute Ebenen proteopathic Aussaat Aktivität 16.
HEK 293T-Zellen, die stabil exprimieren tau repeat domain (RD), das die krankheitsassoziierte Mutation P301S entweder GFP oder YFP fusioniert (nachstehend tau-RD-CFP / YFP-Zellen bezeichnet) dienen als stabile Biosensor seeding Aktivität. In Abwesenheit von proteopathic Samen, die Zellen aufrechtzuerhalten tau als lösliches Monomer und keinen nennenswerten Hintergrund FRET. Spontane Aufnahme oder die Liposomen-vermittelte Transduktion tau Samen in Zellen resultiert jedoch in RD-CFP und YFP RD-Aggregation, die eine FRET-Signals, die innerhalb einzelner Zellen über Durchflusszytometrie gemessen wird erzeugt.
Zahlreiche Komponenten dieses Tests wurden entwickelt, um die Empfindlichkeit zu erhöhen und verringern die Variabilität. Ein monoklonaler Zelllinie mit einem 1: RD-CFP / YFP Expressionsverhältnis 1 wurde ausgewählt, da sie eine optimale Signal: Lärm. Zur Erhöhung der Empfindlichkeit, sind Phospholipide verwendet werden, um Samen einzuführen direkt in Zellen (wenn auch in biologischen Mechanismen der Aufnahme zu studieren, kann diese weggelassen werden). Schließlich Durchflusszytometrie Monitoren FRET auf Bevölkerungsebene und einer einzelnen Zelle Ebene, im Gegensatz zu anderen Proteinaggregation Assays. Das endgültige Ergebnis zu messen, integrierte FRET Dichte ist hoch quantitative und gehen sowohl die Zahl der Zellen mit Aggregation und dem Grad der Aggregation innerhalb jeder Zelle aufgetreten. Alle diese optimierten Parameter zu verbessern Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
Dieses System wurde vor kurzem in einer umfassenden Studie an transgenen Mäusen P301S Tauopathie 17, die die zeitliche Entstehung und Progression von Tau-Seeding-Aktivität im Vergleich zu anderen gängigen tau pathologischen Markern (zB MC1, AT8, PG5 und Thioflavinen) bewertet beschäftigt. Seeding-Aktivität ist bei weitem der frühesten und robusten Marker der tau-Pathologie bewertet vorhergehenden histologischen Nachweis von mindestens 6 Wochen. Seeding Aktivität scheint bei 1,5 Monaten steigt progressiv mit dem Alter zu, was auf eine kausale Rolle der proteopathic Samen bei der Entstehung und / oder Progression der Neurodegeneration 16.
e_content "> Genaue Quantifizierung von Minuten Levels von Saatgut aus biologischen Proben können Studien, die Anfang der Krankheitsfortschritt überwachen zu erleichtern. Durch die Verkürzung Studiendauer und ermöglicht Verwendung von jüngeren Tieren, könnte dies die Effizienz und Genauigkeit der präklinischen Tierversuchen zu erhöhen. Zum Beispiel in das P301S Maus zuvor beschrieben, konnten Leitstrukturen so früh wie 4-6 Wochen geliefert werden (unmittelbar vor oder am Beginn der Aussaat Aktivität) und zur Wirksamkeit von 2-4 Wochen beobachtet. Die Bestimmung ist genau keine Verringerungen der Aussaat zu quantifizieren Aktivität. FRET Durchflusszytometrie wurde in vitro Screening-Anwendungen. Zum Beispiel können anti-tau-Reagenzien (zB Antikörper, von kleinen Molekülen etc.) schnell auf ihre Fähigkeit Impfen Induktion direkt in Kultur unter Verwendung von entweder rekombinanter tau zu Block prüfenden Aggregate oder Gehirn stamm Lysaten als Keimquelle (Abbildung 5). Mit diesem Setup einmal Keimmaterial hergestellt wird, eine Ex-Experiment dauert nur drei Tage, um abzuschließen, einschließlich der Datenanalyse. Die schnelle Quantifizierung von proteopathic Aussaat Aktivität kann somit zu erleichtern viele Studien der Neurodegeneration.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hinweis: Dieses Protokoll betont die Verwendung von FRET Durchflusszytometrie zur Erfassung Seeding-Aktivität von Maus-biologischen Proben. Es ist auch mit rekombinanten Fibrillen und menschlichen biologischen Proben kompatibel. Maus Euthanasie und Gehirn der Ernte wurde in Übereinstimmung mit IACUC genehmigten Verfahren durchgeführt.
1. Gehirn Extraction
- Nach tiefe Betäubung mit Isofluran (2%), durchströmen eine Maus mit eiskaltem PBS, die 0,03% Heparin, und extrahieren Sie die Gehirn nach den in Gage et al Details. 18
- Zeigen extrahierten Gewebe in einem Kryo-Fläschchen, und Snap freeze indem in flüssigem Stickstoff. Alternativ einfrieren Gewebe auf Trockeneis. Wenn sie gefroren ist, übertragen Gewebe auf -80 ° C und Speicherung für eine längere Zeitspanne, falls erforderlich.
Hinweis: Dieses Protokoll ist mit ganzen Hirnhomogenaten oder Mikro seziert Hirnregionen kompatibel. Siehe Hagihara et al. Für eine detaillierte Mikrodissektion Protokoll 19. 2. Herstellung von Biological Impfmaterial - Bereiten Homogenisierungspuffer durch Auflösen von Protease-Inhibitoren (EDTA frei) in 1x TBS (1 Tablette pro 10 ml). Vortex kräftig, und speichern Sie auf dem Eis. Protease-Inhibitoren muss EDTA kostenlos um Biosensor Zelllebensfähigkeit zu bewahren.
- Wiegen gefrorenen Hirngewebe in einer Wegwerf wiegen Boot, und in ein 5 ml konischen Röhrchen. Hinzufügen eiskaltem Homogenisierungspuffer so daß die endgültige Lösung 10% Gewicht / Volumen. Temporäre Speicherung auf Eis. Gewebemasse und anschließende Homogenisation Puffervolumen wird in Abhängigkeit von der Größe des Gehirns und / oder Regionen variieren. Hier wird ein erwachsener Mäuse mit einem Gewicht von 0,2 g hemibrain in 2 ml einer 10% w / vol Lösung suspendiert.
- Transfer von Proben in einem kalten Raum, und stellen Sie eine Ultraschallsonde, um den entsprechenden Einstellungen. Für Sondenbeschallung mit einem Omni Ruptor (hier abgebildet) stellen Sie den Haupt zu 20%, was etwa 75 W. Verwenden Sie eine Impuls-Modus entspricht, um sicherzustellen, Proben nicht ovwährend der Beschallung er-erhitzt. Stellen Sie den Impulsgeber zu 30%, entsprechend ca. 500 msec.
- Reinigen Sie die Spitze der Ultraschallsonde durch Spülen mit Wasser, Isopropanol und Wasser wieder, Abwischen der Sonde zwischen jeder Lösung. Achten Sie darauf, spülen Sie und wischen Sie sowohl die Seiten und der Boden der Sonde mit Lab-Wischtücher.
- Arbeiten mit einer Probe zu einer Zeit, tauchen Sie die Sondenspitze in die Homogenisierungspuffer, und starten Sie das Ultraschallgerät. Verwendung der oben beschriebenen Kraft und Impulsgeber Einstellungen liefern insgesamt 25 Impulse. Stellen Sie sicher, dass Gewebe ist völlig in der Schwebe. Seien Sie vorsichtig, um das Schäumen der Probe in diesem Schritt zu vermeiden.
HINWEIS: Die Proben sind anfällig für schäumende, wenn a) die Gesamtlautstärke ist gering, oder b) das Homogenat erwärmt. Mit dieser spezifischen Instruments, nicht mit einem Volumen von weniger als 250 & mgr; l zu beschallen. Um sicherzustellen, Proben bleiben gekühlt, können Röhrchen auf Eis bei diesem Schritt gespeichert werden. - Reinigen Sie die Sonde durch Wischen entfernt restliche Lysat, liefern dann 10 Impulse in einen Becher of sauberes Wasser. Die Seiten und der Boden der Sonde mit Wasser, Isopropanol und Wasser wieder ausspülen (wie in Schritt 2.4), Wisch Trocknen zwischen jedem Schritt. Um Verunreinigungen zu vermeiden, spülen Sie die Sonde in zwischen den Proben.
HINWEIS: Tau-Aggregaten, haben wir gefunden, daß strengere Reinigungsverfahren zur Verhinderung von Probe zu Probe Kontamination erforderlich sind. Andere Amyloide können jedoch zusätzliche Pflege, die wurde ausgiebig in der Literatur beschrieben 20,21 erforderlich. - Speicher Homogenate auf Eis, bis alle Proben verarbeitet worden sind.
- Spin Homogenate bei 21.300 · g für 15 min bei 4 ° C.
- Den Überstand in einem sauberen Rohr, kümmert sich nicht um das Pellet zu stören. Entsorgen Sie das Pellet. Aliquots des Überstands und Speichern Lysate bei -80ºC zur weiteren Verwendung. Vermeiden Einfrieren / Auftauen der Homogenate jedoch, wie dies reduziert Impfeffizienz.
- In einer sterilen Umgebung ansaugen Kulturmedium. Spülen Sie Zellen mit warmem PBS und absaugen. Trypsinize Zellen (3 ml Trypsin-EDTA (0,05%)) für 3 min, gequenscht mit warmem Kulturmedium (9 ml DMEM, 10% FBS, 1% Pen / Strep, 1% Glutamax), und Zellen, die unverzüglich in einen konischen Rohr.
- Zentrifuge Zellen bei 1.000 × g für 5 min bei RT. Saugen Sie Medium, und resuspendieren Zellpellet in warmem Kulturmedium.
- Verwendung eines Hämocytometer, bestimmen die Zelldichte für jede Zelllinie. Zelldichte in Abhängigkeit von Konfluenz zum Zeitpunkt der Ernte und Resuspensionsvolumen variieren. Die Zellen aus einer 10-cm-Schale mit 90% Konfluenz in 10 ml Medium geerntet, zur Zelldichte etwa 1 Millionen Zellen / ml liegen.
- Machenein Master-Mix aus Zellen + Medium derart, dass jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen werden jeweils 35.000 Zellen in 130 ul Medium enthalten (beispielsweise um einen Master-Mix für 100 Vertiefungen bilden, Resuspendieren 3,5 Millionen Zellen in 13 ml Medium). Ändern Sie die Zellzahl auf einzelne Versuchspläne und Zeitpläne passen. Für Zellbehandlung ~ 18 Stunden nach dem Plattieren hinzufügen 35.000 Zellen in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte.
- Unter Verwendung einer Mehrkanalpipette langsam pipettieren 130 ul des Master-Mix Zellsuspension in jede Vertiefung einer flachen Boden, Gewebekultur-behandelten 96-Well-Platte. Während Plattierung, legen Sie die Pipettenspitze in der Mitte des Brunnens, den Boden der Platte berührt.
Hinweis: Obwohl Plattieren Format kann geändert werden, so dass n = 4 Vertiefungen für jede der Zelllinien 1-3 pro Platte empfohlen. Der Rest der Platte (n = 84) für die Zelllinie # 4 (Biosensor-Zellen) vorbehalten. - Lassen Sie die Zellen, indem man die Platte ungestört für 10 Minuten bei RT zu begleichen. Inkubieren O / N bei 37 ° C, 5% CO 2 und &# 8805; 80% relative Luftfeuchtigkeit.
- In einem Rohr, zu verbinden Transfektionsreagenz wie Lipofectamin mit serumreduzierten wie Opti-MEM, um einen Master-Mix zu machen. Pro Loch, fügen 1,25 ul Transfektionsreagenz und 8,75 & mgr; verringert Serum Medien. Flick Rohr sanft zu mischen, kurz spin down, und Inkubation für 5 min bei RT.
- In einem anderen Rohr, Drill Material (Aliquot des Lysats aus Schritt 2.9) mit reduziertem Serum Medien.
HINWEIS: Volumen des Impfmaterials wird entsprechend der einzelnen Tests variieren. Bei der Auswahl der Samenvolumen, berücksichtigen: Fülle von Samen in einer Probe und potentielle Toxizität. Crude Homogenate können Zellen toxisch sein. Als solche, die niedrigste Lautstärke möglich, um die gewünschte Wirkung zu überwachen. Zuvor getesteten Mengen an Lysat / well Bereich from 1-5 & mgr; l, das entspricht 5-20 & mgr; g Gesamtprotein. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen pro Vertiefung (Samen + reduzierten Serum Medien) ist 10 & mgr; l. - Kombinieren Sie Inhalte aus den beiden in 4.1 und 4.2, Flick beschrieben zum Mischen leicht Rohre, kurz Spin-Down (1000 · g, 5 sec), und Inkubation bei Raumtemperatur für mindestens 20 min und bis zu 2 Std.
- Vorsichtig pipettiert 20 ul Transduktionskomplex auf der Seite der einzelnen Biosensor Vertiefungen. Verwenden Sie drei technische Replikate, wenn möglich. Zurückzukehren behandelten Zellen in den Inkubator für 24-48 Std. Inkubiere unter denselben Bedingungen wie in Schritt 3.6 beschrieben.
HINWEIS: Die entsprechenden Negativkontrolle Voraussetzung für diese Einstellung ist Biosensor-Zellen mit leeren Liposomen (dh Liposomreagenz + reduzierten Serummedien) behandelt, weil die Anwendung von Phospholipiden führt eine leichte Verschiebung in der Fluoreszenz-Profil in Bezug auf Zellen, um unbelichtete Liposomreagenz Biosensor. - Unter Verwendung einer Mehrkanalpipette absaugen alle Zellmedium (150 ul),. Trypsinieren (50 ul) Zellen für 5 min und Abschreckflüssigkeit mit 150 ul Kulturmedium gekühlt. Fügen Sie nicht einen PBS spülen, bevor in diesem Schritt Trypsinierung, denn es kann Zell Heben und anschließende Zellverlust führen. Keine verunreinigenden toten Zellen und Trümmer auszuschließen während Durchflusszytometrie über Gating-Strategien.
- Unmittelbar nach dem Abschrecken, Transferzellen in eine 96-Well-Rundbodenplatte und Zentrifuge bei 1.000 × g für 5 min bei RT.
- Absaugen und entsorgen Medium, wobei darauf zu achten das Zellpellet zu stören.
- Sanft, aber gründlich, Zellpellet in 50 ul 2% Paraformaldehyd, und Inkubation für 10 min. Alternativ können Sie Zellen leben, obgleich Fixierung bietet saubere und konsistente Ergebnisse.
- Zentrifuge Zellen bei 1.000 × g für 5 min bei RT. Absaugen und entsorgen Paraformaldehyd, wobei darauf zu achten das Zellpellet zu stören.
- Sanft, aber gründlich, Zellpellet in 200 ul gekühlt Durchflusszytometrie-Puffer (HBSS, 1% FBS 1 mM EDTA) und führen Sie die Platte so schnell wie möglich zu Zelle Verklumpung zu vermeiden.
- Machen Sie ein Side Scatter-Area (SSC-A) vs Forward Scatter-Umgebung (FSC-A) bivariate Grundstück und mit Zelllinie # 1 laufen, passen Sie die SSC und FSC-Spannungen bis die Zellpopulation in der linken unteren Quadranten. Klicken Sie auf das Polygon-Werkzeug, und definieren die Zellpopulation (Tor P1). Für alle Gating-Parameter siehe Abbildung 2.
- Machen Sie eine FSC-H (Höhe) vs FSC-A bivariate Grundstück und gelten Tor P1 zu dieser Handlung, indem Sie auf "live" über der Handlung, und die Auswahl P1. Mit Zelllinie # 1läuft, klicken Sie auf das Polygon-Werkzeug und definieren Einzelzellen (Tor P2).
- Machen 3 Histogramm Plot, eine für jeden der Filter von Interesse: CFP, YFP und FRET. Bewerben Tor P2, alle diese Grundstücke, indem Sie auf "live" über die Grundstücke und die Auswahl P2. Mit Zelllinie # 1 läuft, stellen Spannungen, so dass die mittlere Zellpopulation in der GFP, YFP, und FRET-Histogramme sind alle zwischen 0 und 1. Zum Messen GFP und FRET, erregt Zellen mit der 405 nm-Laser und Capture-Fluoreszenz mit ein 450/50 nm und 525/50 nm-Filter auf. Um zu messen, YFP, erregt Zellen mit einem 488 nm Laser-und Capture-Fluoreszenz mit einer 525/50-nm-Filter. Laser- und Filtereinstellungen sind ferner in Tabelle 2 beschrieben.
- Führen Ausgleich für CFP Spillover in die FRET und YFP-Kanälen.
HINWEIS: Kompensation ist der Prozess der Fluoreszenzstreuung Korrektur. Fluoreszenzstreuung tritt auf, wenn die Fluoreszenzemission von einem Fluorochrom innerhalb eines Filter desi detektiertengned zum Signal von einem anderen Fluorochrom zu messen. Mit der richtigen Kompensation kann die GFP Spillover-Fluoreszenz der FRET und YFP Kanäle entfernt werden.
HINWEIS: Kompensation erfordert die Anwesenheit von beiden Fluoreszenz-positiven und -negativen Zellen. Somit an GFP-positiven Zellen zu kompensieren (Zell-Linie # 2), negative Zellen (Zelllinie # 1) auf der Probe vor dem Durchlauf hinzugefügt.- Spike in 30 ul Zelllinie # 1-Suspension aus einer Hand gut in 200 ul Zelllinie # 2 Suspension unmittelbar vor der Kompensation.
- Klicken Sie auf das Symbol "Geräteeinstellungen" und dann Registerkarte "Entschädigung", und überprüfen Sie "Matrix", um die Kompensationstabelle zu öffnen.
- Machen Sie eine FRET-A vs GFP-A bivariate Handlung, und wenden Sie Gate P2, wie in Schritt 6.3 beschrieben. Mit Zelllinien 1 + 2 läuft, klicken Sie auf das Symbol "Quadranten" und zeichnen Quadranten, so dass die Fluoreszenz-negative und -positive Populationen werden durch die unteren zwei Quadranten getrennt (Tore LL3 einnd LR3, respectively).
- Erstellen Sie eine Statistiktabelle, die die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von FRET für die LL3 und LR3 Gates zeigt. Stellen Sie den Parameter FRET in der Kompensationsmatrix, bis der MFI des FRET-Signals entspricht zwischen LL3 und LR3. Nach diesem Schritt der MFI des FRET-Signals ist gleich zwischen ungefärbten Zellen und GFP-positiven Zellen, was auf die Abwesenheit von GFP Spillover in die FRET-Kanal.
- Einen YFP-A vs GFP-A bivariate Handlung, und wenden Sie Gate P2, wie in Schritt 6.3 beschrieben. Zeichnen Quadranten (LL4 und LR4) ähnlich wie in Schritt 6.4.3 durchgeführt.
- Erstellen Sie eine Statistiktabelle, die die MFI von YFP für LL4 und LR4 zeigt. Passen Sie die Parameter-YFP in der Kompensationsmatrix, bis der MFI des YFP-Signal entspricht zwischen LL4 und LR4. Nach diesem Schritt wird die MFI einer YFP-Signal ist gleich zwischen ungefärbten Zellen und GFP-positiven Zellen, was auf die Abwesenheit von GFP Spillover in die YFP-Kanal.
- Follaufgrund Gate Setup-und Entschädigung, markieren Brunnen von Interesse und führen Sie den Rest der Platte.
- Nachdem alle Proben, indem Sie auf "Datei" und dann "Kopieren" ausgeführt wurde, Exportdatendateien. Wählen Sie die Registerkarte "Dateien", markieren Sie den Versuch Ordner, und klicken Sie auf "Kopieren".
- FCS offene Dateien in der Durchflusszytometrie-Analyseprogramm.
- Basierend auf Streueigenschaften, verwenden eine polygonale Gate, um die Zellpopulation (SSC gegen FSC) und Singulett-Bevölkerung (FSC-H vs FSC-A) von Zellen mit leeren Liposomen behandelt ähnlich wie in Abschnitt 6 beschrieben definieren.
- Wenn CFP Vergütung wurde während der Installation durchgeführt wird, nicht weiter anpassen GFP.
- Erstellen Sie eine FRET vs YFP bivariate Grundstück. Verwendung von Zelllinie # 3Definieren Sie eine falsche FRET-Gate durch Ziehen einer polygonalen Tor, das entlang der Steigung der FRET-positive Zellpopulation führt. Dieses Tor schließt YFP single-positive Zellen, die ein Signal innerhalb des FRET Filter zu emittieren, und ist ähnlich dem zuvor durch Verbieten et al gezogen. 22
- Definieren Sie eine FRET-Gate durch Auftragen leere Liposomen behandelt CFP / YFP-Zellen auf einem FRET vs GFP bivariate Grundstück. Einführung einer polygonalen Gate entlang der Neigung der Bevölkerung, die sich nach oben erstreckt und weg von der Bevölkerung nach links. Dieses Tor sollten die meisten Zellen (~ 99%), schließen, so daß Hintergrund FRET ≥1% der Zellen. Alle Ereignisse, die in diesem Tor verschieben werden als FRET-positiv.
Hinweis: Jeder einzelnen oben beschriebenen Gate mit allen Proben vor dem Bau nachfolgenden Gates angelegt. Nach der Analyse werden vier einzelne Gates definiert (Zellpopulation; Singulett; falsche FRET; FRET). - Nehmen Sie Analyseparameter von Interesse, darunter: Prozent FRET Positivität und MFIFRET-positiven Zellen. Manuell berechnen die integrierte FRET Dichte durch Messung der Produkt von Prozent Positivität und MFI.
HINWEIS: Wenn integriert FRET Dichte als Endziel, Set Hintergrund FRET und MFI größer oder gleich 1 ist, um die Berechnung eines Produkts, das weniger als die beiden einzelnen Faktoren zu vermeiden (wie in Schritt 7.5 definiert sind) verwendet wird.
3. Replattierung Biosensor-Zellen
HINWEIS:Verwenden Sie vier Zelllinien für diesen Test: HEK 293T (Zelllinie # 1), RD-P301S-CFP (Zelllinie # 2), RD-P301S-YFP (Zelllinie # 3) und RD-P301S-CFP / YFP ( Zelllinie # 4). Beziehen Sie sich auf Tabelle 1 für die Beiträge der einzelnen Zelllinie auf den Test.
4. Behandlung von Zellen
HINWEIS: Die folgenden Tages, als Tau-Biosensor-Zellen sind 60-65% konfluent, bereiten Samenübertragung Komplexe wie folgt:
5. Ernte Cells für FRET Durchflusszytometrie
6. FRET Durchflusszytometrie
HINWEIS: Verwenden Sie ein Durchflusszytometer wie die MACSQuant VYB, die mit FRET-kompatiblen Laserlinien und Filtersätze (Tabelle 2) ausgestattet ist. Für jeden Schritt in diesem Abschnitt, klicken Sie auf die auch von Interesse unter Verwendung der Software 96-Loch-Vorlage, und klicken Sie auf"Play", um Probenaufnahme und Durchfluss beginnen. Machen Grundstücke oder Statistiktabellen, indem Sie auf die "neue Analysefenster" -Symbol. Ändern Achsparameter auf einzelne bivariate Grundstücke, indem Sie auf den Titel auf der X- oder Y-Achse und der Auswahl der geeigneten Filter. Um Zellpopulationen oder Fluoreszenzsignale zu verschieben, erhöhen oder verringern die Spannungen mit den entsprechenden Filter zugeordnet ist. Mit diesem Instrument laufen <1.000 Veranstaltungen / sec, um eine genaue Einzelzellenüberwachung zu gewährleisten.
7. Datenanalyse
HINWEIS: Achsenparameter ändern zu einzelnen bivariate Grundstücke, indem Sie auf den Titel auf der X- oder Y-Achse und der Auswahl der geeigneten Filter.
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Representative Results
FRET Durchflusszytometrie ermöglicht empfindliche, quantitative und schnelle Erkennung von Aussaat Aktivität von rekombinantem oder biologischen Proben. Assay Einrichtung leicht ist: Monoklonaler abgeleitete stabile Zelllinien, die tau-RD-CFP / YFP mit Impfmaterial transduziert, 24-48 h inkubiert und zogen Zytometrieanalyse (1A) fließt. In Abwesenheit von Samen, Biosensorzellen aufrechtzuerhalten tau in einer löslichen, monomeren Form (Abbildung 1B). In Gegenwart der Samen jedoch Biosensorzellen konvertieren tau in einer aggregierten Zustand (1C), wodurch ein FRET Reaktion, die auf einer Basis pro Zelle Durchflusszytometrie festgestellt wird. Quantitative Bewertung zeigt, dass Biosensor-Zellen reagieren auf femtomolar Konzentrationen von Keimmaterial und das Seeding Aktivität kann effektiv über drei Größenordnungen (1D) gemessen werden.
Gating Parameter eingestellt auf die Erfassung eines tr gewährleistenue FRET-Signal, auch bei niedrigen Samenkonzentrationen. Zunächst werden Standard Gating Methoden verwendet, um die Zellpopulation (2A) und Einzelzellen (2B) zu isolieren. Falsch FRET-Signals kann von der direkten Aktivierung von YFP durch die 405-nm-Laser auftreten. Somit wird eine falsche FRET-Gate aus einem YFP Single-positive Zellpopulation gezogen, um verunreinigende Signal (2C) auszuschließen. Zuletzt wird der FRET-Gatter aus ungesetzte CFP / YFP Dual-positive Zellen (2D) definiert. Ein Gate wird in der Nähe der Steigung der Bevölkerung, die sich nach oben erstreckt gezogen und von dieser weg nach links. Stimulierten Zellen sollte einen Hintergrund FRET-Wert auf etwa 1% eingestellt, und FRET-positiven Zellen in einer Dosis-abhängige Weise in dieses Tor zu verlagern (vergleiche Abbildung 2E und 2F). Mehrere Parameter, sind mit FRET genommen Durchflusszytometrie, umfassend: prozentuale Positivität (dh die Anzahl der FRET-positiven Zellen pro Gesamtzellzahl) Und die mittlere Fluoreszenzintensität (dh das Ausmaß, in dem ein FRET Reaktion wird in einem FRET-positive Zelle produziert). Integrierte FRET Dichte ist das bevorzugte Ergebnis zu messen, da es das Produkt dieser beiden Variablen und ganz den Grad der Aussaat Aktivität von jedem gegebenen Probe induziert.
FRET Durchflusszytometrie ist mit P301S Tauopathie Maus stamm Gehirn Lysate kompatibel, auch in jungen Jahren, wie in Abbildung 3 dargestellt. Im Anschluss an die Mikrodissektion von vier verschiedenen Hirnregionen, Bund Durchflusszytometrie wurde verwendet, um Aussaat Aktivität aus Hirnstamm (3A) zu messen, Neocortex (3B), Frontallappen (3C) und Hippocampus (Abbildung 3D) in P301S Mäusen über einen Bereich von Altersgruppen. In jeder Region erhöhte Aussaat Aktivität mit dem Alter und erschien in nur 1,5 Monaten. Allerdings tau-Knockout-Mäusen ("KO")> 12 mos nie angezeigt Aussaat Aktivität. Im Vergleich zu histological Analysen innerhalb der gleichen Tieren durchgeführt, das ist 6 Wochen früher als das Aussehen eines anderen Markers von Tau Abscheidung (3E), einschließlich der Marker der konformationell anomale Tau (MC1), hyperphosphoryliertem tau (AT8 und PG5) und Amyloid-Konformation (Thioflavinen). Aus mechanistischer Sicht der proximale Nachweis von Tau Aussaat Aktivität schlägt Samen als kausaler Vermittler von Tauopathie Entstehung und / oder Progression. Aus experimenteller Sicht bedeutet dies, dass Analyse der Aussaat Aktivität kann eine ideale Ergänzung zur Standard-Endpunkte von Tau-Abscheidung, angesichts seiner frühen und robustes Aussehen.
Neben den transgenen Mäusen, Bund Durchflusszytometrie ist mit menschlichen Gehirns Lysate kompatibel und kann Tau-Aggregaten von der Alzheimer-Krankheit Probanden (Abbildung 4) isoliert ohne weiteres zu erkennen. Wenn gefrorene menschliche Hirngewebe in der gleichen Weise homogenisiert, wie hier für P301S Gehirn Lysate beschrieben Impfen Aktivitätist robust aus allen von Alzheimer-Patienten abgeleitet Proben nachgewiesen. Im Gegensatz dazu ist der Aussaat Aktivität nie aus Lysaten von altersgleichen oder Huntington-Krankheit Kontrollgruppe festgestellt. Dies unterstreicht die Spezifität des Assays für Tau-Aggregaten.
Während der Schwerpunkt dieses Artikels ist empfindlichen Nachweis von tau Aussaat Aktivität unter Verwendung von Liposomen-vermittelte Lieferung von Zuschlagstoffen in HEK-293T-Biosensor-Zellen können mehrere physiologische Zellkultur Paradigmen auch FRET durchgeführt werden, Durchflusszytometrie, um grundlegende zelluläre Aufnahmemechanismen zu bewerten. Beispielsweise kann primären neuronalen Kulturen mit Lentivirus Exprimieren des tau-RD-GFP und tau-RD-YFP-Konstrukte bei der Plattierung infiziert werden. Bei DIV4 ist die Aggregation abwesend in unbehandelten Zellen (5A), aber nachweisbare in Neuronen mit samenhaltigen Materials (5B) behandelt. Wichtig ist, dass Phospholipide in diesen Experimenten ausgeschlossen, wodurch die Untersuchung der physiologischen und pat hophysiological Aussaat Mechanismen. Somit Anwendung tau Fibrillen führt zur neuronalen HSPG-vermittelte Aufnahme und stimuliert die Aggregation in einer dosisabhängigen Art und Weise, die mit FRET Durchflusszytometrie (5C) quantifiziert werden kann. Zusätzlich kann der Test zur Bewertung der therapeutischen tau Aufnahme und Impfen Blockade in vitro unter Verwendung von HEK 293T tau Biosensor-Zellen verwendet werden. Sogar in Abwesenheit von Phospholipiden, die beide rekombinanten Fibrillen (5D) und P301S Gehirn Lysaten (5E) induzieren Tau Aggregation. Vorinkubation dieser tau Samen mit Heparin (zuvor gezeigt wurde, ein potenter Inhibitor von HSPG-vermittelte tau Aufnahme ist) beseitigt jedoch ihre Aussaat Kapazität. Dieser Versuchsaufbau konnte zu jedem Medikament (zB Antikörper, kleine Moleküle, etc.) eingesetzt werden und würden eine schnelle Auswertung der Aufnahme und / oder Saatgut-modifizierende Therapie zu ermöglichen.
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Abbildung 1 FRET Durchflusszytometrie feinfühlig detektiert tau seeding Aktivität 16. Monoklonale HEK 293T-Zellen, die tau-RD-CFP / YFP wurden mit rekombinantem oder biologischen Proben, transduziert, 24-48 h inkubiert und auf Einzelzellgrundlage unter Verwendung von Durchflusszytometrie analysiert (A). Unstimulierten Zellen aufrechtzuerhalten tau-RD in einem monomeren Zustand (B), wohingegen Zellen mit samenhaltigen Materials Anzeige prominente Einschlüsse (C) behandelt. Quantitative Bewertung (Mittelwert ± SEM) der Aussaat Aktivität zeigt, die Durchflusszytometrie ist empfindlich gegenüber femtomolar Konzentrationen (Monomer-Äquivalent) von rekombinanten Saatgut und Detektion erstreckt sich über drei Größenordnungen (D) FRET. Monomer-Äquivalent repräsentiert die Gesamtmenge an Protein in der Fibrillenbildung Reaktion enthielt und nicht für die unvollständige & korrigieren# 160; Einbau von Monomer in aggregierten Materials. Somit muss die Konzentration des tatsächlichen Aggregate (Samen) kleiner als oder gleich seinem "Monomer-Äquivalent. * Von Holmes und Furman et al. 16 Geändert Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Gating-Strategie für FRET Durchflusszytometrie. Zellpopulation (A) und Singulett / Dublette (B) Tore sind mit Standard-Durchflusszytometrie Methodik erstellt. Ein falscher FRET-Gatter (C) aus YFP Single-positiven Zellen gezogen, um in das YFP FRET-Filter eliminieren Durchscheinen. Eine FRET-Gatter (D) von leeren Liposomen behandelten Zellen aufgebaut, beispielsdass Hintergrund FRET ist ≥1%. Eine Bevölkerungsverschiebung in die FRET-Gate erscheint nach der Behandlung mit Samen-positive Material (E) und die Verschiebung wird immer prominenter mit höheren Mengen von Saatgut (F). Schlussanzeigen sind:. Prozent FRET Positivität, mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von FRET-positive Ereignisse, und die integrierte FRET Dichte (Integrated FRET Dichte = Prozent positiver Zellen * MFI) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Progression von Tau-Seeding-Aktivität in Mäusen P301S 16. Seeding Aktivität (Mittelwert ± SEM) von Hirnhomogenaten des P301S Mäusen ist offensichtlich auf 1,5 Monate in der Hirnstamm (A) Neocortex (B), Stirnlappen (C) und Hippocampus (D). Jedoch seeding Aktivität nie in tau-Knockout-Mäuse (> 12 Monate) beobachtet. Seeding Aktivität steigt mit dem Alter und geht das Auftreten von anderen gemeinsamen histologischen Markern, einschließlich MC1, AT8 und PG5 (E). * Mit freundlicher Genehmigung von Holmes und Furman ua. 16 Nachdruck Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Vereinbarkeit von FRET Durchflusszytometrie mit menschlichen biologischen Proben 16. Wenn tau-RD-CFP / YFP Biosensor-Zellen mit 20 ug menschliche Gehirn Lysat transduziert, robust Aussaat (Mittelwert ± SEM) tritt in allen getesteten Alzheimer disease Gehirn, wohingegen bei gleichaltrigen und Huntington-Krankheit Kontrolle Lysate fehlt Aussaat Aktivität. * Von Holmes und Furman et al. 16 Geändert Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Alternative Anwendungen für FRET Durchflusszytometrie 16. Primäre Neuronen mit Lentiviren Encoding tau-CFP transduziert und Tau-YFP-Konstrukte. In Abwesenheit von exogenen Samen es keinen erkennbaren Aggregation (A), aber es gibt in der Gegenwart von Samen (B). Neuronale Biosensoren reagieren dosisabhängig um rekombinante tau Samen, auch in Abwesenheit von Phospholipid-vermittelte Zufuhr (C). Vorinkubation von rekombinanten (D) oder Bi-ological (E) Samenquellen mit Heparin, einem Inhibitor des HSPG-vermittelte tau Saatgutaufnahme, verarmt FRET Ansprechempfindlichkeit HEK 293T Biosensor-Zellen. Quantitative Bewertung Anzeigen (Mittelwert ± SEM). * Von Holmes und Furman et al. 16 Geändert Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1: Mit FRET verwendeten Zelllinien Durchflusszytometrie. HEK 293T-Zellen sind für die Durchflusszytometrie-Setup verwendet. CFP Single-positive Zellen sind für die Entschädigung (*) verwendet werden. YFP Single-positiven Zellen verwendet werden, um falsche FRET-Signals zu eliminieren durch direkte Aktivierung von YFP durch 405 nm-Anregung. CFP / YFP Dual-positive Zellen sind FRET-kompatibel und dienen alsdie Biosensor-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.
Tabelle 2:. Durchflusszytometer Laser und Filter-Einstellungen Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.
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Discussion
Die hier beschriebene FRET Durchflusszytometrie-System ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die schnelle und quantitative Beurteilung tau Aussaat Aktivität. Es erfordert nur moderate Zellkulturerfahrung und Grundkenntnisse in FRET und Durchflusszytometrie. Andere Seeding-Assays, wie Thioflavin T - die verstärkte Fluoreszenz zeigt, wenn es um Beta-Faltblatt-Struktur gebunden - sind aufwendig und erfordern ein reines, rekombinantes Protein-Substrat. Zusätzlich kann in vitro Aussaat Assays für tau sind nur semi-quantitative und in der Regel unempfindlich gegen subnanomolaren Ebenen von Saatgut 23,24. FRET Durchflusszytometrie jedoch eine quantitative und vorzüglich empfindliches Maß der Aussaat Aktivität von entweder rekombinanten oder biologischer Proben. Weiterhin kann Anpassungen der Verfahren machen es nützlich sein, eine Vielzahl von Proteinaggregation Störungen zu untersuchen.
Während die hier beschriebenen Protokoll konzentriert sich auf die Tau-Aussaat, nur einfache Änderungen erforderlich sind to einem Benutzer ermöglichen Aussaat Aktivität von alternativen Arten von proteopathic Samen zu überwachen. Wie in Holmes und Furman et al. Gezeigt, die Schaffung einer monoklonalen Zellinie stabil exprimieren α-Synuclein beherbergen die krankheitsassoziierten A53T-Mutation entweder GFP markiert oder YFP aktiviert empfindlichen Nachweis seeding Aktivität von Volllängen-α-Synuclein rekombinanten Fibrillen 16 . Ähnliche Experimente wurden durchgeführt unter Verwendung von Huntingtin Biosensor-Zellen, die auch Protein-Aggregation effektiv erkennen. Somit kann durch lediglich Ändern der Protein-Biosensor, Bund Durchflusszytometrie ist mit zahlreichen Samenquellen kompatibel. Andere Modifikationen auf den Test, einschließlich der Behandlung Paradigma und Zellmodell kann verwendet werden, um FRET machen Durchflusszytometrie weitere für die Beurteilung physiologischen Mechanismen werden. In diesem Protokoll wurden die Samen direkt in Biosensors Zellen über Liposomen-vermittelte Transduktion als Weg zur Erhöhung der Empfindlichkeit eingeführt.
Es wichtig ist, nOTE jedoch, dass dies keine Anforderung. Tau-Aggregaten aus rekombinanten oder Maus biologischen Proben werden weiterhin in Impfen Biosensor-Zellen in der Abwesenheit von Liposomen (Abbildung 5). So bei der Untersuchung physiologischer Ausbreitung und / oder Aufnahmemechanismen von Tau-Samen können immer noch den Test beschäftigen interessierte Labore. Zusätzlich FRET Durchflusszytometrie mit primären neuronalen Kulturen kompatibel. Durch Infizieren von Zellen mit CFP- und YFP-kodierten lentiviralen Konstrukte zum Zeitpunkt der Plattierung wird ein effizienter FRET Ansprechempfindlichkeit in nanomolaren Konzentrationen nach der Behandlung mit rekombinantem Tau Fibrillen auch in Abwesenheit von Liposomen (Figur 5) erreicht. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass FRET Durchflusszytometrie ist nützlich für das Studium physiologischer Mechanismen der Aussaat für eine Vielzahl von Proteinaggregaten und in mehreren Zellkulturmodellen.
Während die FRET Durchflusszytometrie-System ist benutzerfreundlich und anpassungsfähig, sollten bestimmte Schlüsselschritte seingefolgt, um die Kompatibilität zu gewährleisten, einschließlich der Probenvorbereitung und ordnungsgemäße Zellkonfluenz zum Zeitpunkt der Behandlung. Hochintensitätssonde Ultraschallbehandlung von Gehirnproben ist von entscheidender Bedeutung für eine effektive und optimale Isolierung der Aussaat Aktivität. Während der Entwicklung und Optimierung, wurde beobachtet, daß daß dieses Verfahren mehr als 10-mal wirksamer bei der Isolierung seeding Aktivität aus P301S Mäusehirnen in Bezug auf andere übliche Techniken, beispielsweise Hand Homogenisierung. Es ist möglich, dass sehr große tau Aggregate haben eine relativ geringe Neigung Aussaat und daß Sondenbeschallung ist am effektivsten für Brechen dieser Aggregate in kleinere, samen verträglich Fragmente. Dauer und Frequenz der Ultraschallbehandlung kann bei Bedarf geändert werden, obwohl die oben beschriebenen Einstellungen sind für die empfindliche Detektion von Aussaat Aktivität empfohlen.
Zellkonfluenz zum Zeitpunkt der Behandlung ist von größter Bedeutung, da sie sowohl die Empfindlichkeit als Zell Gesundheit auswirkt. Wenn Zellen Are zu konfluenten, sie nicht ohne weiteres aufnehmen Phospholipide und Saatgut, dadurch drastisch abnehmende Empfindlichkeit. Wenn Konfluenz zu niedrig ist, kann die Zugabe von Phospholipiden und Impfmaterial toxisch sein. Empirische Tests haben gezeigt, dass ein Biosensor Konfluenz von 60-65% ist optimal zur Behandlung und nachfolgende Reaktionsfähigkeit.
Wie im Protokoll vermerkt, werden Kompensationsalgorithmen regelmäßig zur GFP Spillover in die YFP auszuschließen und FRET-Kanäle, wodurch falsche Signale und Erhöhung der Empfindlichkeit. Für eine schnellere und qualitative Bewertung der Aussaat Aktivität jedoch kann dieser Schritt post hoc mittels Durchflusszytometrie-Analyse-Software weggelassen bzw. durchgeführt werden. Ein sauberer und robuste Signal erhalten folgende Vergütungen, aber, und damit für die strengsten und quantitative Analyse dieser Schritt ist sehr zu empfehlen.
Eine Begrenzung des Assays ist seine Unfähigkeit, über die biochemische berichten Zusammensetzungdie proteopathic Samen. Der aktuelle Test mißt seeding Aktivität, eine funktionelle Eigenschaft von Samen. Bestimmung der biochemischen und biophysikalischen Natur der Samen Kopplung zu herkömmlichen Assays, wie Immunpräzipitation, Chromatographie, Circulardichroismus, Massenspektrometrie, usw. erfordern Dennoch wird dieser Assay nützlich bei der Beurteilung der Aussaat Potenz als Endpunkt von unzähligen Proben nachzuweisen.
Dieser Assay wurde kürzlich zur Quantifizierung und Charakterisierung der Zeitverlauf der Aussaat Entwicklung und Progression in P301S-Mäuse im Vergleich zu anderen gemeinsamen Marker von Tau Ablagerung, wie histologischen Färbungen. In dieser Studie war tau seeding Aktivität über sechs Wochen offensichtlich vor dem frühest histologischen Marker (MC1), die wir getestet haben 16. Angesichts seiner frühe Auftreten kann Aussaat Aktivität eine wichtige ergänzende oder auch alternative, Endpunkt zur Beurteilung der Wirksamkeit von therapeutischen Interventionen, zumindest für Vorstudien zu vertreten.Durch die Verkürzung Behandlung und Verlauf und Studium jüngeren Tieren, Wohnkosten und experimentelle Durchlaufzeiten sinken. Denkbar ist, dass Therapeutika könnten P301S Mäusen bei 4-6 Wochen und Gehirn für die Aussaat Aktivität 2-4 Wochen später ausgewertet verabreicht werden. Alternativ könnte Bestimmung der Anti-tau-Therapeutika in Zellen innerhalb weniger Tage durch Bewerten ihrer Fähigkeit zur Induktion der Seeding-Aktivität in Zellen zu blockieren Biosensor, wie in 5 gezeigt, durchgeführt werden.
Im Ergebnis ist die FRET Durchflusszytometrie Impfen Assay ist ein einfacher und effizienter Weg, um tau Animpfen aus rekombinanten oder biologischen Quellen zu erfassen. Seine Empfindlichkeit ist unvergleichlich mit anderen in vitro-Assays tau Aussaat, und es kann verwendet werden, um die früheste pathologische Veränderung in P301S Tauopathie Mäusen nachzuweisen. Darüber hinaus seine Flexibilität bei der Überwachung zahlreicher proteopathic Samen unter verschiedenen Behandlungsbedingungen, und mit mehreren Zellkulturmodelle, ist es nützlich,beliebige Proteinaggregation Labor interessiert schnell Erhebung quantitativer Daten.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TBS | Sigma | T5912 | |
| cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free) | Roche | 4693159001 | |
| Cryo-vials | Sarstedt | 72.694.006 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 105DU | |
| Weighing Boats | Fisher Scientific | 13-735-743 | |
| 15 ml conical tube | USA Scientific | 1475-0501 | |
| Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer | Omni International | 18-000-115 | |
| Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer | Omni International | OR-T-156 | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A451 | |
| Noise Cancelling Ear Muffs | Fisher Scientific | 19-145-412 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | S47299 | |
| 1.5 ml tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 000.215 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 50 ml Conical Tubes | Phenix Research | SS-PH15 | |
| 25 ml reagent resevoirs | VWR | 41428-954 | |
| Multi channel pipet | Fisher Scientific | TI13-690-049 | |
| 96 well flat bottom plates | Corning | 3603 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3788 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |
| Sorvall ST 40 Centrifuge | Thermo Scientific | 75004509 | |
| BIOLiner Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003796 | |
| Hemacytometer | VWR | 15170-172 | |
| MACSQuant VYB Flow Cytomter | Miltenyi Biotec | 130-096-116 | |
| Chill 96 Rack | Miltenyi Biotec | 130-094-459 | |
| Flow Jo analysis software | Flow Jo | ||
| 20 μl pipet tips | Rainin | GPS-L10 | |
| 200 μl pipet tips | Rainin | GPS-250 | |
| 1 ml pipet tips | Rainin | GPS-1000 | |
| 200 μl pipet tips | USA Scientific | 1111-1800 | |
| 5 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-606180 | |
| 10 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-607180 | |
| 25 ml Serological pipett | Phenix Research | SPG-760180 |
References
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