Introduction
De accumulatie van intracellulaire tau amyloids definieert tauopathieën zoals de ziekte van Alzheimer. In de vroege stadia ziekte pathologie is algemeen gelokaliseerd op discrete gebieden van de hersenen, maar met ziekteprogressie, pathologie onveranderlijk verspreidt zich over verschillende neurale netwerken 1-5. Accumuleren bewijs suggereert transcellulaire verspreiding van giftige eiwit aggregaten ten grondslag ligt aan deze pathologie (herzien in 10/06). In dit model worden proteopathic zaden (bv, tau) vrijgelaten uit de donorcellen en voer naburige cellen, transformeren inheemse tau-eiwit in de vorm misfolded via templated conformationele verandering 11-15. De hier beschreven bepaling werd ontwikkeld om dergelijke zaaien activiteit gevoelig detecteren. Het is compatibel met recombinant eiwit en biologische monsters en maakt kwantificering van minuut niveaus van proteopathic zaaien activiteit 16.
HEK 293T-cellen die stabiel tot expressie tau herhaal domain (RD) met de ziekte- geassocieerde P301S mutatie gefuseerd aan ofwel CFP en YFP (hierna tau-RD-CFP / YFP cellen) dienen als stabiele biosensor van zaaien activiteit. Aangezien proteopathic zaden, de cellen behouden tau als een oplosbaar monomeer, en niet betekenisvol achtergrond FRET. Spontane opname of liposomen gemedieerde transductie van tau zaden in cellen, resulteert echter in RD-CFP en YFP RD-aggregatie, welk een FRET signaal dat wordt gemeten tussen enkele cellen via flowcytometrie produceert.
Talrijke bestanddelen van deze test werden om de gevoeligheid verhogen en verlagen variabiliteit. Een monoklonaal cellijn met een 1: 1 RD-CFP / YFP expressie verhouding werd gekozen, omdat het optimale signaal: ruis. Om de gevoeligheid te verhogen, fosfolipiden worden gebruikt om zaden te voeren direct in cellen (hoewel biologische mechanismen te bestuderen van opname, kan deze worden weggelaten). Tenslotte flowcytometrie monitors FRET op populatieniveau en een enkele cel level, in tegenstelling tot andere eiwitten aggregatie-assays. Het eindresultaat maatregel geïntegreerde FRET dichtheid sterk kwantitatief en neemt zowel het aantal cellen met aggregatie, en de mate waarin aggregatie heeft plaatsgevonden binnen elke cel. Al deze geoptimaliseerde parameters verhogen de gevoeligheid en reproduceerbaarheid te verzekeren.
Dit systeem werd onlangs gebruikt in een uitgebreide studie in transgene muizen P301S tauopathie 17 dat de temporele ontstaan en de progressie van tau zaaien activiteit ten opzichte van andere veelgebruikte tau pathologische markers (bijv, MC1, AT8, PG5 en ThioflavinS) geëvalueerd. Seeding activiteit veruit de oudste en meest robuuste marker van tau pathologie geëvalueerd voorafgaand histologische detectie tenminste 6 weken. Seeding activiteit verschijnt 1,5 maanden progressief toeneemt met de leeftijd, hetgeen een oorzakelijke rol proteopathic zaden in het ontstaan en / of de progressie van neurodegeneratie 16.
e_content "> Nauwkeurige kwantificering van minieme hoeveelheden entmateriaal uit biologische monsters studies progressie vroege ziekte te volgen te vergemakkelijken. Door verkorting proces duur en het mogelijk gebruik van jonge dieren, kan dit de efficiëntie en nauwkeurigheid van preklinische dierproeven verhogen. Bijvoorbeeld, in de P301S muis eerder beschreven, kan loodverbindingen zoals geleverd reeds 4-6 weken (onmiddellijk voor of bij het begin van zaaien activiteit) en gecontroleerd op werkzaamheid 2-4 weken later. De test dient nauwkeurig verminderingen van zaaien kwantificeren activiteit. FRET doorstroomcytometrie is in vitro screening toepassingen. Bijvoorbeeld, anti-tau reagentia (bijvoorbeeld antilichamen, kleine moleculen, etc.) kan snel worden getest op hun vermogen te blokkeren zaaien inductie direct in kweek met behulp van recombinant tau aggregaten of hersenen afgeleide lysaten als kiem bron (figuur 5). Bij deze opstelling, wanneer entmateriaal bereid afperiment duurt slechts drie dagen in beslag, met inbegrip van data-analyse. De snelle kwantificering van proteopathic zaaien activiteit kan aldus veel studies van neurodegeneratie vergemakkelijken.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NB: Dit protocol benadrukt het gebruik van FRET flowcytometrie voor het opsporen van zaaien activiteit van de muis biologische monsters. Het is ook compatibel met recombinant fibrillen en menselijke biologische monsters. Muizen euthanasie en hersenen oogsten werd uitgevoerd volgens IACUC-erkende procedures.
1. Brain Extraction
- Na diepe verdoving met isofluraan (2%), perfuseren een muis met ijskoude PBS met 0,03% heparine en extraheer de hersenen na de in Gage et al beschreven details. 18
- Plaats gewonnen weefsel in een cryo-flesje, en snap bevriezen door het plaatsen in vloeibare stikstof. Als alternatief bevriezen weefsel op droog ijs. Eenmaal bevroren, overdragen weefsel -80 ° C en opslag voor langere tijd, indien nodig.
NB: Dit protocol is compatibel met hele hersenhomogenaten of micro-ontleed hersengebieden. Zie Hagihara et al. Voor een gedetailleerde micro-dissectie protocol 19. 2. Voorbereiding van de Biologische Seed Materiaal - Bereid homogenisatiebuffer door oplossen proteaseremmers (EDTA-vrije) in 1x TBS (1 tablet per 10 ml). Vortex krachtig, en op te slaan op het ijs. Proteaseremmers moet EDTA vrij om biosensor levensvatbaarheid van de cellen te behouden zijn.
- Weeg bevroren hersenweefsel in een wegwerp wegen boot, en over te dragen aan een 5 ml conische buis. Add ijskoude homogenisatiebuffer, zodat de eindoplossing 10% gewicht / volume. Tijdelijk op te slaan op het ijs. Weefselmassa en daaropvolgende homogenisering buffer volume is afhankelijk van de grootte van de hersenen en / of gebieden gebruikt. Hier wordt een volwassen muis hemibrain gewicht 0,2 g gesuspendeerd in 2 ml van een 10% gew / vol oplossing.
- Overdracht monsters in een koude kamer, en pas een sonde ultrasoonapparaat naar de juiste instellingen. Voor probe ultrasoonapparaat met Omni Ruptor (hier getoond), zet de AAN tot 20%, wat overeenkomt met ongeveer 75 W. Met een pulsmodus te verzekeren monsters niet over-verwarmd tijdens ultrasoonapparaat. Stel de pulser tot 30%, overeenkomend met ongeveer 500 msec.
- Reinig het uiteinde van de sonde ultrasoonapparaat door spoelen met water, isopropanol en water weer afvegen van de sonde tussen elke oplossing. Wees er zeker van te spoelen en veeg zowel de zijkanten en onderkant van de sonde met een lab-doekjes.
- Werken met één monster tegelijk onderdompelen sondetip in de homogenisatiebuffer en start de sonicator. Met behulp van de kracht en de pulser instellingen zoals hierboven beschreven, leveren 25 in totaal pulsen. Zorg ervoor dat het weefsel volledig in suspensie. Wees voorzichtig om schuimen van het monster tijdens deze stap te vermijden.
Opmerking: De monsters zijn gevoelig voor schuimvorming indien a) het totale volume is laag of b) het homogenaat opwarmt. Met deze specifieke instrument, niet ultrasone trillingen met volumes van minder dan 250 pl. Om ervoor te zorgen monsters blijven gekoeld, kunnen buizen op ijs bewaard worden tijdens deze stap. - Reinig de sonde door weg te vegen resterende lysaat, dan levert 10 pulsen in een bekerglas of schoon water. Spoel de wanden en bodem van de sonde met water, isopropanol en water opnieuw (zoals bij stap 2,4), vegen drogen tussen elke stap. Om besmetting te voorkomen, spoel de sonde tussen de monsters.
OPMERKING: tau aggregaten, we hebben niet gevonden dat strengere reiniging die nodig zijn voor het voorkomen van sample-to-sample besmetting zijn. Andere amyloids kunnen evenwel extra zorg die uitvoerig is beschreven in de literatuur 20,21 vereisen. - WINKEL homogenaten op ijs totdat alle monsters zijn verwerkt.
- Spin homogenaten bij 21.300 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Breng de bovenstaande om een schone buis, verzorgen de pellet te verstoren. Gooi de pellet. Aliquot de supernatant en opslag lysaten bij -80 ° C voor verder gebruik. Vermijd vries / ontdooi cycli van de homogenaten, echter, zoals dit vermindert zaaien efficiency.
- In een steriele omgeving, aspireren kweekmedium. Spoel cellen met warm PBS, en zuig. Trypsinize cellen (3 ml trypsine-EDTA (0,05%)) gedurende 3 min, blussen met warm kweekmedium (9 ml van DMEM, 10% FBS, 1% pen / strep, 1% GlutaMax) en direct cellen te dragen aan een conische buis.
- Centrifugeer cellen bij 1000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zuig medium en resuspendeer celpellet in warm kweekmedium.
- Met behulp van een hemocytometer, bepalen de celdichtheid voor elke cellijn. Celdichtheid afhankelijk van samenvloeiing op het moment van oogsten en resuspensie volume. Resuspendeer cellen geoogst uit een 10 cm schaal bij 90% confluentie in 10 ml media, celdichtheid ongeveer 1 miljoen cellen / ml.
- Makeneen master mix cellen + medium zodat elk putje van een 96 putjesplaat zullen 35.000 cellen in 130 gl medium bevatten (bijvoorbeeld om een master mix maken 100 putten, resuspendeer 3,5 miljoen cellen in 13 ml media). Wijzigen van het aantal cellen aan individuele experimentele ontwerpen en tijdlijnen passen. Voor celtherapie ~ 18 uur na plating, voeg 35.000 cellen per putje van een 96-wells plaat.
- Met behulp van een multi-channel pipet langzaam pipet 130 pi master mix celsuspensie in elk putje van een vlakke bodem, weefselkweek behandelde 96 well plaat. Terwijl plating, plaatst de pipet tip in het midden van de put, niet de bodem van de plaat raken.
OPMERKING: Hoewel plating formaat kan worden aangepast, zodat n = 4 putten voor elk van cellijnen 1-3 per plaat wordt aanbevolen. De rest van de plaat (n = 84) is gereserveerd voor cellijn # 4 (biosensor cellen). - Laat de cellen bezinken door de plaat ongestoord 10 min bij kamertemperatuur. Incubeer O / N bij 37 ° C, 5% CO 2 en &# 8805; 80% relatieve vochtigheid.
- In één buis, combineer transfectie reagens, zoals Lipofectamine met verminderde serum media, zoals Opti-MEM, een master mix maken. Per putje, voeg 1,25 ul transfectiereagens en 8,75 pi verlaagde serum media. Flick buis voorzichtig mengen kort spin down en incubeer gedurende 5 min bij RT.
- In een andere buis, combineer entmateriaal (aliquot lysaat uit stap 2.9) met verminderde serum media.
OPMERKING: volume van entmateriaal zal variëren naar gelang van het experiment. Bij de keuze van het zaad volume, rekening houden met: overvloed van zaden in een monster en mogelijke toxiciteit. Ruwe homogenaten kan toxisch zijn voor cellen. Als zodanig, gebruikt u de laagst mogelijke volume op het gewenste effect te controleren. Eerder geteste volumes lysaat / goed bereik frOM 1-5 ul, overeenkomend met 5-20 ug totaal eiwit. Zorg ervoor dat het totale volume per putje (zaden + verlaagde serum media) is 10 pi. - Combineer de inhoud van de twee buizen van 4,1 en 4,2, flick beschreven voorzichtig mengen kort spin down (1000 xg, 5 sec) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 20 minuten en maximaal 2 uur.
- Voorzichtig pipet 20 ul van transductie complex aan de kant van individuele biosensor putjes. Gebruik drie technische herhalingen, indien mogelijk. Terugkeer behandelde cellen naar de incubator gedurende 24-48 uur. Incubeer onder dezelfde omstandigheden als beschreven in stap 3,6.
LET OP: De juiste negatieve controle voorwaarde voor deze opstelling is biosensor cellen behandeld met lege liposomen (dwz, liposoom reagens + verlaagde serum media) vanwege de toepassing van fosfolipiden introduceert een lichte verschuiving in de fluorescentie profiel ten opzichte van cellen onbelicht aan liposoom reagens biosensor. - Met behulp van een multi-channel pipet, zuig alle cel medium (150 pl). Trypsinize (50 gl) cellen gedurende 5 min, en blussen met 150 ul koud kweekmedium. Voeg geen PBS spoeling voorafgaand aan behandeling met trypsine bij deze stap, aangezien het mobiele heffen en daaropvolgende celverlies veroorzaken. Exclusief eventuele besmetting van dode cellen en puin tijdens flowcytometrie via gating strategieën.
- Direct na afschrikken overdracht cellen aan een 96 putjes met ronde bodemplaat en centrifugeer bij 1000 g gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
- Zuig en gooi medium, zorg om te voorkomen dat verstoring van de cel pellet.
- Zacht, maar grondig, resuspendeer de celpellet in 50 gl 2% paraformaldehyde, en incubeer 10 min. Als alternatief, lopen de cellen leven, hoewel fixatie levert schoner en consistente resultaten.
- Centrifugeer cellen bij 1000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Aspireren en gooi paraformaldehyde, zorg om te voorkomen dat verstoring van de cel pellet.
- Zacht, maar grondig, resuspendeer de celpellet in 200 ui gekoelde flowcytometrie buffer (HBSS, 1% FBS, 1 mM EDTA) en laat de plaat zo snel mogelijk naar cel klonteren te voorkomen.
- Maak een Side Scatter-Area (SSC-A) versus Forward Scatter-Area (FSC-A) bivariate plot, en met cellijn # 1 draait, stel de SSC en FSC spanningen totdat de cel bevolking is in de linker kwadrant. Klik op de polygoon gereedschap en definiëren de cel populatie (Poort P1). Voor alle venstertijd parameters zie figuur 2.
- Maak een FSC-H (hoogte) vs FSC-A bivariabelendiagram en toepassing Poort P1 op dit perceel door te klikken op "live" boven de plot, en het selecteren van P1. Met cellijn # 1hardlopen, klikt u op de polygoon gereedschap en definiëren enkele cellen (Poort P2).
- Maak 3 histogram percelen, één voor elk van de filters van belang: GVB, YFP en FRET. Solliciteer Poort P2 om al deze percelen door te klikken op "live" boven de percelen, en het selecteren van P2. Met cellijn # 1 draait, passen spanningen zodanig dat de mediaan cel populatie in het GVB, YFP en FRET histogrammen zijn allemaal tussen 0 en 1. Om GVB en FRET meten, prikkelen cellen met de 405 nm laser, en capture fluorescentie met een 450/50 nm en 525/50 nm filter, respectievelijk. Om YFP meten, prikkelen cellen met een 488 nm laser en capture fluorescentie met een 525/50 nm filter. Laser en filterinstellingen worden verder beschreven in tabel 2.
- Voeren compensatie voor GVB spillover in de FRET en YFP kanalen.
OPMERKING: Compensatie is het proces van fluorescentie spillover correctie. Fluorescentie spillover treedt op wanneer de fluorescentie-emissie van een fluorochroom wordt gedetecteerd binnen een filter desibestaande situaties om het signaal te meten van een ander fluorochroom. Met de juiste vergoeding, kan het GVB spillover fluorescentie worden verwijderd uit de FRET en YFP kanalen.
OPMERKING: Compensatie vereist de aanwezigheid van zowel de fluorescentie-positieve en -negatieve cellen. Dus, om te compenseren voor het GVB-positieve cellen (cellijn # 2), negatieve cellen (cellijn # 1) moet worden toegevoegd aan het monster voorafgaand aan de vlucht.- Piek in 30 ul van cellijn # 1 ophanging van een enkele ver in 200 ul-cellijn # 2 schorsing onmiddellijk voorafgaand aan compensatie.
- Klik op het pictogram "Instrument Instellingen", vervolgens het tabblad 'compensatie' en vink 'matrix' om de vergoeding tafel te openen.
- Maak een FRET-A vs GVB-A bivariate plot, en poort P2 van toepassing, zoals beschreven in stap 6.3. Met cellijnen 1 + 2 draait, klik op het icoon 'kwadrant' en trekken kwadranten zodanig dat de fluorescentie-negatieve en -positieve bevolkingsgroepen worden gescheiden door de onderste twee kwadranten (Gates LL3 eennd LR3, respectievelijk).
- Maak een tabel met statistieken dat de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van FRET voor de LL3 en LR3 poorten weergeeft. Stel de parameter FRET in de vergoeding matrix tot de MFI van het FRET signaal is gelijk tussen LL3 en LR3. Na deze stap, de MFI van het FRET signaal is gelijk tussen ongekleurd cellen en CFP-positieve cellen, wat suggereert dat de afwezigheid van GVB spillover in de FRET kanaal.
- Maak een YFP-A vs GVB-A bivariate plot, en poort P2 van toepassing, zoals beschreven in stap 6.3. Tekenen kwadranten (LL4 en LR4) gelijk aan die gedaan in stap 6.4.3.
- Maak een tabel met statistieken dat de MFI van YFP geeft voor LL4 en LR4. Stel de parameter YFP in de vergoeding matrix tot de MFI van de YFP signaal is gelijk tussen LL4 en LR4. Na deze stap, de MFI van een YFP signaal is gelijk tussen ongekleurd cellen en CFP-positieve cellen, wat suggereert dat de afwezigheid van GVB spillover in de YFP kanaal.
- Follvanwege poort setup en compensatie, markeert putten van belang en lopen de rest van de plaat.
- Nadat alle monsters zijn uitgevoerd, export data bestanden door te klikken 'bestand', dan 'copy'. Selecteer het tabblad 'databestanden ", markeert u de map experiment, en klik op' copy '.
- Open FCS bestanden in de flowcytometrie analyseprogramma.
- Op basis van de scatter eigenschappen, gebruik dan een veelhoekige poort naar de cel populatie (SSC vs FSC) en singlet bevolking (FSC-H vs FSC-A) te definiëren van cellen behandeld met lege liposomen, vergelijkbaar met die in hoofdstuk 6 beschreven.
- Als GVB compensatie werd uitgevoerd tijdens de installatie, niet verder GVB aan te passen.
- Maak een FRET vs YFP bivariate plot. Met behulp van cellijn # 3Definieer een valse FRET poort door het tekenen van een veelhoekige poort die langs de helling van de FRET-positieve celpopulatie loopt. Deze poort sluit YFP single-positieve cellen die een signaal binnen het FRET filter uitzenden, en is soortgelijk aan die eerder getoond door verbieden et al getekend. 22
- Definieer een FRET poort door het plotten lege liposoom behandelde CFP / YFP cellen op een FRET vs GVB bivariate plot. Invoering van een veelhoekige poort langs de helling van de bevolking boven uitstrekt en weg van de populatie naar links. Moet deze poort de meeste cellen (~ 99%), uit te sluiten, zodat de achtergrond FRET is ≥1% van de cellen. Elke gebeurtenissen die verschuiven naar deze poort worden beschouwd als FRET-positief.
OPMERKING: Elke individuele poort hierboven beschreven wordt toegepast op alle monsters vóór de aanleg van de volgende poorten. Volgende analyse worden vier afzonderlijke poorten gedefinieerd (Cell bevolking, singlet; valse FRET, FRET). - Record analyse parameters van belang, waaronder: procent FRET positiviteit en MFIFRET-positieve cellen. Handmatig berekenen van de geïntegreerde FRET dichtheid door het meten van het product van het percentage positiviteit en MFI.
Opmerking: Als geïntegreerd FRET dichtheid wordt gebruikt als uitkomstmaat, set achtergrond FRET (zoals gedefinieerd in stap 7,5) en MFI groter dan of gelijk aan 1 om te voorkomen berekenen van een product dat minder dan de twee individuele factoren.
3. replating Biosensor Cellen
LET OP:Gebruik vier cellijnen voor deze test: HEK 293T (cellijn # 1), RD-P301S-GVB (cellijn 2 #), RD-P301S-YFP (cellijn 3 #) en RD-P301S-CFP / YFP ( cellijn # 4). Gelieve referentie Tabel 1 voor de bijdrage van elke cellijn aan de test.
4. Behandeling Cellen
LET OP: De volgende dag, toen tau biosensor cellen 60-65% confluent, bereiden zaad transductie complexen als volgt:
5. Oogsten Cellen voor FRET flowcytometrie
6. FRET flowcytometrie
OPMERKING: Gebruik een flowcytometer zoals MACSQuant VYB, die is uitgerust met FRET-compatibele laserlijnen en filtersets (tabel 2). Voor elke stap in deze sectie, klikt u op de put van belang het gebruik van 96 en sjabloon van de software, en klik op"Spelen" met sample opname en doorstroming te beginnen. Maak percelen of statistieken tafels door te klikken op het pictogram van de 'nieuwe analyse venster'. Veranderen as parameters op individuele bivariate percelen door te klikken op de titel op zowel de X- of Y-as en het selecteren van de juiste filter. Naar cel populaties of fluorescentie signalen verplaatsen, vergroten of de spanningen in verband met de juiste filters te verlagen. Met dit instrument, lopen <1000 events / sec om nauwkeurige eencellige toezicht te garanderen.
7. Data Analysis
OPMERKING: asparameters Change op individuele bivariate percelen door te klikken op de titel op zowel de X- of Y-as en het selecteren van de juiste filter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FRET flowcytometrie maakt gevoelige kwantitatieve en snelle detectie van zaaien activiteit uit recombinante of biologische monsters. Assay opstelling is facile: monoklonaal afgeleide stabiele cellijnen die tau-RD-CFP / YFP zijn getransduceerd met entmateriaal gedurende 24-48 uur, en onderworpen aan flowcytometrie-analyse (Figuur 1A). Bij afwezigheid van zaden, biosensor cellen handhaven tau in een oplosbare, monomere vorm (Figuur 1B). In aanwezigheid van kiemen echter biosensor cellen omzetten tau in een geaggregeerde toestand (figuur 1C), het produceren van een FRET respons die wordt waargenomen op een per-cel met flowcytometrie. Kwantitatieve evaluatie blijkt dat biosensor cellen reageren op femtomolaire concentraties entmateriaal en zaaien kan op effectieve wijze worden gemeten over drie ordes van grootte (figuur 1D).
Gating parameters werden opgericht om detectie van een tr zorgenue FRET signaal, zelfs bij lage concentraties zaad. Eerst worden gating standaard methoden toegepast om de celpopulatie (figuur 2A) en enkele cellen (Figuur 2B) te isoleren. Valse FRET signaal kunnen zijn van directe activatie van YFP de 405 nm laser. Aldus wordt een valse FRET poort getrokken uit een enkele YFP-positieve celpopulatie verontreinigende signaal (figuur 2C) sluiten. Eindelijk wordt de FRET poort gedefinieerd vanuit ongeplaatste CFP / YFP dual-positieve cellen (figuur 2D). Een poort is getrokken bij de helling van de bevolking boven uitstrekt en afgelegen naar links. Niet-gestimuleerde cellen moeten een achtergrond FRET-waarde op ongeveer 1% en FRET-positieve cellen verschuift naar deze poort op een dosis-afhankelijke wijze (vergelijk figuur 2E en 2F). Meerdere parameters rekening gehouden met FRET flowcytometrie, inclusief: percentage positiviteit (dwz het aantal FRET-positieve cellen per totale celtelling) En de mediane fluorescentie-intensiteit (dat wil zeggen, de mate waarin een FRET respons wordt in een FRET-positieve cellen). Geïntegreerde FRET dichtheid de voorkeur uitkomstmaat, omdat het product van deze twee variabelen en totaal vertegenwoordigt de mate van enten activiteit geïnduceerd door een bepaald monster.
FRET flowcytometrie Geschikt P301S tauopathie-muizen afgeleide hersenen lysaten, zelfs op jonge leeftijd, zoals weergegeven in figuur 3. Na microdissectie van vier verschillende hersengebieden, FRET flowcytometrie werd gebruikt voor het enten activiteit uit hersenstam (figuur 3A) te meten, neocortex (Figuur 3B), frontale kwab (figuur 3C), en hippocampus in P301S muizen gedurende verschillende tijden (Figuur 3D). In elke regio, zaaien activiteit toe met de leeftijd en verscheen op slechts 1,5 maanden. Echter, tau knockout muizen ("KO")> 12 mnd nooit zaaien activiteit weergegeven. Vergeleken met histological analyses uitgevoerd op dezelfde dieren, is zes weken eerder dan het uiterlijk van elke andere merker van tau depositie (figuur 3E), met inbegrip van merkers van conformationeel afwijkende tau (MC1), hypergefosforyleerde tau (AT8 en PG5) en amyloïdconformatie (ThioflavinS). Van een mechanistische visie, de proximale detectie van tau zaaien activiteit suggereert zaden als een causaal mediator van tauopathie begin en / of progressie. Vanuit een experimenteel uitzicht, dit suggereert dat de analyse van zaaien activiteit een ideale aanvulling op de standaard uitkomstmaten van tau depositie kan zijn, gezien de vroege en robuuste uitstraling.
Naast transgene muizen, FRET flowcytometrie Geschikt menselijke hersenen lysaten en kan gemakkelijk tau-aggregaten geïsoleerd van Alzheimer patiënten (Figuur 4) te detecteren. Wanneer ingevroren menselijk hersenweefsel gehomogeniseerd op dezelfde wijze als hier beschreven voor P301S hersenen lysaten zaaien activiteitis robuust gedetecteerd van alle monsters afkomstig van AD onderwerpen. Daarentegen wordt enten activiteit niet gedetecteerd lysaten van vergelijkbare leeftijd of ziekte van Huntington proefpersonen. Dit benadrukt de specificiteit van de test voor tau aggregaten.
Hoewel de focus van dit artikel is gevoelige detectie van tau zaaien activiteit met liposoomgemedieerde levering van aggregaten in HEK 293T cellen biosensor, kan meer fysiologisch celcultuur paradigma ook worden uitgevoerd met FRET stromingscytometrie fundamentele cellulaire opname mechanismen beoordelen. Zo kunnen primaire neuronale kweken geïnfecteerd met lentivirus expressie tau-RD-tau CFP en YFP-RD-constructen op uitplaten. Bij DIV4, aggregatie afwezig in onbehandelde cellen (figuur 5A), maar detecteerbaar in neuronen behandeld met zaaddragende materiaal (Figuur 5B). Belangrijk is dat fosfolipiden uitgesloten deze experimenten, waardoor het onderzoek naar fysiologische en pat hophysiological zaaien mechanismen. Aldus toepassing van tau fibrillen leidt tot neuronale HSPG-gemedieerde opname en stimuleert aggregatie op een dosis-afhankelijke wijze die kan worden gekwantificeerd met FRET flowcytometrie (Figuur 5C). Daarnaast kan de test worden gebruikt voor therapeutische evaluatie van tau opname en zaaien blokkade in vitro gebruik van HEK 293T cellen tau biosensor. Zelfs bij afwezigheid van fosfolipiden, zowel recombinant fibrillen (figuur 5D) en P301S hersenen lysaten (figuur 5E) induceren tau aggregatie. Pre-incubatie van deze tau zaden met heparine (voorheen aangetoond dat het een krachtige remmer van HSPG-gemedieerde opname tau zijn), maar elimineert het zaaien capaciteit. Deze experimentele opzet kan worden toegepast op elk geneesmiddel (bijvoorbeeld antilichamen, kleine moleculen, etc.) en zouden snelle evaluatie van opname en / of zaden modificerende geneesmiddelen mogelijk.
guur 1 "src =" / files / ftp_upload / 53.205 / 53205fig1.jpg "/>
Figuur 1. FRET flowcytometrie gevoelig tau seeding activiteit 16 detecteert. Monoklonale HEK 293T cellen die tau-RD-CFP / YFP werden getransduceerd met recombinante of biologische monsters, geïncubeerd gedurende 24-48 uur, en op een enkele cel basis middels flowcytometrie geanalyseerd (A). Gestimuleerde cellen behouden tau-RD in een monomeer toestand (B), terwijl cellen behandeld met zaadhoudende materiaal weergave prominente insluitingen (C). Kwantitatieve beoordeling (gemiddelde ± SEM) van zaaien activiteit blijkt dat FRET stromingscytometrie is gevoelig voor femtomolaire concentraties (monomeer equivalent) recombinant entmateriaal en detectie omvat drie orden van grootte (D). Monomeer equivalente vertegenwoordigt de totale hoeveelheid eiwit aanwezig in het fibrillization reactie en niet corrigeren voor het incomplete &# 160; incorporatie van monomeer in geaggregeerde materiaal. Zo moet de concentratie van de werkelijke aggregaten (zaden) kleiner dan of gelijk aan het "monomeer equivalent". * Modified van Holmes en Furman et al. 16 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Gating strategie voor FRET stromingscytometrie. Cell populatie (A) en singlet / doublet (B) poorten getekend met flowcytometrie standaard methodologie. Een valse FRET poort (C) wordt getrokken van YFP enkele positieve cellen te elimineren YFP bleedthrough in de FRET filter. Een FRET gate (D) wordt opgebouwd uit lege liposoom behandelde cellen, zoalsdie achtergrond FRET is ≥1%. Een verschuiving van de bevolking in de FRET gate verschijnt na behandeling met zaad-positieve materiaal (E) en de verschuiving steeds prominent met hogere hoeveelheden zaad materiaal (F). Definitieve uitlezingen omvatten:. Procent FRET positiviteit, mediaan fluorescentie-intensiteit (MFI) van FRET-positieve gebeurtenissen, en de geïntegreerde FRET dichtheid (Integrated FRET Density = percentage positieve cellen * MFI) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Progressie van tau zaaien activiteit in P301S muizen 16. Zaaien activiteit (gemiddelde ± SEM) van hersenhomogenaten van P301S muizen blijkt op 1,5 maanden in de hersenstam (A) Neocortex (B), frontale kwab (C), en hippocampus (D). Echter, zaaien activiteit nooit waargenomen in tau knockout muizen (> 12 maanden). Zaaien activiteit toeneemt met de leeftijd en vooraf aan het verschijnen van andere gemeenschappelijke histologische merkers, waaronder MC1, AT8 en PG5 (E). * Overgenomen met toestemming van Holmes en Furman et al. 16 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Compatibiliteit van FRET flowcytometrie met menselijke biologische monsters 16. Bij het tau-RD-CFP / YFP biosensor cellen worden getransduceerd met 20 ug menselijk brein lysaat, robuuste zaaien (gemiddelde ± SEM) komt voor in alle geteste diseà Alzheimerse hersenen, terwijl vergelijkbare leeftijd en de ziekte van Huntington controle lysaten missen zaaien activiteit. * Modified van Holmes en Furman et al. 16 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. alternatieve toepassingen voor FRET flowcytometrie 16. Primair neuronen getransduceerd met lentivirus encoding tau-GVB en tau-YFP construeert. Bij afwezigheid van exogene zaden er geen zichtbare aggregatie (A), maar is in aanwezigheid van zaden (B). Neuronale biosensoren reageren dosisafhankelijk recombinant tau zaden, zelfs in de afwezigheid van fosfolipide-gemedieerde aflevering (C). Pre-incubatie van recombinant (D) of bische (E) zaadbronnen met heparine, een remmer van HSPG-gemedieerde opname tau zaad, put FRET reactievermogen van HEK 293T biosensor cellen. Kwantitatieve beoordeling displays (gemiddelde ± SEM). * Modified van Holmes en Furman et al. 16 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Cellijnen gebruikt FRET flowcytometrie. HEK 293T cellen worden gebruikt voor flowcytometrie setup. CFP single-positieve cellen worden gebruikt voor compensatie (*). YFP single-positieve cellen worden gebruikt om valse FRET signaal te elimineren door directe activatie van YFP met 405 nm excitatie. CFP / YFP dual-positieve cellen zijn FRET-compatibel en dienen alsde biosensor cellen. Klik hier om een grotere versie van deze tabel bekijken.
Tabel 2:. Stromingscytometer laser en filter instellingen Klik hier om een grotere versie van deze tabel bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De FRET flowcytometrie systeem hier beschreven is een krachtig hulpmiddel voor het snel en kwantitatief beoordelen van tau zaaien activiteit. Het vereist slechts een matige celkweek ervaring en een praktische kennis van FRET en flowcytometrie. Andere zaaien assays, zoals Thioflavine T - waarbij vertoont verbeterde fluorescentie indien gebonden aan beta sheet structuur - omslachtig en vereisen een zuivere, recombinant eiwit substraat. Bovendien zaaien in vitro assays voor tau slechts semi-kwantitatief en in het algemeen ongevoelig voor subnanomolaire niveaus van entmateriaal 23,24. Fret flowcytometrie, maar zorgt voor een kwantitatieve en prachtig gevoelige maatregel van zaaien activiteit van ofwel recombinant of biologische monsters. Bovendien kan aanpassing van de procedure het nuttig om diverse aandoeningen te bestuderen eiwit aggregatie maken.
Hoewel de hierin beschreven protocol gericht op tau enten zijn slechts eenvoudige aanpassingen nodig to zorgen voor een gebruiker om te zaaien activiteit monitoren van alternatieve vormen van proteopathic zaden. Zoals aangetoond in Holmes en Furman et al., Creëren van een monoklonaal cellijn stabiel tot expressie α-synucleïne herbergen van de ziekte-geassocieerde A53T mutatie hebben ofwel CFP en YFP mogelijk gevoelige detectie van zaaien activiteit van full-length α-synucleïne recombinant fibrillen 16 . Soortgelijke experimenten werden uitgevoerd met behulp huntingtine biosensor cellen, die ook effectief detecteren eiwit aggregatie. Dus, door alleen het wijzigen van het eiwit biosensor, lijstwerk flowcytometrie is compatibel met tal van zaad bronnen. Andere modificaties van de assay, waaronder behandelingsparadigma en celmodel, kan worden gebruikt om vergrimmen stromingscytometrie toepasselijker de beoordeling fysiologische mechanismen. In dit protocol werden zaden direct in biosensor cellen via liposomen gemedieerde transductie als een manier om de gevoeligheid te verhogen.
Het is belangrijk om noot echter dat dit geen vereiste. Tau aggregaten van recombinant of de muis biologische monsters nog kunnen zaaien biosensor cellen in afwezigheid van liposomen (Figuur 5). Zo, laboratoria die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van de fysiologische vermeerdering en / of opname mechanismen van tau zaden kunnen nog steeds gebruik van de test. Bovendien FRET flowcytometrie Geschikt primaire neuronale culturen. Door cellen te infecteren met CFP- en YFP-gecodeerde lentivirale constructen ten uitplaten, is efficiënte FRET responsiviteit bereikt bij nanomolaire concentraties na behandeling met recombinant tau fibrillen, zelfs bij afwezigheid van liposomen (Figuur 5). Samengenomen geven deze gegevens aan dat FRET flowcytometrie is nuttig voor het bestuderen van de fysiologische mechanismen van enten voor diverse proteïneaggregaten en in meerdere celkweekmodellen.
Terwijl de FRET flowcytometrie systeem is gebruiksvriendelijk en aanpasbaar, moeten bepaalde belangrijke stappen zijngevolgd om compatibiliteit te garanderen, met inbegrip van het monster voorbereiding en goede cel confluentie op het moment van de behandeling. Hoge intensiteit sonde ultrasoonapparaat van de hersenen exemplaren is van cruciaal belang voor een effectieve en optimale isolatie van zaaien activiteit. Tijdens de ontwikkeling en optimalisatie werd waargenomen dat deze methode meer dan 10 maal effectiever isoleren enten activiteit van P301S muizenhersenen opzichte van andere gebruikelijke technieken, bijv handheld homogenisatie. Het is mogelijk dat zeer grote tau aggregaten een relatief lage neiging zaaien, en probe sonicatie het meest effectief is voor het breken van deze aggregaten in kleinere, seed-compatibele fragmenten. Duur en frequentie van de geluidsgolven kunnen worden gewijzigd indien nodig, alhoewel de bovengenoemde instellingen worden aanbevolen voor gevoelige detectie van zaaien activiteit.
Cel confluentie op het moment van de behandeling is van groot belang, omdat de gevoeligheid en de gezondheid van de cellen beïnvloedt. Als cellen eenopnieuw te confluent, doen ze niet gemakkelijk nemen fosfolipiden en pootgoed, waardoor drastisch afneemt gevoeligheid. Als confluentie te laag is, kan toevoeging van fosfolipiden en entmateriaal giftig zijn. Empirische proeven blijkt dat een biosensor confluentie van 60-65% is optimaal voor behandeling en daaropvolgende respons.
Zoals vermeld in het protocol, worden compensatie algoritmen regelmatig gebruikt om de GVB-spill-kanalen uit te sluiten in de YFP en FRET, waardoor valse signalen te elimineren en het verhogen van de gevoeligheid. Voor een snellere en kwalitatieve beoordeling van zaaien activiteit, maar deze stap kan worden weggelaten of uitgevoerd post hoc met flowcytometrieanalyse software. Een schonere en meer robuuste signaal wordt verkregen na compensatie, echter, en daarmee voor de meest rigoureuze en kwantitatieve analyse van deze stap is een echte aanrader.
Een beperking van de test is het onvermogen om te rapporteren over de biochemische Samenstellingde proteopathic zaden. De huidige test meet zaaien activiteit, een functionele eigenschap van zaden. Bepaling van de biochemische en biofysische eigenschappen van de zaden koppeling met traditionele testen zoals immunoprecipitatie, chromatografie, circulair dichroïsme, massaspectrometrie etc. vereisen echter dit assay belang voor de evaluatie zaaien potentie als eindpunt van talloze monsters aantonen.
Deze test werd onlangs gebruikt te kwantificeren en karakteriseren van het tijdsverloop van de ontwikkeling en progressie zaaien in P301S muizen ten opzichte van andere gemeenschappelijke merkers tau-afzetting, zoals histologische kleuringen. In deze studie tau zaaien activiteit bleek meer dan zes weken voorafgaand aan de eerste histologische marker (MC1) testten we 16. Gezien de vroege verschijning, zaaien activiteit kan belangrijke aanvullende of zelfs alternatief uitkomst maat vormen voor het evalueren van de werkzaamheid van therapeutische interventies, althans voor voorbereidende studies.Door het verkorten van de behandeling cursus en het bestuderen van jonge dieren, woonlasten en experimentele doorlooptijd zal afnemen. Het is denkbaar dat therapeutische middelen kunnen worden toegediend aan P301S muizen 4-6 weken en hersenen 2-4 weken later geëvalueerd zaaien activiteit. Alternatief evaluatie van anti-tau therapeutica in cellen kunnen binnen dagen worden uitgevoerd door het bepalen van hun vermogen tot inductie van zaaien activiteit blokkeren biosensor cellen, zoals aangetoond in figuur 5.
Kortom, de FRET flowcytometrie zaaien test is een eenvoudige en efficiënte manier om tau zaaien detecteren van recombinant of biologische bronnen. De gevoeligheid is ongeëvenaard van andere in vitro tau zaaien assays, en kan worden toegepast op de vroegste pathologische verandering P301S tauopathie muizen te detecteren. Verder zijn flexibiliteit bij het toezicht op tal proteopathic zaden onder verschillende behandeling voorwaarden, en met meerdere celcultuur modellen, maakt het nuttig voorelke eiwitaggregatie laboratorium geïnteresseerd in snel het verzamelen van kwantitatieve gegevens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TBS | Sigma | T5912 | |
| cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free) | Roche | 4693159001 | |
| Cryo-vials | Sarstedt | 72.694.006 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 105DU | |
| Weighing Boats | Fisher Scientific | 13-735-743 | |
| 15 ml conical tube | USA Scientific | 1475-0501 | |
| Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer | Omni International | 18-000-115 | |
| Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer | Omni International | OR-T-156 | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A451 | |
| Noise Cancelling Ear Muffs | Fisher Scientific | 19-145-412 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | S47299 | |
| 1.5 ml tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 000.215 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 50 ml Conical Tubes | Phenix Research | SS-PH15 | |
| 25 ml reagent resevoirs | VWR | 41428-954 | |
| Multi channel pipet | Fisher Scientific | TI13-690-049 | |
| 96 well flat bottom plates | Corning | 3603 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3788 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |
| Sorvall ST 40 Centrifuge | Thermo Scientific | 75004509 | |
| BIOLiner Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003796 | |
| Hemacytometer | VWR | 15170-172 | |
| MACSQuant VYB Flow Cytomter | Miltenyi Biotec | 130-096-116 | |
| Chill 96 Rack | Miltenyi Biotec | 130-094-459 | |
| Flow Jo analysis software | Flow Jo | ||
| 20 μl pipet tips | Rainin | GPS-L10 | |
| 200 μl pipet tips | Rainin | GPS-250 | |
| 1 ml pipet tips | Rainin | GPS-1000 | |
| 200 μl pipet tips | USA Scientific | 1111-1800 | |
| 5 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-606180 | |
| 10 ml serological pipett | Phenix Research | SPG-607180 | |
| 25 ml Serological pipett | Phenix Research | SPG-760180 |
References
- Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks. Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).
- Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. Predicting Regional Neurodegeneration from the Healthy Brain Functional Connectome. Neuron. 73 (6), 1216-1227 (2012).
- Raj, A., Kuceyeski, A., Weiner, M. A Network Diffusion Model of Disease Progression in Dementia. Neuron. 73 (6), 1204-1215 (2012).
- Braak, H., Braak, E.
- Braak, H., Braak, E. Staging of Alzheimer's disease-related neurofibrillary changes. Neurobiol Aging. 16 (3), 271-278 (1995).
- Frost, B., Diamond, M. I.
- Holmes, B. B., Diamond, M. I.
- Kaufman, S. K., Diamond, M. I. Prion-like propagation of protein aggregation and related therapeutic strategies. Neurotherapeutics. 10 (3), 371-382 (2013).
- Holmes, B. B., Diamond, M. I. Prion-like properties of Tau protein: the importance of extracellular Tau as a therapeutic target. J Biol Chem. 289 (29), 19855-19861 (2014).
- Guo, J. L., Lee, V. M. Cell-to-cell transmission of pathogenic proteins in neurodegenerative diseases. Nat Med. 20 (2), 130-138 (2014).
- Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
- Guo, J. L., Lee, V. M. Y. Seeding of normal tau by pathological tau conformers drives pathogenesis of Alzheimer-like tangles. Journal of Biological Chemistry. , (2011).
- Holmes, B. B., et al. Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), E3138-E3147 (2013).
- de Calignon, A., et al. Propagation of Tau Pathology in a Model of Early Alzheimer's Disease. Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).
- Liu, L., et al. Trans-Synaptic Spread of Tau Pathology In Vivo. PLoS One. 7 (2), e31302 (2012).
- Holmes, B. B., et al. Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), E4376-E4385 Forthcoming.
- Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65 (65), (2012).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. J Vis Exp. (33), (2009).
- Yan, Z. X., Stitz, L., Heeg, P., Pfaff, E., Roth, K. Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies. Infect Control Hosp Epidemiol. 25 (4), 280-283 (2004).
- McDonnell, G., et al. Cleaning, disinfection and sterilization of surface prion contamination. J Hosp Infect. 85 (4), 268-273 (2013).
- Banning, C., et al. A flow cytometry-based FRET assay to identify and analyse protein-protein interactions in living cells. PLoS One. 5 (2), e9344 (2010).
- Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein. Biochemistry. , (2013).
- Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein. J Vis Exp. (95), e51537 (2015).
