Protocol
1. Electroporation للمن الخلايا الليفية مع كلا التعبير ناقلات EYFP-باركين وpDsRed2-ميتو
- تنمو الماوس خلدت الخلايا الليفية الجنينية في 10 سنتيمتر لوحة الأنسجة الثقافة باستخدام DMEM (Dulbecco لتعديل المتوسطة النسر) متوسطة تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني، 2 مليمول / لتر L-الجلوتامين، و 100 U / البنسلين مل، و 100 ملغ / مل الستربتومايسين في جو مرطب يحتوي على 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية.
- في 80٪ confluency الخلية، تجاهل المتوسطة DMEM كاملة عن طريق الشفط معقمة وإضافة 10 مل من 1X العقيمة حل العازلة الفوسفات (PBS) (80 غرام من كلوريد الصوديوم، 2.0 غرام من بوكل، 14.4 غراما من نا 2 هبو 4، 2.4 غرام من KH 2 ص 4 و 1 لتر المقطر H 2 O، PH: 7.4).
- تجاهل برنامج تلفزيوني عن طريق الشفط المعقم وإضافة 1 مل من التربسين-EDTA 0.25٪. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية حتى يتم فصل الخلايا (2-3 دقيقة). إضافة 4 مل من المتوسط DMEM كاملة، resuspend الخلايا وإخراج 10 _6؛ لتر من تعليق خلية لمدة العد عدادة الكريات.
ملاحظة: تم تصميم عدادة الكريات حتى أن عدد الخلايا في مجموعة واحدة من 16 الساحات الزاوية يساوي عدد الخلايا × 10 4 / مل.
- البذور 1 × 10 6 الخلايا على 10 سم أطباق زراعة الأنسجة 24 ساعة السابقة لعملية Electroporation لل.
- تجاهل المتوسطة DMEM كاملة عن طريق الشفط معقمة وإضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة. تجاهل برنامج تلفزيوني عن طريق الشفط المعقم وإضافة 1 مل من التربسين-EDTA 0.25٪. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية حتى يتم فصل الخلايا (2-3 دقيقة). إضافة 4 مل من المتوسط DMEM كاملة وresuspend الخلايا في أنبوب 15 مل.
- تدور الخلايا في أسفل 250 x ج لمدة 5 دقائق باستخدام الطرد المركزي المبردة (4 درجة مئوية). تجاهل طاف بواسطة الشفط المعقم و resuspend بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة. تدور الخلايا في أسفل 250 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- تجاهل طاف بواسطة الشفط العقيمة، وإضافة 100 ميكرولتر سو مزيج حل ل electroporation (82 ميكرولتر من Electroporation للحلول V + 18 ميكرولتر من حل التكميلي 1) إلى الخلية بيليه و resuspend بلطف بيليه بواسطة pipetting (لمزيد من التفاصيل يرجى الرجوع إلى دليل المستخدم). إضافة 2 ميكروغرام من EYFP-باركين (الإثارة / الانبعاثات 514/527) و 1 ميكروغرام pDsRed2-ميتو (الإثارة / الانبعاثات 565/620) في تعليق خلية.
- نقل الحل لكفيت معقمة باستخدام باستور المتاح (ترد على حد سواء الأدوات مع عدة) وelectroporate باستخدام برنامج محدد سلفا المعاهد الوطنية للصحة / 3T3 U-030 (نبض واحد، والجهد 200 V، سعة 960 μF، الساعة نبض 20 ميلي ثانية ، عدد النبض: 1).
- مباشرة بعد Electroporation لل، إضافة 500 ميكرولتر من المتوسط قبل تحسنت الطازجة DMEM كاملة والبذور الخلية على 6 سم لوحة نسيج الثقافة الحية التصوير الصف واحتضان لهم في جو مرطب يحتوي على 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
2. الوقت الفاصل بين الفيديو المجهر
- في هذه المرحلة، وإعداد وسيلة محددة التصوير الحي للمضي قدما في البروتوكول التجريبي. إعداد المتوسطة التصوير الحي على النحو التالي؛ مزيج DMEM خالية من الفينول تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني، 2 مليمول / لتر L-الجلوتامين، و 100 U / البنسلين مل، و 100 ملغ / مل الستربتومايسين. قبل تدفئة المتوسطة التصوير الحي عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
- تجاهل المتوسطة من الخلايا electroporated عن طريق الشفط المعقم وإضافة 1 مل من قبل حرارة متوسطة التصوير الحي، وذلك باستخدام الماصة P1000 واحتضان لوحة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- خلال الفترة وحة الحضانة، وتدفق 5٪ CO 2 في غرفة المجهر بالفعل عند درجة حرارة ثابتة من 37 درجة مئوية.
- وضع لوحة مع الخلايا electroporated إلى غرفة المجهر تجنب الحركات الكبرى أو اهتزازات.
- باستخدام واجهة البرنامج، تعيين المجهر من أجل كشف كل fluoreإشارات مسرح الحادث من البروتينات الانصهار المشفرة بواسطة ناقلات-transfected المشترك، EYFP-باركين (المدى الإثارة 495-510 نانومتر، ومجموعة الانبعاثات 520-550 نانومتر والأخضر) وpDsRed2-ميتو (الإثارة القصوى 558 نانومتر، والانبعاثات الحد الأقصى 583 نانومتر، أحمر).
- فتح الوقت الفاصل بين برامج الفيديو المجهر. في القائمة العلوية تحديد FITC لEYFP-باركين والرودامين لpDsRed2-ميتو. في القائمة العلوية اختر التكبير (20X).
- باستخدام واجهة البرنامج، والبحث عن خلية واحدة التعبير عن كل ناقلات-transfected المشترك وتسجيل موقف. كرر هذه الخطوة حتى يتم جمع ما لا يقل عن 10 خلايا لكل حالة تجريبية (المجموعة التجريبية).
- اختر من القائمة "تطبيقات" وانقر على موضوع اكتساب الأبعاد. في موضوع النوافذ اكتساب الأبعاد تحديد المعايير اللازمة، مثل عدد من عمليات الاستحواذ، لفترة من الزمن بين كل الاقتناء وموضع الخلية المسجلة. انقر على "اكتساب"لبدء عملية الاستحواذ.
- بدء اكتساب القاعدية كل من EYFP-باركين وDsRed2-ميتو إشارة الفلورسنت جمع الصور في كل 5 دقائق لفترة الإجمالي لمدة 15 دقيقة.
- إعداد قبل تحسنت المتوسطة التصوير الحي مع تركيز FCCP أعلى مرتين من تركيز العمل النهائية (0،1 حتي 10 ميكرومتر، نوع التي تعتمد على خلية).
- مقاطعة عملية اكتساب وإضافة بلطف 1 مل من قبل تحسنت المتوسطة التصوير الحي مع FCCP في لوحة داخل غرفة المجهر باستخدام الماصة P1000.
- استئناف عملية الاستحواذ كما هو موضح سابقا، لمدة إجمالية قدرها 3 ساعات، وذلك باستخدام موقف المسجلة. حفظ جميع الصور المكتسبة من أجل تحليلها وإنشاء شريط فيديو لعملية mitophagic عند شراء أكثر من.
3. تحليل
- جمع كل الصور تم الحصول عليها في شكل "و tiff" على جهاز كمبيوتر شخصي
- فتح الصور مع لينة الرسموير وتحديد الفترة الزمنية وقعت من الميتوكوندريا التي يسببها الاستقطاب مع FCCP إلى الصورة الأولى تظهر تجنيد باركين في غشاء الميتوكوندريا (يتم الحصول على الصور كل 5 دقائق). كرر هذا التحليل لكل خلية في المجموعة التجريبية.
- تسمية الخلية الأولى من العمود على جدول مع اسم المجموعة التجريبية. لكل المجموعة التجريبية، وقياس فترات الزمنية لتجنيد باركين ما لا يقل عن 10 الخلايا. جعل متوسط فترات الزمنية المحسوبة لتجنيد باركين وتحديد الانحراف المعياري لكل مجموعة تجريبية (متوسط ± SD، ن = 10).
- تنظيم في أعمدة فترات زمنية محسوبة واحدة. يحتوي كل عمود ن = 10 قياسات صالح المجموعة التجريبية.
- حدد وظيفة "المتوسط" من القائمة بناء الصيغة. حدد البيانات في العمود. حدد وظيفة "الانحراف المعياري" من القائمة بناء الصيغة. سيليط البيانات في العمود.
- باستخدام المنهج الإحصائي، مقارنة المجموعات التجريبية تطبيق الإحصائية المناسبة من أجل تحديد فرق كبير في ديناميكية mitophagy بين المجموعات التجريبية. (على سبيل المثال، مجموعتين = الطالب اختبار t أو ثلاثة أو أكثر من مجموعات = أنوفا بالإضافة إلى اختبار ما بعد خاص)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا، وتبين لنا كم من الوقت الفاصل بين الفيديو المجهري هو أسلوب القوية التي يمكن استخدامها لمتابعة الأحداث الجزيئية من البروتينات fluorescently الموسومة في خلية واحدة. تظهر نتائج ممثلة أيضا كيف تسمح هذه التقنية لاقتناء صور ذات جودة عالية. عندما يتم الحصول على الصور من عملية الجزيئية، لدينا الفرصة لتحليلها بطرق مختلفة. هنا، نحن نحلل الفترة الزمنية بين بدء عملية mitophagy التي يسببها، والتي هي عملية الجزيئية الحيوية التي تحافظ على التوازن الخلوي إزالة انتقائي الميتوكوندريا المتضررة.
هذه التقنية يؤسس مجموعة واسعة من التطبيقات. ويمكن استخدامه إما لرصد عملية الخلوية الماكرو مثل الهجرة الخلية أو الأحداث الجزيئية الصغيرة من خلال وضع العلامات من الجزيئات الرئيسية المشاركة في العملية التي لابد من دراستها.
س: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> بوساطة باركين-Mitophagy
ولخص انتقائية إزالة بوساطة باركين لعملية الميتوكوندريا التالفة وغير فعالة في الشكل رقم 1، حيث الاستقطاب غشاء الناجمة عن وكيل فك ربط FCCP يطلق انتقائية mitophagy بوساطة باركين، تجنيد PINK1 لغشاء الميتوكوندريا الخارجي. التالية، يتم تجنيده باركين إلى الميتوكوندريا التالفة ويتفاعل مع PINK1. هذا المجمع باركين-PINK1 يؤدي إلى ubiquitination من عضية التالفة وإدماجه في أي جسيم بلعمي ذاتي، الذي يتماهى في يحلول. وتعتبر هذه العملية المعروفة باسم mitophagy أن تكون عملية التمثيل الغذائي حاسمة من اجل الحفاظ على البيئة الخلوية صحية والسماح للتجديد من الميتوكوندريا وظيفية 8،15.
بروتوكول تجريبي
الإقليم الشمالي "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> ويبين الشكل 2 تمثيل تخطيطي للبروتوكول تجريبي والمجهر انشاء المستخدمة لمتابعة توظيف EYFP-باركين قبل وبعد عملية mitophagy يسببها FCCP.باركين التوظيف لاستقطابها الميتوكوندريا الغشاء
في الشكل 3A، وتبين لنا توزيع باركين إدارة سابق وآخر FCCP. وخلال لحظات زمنية القاعدية (BT5، BT10 وBT15 دقيقة) تتفرق EYFP-باركين (الأخضر) متجانس في جميع أنحاء الخلية ويظهر شبكة الميتوكوندريا (الأحمر) لتكون مترابطة بشكل جيد. بعد تناوله FCCP (FT = 0 دقيقة) (الشكل 3B)، نلاحظ تجزئة الميتوكوندريا (FT = 5 دقائق). ومع ذلك، لا تزال منتشرة EYFP-باركين متجانس على الرغم من السيتوبلازم. يتم تحفيز Mitophagy في 55 دقيقة البعدي FCCP،يتم تجنيده EYFP-باركين في أغشية الميتوكوندريا المتضررة لتحريك عملية mitophagy (FT = 55).
يحدث الشكل 1. التمثيل التخطيطي Mitophagy بوساطة باركين. وتناقص غشاء المحتملة (Ψm) في الميتوكوندريا التالفة أو مختلة ويمكن أن يتسبب من قبل وكيل فك ربط FCCP. فقدان غشاء المحتملة يطلق انتقائية mitophagy بوساطة باركين، تجنيد PINK1 (الأحمر) لغشاء الميتوكوندريا الخارجي. يتم تجنيده باركين (الأزرق) إلى الميتوكوندريا التي تضررت من التفاعل مباشرة مع PINK1. وجود باركين يؤدي إلى ubiquitination (الاصفر) من عضية التالفة وإدماجه في أي جسيم بلعمي ذاتي، الذي يتماهى في يحلول. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. مجهر مجموعة المتابعة والتمثيل من البروتوكول التجريبي. (A) لمحة عامة عن الأحداث التجريبية الموضحة في قسم البروتوكول. الأحداث التجريبية ذكرت تسمح للمشغل عابر شارك في transfect الخلايا مع EYFP-باركين وpDsRed2-ميتو من قبل Electroporation للمن أجل متابعة عملية mitophagy الناجم عن FCCP باستخدام (ب) انشاء لمرور الزمن نهج الفيديو المجهر. BT = نقطة زمنية القاعدية. FT = FCCP نقطة زمنية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الخلايا الليفية خلية عرض باركين Recruitme الإقليم الشمالي بعد الميتوكوندريا غشاء الاستقطاب المستحث بواسطة FCCP.-باركين EYFP (الأخضر) النبات في الميتوكوندريا (الحمراء) رصدته الوقت الفاصل بين المجهري الفيديو خلال نقطة زمنية القاعدية (BT) والرد على إدارة FCCP (FT). من BT = 0، تم الكشف عن EYFP-باركين ومضان الميتوكوندريا كل 5 دقائق. (A) EYFP-باركين تنتشر متجانس عبر فترة القاعدية كلها وشبكة الميتوكوندريا هي سليمة (السهام البيضاء). يتم تسجيل (ب) تجزئة الميتوكوندريا بسبب الاستقطاب الغشاء FCCP في FT = 5 دقيقة (السهام البيضاء) وتجنيد EYFP-باركين لأغشية الميتوكوندريا المتضررة بدأت في FT = 55 دقيقة (السهام البيضاء). تمثل المربعات البيضاء في منطقة تضخيم لوحات (5X). لمزيد من التفاصيل بشأن تطبيق هذا البروتوكول التجريبي الرجوع إلى مرجع 8. (مقياس شريط: 10 ميكرومتر).> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويمكن تعريف الوقت الفاصل بين المجهري كتقنية الذي يمتد التصوير الخلية الحية من ملاحظة واحدة في الوقت المناسب لمراقبة ديناميات الخلوية على مدى فترات طويلة من الزمن. وهذه المنهجية المتميزة من متحد البؤر بسيط أو المجهر الخلايا الحية لأنه يسمح للمراقب لتحديد في الوقت الحقيقي بروتين فلوري الموسومة احد ومتابعة ديناميكية في داخل الخلية الحية واحدة. في الواقع، لا يمكن للمتحد البؤر المجهري تحدد بسهولة البروتينات المسمى المناعية باستخدام الأجسام المضادة الفلورسنت، لكنه لا يسمح مراقبة الخلية والحدث الجزيئية في بيئته المباشرة.
يتم استخدام الوقت الفاصل بين الفيديو المجهري في المقام الأول في مجال البحوث رصد العمليات الجزيئية في أنواع مختلفة الخلية مثل HEK293 16، الخلايا العصبية الأولية 17 و خلايا هيلا 18 ولكن لديه أيضا التطبيق السريري مثل الحمل وتوقع عدم توازن الصبغيات 19،20. يوفر الوقت الفاصل بين المجهري embryologISTS مع معلومات إضافية حول تطور الجنين عن الحمل السريري، وأنه من الممكن أن هذه المعلومات يمكن أن تستخدم لتحسين قدرتنا على تحديد الأجنة قابلة للنقل. وتشمل مزايا إضافية لاستخدام المجهر الوقت الفاصل بين أقل التعامل مع الأجنة وأطباقهم عن الملاحظات وسيطة، والتي من شأنها أن تقلل من خطر فقدان أو التلوث داخل المختبر 19.
الخلايا قادرة على الحفاظ على توازن الميتوكوندريا صحي من خلال المهينة الميتوكوندريا التالفة وغير فعالة من خلال mitophagy. يرتبط mitophagy معيب لمرض الشلل الرعاش 21، موت الخلايا المبرمج 22، والشيخوخة والسرطان 23 24. والدافع Mitophagy من قبل يغاز اليوبيكويتين باركين وPINK1 21. نظرا لأهمية هذه العملية للحفاظ على الوضع الميتوكوندريا صحي، وجدنا أنه من المهم لدراسة ديناميكية هذا الحدث باستخدام الوقت الفاصل بين الفيديو المجهر. الموالية المقترحةtocol وتقديم أدلة على كيف يتأثر التوازن الميتوكوندريا في ظل ظروف الخلوية المختلفة، بما في ذلك التغيرات في وظائف الجينات والبروتينات.
في هذه الدراسة، ونحن transfected عابر الخلايا الليفية التي كتبها Electroporation لل. ينطبق على طريقة Electroporation للنبضة كهربائية في الجهد الأمثل دائم بضعة ميكروثانية إلى تعليق خلية من أجل زيادة نفاذية غشاء الخلية عن طريق الإخلال طبقة ثنائية فسفوليبيد الغشاء. النتائج هذا الإجراء في تشكيل المسام مؤقتة. يسمح permeabilization غشاء الحمض النووي لإدخالها في خلية 25. لقد اخترنا هذه العملية ل transfect عابر الخلايا الليفية من أجل الحصول على كفاءة ترنسفكأيشن أعلى من كل من البلازميدات EYFP-باركين وpDsRed2-ميتو. في الواقع، فإن عملية Electroporation للما يقرب من عشر مرات أكثر فعالية من ترنسفكأيشن الكيميائية 26. عملية الاستحواذ الصور يمكن المساومة عليها من قبل كل من يكستيالعوامل rnal. التقلبات في درجات الحرارة والاهتزازات والرطوبة والعوامل الداخلية؛ درجة الحموضة، حركية الخلية. وElectroporation للوتتبع الفلورسنت نوعان من الخطوات التي تعتبر الأكثر أهمية لنجاح هذا البروتوكول التجريبي. حتى لو كانت كفاءة ترنسفكأيشن هو أعلى من الأساليب الأخرى، وElectroporation لليقتل ~ 20٪ من الخلايا electroporated. قضية رئيسية أخرى هي نوعية اقتناء الصور أثناء الخطوة الرصد. منذ البيئة الخلوية هو دينامية، الطائرة التركيز يحتاج تعديلات مستمرة من أجل الحفاظ على التركيز طوال عملية الاستحواذ.
يمكن أن يكون سبب الضرر الميتوكوندريا من الاستقطاب الميتوكوندريا الغشاء والاكسدة. هذه العوامل تحفز استجابة mitophagic. دليل على أن الميتوكوندريا الاستقطاب يمكن أن تحدث mitophagy انتقائية يأتي من التجارب photodamage التي تؤدي إلى إنتاج روس وإصابة الميتوكوندريا 27-30. من أجل حمل ذاكرة الميتوكوندرياالاستقطاب الغشاء والاستجابة mitophagic، وقد استخدم FCCP كما protonophore 10. FCCP هو حامل الأيون الذي يسمح البروتونات لعبور طبقات ثنائية الدهون يحفز الغشاء الاستقطاب. باستخدام هذا النهج الذي يسببها mitophagy ويتبع ديناميكية الواسمات الجزيئية.
تركيز FCCP أمر بالغ الأهمية، لأنها يمكن أن تكون السامة للخلايا وتعزيز الموت الخلوي. وبما أن هذا النهج يعتمد على الملاحظة من الخلايا الحية، وتركيز النهائي من FCCP لابد من تعديلها بطريقة تعتمد على نوع من الخلايا من أجل حمل mitophagy دون تحريك الآليات التي تؤدي إلى الموت الخلوي.
وبشكل عام، فإننا نعتقد أنه في أعقاب ديناميكية mitophagy، وذلك باستخدام EYFP-باركين كعلامة الفلورسنت، وتقديم رؤى جديدة في وظيفة الميتوكوندريا. إزالة انتقائية من الميتوكوندريا عبر mitophagy هي عملية حاسمة في الحفاظ على جودة الميتوكوندريا، بقاء الخلية والتوازن. هذا النهج التصوير الحي وقال انهليرة لبنانية لفهم عملية mitophagic في ظل ظروف صحية واكد.
الاتجاهات الحديثة وكذلك تمديد الوقت الفاصل بين الملاحظات المجهر وراء صناعة الأفلام من ديناميات الخلوية. على نحو متزايد وعدم وضوح هذه الحدود يتم دمج تقنيات cytometric مع تقنيات التصوير لرصد وقياس أنشطة حيوية الخلايا والهياكل التحت خلوية 31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning Life Science | 10-013-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Phenol-free DMEM | Corning Life Science | 17-205-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Pre-warm at 37 °C before use |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Penicillin/streptomycin | Corning Life Science | 30-002-CI | Pre-warm at 37 °C before use |
| EYFP-PARKIN expression vector | Addgene | 23955 | |
| pDsRed2-Mito expression vector | Clontech | 632421 | |
| Nucleofector 2B device | LONZA | AAD-1001S | |
| Nucleofector for kit R NIH/3T3 | LONZA | VCA-1001 | |
| ZEISS AXIOVERT 200M inverted microscope | CARL ZEISS | ||
| Carbonyl Cyanide 4-(trifluoromethoxy)-Phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Experimental Builder | |
| ImageJ | National Institute of Health | Experimental Builder |
References
- Youle, R. J., Narendra, D. P.
- Zhi, X., Zhong, Q.
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biol Chem. 393, 547-564 (2012).
- Lemasters, J. J. Selective mitochondrial autophagy, or mitophagy, as a targeted defense against oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and aging. Rejuvenation Res. 8, 3-5 (2005).
- Kissova, I., Deffieu, M., Manon, S., Camougrand, N. Uth1p is involved in the autophagic degradation of mitochondria. J Biol Chem. 279, 39068-39074 (2004).
- Kubli, D. A., Gustafsson, A. B. Mitochondria and mitophagy: the yin and yang of cell death control. Circ Res. 111, 1208-1221 (2012).
- Redmann, M., Dodson, M., Boyer-Guittaut, M., Darley-Usmar, V., Zhang, J. Mitophagy mechanisms and role in human diseases. Int J Biochem Cell Biol. 53, 127-133 (2014).
- Di Sante, G., et al. Loss of sirt1 promotes prostatic intraepithelial neoplasia, reduces mitophagy, and delays park2 translocation to mitochondria. Am J Pathol. 185, 266-279 (2015).
- Tanaka, A. Parkin-mediated selective mitochondrial autophagy, mitophagy: Parkin purges damaged organelles from the vital mitochondrial network. FEBS Lett. 584, 1386-1392 (2010).
- Shiba-Fukushima, K., et al. PINK1-mediated phosphorylation of the Parkin ubiquitin-like domain primes mitochondrial translocation of Parkin and regulates mitophagy. Sci Rep. 2, 1002 (2012).
- Trinh, J., Farrer, M.
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
- Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochem Biophys Res Commun. 7, 272-275 (1962).
- Karan, G., Yang, Z., Zhang, K. Expression of wild type and mutant ELOVL4 in cell culture: subcellular localization and cell viability. Mol Vis. 10, 248-253 (2004).
- Jin, S. M., Youle, R. J. PINK1- and Parkin-mediated mitophagy at a glance. J Cell Sci. 125, 795-799 (2012).
- Kerr, M. C., et al. Visualisation of macropinosome maturation by the recruitment of sorting nexins. J Cell Sci. 119, 3967-3980 (2006).
- Edin, F., et al. 3-D gel culture and time-lapse video microscopy of the human vestibular nerve. Acta Otolaryngol. 134, 1211-1218 (2014).
- Ramsden, A. E., Mota, L. J., Munter, S., Shorte, S. L., Holden, D. W. The SPI-2 type III secretion system restricts motility of Salmonella-containing vacuoles. Cell Microbiol. 9, 2517-2529 (2007).
- Meseguer, M., et al. Embryo incubation and selection in a time-lapse monitoring system improves pregnancy outcome compared with a standard incubator: a retrospective cohort study. Fertil Steril. 98, 1481-1489 (2012).
- Campbell, A., et al. Modelling a risk classification of aneuploidy in human embryos using non-invasive morphokinetics. Reprod Biomed Online. 26, 477-485 (2013).
- Bingol, B., et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 510, 370-375 (2014).
- Carroll, R. G., Hollville, E., Martin, S. J. Parkin sensitizes toward apoptosis induced by mitochondrial depolarization through promoting degradation of Mcl-1. Cell Rep. 9, 1538-1553 (2014).
- Batlevi, Y., La Spada, A. R. Mitochondrial autophagy in neural function, neurodegenerative disease, neuron cell death, and aging. Neurobiol Dis. 43, 46-51 (2011).
- Frank, M., et al. Mitophagy is triggered by mild oxidative stress in a mitochondrial fission dependent manner. Biochim Biophys Acta. 1823, 2297-2310 (2012).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-845 (1982).
- Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophys Chem. 19, 211-225 (1984).
- Lemasters, J. J. Variants of mitochondrial autophagy: Types 1 and 2 mitophagy and micromitophagy (Type 3). Redox Biol. 2, 749-754 (2014).
- Aggarwal, B. B., Quintanilha, A. T., Cammack, R., Packer, L. Damage to mitochondrial electron transport and energy coupling by visible light. Biochim Biophys Acta. 502, 367-382 (1978).
- Alexandratou, E., Yova, D., Handris, P., Kletsas, D., Loukas, S. Human fibroblast alterations induced by low power laser irradiation at the single cell level using confocal microscopy. Photochem Photobiol Sci. 1, 547-552 (2002).
- Kim, I., Lemasters, J. J. Mitophagy selectively degrades individual damaged mitochondria after photoirradiation. Antioxid Redox Signal. 14, 1919-1928 (2011).
- Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions. J Cell Sci. 126, 3805-3815 (2013).
