Protocol
1. Elektroporatie van fibroblast met Beide Expression Vectors EYFP-Parkin en pDsRed2-Mito
- Groeien de onsterfelijk muis embryonale fibroblast cellen op 10 cm weefsel- kweekplaat met behulp DMEM (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium) medium aangevuld met 10% foetaal runderserum, 2 mmol / l L-glutamine, 100 U / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine in bevochtigde atmosfeer die 5% CO2 bij 37 ° C.
- Bij 80% cel confluentie, gooi de volledige DMEM medium met steriele afzuigen en voeg 10 ml steriele 1x fosfaatbufferoplossing (PBS) (80 g NaCl, 2,0 g KCl, 14,4 g Na 2 HPO 4, 2,4 g KH 2 PO 4 en 1 l gedestilleerd H2O, pH: 7,4).
- Gooi de PBS door steriele zuig- en voeg 1 ml trypsine-EDTA 0,25%. Incubeer de plaat bij 37 ° C totdat de cellen losgemaakt (2-3 min). Voeg 4 ml compleet DMEM medium, resuspendeer de cellen en nemen 10 _6, l van de celsuspensie voor de hemocytometer geteld.
OPMERKING: De hemocytometer is zo ontworpen dat het aantal cellen in één set van 16 hoekvelden is gelijk aan het aantal cellen x 10 4 / ml.
- Seed 1 x 10 6 cellen op 10 cm weefselcultuurschalen 24 uur voorafgaand aan de elektroporatie werkwijze.
- Gooi de volledige DMEM medium met steriele zuig- en voeg 10 ml steriel PBS. Gooi de PBS door steriele zuig- en voeg 1 ml trypsine-EDTA 0,25%. Incubeer de plaat bij 37 ° C totdat de cellen losgemaakt (2-3 min). Voeg 4 ml compleet DMEM medium en resuspendeer de cellen in een 15 ml buis.
- Spin de cellen neer op 250 xg gedurende 5 min met behulp van een gekoelde centrifuge (4 ° C). Verwijder het supernatant door afzuigen steriel en resuspendeer de pellet in 1 ml steriel PBS. Spin de cellen neer op 250 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant door steriele afzuigen en voeg 100 ul of oplossing mix voor elektroporatie (82 ul van elektroporatie Solution V + 18 pl Aanvullende oplossing 1) naar de cel pellet en voorzichtig resuspendeer de pellet door pipetteren (Voor meer details, zie de handleiding van). Voeg 2 ug EYFP-Parkin (excitatie / emissie 514/527) en 1 ug pDsRed2-Mito (excitatie / emissie 565/620) aan de celsuspensie.
- Breng de oplossing aan de steriele cuvet met behulp van een wegwerp pasteur (beide instrumenten zijn voorzien van de kit) en electroporate met behulp van de vooraf ingestelde programma NIH / 3T3 U-030 (Single puls, spanning 200 V, capaciteit 960 uF, pulstijd 20 milliseconden , pulse nummer: 1).
- Onmiddellijk na de elektroporatie, voeg 500 ul vers voorverwarmde compleet DMEM medium en zaden de cel op een 6 cm weefsel kweekplaat live imaging-rang en incubeer ze in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 bij 37 ° C 24 uur.
2. Time-lapse video Microscopie
- Op dit moment stelt een specifieke levende beeldmedium te gaan met de experimentele protocol. Bereid de live-imaging medium als volgt; mix DMEM fenolvrij gesupplementeerd met 10% foetaal runderserum, 2 mmol / l L-glutamine, 100 U / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine. Pre-warm de levende beeldmedium bij 37 ° C in een waterbad.
- Gooi het medium van de geëlektroporeerde cellen door steriele afzuigen en voeg 1 ml voorverwarmde levende beeldmedium, met een P1000 pipet en incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Tijdens de plaat incubatieperiode instroom 5% CO 2 in de microscoop kamer al op een stabiele temperatuur van 37 ° C.
- Leg de plaat met de geëlektroporeerde cellen in de microscoop kamer van het vermijden van grote bewegingen of trillingen.
- Via de software-interface, zet de microscoop teneinde zowel fluore detecterenscene signalen van de fusie-eiwitten waarvoor het gecotransfecteerd vectoren, EYFP-Parkin (Excitatie bereik 495-510 nm en emissie bereik 520-550 nm, groen) en de pDsRed2-Mito (excitatiemaximum 558 nm en emissie maximum 583 nm, rood).
- Open de time-lapse video microscopie-software. In het bovenste menu de FITC voor EYFP-Parkin en Rhodamine voor pDsRed2-Mito. In het bovenste menu de vergroting (20X).
- Met behulp van de software-interface, kijk voor de enkele cel die zowel gecotransfecteerde vectoren en registreren van de positie. Herhaal deze stap tot een minimum van 10 cellen wordt verzameld voor elke experimentele conditie (experimentele groep).
- Selecteer het menu "Apps" en klik op Multi Dimensional Acquisition. In de multidimensionale Verwerving vensters selecteert de parameters die nodig zijn, zoals het aantal acquisities, het tijdsinterval tussen elke verwerving en de positie van de cel opgenomen. Klik op 'Acquire"Om de overname te starten.
- Start de basale overname van zowel EYFP-Parkin en DsRed2-Mito fluorescerend signaal verzamelen van beelden elke 5 minuten voor een totaal interval van 15 minuten.
- Bereid voorverwarmde live-imaging medium met een concentratie van FCCP twee keer hoger dan de uiteindelijke werking concentratie (0,1-10 pM, het type-afhankelijke cel).
- Onderbreekt het acquisitieproces en voeg voorzichtig 1 ml voorverwarmde levende beeldmedium met FCCP in de plaat in de microscoop kamer met een P1000 pipet.
- Start de acquisitieproces zoals eerder beschreven, een totale duur van 3 uur, met de vastgelegde positie. Bewaar alle verkregen beelden om ze te analyseren en een video van de mitophagic proces bij de overname is voorbij.
3. Analyse
- Verzamel alle verkregen beelden in ".tiff" formaat op een personal computer
- Open de foto's met een grafische zachteware en de temporele interval definiëren plaatsgevonden vanaf het mitochondriale geïnduceerde-depolarisatie met FCCP naar het eerste plaatje van de werving van Parkin in het mitochondriale membraan (De beelden worden elke 5 min verworven). Herhaal deze analyse voor elke cel in de experimentele groep.
- Label de eerste cel van de kolom op een spreadsheet met de experimentele groepsnaam. Voor elke experimentele groep, het meten van de tijdelijke intervallen voor Parkin aanwerving van een minimum van 10 cellen. Maak een gemiddelde van de berekende tijdsintervallen voor Parkin werving en bepalen de standaardafwijking voor elke experimentele groep (gemiddelde ± SD, n = 10).
- Organiseren in de kolommen van de enkele berekende tijdelijke intervallen. Elke kolom bevat n = 10 metingen van de experimentele groep.
- Selecteer de functie "gemiddelde" van de Formula Builder menu. Selecteer de gegevens in de kolom. Selecteer de functie "standaarddeviatie" van de Formula Builder menu. Select de gegevens in de kolom.
- Met behulp van een statistische benadering, vergelijk de experimentele groepen van de gepaste statistiek om een significant verschil in de dynamiek van mitofagie tussen de experimentele groepen definiëren. (Bijvoorbeeld, twee groepen = t-toets, drie of meer groepen = ANOVA plus een post-hoc test)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hierin tonen we hoe time-lapse microscopie video is een techniek die kan worden gebruikt om moleculaire gebeurtenissen van fluorescent-gemerkte eiwitten volgen in één cel. De representatieve resultaten laten ook zien hoe deze techniek zorgt voor het verkrijgen van beelden van hoge kwaliteit. Wanneer beelden van de moleculaire proces worden verkregen, hebben we de mogelijkheid om ze te analyseren op verschillende manieren. Hier analyseren we de tijd tussen start van de geïnduceerde mitofagie proces, dat het cruciale moleculaire proces dat de cellulaire homeostase selectief verwijderen van de beschadigde mitochondriën.
Deze techniek richt een breed scala van toepassingen. Het kan worden gebruikt voor het bewaken macro celprocessen zoals celmigratie of micro moleculaire gebeurtenissen uit de etikettering van de belangrijkste moleculen betrokken bij het proces dat moet worden onderzocht.
o: keep-together.within-page = "1"> Parkin-gemedieerde mitofagie
De selectieve Parkin-gemedieerde verwijdering van beschadigde en disfunctionele mitochondriën werkwijze wordt samengevat in figuur 1, waarbij een membraan depolarisatie geïnduceerd door de ontkoppeling middel FCCP veroorzaakt selectieve Parkin-gemedieerde mitofagie, werven PINK1 de buitenste mitochondriale membraan. Volgend, Parkin wordt aangeworven om de beschadigde mitochondria en de wisselwerking met PINK1. Dit complex Parkin-PINK1 leidt tot de ubiquitinering van de beschadigde organel en de opname in een autophagosome, die combineert met een lysosoom. Dit proces wordt mitofagie wordt beschouwd als een cruciaal stofwisseling om de cellulaire omgeving gezond te houden en de regeneratie van functionele mitochondria 8,15 zijn.
experimenteel Protocol
nt "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figuur 2 toont een schematische weergave van de experimentele protocol en de microscoop opstelling voor na het aantrekken van EYFP-Parkin voor en na FCCP geïnduceerde mitofagie proces.Parkin rekrutering van gedepolariseerd mitochondriale membraan
In figuur 3A, laten we zien Parkin distributie voorafgaand en na FCCP administratie. Gedurende de basale tijdstippen (BT5, BT10 en BT15 min) EYFP-Parkin (groen) homogeen verspreid gehele cel en de mitochondria netwerk (rood) goed lijkt verbonden te zijn. Na FCCP administratie (FT = 0 min) (Figuur 3B), zien we mitochondria fractionering (FT = 5 min). Echter, EYFP-Parkin nog homogeen verspreid al uit het cytoplasma. Mitofagie wordt gestimuleerd op 55 min na FCCP administratie,EYFP-Parkin wordt aangeworven in de beschadigde membranen aan de mitofagie proces (FT = 55) te activeren.
Figuur 1. Schematische weergave van Parkin-gemedieerde mitofagie. Een afnemend van membraanpotentiaal (Ψm) komt in beschadigde of disfunctioneel mitochondriën en kan worden geïnduceerd door de ontkoppeling middel FCCP. Verlies van membraanpotentiaal veroorzaakt selectieve Parkin-gemedieerde mitofagie, werven PINK1 (rood) naar de buitenste mitochondriale membraan. Parkin (Blauw) wordt aangeworven om de beschadigde mitochondria door directe interactie met PINK1. De aanwezigheid van Parkin leidt tot de ubiquitinering (geel) van de beschadigde organel en de opname in een autophagosome, die combineert met een lysosoom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Microscoop Set-up en de Vertegenwoordiging van de Experimentele Protocol. (A) Overzicht van de experimentele evenementen in de sectie protocol beschreven. De gemelde experimentele evenementen kan de bestuurder op transiënte co-transfecteren de cellen met EYFP-Parkin en pDsRed2-Mito door elektroporatie met het oog op de FCCP geïnduceerde mitofagie proces met behulp van een (B) set-up voor time-lapse video microscopie aanpak te volgen. BT = basale tijdstip; FT = FCCP tijdstip. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. fibroblastcellijn Resultaat Parkin Recruitme nt na mitochondriale membraan Depolarisatie geïnduceerd door FCCP. EYFP-Parkin (groen) translocatie in de mitochondria (rood) werd gevolgd door time-lapse video microscopie tijdens de basale tijdstip (BT) en post FCCP administratie (FT). Van BT = 0, EYFP-Parkin en mitochondriale fluorescentie werden ontdekt om de 5 min. (A) EYFP-Parkin is homogeen verspreid over het hele basale periode en het mitochondriale netwerk intact is (witte pijlen). (B) Mitochondrial fractionering als gevolg van membraandepolarisatie door FCCP wordt geregistreerd op FT = 5 min (witte pijlen) en EYFP-Parkin recruitment om beschadigde membranen begonnen bij FT = 55 min (witte pijlen). De witte dozen vertegenwoordigen de vergrote gebied van de panelen (5x). Voor meer informatie over de toepassing van deze experimentele protocol wordt verwezen naar referentie 8. (Schaal bar: 10 pm).> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Time-lapse microscopie kan worden gedefinieerd als de techniek die live cell imaging uitstrekt vanaf één observatie in de tijd om de waarneming van cellulaire dynamiek gedurende lange tijd. Deze methode onderscheidt zich van een eenvoudige confocale microscopie en levende cellen omdat het de waarnemer identificeren in real time een fluorescerend-gemerkt eiwit en volg de dynamische in een levende cel. In feite, kan het confocale microscopie gemakkelijk geïdentificeerd immunologisch gemerkte eiwitten met fluorescerende antilichamen, maar het staat niet toe dat het waarnemen van de cel en de moleculaire gebeurtenis in zijn productieomgeving.
De time-lapse microscopie video wordt vooral gebruikt voor onderzoek bewaken moleculaire processen in verschillende celtypes zoals HEK293 16, 17 primaire neuronen en Hela cellen 18 maar heeft ook klinische toepassing, zoals zwangerschap en voorspellen aneuploidie 19,20. Time-lapse microscopie biedt embryologists aanvullende informaties embryo ontwikkeling voor een klinische zwangerschap, en het is mogelijk dat deze informatie kan worden gebruikt om de capaciteit om levensvatbare embryo's te selecteren voor overdracht verbeteren. Bijkomende voordelen van het gebruik van Time-lapse microscopie omvatten minder handling van embryo's en hun gerechten voor intermediaire opmerkingen, die het risico van verlies of verontreiniging in het laboratorium 19 zou verminderen.
Cellen kunnen een gezonde mitochondriale homeostase door afbreken beschadigde disfunctionele mitochondriën tot mitofagie. Defecte mitofagie is gekoppeld aan de ziekte 21 van Parkinson, 22 apoptose, veroudering en kanker 23 24. Mitofagie wordt gedreven door de ubiquitine ligase Parkin en PINK1 21. Vanwege het belang van dit proces om een gezonde mitochondriale status te behouden, vonden we het belangrijk om de dynamiek van deze gebeurtenis registreren met een time-lapse video microscoop. De voorgestelde protocol zullen cijfers over de mitochondriën homeostase wordt beïnvloed onder verschillende cellulaire voorwaarden, met inbegrip van veranderingen in genexpressie en eiwit functies.
In deze studie hebben we fibroblasten transient getransfecteerd door elektroporatie. De elektroporatie werkwijze past een elektrische puls op een optimale spanning van enkele microseconden aan de celsuspensie om de permeabiliteit van de celmembraan verhogen door verstoring van de fosfolipide dubbellaag van het membraan. Deze actie resulteert in de vorming van tijdelijke poriën. Het membraan permeabilisatie maakt het DNA dat moet worden ingebracht in de cel 25. We kozen voor dit proces om kortstondig transfecteren fibroblasten om hogere transfectie-efficiëntie van zowel plasmiden EYFP-Parkin en pDsRed2-Mito hebben. In feite, de elektroporatie werkwijze ongeveer tien maal effectiever dan chemische transfectie 26. De afbeeldingen acquisitieproces kunnen worden aangetast door zowel external factoren; temperatuurschommelingen, trillingen, vochtigheid en interne factoren; pH, celmotiliteit. De elektroporatie en fluorescerende volgen twee stappen de belangrijkste factor voor het succes van deze experimentele protocol is. Zelfs als de transfectie-efficiëntie hoger is dan andere methoden, elektroporatie doodt ~ 20% van de cellen geëlektroporeerd. Een ander belangrijk punt is het verwerven kwaliteit van de beelden tijdens de bewakingsstap. Omdat de cellulaire omgeving is dynamisch, de focus vliegtuig moet continu aangepast om de focus tijdens het acquisitieproces handhaven.
Mitochondriale schade kan worden veroorzaakt door het membraan mitochondriale depolarisatie en oxidatieve stress. Deze factoren leiden tot een mitophagic reactie. Het bewijs dat mitochondriën depolarisatie selectieve mitofagie kan induceren komt uit photodamage experimenten die leiden tot de productie van ROS en mitochondriale letsel 27-30. Om mitochondriale mem inducerenmembraan depolarisatie en mitophagic reactie hierop heeft FCCP gebruikt als protonophore 10. FCCP is een ionofoor waarmee protonen lipide bilagen induceren membraandepolarisatie steken. Met deze aanpak we geïnduceerd mitofagie en volgde de dynamiek van de moleculaire merker.
De concentratie van FCCP cruciaal, omdat het cytotoxische kan bevorderen en celdood. Aangezien deze benadering berust op de waarneming van levende cellen, de eindconcentratie van FCCP heeft in een celtype afhankelijke wijze worden aangepast om mitofagie induceren zonder trigger mechanismen die leiden tot celdood.
Globaal genomen, we denken dat het volgen van de dynamiek van mitofagie, met behulp van EYFP-Parkin als een fluorescerende marker, zal nieuwe inzichten in mitochondriale functie te geven. De selectieve verwijdering van mitochondria via mitofagie is een cruciaal proces handhaven mitochondriale kwaliteit cellevensvatbaarheid en homeostase. Deze live-imaging aanpak zal hijlp de mitophagic proces in het kader van een gezonde en benadrukte voorwaarden te begrijpen.
Moderne benaderingen verdere uitbreiding van time-lapse microscopie waarnemingen buiten het maken van films van cellulaire dynamiek. In toenemende mate deze grens is wazig als cytometrische technieken worden geïntegreerd met beeldvormende technieken voor het monitoren en meten van dynamische activiteiten van cellen en subcellulaire structuren 31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning Life Science | 10-013-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Phenol-free DMEM | Corning Life Science | 17-205-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Pre-warm at 37 °C before use |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Penicillin/streptomycin | Corning Life Science | 30-002-CI | Pre-warm at 37 °C before use |
| EYFP-PARKIN expression vector | Addgene | 23955 | |
| pDsRed2-Mito expression vector | Clontech | 632421 | |
| Nucleofector 2B device | LONZA | AAD-1001S | |
| Nucleofector for kit R NIH/3T3 | LONZA | VCA-1001 | |
| ZEISS AXIOVERT 200M inverted microscope | CARL ZEISS | ||
| Carbonyl Cyanide 4-(trifluoromethoxy)-Phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Experimental Builder | |
| ImageJ | National Institute of Health | Experimental Builder |
References
- Youle, R. J., Narendra, D. P.
- Zhi, X., Zhong, Q.
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biol Chem. 393, 547-564 (2012).
- Lemasters, J. J. Selective mitochondrial autophagy, or mitophagy, as a targeted defense against oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and aging. Rejuvenation Res. 8, 3-5 (2005).
- Kissova, I., Deffieu, M., Manon, S., Camougrand, N. Uth1p is involved in the autophagic degradation of mitochondria. J Biol Chem. 279, 39068-39074 (2004).
- Kubli, D. A., Gustafsson, A. B. Mitochondria and mitophagy: the yin and yang of cell death control. Circ Res. 111, 1208-1221 (2012).
- Redmann, M., Dodson, M., Boyer-Guittaut, M., Darley-Usmar, V., Zhang, J. Mitophagy mechanisms and role in human diseases. Int J Biochem Cell Biol. 53, 127-133 (2014).
- Di Sante, G., et al. Loss of sirt1 promotes prostatic intraepithelial neoplasia, reduces mitophagy, and delays park2 translocation to mitochondria. Am J Pathol. 185, 266-279 (2015).
- Tanaka, A. Parkin-mediated selective mitochondrial autophagy, mitophagy: Parkin purges damaged organelles from the vital mitochondrial network. FEBS Lett. 584, 1386-1392 (2010).
- Shiba-Fukushima, K., et al. PINK1-mediated phosphorylation of the Parkin ubiquitin-like domain primes mitochondrial translocation of Parkin and regulates mitophagy. Sci Rep. 2, 1002 (2012).
- Trinh, J., Farrer, M.
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
- Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochem Biophys Res Commun. 7, 272-275 (1962).
- Karan, G., Yang, Z., Zhang, K. Expression of wild type and mutant ELOVL4 in cell culture: subcellular localization and cell viability. Mol Vis. 10, 248-253 (2004).
- Jin, S. M., Youle, R. J. PINK1- and Parkin-mediated mitophagy at a glance. J Cell Sci. 125, 795-799 (2012).
- Kerr, M. C., et al. Visualisation of macropinosome maturation by the recruitment of sorting nexins. J Cell Sci. 119, 3967-3980 (2006).
- Edin, F., et al. 3-D gel culture and time-lapse video microscopy of the human vestibular nerve. Acta Otolaryngol. 134, 1211-1218 (2014).
- Ramsden, A. E., Mota, L. J., Munter, S., Shorte, S. L., Holden, D. W. The SPI-2 type III secretion system restricts motility of Salmonella-containing vacuoles. Cell Microbiol. 9, 2517-2529 (2007).
- Meseguer, M., et al. Embryo incubation and selection in a time-lapse monitoring system improves pregnancy outcome compared with a standard incubator: a retrospective cohort study. Fertil Steril. 98, 1481-1489 (2012).
- Campbell, A., et al. Modelling a risk classification of aneuploidy in human embryos using non-invasive morphokinetics. Reprod Biomed Online. 26, 477-485 (2013).
- Bingol, B., et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 510, 370-375 (2014).
- Carroll, R. G., Hollville, E., Martin, S. J. Parkin sensitizes toward apoptosis induced by mitochondrial depolarization through promoting degradation of Mcl-1. Cell Rep. 9, 1538-1553 (2014).
- Batlevi, Y., La Spada, A. R. Mitochondrial autophagy in neural function, neurodegenerative disease, neuron cell death, and aging. Neurobiol Dis. 43, 46-51 (2011).
- Frank, M., et al. Mitophagy is triggered by mild oxidative stress in a mitochondrial fission dependent manner. Biochim Biophys Acta. 1823, 2297-2310 (2012).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-845 (1982).
- Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophys Chem. 19, 211-225 (1984).
- Lemasters, J. J. Variants of mitochondrial autophagy: Types 1 and 2 mitophagy and micromitophagy (Type 3). Redox Biol. 2, 749-754 (2014).
- Aggarwal, B. B., Quintanilha, A. T., Cammack, R., Packer, L. Damage to mitochondrial electron transport and energy coupling by visible light. Biochim Biophys Acta. 502, 367-382 (1978).
- Alexandratou, E., Yova, D., Handris, P., Kletsas, D., Loukas, S. Human fibroblast alterations induced by low power laser irradiation at the single cell level using confocal microscopy. Photochem Photobiol Sci. 1, 547-552 (2002).
- Kim, I., Lemasters, J. J. Mitophagy selectively degrades individual damaged mitochondria after photoirradiation. Antioxid Redox Signal. 14, 1919-1928 (2011).
- Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions. J Cell Sci. 126, 3805-3815 (2013).
