Protocol
1. Eletroporação de Fibroblasto com Ambos Expression Vectors EYFP-Parkin e pDsRed2-Mito
- Cresça o rato imortalizada células de fibroblastos embrionários de 10 centímetros placa de cultura de tecidos, utilizando meio DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbecco) suplementado com 10% de soro bovino fetal, 2 mmol / l de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, e 100 mg / mL estreptomicina, em atmosfera humidificada contendo 5% de CO2 a 37 ° C.
- Na confluência celular de 80%, descartar o meio DMEM completo por sucção estéril e adicionar 10 ml de solução tampão de fosfato de 1x estéril (PBS) (80 g de NaCl, 2,0 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2,4 g de KH 2 PO 4 e 1 L de H2O destilada, pH: 7,4).
- Descartar o PBS por sucção estéril e adicionar 1 mL de Tripsina-EDTA a 0,25%. Incubar a placa a 37 ° C até as células são separadas (2-3 minutos). Adicione 4 ml de meio DMEM completo, voltar a suspender as células e tirar 10 _6; L da suspensão de células para a contagem em hemocitómetro.
NOTA: O hemocitómetro é concebido de modo que o número de células em um conjunto de quadrados de canto 16 é equivalente ao número de células x 10 4 / ml.
- Semente de 1 x 10 6 células nas placas de 10 cm de cultura de tecidos de 24 horas antes do processo de electroporação.
- Descartar o meio DMEM completo por sucção estéril e adicionar 10 ml de PBS estéril. Descartar o PBS por sucção estéril e adicionar 1 mL de Tripsina-EDTA a 0,25%. Incubar a placa a 37 ° C até as células são separadas (2-3 minutos). Adicionar 4 ml de meio DMEM completo e ressuspender as células em um tubo de 15 ml.
- Rodar as células para baixo a 250 xg durante 5 min, utilizando a-centrifugadora refrigerada (4 ° C). Descartar o sobrenadante por aspiração estéril e ressuspender o sedimento em 1 ml de PBS estéril. Rodar as células para baixo a 250 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Descartar o sobrenadante por aspiração estéril, e adiciona-se 100 ul Of mix solução para eletroporação (82 ul de eletroporação Solução V + 18 ml de solução Suplementar 1) para o pellet celular e delicadamente ressuspender o sedimento pipetando (Para mais detalhes, consulte o manual do utilizador). Adicionar 2 ug de EYFP-Parkin (excitação / emissão de 514/527) e 1 ug pDsRed2-Mito (excitação / emissão de 565/620) a suspensão de células.
- Transferir a solução para a cuvete estéril usando um pasteur descartável (ambas as ferramentas são fornecidos com o kit) e electroporate usando o programa pré-definido NIH / 3T3 U-030 (pulso único, tensão de 200 V, capacitância 960 mF, tempo de pulso de 20 milissegundos , número de pulsos: 1).
- Imediatamente após a electroporação, adicionar 500 uL de meio DMEM completo pré-aquecido frescos e as sementes da célula em um-processamento de imagem de grau directo de 6 centímetros de cultura de tecidos de placa e incubar-los numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO2 a 37 ° C durante 24 horas.
2. Time-Lapse Vídeo Microscopy
- Neste ponto, se preparar um meio específico de imagens ao vivo para prosseguir com o protocolo experimental. Prepare o suporte de imagens ao vivo da seguinte forma; misturar DMEM isento de fenol suplementado com 10% de soro bovino fetal, 2 mmol / l de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, e 100 mg / ml de estreptomicina. Pré-aquecer o meio de imagens ao vivo a 37 ° C num banho de água.
- Descartar a forma das células electroporadas por sucção estéril e adicionar 1 ml de meio de imagens ao vivo pré-aquecido, usando uma pipeta P1000 e incubar a placa durante 30 minutos a 37 ° C.
- Durante o período de incubação da placa, influxo de 5% de CO 2 na câmara do microscópio já a uma temperatura estável de 37 ° C.
- Coloque a placa com as células electroporadas à câmara do microscópio evitar grandes movimentos ou oscilações.
- Utilizando o software de interface, definir o microscópio, a fim de detectar tanto fluorésinais scence de as proteínas de fusão codificadas pelos vectores co-transfectados, EYFP-Parkin (gama Excitação 495-510 nm e faixa de emissão de 520-550 nm, verde) e o pDsRed2-Mito (excitação máximo 558 nm e de emissão de máximo 583 nm, vermelho).
- Abra o software de vídeo microscopia de lapso de tempo. No menu superior, selecione a FITC para EYFP-Parkin e Rodamina para pDsRed2-Mito. No menu superior, selecione a ampliação (20x).
- Usando a interface do software, procure a única célula expressando ambos os vectores de co-transfectadas e registrar a posição. Repita este passo até um mínimo de 10 células são coletadas para cada condição experimental (grupo experimental).
- Selecione o menu "Aplicativos" e clique em Aquisição multi-dimensional. Nas janelas de aquisição multi dimensional seleccionar os parâmetros necessários, tais como o número de aquisições, o intervalo de tempo entre cada uma das aquisições e a posição da célula registada. Clique em "Adquirir"Para iniciar o processo de aquisição.
- Comece a aquisição basal de ambos EYFP-Parkin e sinal fluorescente DsRed2-Mito recolher imagens a cada 5 minutos para um intervalo total de 15 min.
- Prepare meio de imagem ao vivo pré-aquecido com uma concentração de FCCP duas vezes mais elevada do que a concentração final de trabalho (0,1-10 uM, dependentes de tipo de célula).
- Interromper o processo de aquisição e adicionar suavemente 1 ml de meio de imagens ao vivo pré-aquecido com FCCP para a placa dentro da câmara do microscópio utilizando uma pipeta P1000.
- Reiniciar o processo de aquisição, como anteriormente descrito, para um período total de 3 horas, utilizando a posição registada. Salve todas as imagens adquiridas, a fim de analisá-los e criar um vídeo do processo mitophagic quando a aquisição é longo.
3. Análise
- Recolha todas as imagens adquiridas em formato "tiff" em um computador pessoal
- Abra as imagens com um pano macio gráficoWare e definem o intervalo de tempo ocorreu a partir da mitocondrial induzida por despolarização com FCCP para a primeira imagem que mostra o recrutamento de Parkin na membrana mitocondrial (as imagens são adquiridas a cada 5 minutos). Repetir esta análise para cada célula no grupo experimental.
- Rotular a primeira célula da coluna, numa folha de cálculo com o nome do grupo experimental. Para cada grupo experimental, medir os intervalos temporais para Parkin recrutamento de um mínimo de 10 células. Realizar uma média dos intervalos temporais calculados para o recrutamento e Parkin definir o desvio padrão para cada grupo experimental (Média ± DP, n = 10).
- Organizar-se em colunas os intervalos temporais calculados individuais. Cada coluna contém o n = 10 medidas do grupo experimental.
- Seleccione a função de "médio" a partir do menu Formula Builder. Seleccionar os dados na coluna. Seleccione a função "Desvio Padrão" no menu Formula Builder. SeleCT os dados na coluna.
- Usando uma abordagem estatística, comparar os grupos experimentais que aplicam a estatística apropriada, a fim de definir uma diferença significativa na dinâmica de mitophagy entre os grupos experimentais. (Por exemplo, dois grupos = t de Student, três ou mais grupos = ANOVA além de um teste post-hoc)
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Representative Results
Aqui, mostramos como microscopia de lapso de tempo vídeo é uma técnica poderosa que pode ser usado para acompanhar os acontecimentos moleculares de proteínas fluorescentes-marcado em uma única célula. Os resultados representativos também mostram como esta técnica permite a aquisição de imagens de alta qualidade. Quando as imagens dos processos moleculares, são obtidas, que têm a oportunidade de analisá-los de modos diferentes. Aqui, analisamos o intervalo de tempo entre o início do processo de mitophagy induzida, que é o processo fundamental que molecular manter a homeostase celular remover selectivamente as mitocôndrias danificadas.
Esta técnica funda uma ampla gama de aplicações. Pode ser usado tanto para o acompanhamento macro processos celulares, tais como migração de células ou eventos moleculares micro, através da marcação das moléculas-chave envolvidas no processo que tem que ser estudado.
o: manter-together.within-page = "1"> Parkin mediada Mitophagy
A remoção selectiva Parkin-mediada de processo mitocôndrias danificado e disfuncional está resumida na Figura 1, onde uma despolarização da membrana induzida pelo agente de desacoplamento FCCP desencadeia mitophagy selectiva Parkin-mediada, recrutando PINK1 para a membrana mitocondrial externa. A seguir, Parkin é recrutado para as mitocôndrias danificadas e interage com PINK1. Este complexo Parkin-PINK1 leva à ubiquitinação da organela danificado e sua incorporação em um autophagosome, que se funde com uma lisossoma. Este processo conhecido como mitophagy é considerado como um processo metabólico essencial, a fim de manter o ambiente celular saudável e permitir a regeneração das mitocôndrias funcionais 8,15.
Protocolo experimental
NT "FO: manter-together.within-page =" 1 "> A Figura 2 mostra uma representação esquemática do protocolo experimental e o microscópio set-up usado para seguir o recrutamento de EYFP-Parkin antes e após o processo de mitophagy induzida por FCCP.Parkin recrutamento para despolarizado Membrana Mitocondrial
Na Figura 3A, mostramos a distribuição Parkin administração anterior e pós FCCP. Durante os pontos no tempo basal (BT5, BT10 e BT15 min) EYFP-Parkin (Verde) é difundido de forma homogénea por toda a célula e a rede de mitocôndrias (vermelho) parece ser bem interligado. Após a administração FCCP (FT = 0 min) (Figura 3B), observa-se o fraccionamento mitocôndrias (FT = 5 min). No entanto, EYFP-Parkin ainda está homogeneamente difundida embora fora do citoplasma. Mitophagy é estimulado a 55 min administração pós FCCP,EYFP-Parkin é recrutado nas membranas mitocondriais danificados para desencadear o processo mitophagy (FT = 55).
Figura 1. Representação esquemática da Mitophagy Parkin-mediada. Uma diminuição do potencial de membrana (Ψm) ocorre nas mitocôndrias danificados ou disfuncionais e pode ser induzida pelo agente de desacoplamento FCCP. A perda do potencial de membrana desencadeia mitophagy selectiva Parkin-mediada, recrutando PINK1 (vermelho) para a membrana mitocondrial externa. Parkin (azul) é recrutado para as mitocôndrias danificadas, interagindo diretamente com PINK1. A presença de Parkin leva à ubiquitinação (amarelo) da organela danificado e sua incorporação em um autophagosome, que se funde com uma lisossoma. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Microscópio Set-up e Representação do protocolo experimental. (A) Visão geral dos eventos experimentais descritos na seção de protocolo. Os eventos experimentais relatados permitem ao operador transitoriamente co-transfectar as células com EYFP-Parkin e pDsRed2-Mito por eletroporação, a fim de acompanhar o processo mitophagy induzida por FCCP usando um (B) set-up para time-lapse abordagem microscopia de vídeo. BT = ponto de tempo basal; FT = FCCP ponto de tempo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. celular de fibroblastos Mostrando Parkin Recruitme nt depois de Membrana Mitocondrial despolarização induzida por EYFP-Parkin (verde) translocação para a mitocôndria (vermelho) FCCP. foi monitorada por microscopia de lapso de tempo vídeo durante o ponto de tempo basal (BT) e após a administração FCCP (FT). De BT = 0, EYFP-Parkin e fluorescência mitocondrial foram detectados a cada 5 minutos. (A) EYFP-Parkin é homogeneamente difundido em todo o período basal e a rede mitocondrial é intactos (setas brancas). (B) fracionamento mitocondrial devido à despolarização da membrana por FCCP é gravado em FT = 5 min (setas brancas) e recrutamento EYFP-Parkin às membranas mitocondriais danificados começou no FT = 55 min (setas brancas). As caixas brancas representam a área ampliada dos painéis (5x). Para mais detalhes sobre a aplicação deste protocolo experimental referem-se a referência 8. (Barra de escala: 10 mm).> Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
microscopia de lapso de tempo pode ser definido como a técnica que se estende imagem de células vivas a partir de uma única observação em tempo para a observação da dinâmica celular durante longos períodos de tempo. Esta metodologia é distinguida de uma simples confocal ou microscopia de células vivas porque permite que o observador identificar em tempo real, com uma única proteína fluorescente marcado com e seguir a sua dinâmica dentro de uma única célula viva. Na verdade, a microscopia confocal pode facilmente identificar proteínas marcadas com imuno utilizando anticorpo fluorescente, mas não permite a observação da célula e o evento molecular no seu ambiente real.
A microscopia de lapso de tempo vídeo é usado principalmente em pesquisa monitoramento de processos moleculares em diferentes tipos de células, tais como HEK293 16, neurônios primários 17 e células Hela 18 mas também tem aplicação clínica tais como a gravidez e prever aneuploidia 19,20. microscopia de lapso de tempo fornece embryologistas com informações adicionais sobre o desenvolvimento do embrião para uma gravidez clínica, e é possível que esta informação pode ser usada para melhorar a nossa capacidade de selecionar embriões viáveis para transferência. Outras vantagens do uso de microscopia de lapso de tempo incluem menor manipulação de embriões e os seus pratos para observações intermediárias, o que reduziria o risco de perda ou contaminação dentro do laboratório 19.
As células são capazes de manter a homeostase mitocondrial saudável, degradando mitocôndrias danificadas e disfuncionais através mitophagy. Mitophagy defeituoso está ligado à doença de Parkinson 21, a apoptose 22, o envelhecimento 23 e câncer 24. Mitophagy é impulsionado pela ligase de ubiquitina e Parkin PINK1 21. Devido à importância deste processo para manter um status mitocondrial saudável, achamos que é importante estudar a dinâmica deste evento usando um microscópio de vídeo time-lapse. O pro propostaprotocolo irá fornecer evidências sobre como homeostase mitocôndria é afectada sob diferentes condições de celulares, incluindo mudanças nas funções de expressão de genes e proteínas.
Neste estudo, foram transientemente transfectadas por electroporação fibroblastos. O método de electroporação aplica um impulso eléctrico com uma tensão optimizada durando alguns microssegundos para a suspensão de células, a fim de aumentar a permeabilidade da membrana celular por perturbação da bicamada de fosfolípido da membrana. Esta acção resulta na formação de poros temporários. A permeabilização da membrana permite que o ADN a ser introduzido para dentro da célula 25. Nós escolhemos este processo para transfectar transientemente fibroblastos, a fim de ter uma maior eficiência de transfecção de ambos os plasmídeos EYFP-Parkin e pDsRed2-Mito. De facto, o processo de electroporação é cerca de dez vezes mais eficaz do que a transfecção química 26. O processo de aquisição das imagens pode ser comprometida por tanto extefatores rnal; flutuações de temperatura, vibrações, humidade e fatores internos; pH, motilidade celular. A eletroporação e rastreamento fluorescentes são dois passos considerados os mais críticos para o sucesso deste protocolo experimental. Mesmo que a eficiência de transfecção é mais elevada do que outros métodos, a electroporação mata ~ 20% das células electroporadas. Outro grande problema é a qualidade de aquisição das imagens durante a etapa de monitorização. Uma vez que o ambiente celular é dinâmico, o plano de focagem precisa ajustamentos contínuos, a fim de manter o foco ao longo do processo de aquisição.
dano mitocondrial pode ser provocada pela despolarização da membrana mitocondrial e stress oxidativo. Estes factores induzem uma resposta mitophagic. A prova de que as mitocôndrias despolarização pode induzir mitophagy seletiva vem de experimentos photodamage que levam à produção de ROS e lesão mitocondrial 27-30. De modo a induzir MEM mitocondrialdespolarização brana e resposta mitophagic, FCCP foi usado como protonophore 10. FCCP é um ionóforo que permite protões para atravessar bicamadas lipidicas que induzem a despolarização da membrana. Usando essa abordagem, induzida mitophagy e seguiu a dinâmica do marcador molecular.
A concentração de FCCP é crucial, uma vez que pode ser citotóxico e promovem a morte celular. Uma vez que esta abordagem baseia-se na observação de células vivas, a concentração final de FCCP tem de ser ajustado de uma forma dependente do tipo de célula de modo a induzir mitophagy sem desencadear os mecanismos que conduzem à morte celular.
No geral, nós pensamos que na sequência da dinâmica de mitophagy, usando EYFP-Parkin como um marcador fluorescente, irá fornecer novos insights sobre a função mitocondrial. A remoção selectiva de mitocôndrias através mitophagy é um processo crucial na manutenção da qualidade mitocondrial, a viabilidade celular e a homeostase. Esta abordagem ao vivo Imaging elelp para entender o processo mitophagic em condições saudáveis e estressado.
abordagens modernas estão ampliando ainda mais observações de microscopia de lapso de tempo para além de fazer filmes de dinâmica celular. Cada vez mais este limite é turva como técnicas de citometria estão sendo integradas com técnicas de imagem para o monitoramento e avaliação das actividades desenvolvidas dinâmicas de células e estruturas subcelulares 31.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning Life Science | 10-013-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Phenol-free DMEM | Corning Life Science | 17-205-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Pre-warm at 37 °C before use |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Penicillin/streptomycin | Corning Life Science | 30-002-CI | Pre-warm at 37 °C before use |
| EYFP-PARKIN expression vector | Addgene | 23955 | |
| pDsRed2-Mito expression vector | Clontech | 632421 | |
| Nucleofector 2B device | LONZA | AAD-1001S | |
| Nucleofector for kit R NIH/3T3 | LONZA | VCA-1001 | |
| ZEISS AXIOVERT 200M inverted microscope | CARL ZEISS | ||
| Carbonyl Cyanide 4-(trifluoromethoxy)-Phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Experimental Builder | |
| ImageJ | National Institute of Health | Experimental Builder |
References
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