Protocol
1. Electroporation fibroblast med Både ekspresjonsvektorer EYFP-Parkin og pDsRed2-Mito
- Vokse udødelig mus embryonale fibroblastceller på 10 centimeter vev-kulturplate ved hjelp av DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagles medium) medium supplementert med 10% føtalt bovint serum, 2 mmol / l L-glutamin, 100 U / ml penicillin, og 100 mg / ml streptomycin i fuktet atmosfære inneholdende 5% CO2 ved 37 ° C.
- Ved 80% celle konfluens forkaste hele DMEM-medium med steril suging og tilsett 10 ml steril 1 x fosfatbufferløsning (PBS) (80 g NaCl, 2,0 g KCl, 14,4 g Na 2 HPO 4, 2,4 g KH 2 PO 4 og 1 liter destillert H 2 O, pH: 7,4).
- Kast PBS ved sterile suge og tilsett 1 ml Trypsin-EDTA 0,25%. Inkuber platen ved 37 ° C inntil cellene er frittliggende (2 - 3 min). Tilsett 4 ml komplett DMEM medium, resuspender cellene og ta ut 10 _6; l av cellesuspensjonen for hemocytometer telling.
MERK: hemocytometer er utformet slik at antallet av celler i et første sett av 16 hjørne kvadrater tilsvarer antall celler x 10 4 / ml.
- Seed 1 x 10 6 celler bort på 10 cm vev kultur retter 24 timer før den electroporation prosessen.
- Kast komplett DMEM medium med sterile suge og tilsett 10 ml steril PBS. Kast PBS ved sterile suge og tilsett 1 ml Trypsin-EDTA 0,25%. Inkuber platen ved 37 ° C inntil cellene er frittliggende (2 - 3 min). Tilsett 4 ml komplett DMEM-medium og resuspender cellene i et 15 ml rør.
- Spinn cellene ned ved 250 xg i 5 min ved anvendelse av en nedkjølt-sentrifuge (4 ° C). Kast supernatanten ved steril suging og resuspender pelleten i 1 ml steril PBS. Spinn cellene ned ved 250 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Kast supernatanten av sterile suge, og tilsett 100 mL of løsning mix for electroporation (82 mL av electroporation Solution V + 18 mL av Supplemental løsning 1) til cellen pellet og forsiktig resuspender pelleten ved å pipettere (For flere detaljer, se bruksanvisningen). Tilsett 2 ug EYFP-Parkin (eksitasjon / emisjon 514/527), og 1 ug pDsRed2-Mito (eksitasjon / emisjon 565/620) ved cellesuspensjonen.
- Overfør løsningen på den sterile kyvetten ved hjelp av en engangs Pasteur (både verktøy følger med settet) og electroporate hjelp av forhåndsinnstilte program NIH / 3T3 U-030 (Enkel puls, spenning 200 V, kapasitans 960 uF, puls tids 20 millisekunder , puls nummer: 1).
- Umiddelbart etter elektroporering, tilsett 500 ul av frisk forvarmet komplett DMEM-medium og frø i cellen på en 6 cm vev-kulturplate levende avbildning grad og inkuber dem i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO2 ved 37 ° C i 24 timer.
2. Time-Lapse Video Mikros
- På dette punktet, utarbeide en spesifikk levende bildemateriale for å fortsette med forsøksprotokoll. Forbered live bildemediumet som følger; blande DMEM fenol-fritt supplert med 10% føtalt bovint serum, 2 mmol / l L-glutamin, 100 U / ml penicillin, og 100 mg / ml streptomycin. Forvarme det levende bilde medium ved 37 ° C i et vannbad.
- Kast mediet av de elektroporerte celler ved steril suging og tilsett 1 ml forvarmet levende avbildning medium, ved hjelp av en pipette, P1000 og inkuber platen i 30 minutter ved 37 ° C.
- Under platen inkubasjonstiden, tilstrømning 5% CO2 i mikroskopet kammeret allerede ved en stabil temperatur på 37 ° C.
- Sett platen med electroporated celler i mikroskopet kammeret unngå store bevegelser eller svingninger.
- Ved hjelp av programvaren grensesnittet, sette mikroskop for å oppdage både fluoreScence signaler fra fusjonsproteiner kodet av kotransfiserte vektorer, EYFP-Parkin (Magnetiseringsutkobling range 495-510 nm og emisjon utvalg 520-550 nm, grønn) og pDsRed2-Mito (Magnetiseringsutkobling maks 558 nm og emisjonsmaksimum 583 nm, rød).
- Åpne time-lapse video mikroskopi programvare. I den øvre menyen velger FITC for EYFP-Parkin og Rhodamine for pDsRed2-Mito. I den øvre menyen velger forstørrelse (20X).
- Ved hjelp av programvaren grensesnittet, se etter enkelt celle som uttrykker både kotransfiserte vektorer og registrere stillingen. Gjenta dette trinnet til et minimum av 10 celler samles for hver eksperimentell tilstand (eksperimentell gruppe).
- Velg menyen "Apps" og klikk på Multi Dimensional Acquisition. I Multi Dimensional Anskaffelses vinduer velge parametere som trengs, for eksempel antall oppkjøp, tidsintervallet mellom hvert oppkjøp og plasseringen av den innspilte celle. Klikk på "Acquire"For å starte anskaffelsesprosessen.
- Start basal oppkjøpet av både EYFP-Parkin og DsRed2-Mito fluorescerende signal samle bilder hvert 5 min for totalt intervall på 15 min.
- Forbered forvarmet levende bildemateriale med en konsentrasjon av FCCP to ganger høyere enn den endelige arbeidskonsentrasjon (0,1 til 10 mikrometer, celletype avhengig).
- Avbryte anskaffelsesprosessen og legg forsiktig 1 ml forvarmet levende bildemateriale med FCCP inn platen inne i mikroskopet kammeret ved hjelp av en P1000 pipette.
- Start innhentingsprosessen som tidligere beskrevet, for en total periode på 3 timer, bruk av registrerte posisjon. Lagre alle de oppkjøpte bilder for å analysere dem og lage en video av mitophagic prosessen når oppkjøpet er over.
3. Analyse
- Samle alle de oppkjøpte bilder i "TIFF" format på en personlig datamaskin
- Åpne bilder med et grafisk mykware og definere tidsmessige intervallet skjedd fra mitokondrie indusert-depolarisering med FCCP til det første bildet viser rekruttering av Parkin inn i mitokondrie membran (Bildene er kjøpt hvert 5 min). Gjenta denne analysen for hver celle i forsøksgruppen.
- Merk den første cellen i kolonnen på et regneark med den eksperimentelle gruppenavnet. For hver forsøksgruppe, måle tidsmessige intervaller for Parkin rekruttering av minimum 10 celler. Gjør et gjennomsnitt av de beregnede timeintervaller for Parkin rekruttering og definere standardavviket for hver forsøksgruppe (Mean ± SD, N = 10).
- Organiser i kolonner enkelt beregnede timeintervaller. Hver kolonne inneholder n = 10 målinger av den eksperimentelle gruppen.
- Velg funksjonen "gjennomsnittlig" fra Formula Builder menyen. Velg data i kolonnen. Velg funksjonen "standardavvik" fra Formula Builder menyen. Select dataene i kolonnen.
- Ved hjelp av en statistisk metode, sammenligne eksperimentelle grupper som gjelder den aktuelle statistikk for å definere en betydelig forskjell i det dynamiske av mitophagy mellom forsøksgruppene. (For eksempel, to grupper = t-test, tre eller flere grupper = ANOVA pluss en post-hoc test)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Heri, viser vi hvordan time-lapse video mikroskopi er en kraftfull teknikk som kan brukes til å følge molekylære hendelser fluorescently-merket proteiner i en enkelt celle. De representative Resultatene viser også hvordan denne teknikken åpner for kjøp av høy kvalitet. Når bilder av den molekylære prosessen, er innhentet, har vi muligheten til å analysere dem på forskjellige måter. Her analyserer vi tidsintervallet mellom initiering av den induserte mitophagy prosessen, som er det avgjørende molekylære prosess som opprettholder den cellulære homøostase selektivt å fjerne de ødelagte mitokondriene.
Denne teknikken grunnlegger et bredt spekter av applikasjoner. Den kan brukes enten for overvåking av makrocelledelt prosess, slik som cellemigrering eller mikro molekylære hendelser gjennom merkingen av de viktige molekyler som er involvert i den prosess som skal studeres.
o: keep-together.within-page = "1"> Parkin-mediert Mitophagy
Den selektive Parkin-mediert fjerning av skadet og dysfunksjonell mitokondrier prosessen er oppsummert i figur 1, hvor en membran depolarisasjonsinduserte ved frakopling midlet FCCP utløser selektiv Parkin-mediert mitophagy, rekruttering Nature1 til den ytre mitokondriemembranen. Følgende, er Parkin rekruttert til de skadede mitokondrier og samhandler med Nature1. Dette komplekset Parkin-Nature1 fører til ubiquitinering av den skadede organeller og dens inkorporering i en autophagosome, som sikringer med en lysosome. Denne prosessen er kjent som mitophagy er ansett for å være en viktig metabolsk prosess for å beholde den cellulære miljø sunne og tillate regenerering av funksjonelle mitokondrier 8,15.
forsøks~~POS=TRUNC protokoll~~POS=HEADCOMP
nt "fo: holde-together.within-siden =" en "> Figur 2 viser en skjematisk fremstilling av den eksperimentelle protokollen og mikroskop oppsett som brukes for å følge rekruttering av EYFP-Parkin før og etter FCCP-indusert mitophagy prosess.Parkin Rekruttering til depolarisert mitokondrielle membranen
I figur 3A viser vi Parkin fordeling før og etter FCCP administrasjon. I løpet av de basale tidspunkter (BT5, BT10 og BT15 min) EYFP-Parkin (grønn) er homogent spredt over hele mobil og mitokondrier nettverk (Red) ser ut til å være godt sammenvevd. Etter FCCP administrasjon (FT = 0 min) (figur 3B), ser vi mitokondrier fraksjonering (FT = 5 min). Imidlertid er EYFP-Parkin fortsatt homogent diffust skjønt ut cytoplasma. Mitophagy stimuleres ved 55 min post FCCP administrasjon,EYFP-Parkin er rekruttert på skadede mitokondrie membraner for å utløse mitophagy prosessen (FT = 55).
Figur 1. Skjematisk fremstilling av Parkin-mediert Mitophagy. En redusering av membranpotensialet (Ψm) oppstår i skadede eller dysfunksjonelle mitokondrier og kan induseres ved frakopling agenten FCCP. Tap av membranpotensialet utløser selektiv Parkin-mediert mitophagy, rekruttering Nature1 (rød) til den ytre mitokondrie membran. Parkin (blå) er rekruttert til de skadede mitokondriene ved direkte samspill med Nature1. Tilstedeværelsen av Parkin fører til ubiquitinering (gul) av den skadede organeller og dens inkorporering i en autophagosome, som sikringer med en lysosome. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Mikroskop Oppsett og representasjon av den eksperimentelle protokollen. (A) Oversikt over de eksperimentelle hendelsene beskrevet i protokollen delen. De rapporterte eksperimentelle hendelser tillater operatøren å forbigående co-transfektere cellene med EYFP-Parkin og pDsRed2-Mito ved electroporation for å følge FCCP-indusert mitophagy prosessen med en (B) oppsett for time-lapse video mikros tilnærming. BT = basal tidspunkt; FT = FCCP tidspunkt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Fibroblast Cell Viser Parkin Recruitme nt etter mitokondriemembranen depolarisasjonsinduserte av FCCP. EYFP-Parkin (grønn) trans inn i mitokondriene (rød) ble overvåket av time-lapse video mikroskopi i basal tidspunkt (BT) og legge FCCP administrasjon (FT). Fra BT = 0, ble EYFP-Parkin og mitokondrie fluorescens påvises hvert 5 min. (A) EYFP-Parkin er homogent spredt over hele basal perioden og mitokondrielle nettverket er intakte (hvite piler). (B) Mitokondriefraksjonering på grunn av membran depolarisering av FCCP er registrert på FT = 5 min (hvite piler) og EYFP-Parkin rekrutteringen til skadede mitokondrielle membraner startet på FT = 55 min (hvite piler). De hvite boksene representerer det forstørrede området av panelene (5X). For flere detaljer vedrørende anvendelsen av denne eksperimentelle protokollen referere til referanse 8. (Skala: 10 mikrometer).> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Time-lapse mikroskopi kan defineres som den teknikk som strekker seg levende celle avbildning fra en enkelt observasjon i tid til observasjon av cellulære dynamikk over lange tidsperioder. Denne metodikken skiller seg fra et enkelt confocal eller levende celle mikroskopi fordi det tillater betrakteren å identifisere i sanntid ett fluorescerende-merket protein og følge dens dynamiske inne en enkelt levende celle. Faktisk kan den konfokalmikroskopi lett identifiserer immunmerkede proteiner ved hjelp av fluorescerende antistoff, men det tillater ikke observere celle og molekylær hendelse i sin levende miljø.
Time-lapse video mikroskopi er først og fremst brukt i forskning overvåking molekylære prosesser i ulike celletyper som HEK293 16, primær nevroner 17 og Hela celler 18, men har også klinisk program som for eksempel graviditet og forutsi Aneuploidy 19,20. Time-lapse mikroskopi gir embryologists med ytterligere informasjon om embryo utvikling for en klinisk graviditet, og det er mulig at denne informasjonen kan brukes til å forbedre vår evne til å velge levedyktige embryoer for overføring. Andre fordeler ved bruk av Time-lapse mikros omfatte mindre håndtering av embryoer og sine retter for mellom observasjoner, noe som vil redusere risikoen for tap eller forurensning i laboratorium 19.
Cellene er i stand til å opprettholde en sunn mitokondriell homeostase ved nedverdigende skadet og dysfunksjonelle mitokondrier gjennom mitophagy. Defekt mitophagy er knyttet til Parkinsons sykdom 21, apoptose 22, aldring 23 og kreft 24. Mitophagy er drevet av ubiquitin ligase Parkin og Nature1 21. På grunn av betydningen av denne prosessen for å opprettholde en sunn mitokondrie status, fant vi det viktig å studere dynamikken i denne hendelsen ved hjelp av en time-lapse video mikroskopi. Den foreslåtte proprotokollen vil gi bevis på hvordan mitokondrier homeostase påvirkes under forskjellige cellulære forhold, herunder endringer i genuttrykk og proteinfunksjoner.
I denne studien vi transient transfektert ved elektroporering fibroblaster. Elektroporeringsmetoden gjelder en elektrisk puls ved et optimalisert spenning som varer noen få mikrosekunder til cellesuspensjonen for å øke permeabiliteten til cellemembranen ved å forstyrre fosfolipid dobbeltlag av membranen. Denne virkning resulterer i dannelsen av midlertidige porer. Membranen permeabilization tillater at DNA som skal innføres i cellen 25. Vi valgte denne prosess til forbigående transfektere fibroblaster for å ha høyere transfeksjonseffektivitet av begge plasmider EYFP-Parkin og pDsRed2-Mito. Faktisk er det elektroporering prosessen omtrent ti ganger mer effektiv enn kjemisk transfeksjon 26. Den Images anskaffelsesprosess kan bli svekket av både external faktorer; temperatursvingninger, vibrasjoner, fuktighet og interne faktorer; pH, cellemotilitet. Elektroporeringsmetoden og fluorescerende sporing er to trinn anses å være den mest kritiske for å lykkes med denne eksperimentelle protokollen. Selv om transfeksjonseffektiviteten er høyere enn andre metoder, dreper elektroporering ~ 20% av de elektroporerte cellene. Et annet stort problem er oppkjøpet kvaliteten på bildene under overvåking trinn. Siden mobil miljø er dynamisk, må fokusplanet kontinuerlig justering for å opprettholde fokus gjennom innhentingsprosessen.
Mitokondriell skade kan forårsakes av membranen mitokondrie depolarisering og oksidativt stress. Disse faktorene indusere en mitophagic respons. Bevis for at mitokondriene depolarisering kan indusere selektiv mitophagy kommer fra photodamage eksperimenter som fører til ROS produksjon og mitokondrieskade 27-30. For å indusere mitokondrie memBrane depolarisering og mitophagic svar, har FCCP blitt brukt som protonophore 10. FCCP er en ionofor som tillater protoner å krysse lipidbilagene induserende membran depolarisering. Ved hjelp av denne tilnærmingen vi indusert mitophagy og fulgte dynamikken i molekylær markør.
Konsentrasjonen av FCCP er avgjørende, da det kan være cytotoksisk og fremme cellulær død. Etter denne metode er avhengig av observasjon av levende celler, har den endelige konsentrasjonen av FCCP å bli justert i en celletype avhengig måte for å indusere mitophagy uten å utløse de mekanismene som fører til cellulær død.
Totalt, tror vi at følgende dynamikken i mitophagy, ved hjelp EYFP-Parkin som en fluoriserende fargestoff, vil gi ny innsikt i mitokondrienes funksjon. Den selektive fjerning av mitokondrier via mitophagy er en viktig prosess i å opprettholde mitokondriell kvalitet, celle-levedyktighet og homeostase. Denne live bildebehandling tilnærmingen vil hanlp å forstå mitophagic prosessen under sunne og stressede forhold.
Moderne tilnærminger er ytterligere utvide time-lapse mikros observasjoner utover å lage filmer av mobilnettet dynamikk. Stadig denne grensen er uskarpt som cytometriske teknikker blir integrert med bildeteknikker for overvåking og måling av dynamiske aktiviteter celler og subcellulære strukturer 31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning Life Science | 10-013-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Phenol-free DMEM | Corning Life Science | 17-205-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Pre-warm at 37 °C before use |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Penicillin/streptomycin | Corning Life Science | 30-002-CI | Pre-warm at 37 °C before use |
| EYFP-PARKIN expression vector | Addgene | 23955 | |
| pDsRed2-Mito expression vector | Clontech | 632421 | |
| Nucleofector 2B device | LONZA | AAD-1001S | |
| Nucleofector for kit R NIH/3T3 | LONZA | VCA-1001 | |
| ZEISS AXIOVERT 200M inverted microscope | CARL ZEISS | ||
| Carbonyl Cyanide 4-(trifluoromethoxy)-Phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Experimental Builder | |
| ImageJ | National Institute of Health | Experimental Builder |
References
- Youle, R. J., Narendra, D. P.
- Zhi, X., Zhong, Q.
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biol Chem. 393, 547-564 (2012).
- Lemasters, J. J. Selective mitochondrial autophagy, or mitophagy, as a targeted defense against oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and aging. Rejuvenation Res. 8, 3-5 (2005).
- Kissova, I., Deffieu, M., Manon, S., Camougrand, N. Uth1p is involved in the autophagic degradation of mitochondria. J Biol Chem. 279, 39068-39074 (2004).
- Kubli, D. A., Gustafsson, A. B. Mitochondria and mitophagy: the yin and yang of cell death control. Circ Res. 111, 1208-1221 (2012).
- Redmann, M., Dodson, M., Boyer-Guittaut, M., Darley-Usmar, V., Zhang, J. Mitophagy mechanisms and role in human diseases. Int J Biochem Cell Biol. 53, 127-133 (2014).
- Di Sante, G., et al. Loss of sirt1 promotes prostatic intraepithelial neoplasia, reduces mitophagy, and delays park2 translocation to mitochondria. Am J Pathol. 185, 266-279 (2015).
- Tanaka, A. Parkin-mediated selective mitochondrial autophagy, mitophagy: Parkin purges damaged organelles from the vital mitochondrial network. FEBS Lett. 584, 1386-1392 (2010).
- Shiba-Fukushima, K., et al. PINK1-mediated phosphorylation of the Parkin ubiquitin-like domain primes mitochondrial translocation of Parkin and regulates mitophagy. Sci Rep. 2, 1002 (2012).
- Trinh, J., Farrer, M.
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
- Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochem Biophys Res Commun. 7, 272-275 (1962).
- Karan, G., Yang, Z., Zhang, K. Expression of wild type and mutant ELOVL4 in cell culture: subcellular localization and cell viability. Mol Vis. 10, 248-253 (2004).
- Jin, S. M., Youle, R. J. PINK1- and Parkin-mediated mitophagy at a glance. J Cell Sci. 125, 795-799 (2012).
- Kerr, M. C., et al. Visualisation of macropinosome maturation by the recruitment of sorting nexins. J Cell Sci. 119, 3967-3980 (2006).
- Edin, F., et al. 3-D gel culture and time-lapse video microscopy of the human vestibular nerve. Acta Otolaryngol. 134, 1211-1218 (2014).
- Ramsden, A. E., Mota, L. J., Munter, S., Shorte, S. L., Holden, D. W. The SPI-2 type III secretion system restricts motility of Salmonella-containing vacuoles. Cell Microbiol. 9, 2517-2529 (2007).
- Meseguer, M., et al. Embryo incubation and selection in a time-lapse monitoring system improves pregnancy outcome compared with a standard incubator: a retrospective cohort study. Fertil Steril. 98, 1481-1489 (2012).
- Campbell, A., et al. Modelling a risk classification of aneuploidy in human embryos using non-invasive morphokinetics. Reprod Biomed Online. 26, 477-485 (2013).
- Bingol, B., et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 510, 370-375 (2014).
- Carroll, R. G., Hollville, E., Martin, S. J. Parkin sensitizes toward apoptosis induced by mitochondrial depolarization through promoting degradation of Mcl-1. Cell Rep. 9, 1538-1553 (2014).
- Batlevi, Y., La Spada, A. R. Mitochondrial autophagy in neural function, neurodegenerative disease, neuron cell death, and aging. Neurobiol Dis. 43, 46-51 (2011).
- Frank, M., et al. Mitophagy is triggered by mild oxidative stress in a mitochondrial fission dependent manner. Biochim Biophys Acta. 1823, 2297-2310 (2012).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-845 (1982).
- Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophys Chem. 19, 211-225 (1984).
- Lemasters, J. J. Variants of mitochondrial autophagy: Types 1 and 2 mitophagy and micromitophagy (Type 3). Redox Biol. 2, 749-754 (2014).
- Aggarwal, B. B., Quintanilha, A. T., Cammack, R., Packer, L. Damage to mitochondrial electron transport and energy coupling by visible light. Biochim Biophys Acta. 502, 367-382 (1978).
- Alexandratou, E., Yova, D., Handris, P., Kletsas, D., Loukas, S. Human fibroblast alterations induced by low power laser irradiation at the single cell level using confocal microscopy. Photochem Photobiol Sci. 1, 547-552 (2002).
- Kim, I., Lemasters, J. J. Mitophagy selectively degrades individual damaged mitochondria after photoirradiation. Antioxid Redox Signal. 14, 1919-1928 (2011).
- Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions. J Cell Sci. 126, 3805-3815 (2013).
