Protocol
1. Elektroporation von Fibroblast mit beiden Expressionsvektoren EYFP-Parkin und pDsRed2-Mito
- Wachsen die immortalisierten embryonalen Maus-Fibroblasten-Zellen auf 10 cm-Gewebekulturplatte unter Verwendung von DMEM (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium) -Medium mit 10% fötalem Rinderserum, 2 mmol / l L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin in befeuchteter Atmosphäre mit 5% CO 2 bei 37 ° C.
- Bei 80% Zellkonfluenz, verwerfen die komplette DMEM - Medium durch sterile Absaug- und 10 ml sterile 1x Phosphatpufferlösung (PBS) (80 g NaCl, 2,0 g KCl, 14,4 g Na 2 HPO 4, 2,4 g KH hinzufügen 2 PO 4 und 1 l destilliertes H 2 O, pH - Wert: 7,4).
- Entsorgen Sie die PBS durch sterile Absaug- und 1 ml Trypsin-EDTA 0,25%. Die Platte bei 37 ° C, bis die Zellen abgelöst werden (2 - 3 min). In 4 ml komplettem DMEM-Medium, Resuspendieren der Zellen und nehmen 10 _6; l der Zellsuspension für die Zählkammer Zählen.
HINWEIS: Die Hämozytometer so ausgelegt ist, dass die Anzahl der Zellen in einem Satz von 16 Eckquadrate der Anzahl der Zellen entspricht x 10 4 / ml.
- Seed 1 x 10 6 Zellen auf 10 cm - Gewebekulturschalen 24 Stunden vor der Elektroporation.
- Entsorgen Sie das komplette DMEM-Medium durch sterile Absaug- und 10 ml sterilem PBS. Entsorgen Sie die PBS durch sterile Absaug- und 1 ml Trypsin-EDTA 0,25%. Die Platte bei 37 ° C, bis die Zellen abgelöst werden (2 - 3 min). In 4 ml komplettem DMEM-Medium und Resuspendieren der Zellen in einem 15-ml-Tube.
- Dreh die Zellen nach unten bei 250 xg für 5 min unter Verwendung einer Kühlzentrifuge (4ºC). Überstand verwerfen durch sterile Absaug- und das Pellet in 1 ml sterilem PBS. Dreh die Zellen nach unten bei 250 xg für 5 min bei 4 ° C.
- Überstand verwerfen durch sterile abgesaugt und mit 100 & mgr; l of Lösung Mix für die Elektroporation (82 & mgr; l der Elektroporation Lösung V + 18 & mgr; l Zusatzlösung 1) an die Zellpellet und resuspendieren sanft das Pellet durch Pipettieren (Weitere Informationen finden Sie im Benutzerhandbuch). In 2 ug EYFP-Parkin (Anregung / Emission 514/527) und 1 & mgr; g pDsRed2-Mito (Anregung / Emission 565/620) an der Zellsuspension.
- Die Lösung wird in der sterilen Küvette eine Einweg-pasteur mit (beide Werkzeuge sind mit dem Kit zur Verfügung gestellt) und Elektroporation den voreingestellten Programm NIH / 3T3-U-030 (Single Impuls mit, Spannung 200 V, Kapazität 960 uF, Pulszeit von 20 Millisekunden , Pulszahl: 1).
- Unmittelbar nach der Elektroporation, 500 & mgr; l frisches vorgewärmtes komplettes DMEM - Medium und der Zelle auf einer 6 cm - Gewebekulturplatte Live-imaging-grade Saatgut und inkubieren sie in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 bei 37 ° C für 24 Stunden.
2. Zeitraffervideomikroskopie
- An dieser Stelle bereiten eine bestimmte Live-Abbildungsmedium mit dem Versuchsprotokoll, um fortzufahren. Bereiten Sie die Live-Abbildungsmedium wie folgt; mischen DMEM phenolfrei mit 10% fötalem Rinderserum, 2 mmol / l L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin. Pre-warm das Live-Imaging-Medium bei 37 ° C in einem Wasserbad.
- Entsorgen Sie das Medium der elektroporierten Zellen durch sterile Absaug- und 1 ml vorgewärmtes Live-Abbildungsmedium, ein P1000-Pipette und die Platte Inkubation für 30 min bei 37 ° C.
- Während der Platte Inkubationszeit Zustrom 5% CO 2 in die Kammer des Mikroskop bereits bei einer stabilen Temperatur von 37 ° C.
- Legen Sie die Platte mit den elektroporierten Zellen in die Kammer des Mikroskops zu vermeiden großen Bewegungen oder Schwingungen.
- Mit Hilfe der Software-Schnittstelle, setzen Sie das Mikroskop, um sowohl die fluore zu erkennenscence Signale von den Fusionsproteinen durch die cotransfiziert Vektoren codiert, EYFP-Parkin (Anregungsbereich von 495 bis 510 nm und Emissionsbereich von 520 bis 550 nm, grün) und die pDsRed2-Mito (Erregungs maximal 558 nm und Emissionsmaximum 583 nm, rot).
- Öffnen Sie die Zeitraffer-Video-Mikroskopie-Software. Im oberen Menü wählen Sie die FITC für EYFP-Parkin und Rhodamin für pDsRed2-Mito. Im oberen Menü wählen Sie die Vergrößerung (20X).
- Mit Hilfe der Software-Schnittstelle, sucht die einzelne Zelle beide cotransfiziert Vektoren exprimieren, und die Position zu registrieren. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis ein Minimum von 10 Zellen für jede experimentelle Bedingung (Versuchsgruppe) gesammelt wird.
- Wählen Sie das Menü "Apps" und klicken Sie auf Multi Dimensional Acquisition. In der Multi-Dimensional Acquisition Fenster wählen Sie die benötigten Parameter, wie etwa die Anzahl von Akquisitionen, der Zeitintervall zwischen jeder Aufnahme und die Position der aufgenommenen Zelle. Klicken Sie auf "Acquire", Um den Akquisitionsprozess zu starten.
- Starten Sie den basalen Erwerb von sowohl EYFP-Parkin und DsRed2-Mito Fluoreszenzsignal Bilder alle 5 min für einen Gesamtintervall von 15 Minuten zu sammeln.
- Bereiten vorgewärmten Live Bilderzeugungsmedium mit einer Konzentration von FCCP zweimal höher als die endgültige Arbeitskonzentration (0,1 bis 10 uM, zelltypabhängig).
- Unterbrechen Sie den Erfassungsprozess und fügen Sie vorsichtig 1 ml vorgewärmtes Live-Abbildungsmedium mit FCCP in die Platte im Inneren der Kammer des Mikroskops ein P1000-Pipette.
- Starten Sie den Akquisitionsprozess, wie zuvor beschrieben, für eine Gesamtdauer von 3 Stunden, die aufgezeichneten Position mit. Speichern Sie alle aufgenommenen Bilder, um sie zu analysieren und ein Video von der mitophagic Prozess erstellen, wenn der Erwerb vorbei ist.
3. Analyse
- Sammeln Sie alle aufgenommenen Bilder in "Tiff" Format auf einem PC
- Öffnen Sie die Bilder mit einer Grafik weichenware und definieren aufgetreten den zeitlichen Abstand von der mitochondrialen induzierte Depolarisation mit FCCP zum ersten Bild die Rekrutierung von Parkin in der mitochondrialen Membran zeigt (Bilder alle 5 min erworben werden). Wiederholen Sie diese Analyse für jede Zelle in der experimentellen Gruppe.
- Beschriften Sie die erste Zelle der Spalte auf einer Kalkulationstabelle mit dem experimentellen Gruppennamen. Für jede Versuchsgruppe, messen die zeitlichen Intervalle für Parkin Rekrutierung von mindestens 10 Zellen. Machen Sie einen Mittelwert der berechneten zeitlichen Intervalle für Parkin Rekrutierung und definieren die Standardabweichung für jede Versuchsgruppe (Mittelwert ± SD, N = 10).
- Organisieren Sie in Spalten die einzelnen berechneten zeitlichen Abständen. Jede Spalte enthält die n = 10 Messungen der Versuchsgruppe.
- Wählen Sie die Funktion "Mittelwert" aus der Formel-Generator-Menü. Wählen Sie die Daten in der Spalte. Wählen Sie die Funktion "Standardabweichung" aus der Formel-Generator-Menü. Select die Daten in der Spalte.
- Verwendung eines statistischen Ansatzes, zu vergleichen, um die experimentellen Gruppen die entsprechende Statistik, um die Anwendung einen signifikanten Unterschied in der Dynamik der Mitophagie zwischen den Versuchsgruppen zu definieren. (Zum Beispiel können zwei Gruppen = Student-t-Test, drei oder mehr Gruppen = ANOVA plus eine post-hoc - Test)
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Representative Results
Hier zeigen wir, wie Zeitraffer-Video-Mikroskopie eine leistungsfähige Technik, die verwendet werden können molekulare Ereignisse von fluoreszenzmarkierten Proteine in einer einzigen Zelle zu folgen. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen auch, wie diese Technik für den Erwerb von Bildern hoher Qualität ermöglicht. Wenn Bilder des molekularen Verfahren, erhalten werden, haben wir die Möglichkeit, sie auf unterschiedliche Weise zu analysieren. Hier analysieren wir das Zeitintervall zwischen dem Beginn des induzierten Mitophagie Prozess, der der entscheidende molekularen Prozess ist, der die zelluläre Homöostase selektives Entfernen der beschädigten Mitochondrien aufrechtzuerhalten.
Diese Technik gründet eine breite Palette von Anwendungen. Es kann entweder für die Überwachung Makro zellulärer Prozess, wie beispielsweise die Zellmigration oder Mikro molekularen Ereignisse durch die Markierung der Schlüsselmoleküle in den Prozess einbezogen werden, die untersucht werden muss.
o: keep-together.within-page = "1"> Parkin-vermittelte Mitophagie
Die selektive Parkin-vermittelte Entfernung von beschädigten und dysfunktionalen Mitochondrien Prozess ist in 1 zusammengefasst, in der eine Membran - Depolarisation durch die Entkopplungsmittel induzierten FCCP löst selektiv-Parkin vermittelt Mitophagie, PINK1 an der äußeren mitochondrialen Membran rekrutieren. Im Anschluss wird Parkin an die geschädigten Mitochondrien rekrutiert und interagiert mit PINK1. Dieser Komplex Parkin-PINK1 führt zu der Ubiquitinierung des beschädigten Organell und dessen Einbau in eine Autophagosom, die mit einem Lysosom verschmilzt. Dieser Prozess wird als Mitophagie bekannt gilt als ein entscheidender Stoffwechselprozess zu sein , um die zelluläre Umgebung gesund zu halten und die Regeneration von funktionellen Mitochondrien 8,15 ermöglichen.
Versuchsprotokoll
nt "fo: keep-together.within-page =" 1 "> 2 zeigt eine schematische Darstellung des experimentellen Protokolls und dem Mikroskop Set-up für im Anschluss an die Einstellung von EYFP-Parkin verwendet vor und nach FCCP-induzierten Mitophagie Prozess.Parkin Recruitment, depolarisierte mitochondrialen Membran
In 3A zeigen wir Parkin Verteilung vor und nach der FCCP Verwaltung. Während der basalen Zeitpunkten (BT5, BT10 und BT15 min) EYFP-Parkin (Grün) ist homogen über die Zelle verteilt und die Mitochondrien-Netzwerk (rot) scheint gut miteinander verbunden zu sein. Nach FCCP Verwaltung (FT = 0 min) (3B), beobachten wir Mitochondrien - Fraktionierung (FT = 5 min). Allerdings ist EYFP-Parkin noch homogen, obwohl aus dem Cytoplasma diffundiert. Mitophagie wird bei 55 min nach FCCP Verwaltung angeregt,EYFP-Parkin an den geschädigten Mitochondrien-Membranen rekrutiert die Mitophagie Prozess (FT = 55) auszulösen.
Abbildung 1 Schematische Darstellung des Parkin-vermittelten Mitophagie. Eine Abnahme des Membranpotentials (& psi; m) tritt in beschädigten oder gestörten Mitochondrien und kann durch die Entkopplungsmittel FCCP induziert werden. Der Verlust des Membranpotentials löst selektiv Parkin-vermittelte Mitophagie, Rekrutierung von PINK1 (rot) an der äußeren Membran der Mitochondrien. Parkin (blau) durch direkt die Interaktion mit PINK1 an die geschädigten Mitochondrien rekrutiert. Die Anwesenheit von Parkin führt zur Ubiquitinierung (gelb) des beschädigten Organell und dessen Einbau in ein Autophagosom, die mit einem Lysosom Sicherungen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Mikroskop Aufbau und Darstellung des Versuchsprotokolls. (A) Übersicht über die experimentellen Ereignisse im Protokoll Abschnitt beschrieben. Die berichteten experimentellen Veranstaltungen ermöglichen es dem Bediener zu transient co-transfizieren die Zellen mit EYFP-Parkin und pDsRed2-Mito durch Elektroporation, um die FCCP-induzierten Mitophagie Verfahren unter Verwendung eines (B) Set-up für Zeitraffer-Videomikroskopie Ansatz zu folgen. BT = basale Zeitpunkt; FT = FCCP Zeitpunkt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Fibroblast Zelle zeigt Parkin Recruitme nt nach Mitochondrial Membrandepolarisierung induziert durch FCCP. EYFP-Parkin (grün) Translokation in den Mitochondrien (rot) wurde durch Zeitraffervideomikroskopie während der basalen Zeitpunkt (BT) und Post FCCP Verwaltung (FT) überwacht. Von BT = 0 wurden EYFP-Parkin und mitochondriale Fluoreszenz alle 5 min detektiert. (A) EYFP-Parkin ist homogen über die gesamte Grundperiode diffundiert und die mitochondriale Netzwerk intakt ist (weiße Pfeile). (B) Mitochondrial Fraktionierung aufgrund Membrandepolarisierung durch FCCP bei FT = 5 min (weiße Pfeile) und EYFP-Parkin Rekrutierung beschädigte mitochondriale Membranen gestartet = 55 min bei FT aufgezeichnet (weiße Pfeile). Die weißen Kästen stellen den vergrößerten Bereich der Platten (5X). Für weitere Einzelheiten der Anwendung dieses Versuchsprotokoll über beziehen 8 zu verweisen. (Maßstab: 10 & mgr; m).> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Zeitraffer-Mikroskopie kann als Technik definiert werden, die auf die Beobachtung der Zelldynamik über lange Zeiträume in der Zeit lebenden Zellen aus einer einzigen Beobachtung erstreckt. Diese Methode unterscheidet sich von einer einfachen konfokalen oder Live-Zellmikroskopie, weil es dem Betrachter ermöglicht, in Echtzeit eine einzige fluoreszierende-markierten Protein und folgen Sie den dynamischen innerhalb einer einzelnen lebenden Zellen zu identifizieren. In der Tat identifiziert die konfokale Mikroskopie kann leicht Immuno-markierte Proteine fluoreszierende Antikörper verwendet, aber es ist nicht der Zelle zu beobachten und die molekulare Ereignis in seiner Live-Umgebung.
Die Zeitraffer-Video - Mikroskopie wird in der Forschung Überwachung molekularer Prozesse in verschiedenen Zelltypen wie HEK293 16, primäre Neuronen 17 und Hela - Zellen 18 , sondern hat auch die klinische Anwendung wie Schwangerschaft und Vorhersage von Aneuploidie 19,20 eingesetzt. Zeitraffer-Mikroskopie liefert embryologists mit zusätzlichen Informationen über die Entwicklung des Embryos für eine klinische Schwangerschaft, und es ist möglich, dass diese Informationen verwendet werden können, unsere Fähigkeit zu verbessern, tragfähige Embryonen auszuwählen für die Übertragung. Weitere Vorteile der Verwendung von Zeitraffermikroskopie sind weniger Umgang mit Embryonen und ihre Gerichte für Zwischen Beobachtungen, die das Risiko von Verlust oder Kontamination im Labor 19 reduzieren würde.
Die Zellen sind in der Lage, eine gesunde Mitochondrien-Homöostase durch Abbau beschädigt und dysfunktionalen Mitochondrien durch Mitophagie zu halten. Defective Mitophagie an Parkinson-Krankheit 21 verbunden Apoptose 22, Alterung und Krebs 23 24. Mitophagie wird durch das Ubiquitin - Ligase Parkin und PINK1 21 angetrieben. Aufgrund der Bedeutung dieses Prozesses einen gesunden mitochondrialen Status zu erhalten, fanden wir es wichtig, die Dynamik dieses Ereignis mit einem Zeitraffer-Video-Mikroskopie zu untersuchen. Die vorgeschlagene Prokoll liefert Belege dafür, wie Mitochondrien Homöostase unter verschiedenen zellulären Bedingungen beeinflusst wird, einschließlich Veränderungen in der Genexpression und Proteinfunktionen.
In dieser Studie haben wir Fibroblasten durch Elektroporation transient transfiziert. Das Elektroporationsverfahren wendet einen elektrischen Impuls an eine optimierte Spannungs einigen Mikrosekunden zu der Zellsuspension, um die Permeabilität der Zellmembran durch Stören der Phospholipid-Doppelschicht der Membran nachhaltig zu erhöhen. Diese Aktion führt zur Bildung von temporärer Poren. Die Membran - Permeabilisierung erlaubt die DNA in die Zelle 25 eingeführt werden. Wir haben uns für diesen Prozess zu transient Fibroblasten um transfizieren höhere Transfektion haben Effizienz beider Plasmide EYFP-Parkin und pDsRed2-Mito. In der Tat ist die Elektroporation etwa zehnmal wirksamer als chemische Transfektion 26. Die Bilder Akquisitionsprozess kann sowohl von EXTE beeinträchtigt werdenrnal Faktoren; Temperaturschwankungen, Vibrationen, Feuchtigkeit und interne Faktoren; pH-Wert, der Zellbeweglichkeit. Die Elektroporation und fluoreszierende Tracking sind zwei Schritte als die kritischsten für den Erfolg dieses experimentellen Protokolls. Selbst wenn die Transfektionseffizienz höher als bei anderen Verfahren ist, tötet die Elektroporation ~ 20% der elektroporierten Zellen. Ein weiteres wichtiges Thema ist die Akquisition Qualität der Bilder während der Überwachungsschritt. Da die zelluläre Umgebung dynamisch ist, muss die Fokusebene kontinuierliche Anpassungen, um den Fokus in der gesamten Erfassungsprozesses aufrechtzuerhalten.
Mitochondriale Schaden kann durch Membran der Mitochondrien Depolarisation und oxidativen Stress verursacht werden. Diese Faktoren eine mitophagic Antwort induzieren. Der Nachweis , dass die Mitochondrien Depolarisation kann selektiv Mitophagie induzieren kommt von Lichtschäden Experimenten , die 27-30 zu ROS - Produktion und der mitochondrialen Schädigung führen. Um mitochondrialen mem zu induzierenbran Depolarisation und mitophagic Antwort hat FCCP als protonophore 10 verwendet. FCCP ist ein Ionophor, die Protonen zu überqueren Lipid-Doppelschichten zu induzieren Membrandepolarisierung ermöglicht. Mit diesem Ansatz induziert wir Mitophagie und folgte der Dynamik der molekularen Marker.
Die Konzentration von FCCP ist von entscheidender Bedeutung, da es den Zelltod zytotoxische und fördern kann. Da dieser Ansatz auf die Beobachtung von lebenden Zellen beruht, hat die endgültige Konzentration von FCCP, um in einem Zelltyp abhängige Weise angepasst werden Mitophagie zu induzieren, ohne die Mechanismen auslösen, die zu Zelltod führen.
Insgesamt denken wir, dass im Anschluss an die Dynamik der Mitophagie, EYFP-Parkin als fluoreszierender Marker, neue Einblicke in die Funktion der Mitochondrien liefern. Die selektive Entfernung von Mitochondrien über Mitophagie ist ein wichtiger Prozess mitochondrialen Qualität, die Lebensfähigkeit der Zellen und die Homöostase aufrechtzuerhalten. Dieser Ansatz Live-Bildgebung wird erlp die mitophagic Prozess unter gesunden und Stressbedingungen zu verstehen.
Moderne Ansätze erweitern weiter Zeitraffer-Mikroskopie Beobachtungen über Filme der zellulären Dynamik zu machen. Immer diese Grenze ist verschwommen als zytometrischer Techniken für die Überwachung mit Imaging - Techniken integriert werden und die Messung dynamischer Aktivität von Zellen und subzellulärer Strukturen 31.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning Life Science | 10-013-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Phenol-free DMEM | Corning Life Science | 17-205-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Pre-warm at 37 °C before use |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Penicillin/streptomycin | Corning Life Science | 30-002-CI | Pre-warm at 37 °C before use |
| EYFP-PARKIN expression vector | Addgene | 23955 | |
| pDsRed2-Mito expression vector | Clontech | 632421 | |
| Nucleofector 2B device | LONZA | AAD-1001S | |
| Nucleofector for kit R NIH/3T3 | LONZA | VCA-1001 | |
| ZEISS AXIOVERT 200M inverted microscope | CARL ZEISS | ||
| Carbonyl Cyanide 4-(trifluoromethoxy)-Phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Experimental Builder | |
| ImageJ | National Institute of Health | Experimental Builder |
References
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