Protocol
1. Электропорация фибробласте с обоими экспрессирующие векторы EYFP-Паркин и pDsRed2-Мито
- Grow иммортализованных мышиных эмбриональных фибробластах клеток на 10 см ткани планшет для культивирования с использованием DMEM (модифицированная среда Игла Дульбекко) среде, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 ммоль / л L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицин в увлажненной атмосфере , содержащей 5% СО 2 при 37 ° с.
- На 80% сплошности клеток, отбрасывать полную среду DMEM с помощью стерильного отсоса и добавляют 10 мл стерильного 1x фосфатного буферного раствора (PBS) (80 г NaCl, 2,0 г KCl, 14,4 г Na 2 HPO 4 2,4 г КН 2 PO 4 и 1 л дистиллированной H 2 O, PH: 7,4).
- Выбросьте PBS стерильным отсасывают и добавляют 1 мл трипсина-EDTA 0,25%. Инкубируйте планшет при 37 ° С до тех пор, пока клетки не отделяются (2 - 3 мин). Добавляют 4 мл полной среды DMEM, ресуспендирования клеток и вынимают 10 _6; л клеточной суспензии для подсчета гемоцитометра.
Примечание: гемоцитометре разработан таким образом , что число клеток в одном наборе из 16 угловых квадратов эквивалентно числу ячеек х 10 4 / мл.
- Семенной 1 х 10 6 клеток на 10 см для культуры ткани блюд за 24 часа до начала процесса электропорации.
- Выбросьте полной среды DMEM стерильным отсасывают и добавляют 10 мл стерильной PBS. Выбросьте PBS стерильным отсасывают и добавляют 1 мл трипсина-EDTA 0,25%. Инкубируйте планшет при 37 ° С до тех пор, пока клетки не отделяются (2 - 3 мин). Добавляют 4 мл полной среды DMEM и клетки вновь суспендируют в 15 мл пробирку.
- Спин ячейки вниз при 250 х г в течение 5 мин, используя охлаждаемую-центрифуге (4 ° С). Жидкость над осадком сливают стерильным отсоса и ресуспендируют осадок в 1 мл стерильной PBS. Спин ячейки вниз при 250 х г в течение 5 мин при 4 ° C.
- Удалите супернатант с помощью стерильного отсасыванием и добавляют 100 мкл Oе смесь раствор для электропорации (82 мкл электропорации Solution V + 18 мкл раствора 1 Дополнительное) к осадку клеток и осторожно ресуспендируют осадок пипеткой (Для получения более подробной информации обратитесь к руководству пользователя). Добавить 2 мкг EYFP-Паркином (возбуждения / испускания 514/527) и 1 мкг pDsRed2-Мито (возбуждение / излучение 565/620) в клеточной суспензии.
- Переносят раствор в стерильной кювету с использованием одноразового использования Пастера (оба инструмента снабжены комплектом) и электропорации с использованием предварительно установленной программы NIH / 3T3 U-030 (Одиночный импульс, напряжение 200 В, емкость 960 мкФ, длительность импульса 20 мс , количество импульсов: 1).
- Сразу после электропорации, добавьте 500 мкл свежей подогретого полной среде DMEM и семенем клетки на 6 см тканевого культурального планшета живого изображения степени злокачественности и инкубировать их в увлажненной атмосфере , содержащей 5% СО 2 при 37 ° С в течение 24 часа.
2. Замедленная видеомикроскопия
- На данный момент, подготовить конкретную среду живого изображения, чтобы приступить к экспериментальным протоколом. Подготовьте носитель живого изображения следующим образом; смешивать DMEM, фенолов в с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 ммоль / л L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина. Предварительно нагреть среду живого изображения при 37 ° С в водяной бане.
- Выбросите среду электропорации клетки стерильным отсоса и добавляют 1 мл подогретого среды живого изображения, используя пипетку P1000 и инкубируйте в течение 30 мин при 37 ° С.
- В течение периода инкубации пластины, приток 5% СО 2 в камере уже микроскопа при стабильной температуре 37 ° С.
- Поместите пластину с электропорации клеток в камере микроскопа, избегая крупных движений или колебаний.
- С помощью программного интерфейса, установите микроскоп, чтобы обнаружить как fluoreScence сигналы от слитых белков, кодируемых котрансфицируют векторами, EYFP-Паркин (диапазон возбуждения 495 до 510 нм и диапазон эмиссии от 520 до 550 нм, зеленый) и pDsRed2-Мито (Возбуждение максимум 558 нм и эмиссии максимум 583 нм, красный).
- Откройте замедленную видеомикроскопия программного обеспечения. В верхнем меню выберите FITC для EYFP-Паркин и родамина для pDsRed2-Мито. В верхнем меню выберите увеличение (20X).
- Используя программный интерфейс, обратите внимание на одну ячейку, выражающего оба котрансфицируют векторов и зарегистрировать положение. Повторите этот шаг до тех пор, как минимум 10 клеток не собирается для каждого условия эксперимента (экспериментальная группа).
- Выберите меню "Программы" и нажмите на многомерные Приобретения. В многомерном окна Приобретение выберите параметры, необходимые, например, количество приобретений, интервал времени между каждым приобретением и положением записанной ячейки. Нажмите на кнопку "Acquire"Чтобы начать процесс покупки.
- Запуск базальную приобретение как EYFP-Паркином и DsRed2-Мито флуоресцентного сигнала для сбора изображений каждые 5 мин в течение полного интервала 15 мин.
- Подготовка подогретого среды живого изображения с концентрацией FCCP в два раза выше, чем в окончательной рабочей концентрации (0,1 - 10 мкМ, зависящая от типа клеток).
- Прерывание процесса приобретения и добавьте мягко 1 мл подогретого среды живого изображения с FCCP в пластину внутри камеры микроскопа с использованием P1000 пипетку.
- Перезапустите процесс обнаружения, как описано выше, в течение общей сложности в течение 3-х часов, используя запомненное положение. Сохранить все полученные изображения для того, чтобы проанализировать их и создать видео из mitophagic процесса, когда приобретение закончится.
3. Анализ
- Соберите все полученные изображения в формате ".tiff" на персональном компьютере
- Откройте изображение с графическим мягкимпосуда и определяют временной интервал произошел из митохондриального наведенного деполяризации с FCCP на первое изображение, показывающий набор Паркином в митохондриальной мембране (изображения получены каждые 5 мин). Повторите этот анализ для каждой ячейки в экспериментальной группе.
- Добавьте первую ячейку столбца на таблицу с именем экспериментальной группы. Для каждой экспериментальной группы, измерения временных интервалов для Паркин найма минимум 10 клеток. Сделать среднее число вычисленных временных интервалов для Parkin набора и определяют стандартное отклонение для каждой экспериментальной группы (среднее ± стандартное отклонение, n = 10).
- Организация в столбцы отдельные расчетные временные интервалы. Каждый столбец содержит N = 10 измерений экспериментальной группы.
- Выберите функцию "среднее" из меню Formula Builder. Выберите данные в столбце. Выберите функцию "Стандартное отклонение" в меню Formula Builder. Селект данных в столбце.
- Используя статистический подход, сравнить экспериментальные группы, применяющим соответствующие статистические данные, чтобы определить значительную разницу в динамике mitophagy между экспериментальными группами. (К примеру, две группы = Стьюдента-тест, три или более групп = ANOVA плюс испытание ретроспективном)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы покажем, как замедленная видео микроскопия является мощным методом, который может быть использован, чтобы следовать за молекулярных событий флуоресцентно-меченных белков в одной клетке. Представительные результаты также показывают, как эта методика позволяет для приобретения высококачественных изображений. Когда изображения молекулярного процесса, получены, мы имеем возможность анализировать их по-разному. Здесь мы анализируем интервал времени между началом индуцированного процесса mitophagy, который является важным молекулярный процесс, поддерживать клеточный гомеостаз селективного удаления поврежденных митохондрий.
Этот метод основывает широкий спектр применения. Он может быть использован как для мониторинга макросъемки клеточного процесса, таких как миграция клеток или микро молекулярных событий посредством маркировки ключевых молекул, участвующих в процессе, который должен быть изучен.
O: Keep-together.within-страница = "1"> Паркин-опосредованная Mitophagy
Селективное Паркин-опосредованная удаление поврежденной и дисфункционального процесса митохондрии суммированы на фиг.1, где деполяризацию мембраны , индуцированное разделительным агентом FCCP вызывает селективное Паркин-опосредованную mitophagy, рекрутинг PINK1 к внешней митохондриальной мембраной. После Паркин рекрутируется поврежденных митохондрий и взаимодействует с PINK1. Этот комплекс Паркин-PINK1 приводит к убихитинизация поврежденной органелл и ее включение в аутофагосом, который сливается с лизосомы. Этот процесс , известный как mitophagy считается решающим метаболический процесс для того , чтобы поддерживать клеточную среду здоровой и позволяют регенерации функциональных митохондрий 8,15.
Экспериментальный протокол
нт "ВОК: Keep-together.within-страницу =" 1 "> На рисунке 2 показано схематическое представление протокола эксперимента и микроскопа настройке , используемой для после набора EYFP-Паркин до и после FCCP-индуцированного процесса mitophagy.Паркин Прием на деполяризованных митохондриальной мембраны
На рисунке 3А, мы показываем распределение Паркин администрации до и после FCCP. В базальных моменты времени (BT5, BT10 и BT15 мин) EYFP-Паркин (зеленый) равномерно рассеивается по всей клетке и митохондрии сети (красный), как представляется, хорошо связаны между собой. После введения FCCP (FT = 0 мин) (рис 3B), мы наблюдаем митохондрии фракционирование (FT = 5 мин). Тем не менее, EYFP-Паркин по-прежнему однородно рассеянным, хотя из цитоплазмы. Mitophagy стимулируется в 55 мин введения пост FCCP,EYFP-Паркин набирается на поврежденных митохондриальных мембран для запуска mitophagy процесса (FT = 55).
Рисунок 1. Схематическое изображение Паркин-опосредованной Mitophagy. Убывающий мембранного потенциала (фт) происходит в поврежденными или дисфункциональных митохондрий и может быть индуцирована разделительным агентом FCCP. Потеря мембранного потенциала вызывает селективное Паркин-опосредованного mitophagy, рекрутинг PINK1 (красный) на внешней мембране митохондрий. Паркин (синий) набирается на поврежденные митохондрии путем непосредственного взаимодействия с PINK1. Присутствие Паркин приводит к убихитинизация (желтый) поврежденного органелл и ее включение в аутофагосом, который сливается с лизосомы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры,
Рисунок 2. Микроскоп Установка и представление экспериментального протокола. (A) Обзор экспериментальных событий , описанных в разделе протокола. Представленные экспериментальные события позволяют оператору скоротечно совместно трансфекции клеток с EYFP-Паркин и pDsRed2-Mito посредством электропорации для того , чтобы наблюдать за процессом mitophagy FCCP индуцированных с использованием (B) установка для покадровой видео микроскопии подход. BT = базальную момент времени; FT = FCCP момент времени. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Фибробласт Cell Отображение Паркин Recruitme нт после митохондриальной деполяризации мембраны , индуцированные FCCP. EYFP-Паркин (зеленый) транслокации в митохондрии (красный) контролировали с помощью покадровой видеомикроскопии во время базисной точки времени (BT) и после введения FCCP (FT). Из BT = 0, EYFP-Паркин и митохондриальные флуоресценции были обнаружены через каждые 5 мин. (А) EYFP-Паркин гомогенно рассеянный по всему базального периода и митохондриальная сеть не повреждена (белые стрелки). (B) митохондриальной фракционирование за счет деполяризации мембраны с помощью FCCP записывается в FT = 5 мин (белые стрелки) и EYFP-Паркин набора к поврежденным митохондриальных мембран началось в FT = 55 мин (белые стрелки). Белые прямоугольники представляют увеличенной области панелей (5x). Для получения более подробной информации относительно применения данного экспериментального протокола см ссылку 8. (Шкала бар: 10 мкм).> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Покадровый микроскопии может быть определена как метод, который расширяет изображений живых клеток от одного наблюдения во времени для наблюдения за клеточной динамики в течение длительных периодов времени. Эта методика отличается от простого конфокальной микроскопии или клеток живой, поскольку он позволяет наблюдателю определить в режиме реального времени одну люминесцентную-меченый белок и следить за его динамикой внутри одной живой клетке. На самом деле, конфокальной микроскопии может легко идентифицирует иммуно-меченых белков с использованием флуоресцентных антител, но он не позволяет наблюдать клетки и молекулярное событие в его реальной среде.
Замедленной видео микроскопии в основном используется в исследованиях мониторинга молекулярных процессов в различных типах клеток , таких как HEK293 16, первичных нейронов 17 и клеток Hela 18 , но имеет также клиническое применение, как беременность и прогнозирования анеуплоидии 19,20. Покадровый микроскопии обеспечивает embryologстов с дополнительной информацией о развитии эмбриона для клинической беременности, и вполне возможно, что эта информация может быть использована для улучшения нашей способности выбрать жизнеспособных эмбрионов для переноса. Дополнительные преимущества использования Интерв микроскопии включают меньше обработки эмбрионов и их блюда для промежуточных наблюдений, которые позволили бы сократить риск потери или загрязнения в лаборатории 19.
Клетки способны поддерживать здоровую митохондриальной гомеостаз путем разрушения поврежденных и дисфункциональные митохондрии через mitophagy. Дефектный mitophagy связана с болезнью Паркинсона 21, 22 апоптоз, старение и рак 23 24. Mitophagy движет убиквитинлигазы Паркин и PINK1 21. Ввиду важности этого процесса для поддержания здорового состояния митохондрий, мы обнаружили, что важно изучить динамику этого события, используя замедленную видеомикроскопия. Предлагаемый протокол предоставит данные о том, как митохондрии гомеостаз влияет при различных клеточных условиях, в том числе изменения в экспрессии генов и белковых функций.
В этом исследовании мы трансфицированы фибробласты с помощью электропорации. Метод электропорации применяет электрический импульс при оптимизированном напряжения длительностью несколько микросекунд к клеточной суспензии, с тем, чтобы увеличить проницаемость клеточной мембраны, нарушая фосфолипидный бислой мембраны. Это действие приводит к образованию временных пор. Мембрана пермеабилизации позволяет ДНК быть введен в клетку 25. Мы выбрали этот процесс скоротечно фибробласты трансфекции, чтобы иметь более высокую эффективность трансфекции обеих плазмид EYFP-Parkin и pDsRed2-Mito. На самом деле, процесс электропорации примерно в десять раз эффективнее , чем химические трансфекцией 26. Процесс приобретения изображений может быть поставлена под угрозу обоими External факторы; колебания температуры, вибрации, влажности и внутренних факторов; рН, подвижность клеток. Электропорации и люминесцентная отслеживания два шага считаются наиболее важным для успеха этого экспериментального протокола. Даже если эффективность трансфекции выше, чем другие методы, электропорации убивает ~ 20% электропорации клеток. Еще одним важным вопросом является качество сбора изображений во время этапа мониторинга. Поскольку сотовая среда динамична, фокальная плоскость нуждается в постоянной корректировки, чтобы поддерживать фокус на протяжении всего процесса приобретения.
Митохондриальной повреждение может быть вызвано с помощью мембранной митохондриальной деполяризации и окислительного стресса. Эти факторы вызывают mitophagic реакцию. Доказательства того, что митохондрии деполяризация может вызывать селективное mitophagy происходит от фотостарения экспериментов , которые приводят к ROS производства и митохондриальной травмы 27-30. Для того, чтобы вызвать митохондриальную MEM-брана деполяризацию и mitophagic ответ, FCCP был использован в качестве протонофора 10. FCCP является Ионофор, что позволяет протоны пересекать бислоев, побуждающие деполяризацию мембраны. Используя этот подход, мы индуцированное mitophagy и следовали за динамикой молекулярного маркера.
Концентрация FCCP имеет решающее значение, так как она может быть цитотоксическое и способствовать клеточной смерти. Поскольку этот подход основан на наблюдении живых клеток, конечная концентрация FCCP должна быть скорректирована в зависимости типа клеток образом для того, чтобы побудить mitophagy без инициировать механизмы, которые приводят к клеточной смерти.
В целом, мы считаем, что вслед за динамикой mitophagy, используя EYFP-Паркин как флуоресцентным маркером, обеспечит новое понимание митохондриальной функции. Избирательное удаление митохондрий с помощью mitophagy является важнейшим процессом в поддержании митохондриальной качества, жизнеспособности клеток и гомеостаза. Такой подход живой визуализации будет онЛ.П., чтобы понять процесс mitophagic под здоровых и стрессовых условиях.
Современные подходы дальнейшего расширения покадровой микроскопии наблюдения за создания фильмов клеточной динамики. Все чаще эта граница размыта , как цитометрии методы интегрируются с методами визуализации для мониторинга и измерения динамических деятельности клеток и субклеточных структур 31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning Life Science | 10-013-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Phenol-free DMEM | Corning Life Science | 17-205-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Pre-warm at 37 °C before use |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Penicillin/streptomycin | Corning Life Science | 30-002-CI | Pre-warm at 37 °C before use |
| EYFP-PARKIN expression vector | Addgene | 23955 | |
| pDsRed2-Mito expression vector | Clontech | 632421 | |
| Nucleofector 2B device | LONZA | AAD-1001S | |
| Nucleofector for kit R NIH/3T3 | LONZA | VCA-1001 | |
| ZEISS AXIOVERT 200M inverted microscope | CARL ZEISS | ||
| Carbonyl Cyanide 4-(trifluoromethoxy)-Phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Experimental Builder | |
| ImageJ | National Institute of Health | Experimental Builder |
References
- Youle, R. J., Narendra, D. P.
- Zhi, X., Zhong, Q.
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biol Chem. 393, 547-564 (2012).
- Lemasters, J. J. Selective mitochondrial autophagy, or mitophagy, as a targeted defense against oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and aging. Rejuvenation Res. 8, 3-5 (2005).
- Kissova, I., Deffieu, M., Manon, S., Camougrand, N. Uth1p is involved in the autophagic degradation of mitochondria. J Biol Chem. 279, 39068-39074 (2004).
- Kubli, D. A., Gustafsson, A. B. Mitochondria and mitophagy: the yin and yang of cell death control. Circ Res. 111, 1208-1221 (2012).
- Redmann, M., Dodson, M., Boyer-Guittaut, M., Darley-Usmar, V., Zhang, J. Mitophagy mechanisms and role in human diseases. Int J Biochem Cell Biol. 53, 127-133 (2014).
- Di Sante, G., et al. Loss of sirt1 promotes prostatic intraepithelial neoplasia, reduces mitophagy, and delays park2 translocation to mitochondria. Am J Pathol. 185, 266-279 (2015).
- Tanaka, A. Parkin-mediated selective mitochondrial autophagy, mitophagy: Parkin purges damaged organelles from the vital mitochondrial network. FEBS Lett. 584, 1386-1392 (2010).
- Shiba-Fukushima, K., et al. PINK1-mediated phosphorylation of the Parkin ubiquitin-like domain primes mitochondrial translocation of Parkin and regulates mitophagy. Sci Rep. 2, 1002 (2012).
- Trinh, J., Farrer, M.
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
- Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochem Biophys Res Commun. 7, 272-275 (1962).
- Karan, G., Yang, Z., Zhang, K. Expression of wild type and mutant ELOVL4 in cell culture: subcellular localization and cell viability. Mol Vis. 10, 248-253 (2004).
- Jin, S. M., Youle, R. J. PINK1- and Parkin-mediated mitophagy at a glance. J Cell Sci. 125, 795-799 (2012).
- Kerr, M. C., et al. Visualisation of macropinosome maturation by the recruitment of sorting nexins. J Cell Sci. 119, 3967-3980 (2006).
- Edin, F., et al. 3-D gel culture and time-lapse video microscopy of the human vestibular nerve. Acta Otolaryngol. 134, 1211-1218 (2014).
- Ramsden, A. E., Mota, L. J., Munter, S., Shorte, S. L., Holden, D. W. The SPI-2 type III secretion system restricts motility of Salmonella-containing vacuoles. Cell Microbiol. 9, 2517-2529 (2007).
- Meseguer, M., et al. Embryo incubation and selection in a time-lapse monitoring system improves pregnancy outcome compared with a standard incubator: a retrospective cohort study. Fertil Steril. 98, 1481-1489 (2012).
- Campbell, A., et al. Modelling a risk classification of aneuploidy in human embryos using non-invasive morphokinetics. Reprod Biomed Online. 26, 477-485 (2013).
- Bingol, B., et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 510, 370-375 (2014).
- Carroll, R. G., Hollville, E., Martin, S. J. Parkin sensitizes toward apoptosis induced by mitochondrial depolarization through promoting degradation of Mcl-1. Cell Rep. 9, 1538-1553 (2014).
- Batlevi, Y., La Spada, A. R. Mitochondrial autophagy in neural function, neurodegenerative disease, neuron cell death, and aging. Neurobiol Dis. 43, 46-51 (2011).
- Frank, M., et al. Mitophagy is triggered by mild oxidative stress in a mitochondrial fission dependent manner. Biochim Biophys Acta. 1823, 2297-2310 (2012).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-845 (1982).
- Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophys Chem. 19, 211-225 (1984).
- Lemasters, J. J. Variants of mitochondrial autophagy: Types 1 and 2 mitophagy and micromitophagy (Type 3). Redox Biol. 2, 749-754 (2014).
- Aggarwal, B. B., Quintanilha, A. T., Cammack, R., Packer, L. Damage to mitochondrial electron transport and energy coupling by visible light. Biochim Biophys Acta. 502, 367-382 (1978).
- Alexandratou, E., Yova, D., Handris, P., Kletsas, D., Loukas, S. Human fibroblast alterations induced by low power laser irradiation at the single cell level using confocal microscopy. Photochem Photobiol Sci. 1, 547-552 (2002).
- Kim, I., Lemasters, J. J. Mitophagy selectively degrades individual damaged mitochondria after photoirradiation. Antioxid Redox Signal. 14, 1919-1928 (2011).
- Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions. J Cell Sci. 126, 3805-3815 (2013).
