Protocol
Hem ifade vektörleri EYFP-Parkin ve pDsRed2-Mito ile fibroblast 1. elektroporasyonu
- 100 mg / ml DMEM (Dulbecco değiştirilmiş Eagle ortamı),% 10 fetal bovin serumu, 2 mmol / L L-glutamin, 100 U / ml penisilin ortamı kullanılarak 10 sm doku kültürü plakasında ölümsüzleştirilmiş fare embriyonik fibroblast hücreleri büyür ve 37 ° C'de,% 5 CO2 içeren nemli bir atmosferde kültürlendi.
- % 80 hücre Akışların birleştiği yerde hücreler, HPO 4, KH 2.4 g, steril emilerek tam bir DMEM ortamıyla atmak ve steril 1 x fosfat tampon çözeltisi (10 ml PBS) (NaCl 80 g, KCl 2.0 g, Na 2, 14.4 g ekleme 7.4): 2 PO 4 ve 1 L H2O PH damıtıldı.
- Steril emme PBS atın ve Tripsin-EDTA% 0.25 1 ml ekleyin. (- 3 dk 2) Hücreler müstakil kadar 37 ° C'de inkübe plakası. _, Tam DMEM orta 4 ml ekleyin hücreleri tekrar süspansiyon ve 10 çıkar6; hemositometre sayımı hücre süspansiyonu l.
Not: 16 Köşe kareler bir takım hücre sayısı hücrelerin x 10 4 / mi sayısına eşit olacak şekilde hemositometre tasarlanmıştır.
- Elektroporasyon işlemine 24 saat önce 10 cm doku kültürü yemekleri üzerine Tohum 1 x 10 6 hücre.
- Steril emilerek tam bir DMEM ortamıyla atın ve steril 10 ml PBS ilave edin. Steril emme PBS atın ve Tripsin-EDTA% 0.25 1 ml ekleyin. (- 3 dk 2) Hücreler müstakil kadar 37 ° C'de inkübe plakası. tam bir DMEM ortamıyla 4 ml ilave edilir ve 15 ml'lik bir tüp içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
- bir buzdolabında-santrifüj (4 ° C) ile 5 dakika boyunca 250 xg'de hücreleri aşağı doğru döndürün. Steril emme Süpernatantı atın ve steril PBS 1 ml pelletini. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 xg'de hücreleri aşağı doğru döndürün.
- Steril emerek supernatant atmak ve 100 ul o ekleyinelektroporasyon f çözüm karışımı hücre pelet (82 Company solüsyon 1 elektroporasyon Çözüm V + 18 ul ul) ve hafifçe pipetleme pelletini (Daha fazla bilgi için kullanım kılavuzuna başvurun). hücre süspansiyonu de EYFP-Parkin (uyarma / emisyon 514/527) ve 1 mcg pDsRed2-Mito (uyarma / emisyon 565/620) 2 ug ekleyin.
- tek kullanımlık pastör kullanarak steril küvete solüsyonu (her iki araç kiti ile birlikte sağlanır) aktarın ve önceden ayarlanmış bir program NIH / 3T3 U-030 (Tek nabız, gerilim 200 V, kapasitans 960 mF, darbe süresi 20 milisaniye kullanarak electroporate , darbe sayısı: 1).
- 37 ° C'de,% 5 CO2 içeren nemli bir atmosferde bunları hemen Elektroporasyon işleminden sonra, taze, önceden ısıtılmış tam bir DMEM ortamıyla 500 ul ve 6 cm doku kültürü plakası, canlı görüntü dereceli hücreyi tohum ve inkübe 24 saat.
2. Time-Lapse video Mikroskopi
- Bu noktada deney protokolü ile devam etmek için, belirli bir canlı görüntüleme ortamı hazırlar. aşağıdaki gibi canlı görüntüleme ortamı hazırlayın; karıştırın DMEM fenol içermeyen,% 10 fetal bovin serumu, 2 mmol / L L-glutamin, 100 U / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin ile takviye edilmiştir. Bir su banyosu içinde 37 ° C 'de, canlı görüntü ortamı önceden ısıtın.
- Steril emilerek elektroporasyona hücre ortamı atılır ve P1000 pipet kullanarak, önceden ısıtılmış canlı görüntüleme ortamının 1 ml ilave edilir ve 37 ° C'de 30 dakika süreyle plaka inkübe edin.
- 37 ° C'lik bir sabit sıcaklıkta önce mikroskop odasındaki Plaka, inkübasyon süresi, akış,% 5 CO2 içinde.
- büyük hareketler ya da salınımları kaçınarak mikroskobun odasına Electroporated hücreleri ile plaka koyun.
- Yazılım arayüzü kullanarak, her iki fluore tespit etmek için mikroskop ayarlamakko-transfekte vektörler tarafından kodlanan füzyon proteinleri scence sinyalleri EYFP-Parkin ve (Uyarım aralığı 495 nm ve emisyon aralığı yeşil 520-550 nm, 510) pDsRed2-Mito (Uyarım maksimum 558 nm ve emisyon maksimum 583 nm, kırmızı).
- time-lapse video mikroskopi yazılımını açın. Üst menüde pDsRed2-Mito için EYFP-Parkin ve rodamin için FITC seçin. Üst menüde büyütme (20X) seçin.
- yazılım arayüzü kullanarak, hem birlikte transfekte vektörleri ifade tek bir hücre için bakmak ve konumunu kaydeder. 10 hücrelerinin en az her deneysel koşul (Deney grubu) için toplanana kadar bu adımı tekrarlayın.
- menu "Uygulamalar" ı seçin ve Çok Boyutlu Edinme tıklayın. Çok Boyutlu Toplama pencerelerinde bu tür satın almalar sayısı, her satın alma ve kaydedilen hücrenin konumu arasındaki zaman aralığı olarak gerekli parametreleri seçin. Edinme "üzerine tıklayın"Satın alma işlemini başlatmak için.
- EYFP-Parkin ve 15 dakika olmak üzere toplam aralığı için görüntüleri her 5 dakikada toplama DsRed2-Mito floresan sinyal hem bazal alımı başlatabilirsiniz.
- son çalışma konsantrasyonu iki katından daha yüksek bir FCCP bir konsantrasyon ile önceden ısıtılmış canlı görüntüleme ortamı hazırlayın (0,1-10 uM, hücre tipine bağlı olarak).
- satın alma işlemini kesintiye ve P1000 pipet kullanarak mikroskobun odasının içine plakasına FCCP önceden ısıtılmış canlı görüntüleme ortamı yavaşça 1 ml ekleyin.
- daha önce kaydedilmiş konumu kullanarak, 3 saatlik bir toplam süre için, tarif edildiği gibi elde etme işlemi başlatın. bunları analiz ve satın alma bittiğinde mitophagic sürecinin bir video oluşturmak için tüm kazanılmış görüntüleri kaydedin.
3. Analiz
- Bir kişisel bilgisayarda ".tiff" biçiminde tüm kazanılmış görüntüleri toplayın
- Bir grafik yumuşak görüntüleri açıngereçleri ve zamansal aralık define (Görüntüler her 5 dakika edinilen) mitokondrial membran içine Parkin istihdamı gösteren ilk görüntüye FCCP mitokondriyal kaynaklı-depolarizasyon dan oluştu. Deney grubunda, her bir hücre için, bu analiz tekrarı.
- Deney grubu adıyla bir tablo üzerinde sütunun ilk hücresini Etiket. her bir deney grubu için, 10 hücreleri en az Parkin alımı için zamansal aralıkları ölçmek. Parkin işe alım için hesaplanan geçici aralıklarla ortalama yapın ve her bir deney grubu için standart sapmayı tanımlamak (Ortalama ± SD, n = 10).
- sütun tek hesaplanan geçici aralıklarla içine düzenleyin. Her sütun n = deney grubunun 10 ölçümlerini içerir.
- Formula Builder menüden fonksiyon "ortalama" seçeneğini seçin. sütunundaki verileri seçin. Formula Builder menüden fonksiyon "Standart Sapma" seçeneğini seçin. Selesütundaki veriler, CT.
- istatistiksel bir yaklaşım kullanarak, deney grupları arasında mitophagy dinamiği önemli bir fark tanımlamak için uygun istatistik uygulayarak deney grupları karşılaştırmak. (Örneğin, iki grup = Student t-testi, üç veya daha fazla gruplar = ANOVA artı bir post-hoc testi)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yazıda, time-lapse video mikroskopi tek bir hücrede floresan etiketli proteinlerin moleküler olayları takip etmek için kullanılabilecek güçlü bir tekniktir nasıl gösterir. temsilcisi sonuçları da bu tekniğin yüksek kaliteli görüntüler elde edilmesi için izin verir nasıl gösterir. Moleküler sürecinin görüntüleri elde edilir, biz farklı şekillerde bunları analiz için fırsat var. Burada, biz seçici hasarlı mitokondri kaldırarak hücresel homeostazı korumak önemli moleküler süreç kaynaklı mitophagy sürecinin başlaması arasındaki zaman aralığını analiz eder.
Bu teknik geniş bir uygulama yelpazesi kurar. Bu tür hücre göçü veya incelenmesi gereken vardır süreçte yer alan önemli moleküllerin etiketleme yoluyla mikro moleküler olaylar gibi makro hücresel sürecinin izlenmesi için ya da kullanılabilir.
o: keep-together.within-page = "1"> Parkin-aracılı Mitophagy
Hasarlı ve işlevsiz mitokondri işlemi seçici Parkin-aracılı çıkarılması sökme maddesi FCCP ile indüklenen bir membran depolarizasyon dış mitokondriyal membran PINK1 alımı seçici Parkin-aracılı mitophagy tetikler Şekil 1 'de özetlenmiştir. Ardından, Parkin hasarlı mitokondri için işe ve PINK1 ile etkileşime girer. Bu kompleks Parkin-PINK1 hasarlı organel ubikitinasyonuna ve lizozom ile kaynaştıran bir autophagosome, içine kurulduğu yol açar. Mitophagy olarak bilinen bu proses, sağlıklı bir hücresel çevreye tutmak fonksiyonel mitokondrilerinin 8,15 yenilenmesini sağlamak için çok önemli bir metabolik proses olduğu kabul edilir.
Deneysel Protokol
"fo: keep-together.within-PAGE =" nt 1 "> Şekil 2, deneysel protokol öncesi ve FCCP kaynaklı mitophagy işleminden sonra EYFP-Parkin alımı aşağıdakiler için kullanılan mikroskop kurulumu şematik bir temsilini göstermektedir.Depolarize Mitokondriyal Membran Parkin alımı
Şekil 3A, biz Parkin dağıtım öncesi ve sonrası FCCP yönetimini gösterir. Bazal zaman noktalarında (BT5, BT10 ve BT15 dk) sırasında EYFP-Parkin (Yeşil) homojen hücre boyunca yayılır ve mitokondri ağ (Kırmızı) de birbirine görünmektedir. FCCP yönetiminin (FT = 0 dakika) (Şekil 3B) ardından, mitokondri fraksiyonasyon (FT = 5 dk) gözlemlemek. Ancak, EYFP-Parkin hala homojen sitoplazma olsa dışarı yayılır. Mitophagy, 55 dakika sonrası FCCP yönetiminin de uyarılırEYFP-Parkin mitophagy sürecini (= 55 FT) tetiklemek için hasarlı mitokondriyal membranların da işe.
Şekil 1. Parkin-aracılı Mitophagy şematik gösterimi. Olası bir membran (Ψm) azalması ve zarar görmüş işlevsel mitokondri oluşur ve sökme maddesi FCCP tarafından indüklenebilir. Membran potansiyeli kaybı, dış mitokondriyal membran PINK1 (Kırmızı) alımı, seçici Parkin aracılı mitophagy tetikler. Parkin (Mavi) doğrudan PINK1 ile etkileşerek hasarlı mitokondri işe alınır. Parkin varlığı ubikuitinasyomınun hasarlı organelle (Sarı) ve lizozom ile kaynaştıran bir autophagosome, içine onun birleşme yol açar. Bu rakamın büyük halini görmek için tıklayınız.
Deneysel Protokol Şekil 2. Mikroskop Set-up ve Temsil. Protokol bölümünde açıklanan deneysel olayların (A) genel bakış. Bildirilen deneysel olaylar operatör geçici bir (B) kullanarak FCCP kaynaklı mitophagy sürecini time-lapse video mikroskopi yaklaşım set-up takip etmek için elektroporasyon ile EYFP-Parkin ve pDsRed2-Mito hücreleri ko-transfekte sağlar. BT bazal zaman noktasını =; FT = FCCP zaman noktası. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Parkin Recruitme Gösterilen Şekil 3. fibroblast hücre Mitokondriyal Membran Depolarizasyon mitokondri (kırmızı) içine FCCP. EYFP-Parkin (yeşil) translokasyonu Bağlı nt sonra bazal bir zaman noktasında (BT) sırasında time-lapse video mikroskobu ile izlenen ve FCCP yönetimini (FT) sonrası edildi. BT = 0 dan, EYFP-Parkin ve mitokondriyal floresan her 5 dakikada tespit edildi. (A) EYFP-Parkin homojen tüm bazal dönemi boyunca dağınık ve mitokondriyal ağ bozulmamış (beyaz oklar) mesafesindedir. FCCP tarafından nedeniyle membran depolarizasyon (B) Mitokondriyal fraksiyon FT = 55 dakika (beyaz oklar) başladı hasarlı mitokondriyal membranların FT = 5 dakika (beyaz oklar) ve EYFP-Parkin işe kaydedilir. beyaz kutular paneller (5X) büyütülmüş alanı temsil etmektedir. Bu deneysel protokol uygulanmasına ilişkin daha ayrıntılı bilgi için 8 başvuru bakın. (Ölçek çubuğu: 10 mikron).> Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Time-lapse mikroskopi uzun süre boyunca hücresel dinamiklerinin gözlem zamanında tek bir gözlem canlı hücre görüntüleme uzanan tekniği olarak tanımlanabilir. bu gözlemci gerçek zamanlı olarak tek bir floresan etiketli protein tespit ve tek bir canlı hücrenin içinde kendi dinamiğini takip sağlar, çünkü bu yöntem, basit bir konfokal veya canlı hücre mikroskopi ayrılır. Aslında, konfokal mikroskopi kolayca flüoresan antikor kullanılarak imüno-etiketli proteinlerin tanımlar, ancak, hücre ve canlı ortamda molekül etkinlik gözlemleyerek izin vermez.
Time-lapse video mikroskopi esas olarak HEK293 16 olarak farklı hücre tipleri, birincil nöronlar 17 ve Hela hücrelerinde 18 moleküler süreçleri takip araştırmalarda kullanılan, aynı zamanda klinik gebelik gibi uygulama ve anöploidi 19,20 tahmin vardır. Time-lapse mikroskopi embryolog sağlarKlinik gebelik için embriyo gelişimi hakkında ek bilgi ile ists ve bilgilerin transferi için embriyo seçmek için yeteneğini geliştirmek için kullanılabilir olması mümkündür. Time-lapse mikroskobu kullanımının ek avantajları daha az embriyo işlenmesini ve laboratuvar 19 içinde kaybı veya bulaşma riskini azaltacak ara gözlemler, onların yemekleri içerir.
Hücreler mitophagy yoluyla hasarlı ve işlevsiz mitokondri aşağılayıcı sağlıklı mitokondriyal homeostazı muhafaza edebiliyoruz. Arızalı mitophagy, Parkinson hastalığı 21 ile bağlantılı 23 ve kanser 24 yaşlanma 22 apoptozdur. Mitophagy ubikitin ligaz Parkin ve PINK1 21 ile tahrik edilir. Nedeniyle sağlıklı bir mitokondriyal statüsünü korumak için bu sürecin önemine, bunun önemli bir time-lapse video mikroskopi kullanılarak bu olayın dinamik çalışma bulundu. önerilen proProtokolün mitokondri homeostasis gen ifadesi ve protein fonksiyonlarında değişiklikler dahil olmak üzere farklı hücresel şartlar altında nasıl etkilendiğini delil sağlayacaktır.
Bu çalışmada, geçici transfekte edilmiş elektroporasyon ile fibroblastlar. Elektroporasyon yöntemi membran fosfolipid çift tabakası bozarak hücre membranının geçirgenliğini arttırmak için hücre süspansiyonuna bir kaç mikrosaniye süren bir optimize edilmiş bir voltajda bir elektrik akımı uygulanır. Bu işlem, geçici bir gözenek oluşumu ile sonuçlanır. Membran geçirgenleştirilmesi DNA, hücrenin 25 içine sağlar. Bu geçici olarak her iki plazmid EYFP-Parkin ve pDsRed2-Mito yüksek transfeksiyon randımanına sahip olduğu için fibroblastlarını transfekte etmek üzere bu süreci etti. Aslında, elektroporasyon işlemi, kimyasal transfeksiyon 26 yaklaşık olarak on kat daha etkilidir. Görüntüler edinim süreci hem Exte tarafından tehlikeye girebilirrnal faktörler; sıcaklık dalgalanmaları, titreşimler, nem ve iç faktörler; pH değeri, hücre hareketi. elektroporasyon ve floresan izleme Bu deneysel protokol başarısı için en kritik olduğu düşünülen iki adım vardır. transfeksiyon verimi diğer yöntemlere göre daha yüksek olsa bile, elektroporasyon ~ elektroporate edilmiş hücrelerde% 20 öldürür. Bir diğer önemli konu izleme aşaması sırasında görüntülerin elde edilmesi kalitesidir. Hücresel çevre dinamik olduğundan, odak düzlemi elde etme sürecinde odak korumak için sürekli ayarlamalar gerekiyor.
Mitokondriyal hasar zarı mitokondriyal depolarizasyon ve oksidatif strese bağlı olabilir. Bu faktörler, mitophagic tepkisi oluşturur. Mitokondri depolarizasyon seçici mitophagy uyarabilir dair kanıtlar ROS üretimi ve mitokondriyal hasar 27-30 sebep fotoyaşlanma deneyleri geliyor. mitokondriyal mem indüklemek içinmembran depolarizasyon ve mitophagic yanıt FCCP protonophore 10 olarak kullanılmaktadır. FCCP proton membran depolarizasyon uyaran lipit katmanlarını geçmeye izin veren bir iyonofor olduğunu. Bu yaklaşımı kullanarak biz mitophagy uyarılan ve moleküler işaretleyici dinamiğini izledi.
o sitotoksik ve hücresel ölümü teşvik gibi FCCP konsantrasyonu çok önemlidir. Bu yaklaşım, canlı hücre gözlemine dayanır için, FCCP nihai konsantrasyon mitophagy sebep olmaksızın hücresel ölüme neden mekanizmaları tetiklemek için, bir hücre tipi bağlı bir şekilde ayarlanmalıdır.
Genel olarak, biz floresan işaretleyici olarak EYFP-Parkin kullanarak mitophagy dinamiği, aşağıdaki, mitokondriyal fonksiyon yeni bakış açıları sağlayacaktır diye düşünüyorum. mitophagy yoluyla mitokondri seçici çıkarılması mitokondriyal kalite, hücre canlılığı ve vücut dengesinin sürdürülmesinde önemli bir süreçtir. Bu canlı görüntüleme yaklaşımı da olacaklp sağlıklı ve stresli koşullarda mitophagic süreci anlamak için.
Modern yaklaşımlar daha hücresel dinamikleri film yapmaya ötesinde time-lapse mikroskopi gözlemlerini uzatıyoruz. Sitometrik teknikleri izleme ve hücreleri ve hücre içi yapıların 31 dinamik faaliyetlerini ölçmek için görüntüleme yöntemleri ile entegre ediliyor giderek bu sınır bulanık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning Life Science | 10-013-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Phenol-free DMEM | Corning Life Science | 17-205-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Pre-warm at 37 °C before use |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Penicillin/streptomycin | Corning Life Science | 30-002-CI | Pre-warm at 37 °C before use |
| EYFP-PARKIN expression vector | Addgene | 23955 | |
| pDsRed2-Mito expression vector | Clontech | 632421 | |
| Nucleofector 2B device | LONZA | AAD-1001S | |
| Nucleofector for kit R NIH/3T3 | LONZA | VCA-1001 | |
| ZEISS AXIOVERT 200M inverted microscope | CARL ZEISS | ||
| Carbonyl Cyanide 4-(trifluoromethoxy)-Phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Experimental Builder | |
| ImageJ | National Institute of Health | Experimental Builder |
References
- Youle, R. J., Narendra, D. P.
- Zhi, X., Zhong, Q.
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biol Chem. 393, 547-564 (2012).
- Lemasters, J. J. Selective mitochondrial autophagy, or mitophagy, as a targeted defense against oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and aging. Rejuvenation Res. 8, 3-5 (2005).
- Kissova, I., Deffieu, M., Manon, S., Camougrand, N. Uth1p is involved in the autophagic degradation of mitochondria. J Biol Chem. 279, 39068-39074 (2004).
- Kubli, D. A., Gustafsson, A. B. Mitochondria and mitophagy: the yin and yang of cell death control. Circ Res. 111, 1208-1221 (2012).
- Redmann, M., Dodson, M., Boyer-Guittaut, M., Darley-Usmar, V., Zhang, J. Mitophagy mechanisms and role in human diseases. Int J Biochem Cell Biol. 53, 127-133 (2014).
- Di Sante, G., et al. Loss of sirt1 promotes prostatic intraepithelial neoplasia, reduces mitophagy, and delays park2 translocation to mitochondria. Am J Pathol. 185, 266-279 (2015).
- Tanaka, A. Parkin-mediated selective mitochondrial autophagy, mitophagy: Parkin purges damaged organelles from the vital mitochondrial network. FEBS Lett. 584, 1386-1392 (2010).
- Shiba-Fukushima, K., et al. PINK1-mediated phosphorylation of the Parkin ubiquitin-like domain primes mitochondrial translocation of Parkin and regulates mitophagy. Sci Rep. 2, 1002 (2012).
- Trinh, J., Farrer, M.
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
- Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochem Biophys Res Commun. 7, 272-275 (1962).
- Karan, G., Yang, Z., Zhang, K. Expression of wild type and mutant ELOVL4 in cell culture: subcellular localization and cell viability. Mol Vis. 10, 248-253 (2004).
- Jin, S. M., Youle, R. J. PINK1- and Parkin-mediated mitophagy at a glance. J Cell Sci. 125, 795-799 (2012).
- Kerr, M. C., et al. Visualisation of macropinosome maturation by the recruitment of sorting nexins. J Cell Sci. 119, 3967-3980 (2006).
- Edin, F., et al. 3-D gel culture and time-lapse video microscopy of the human vestibular nerve. Acta Otolaryngol. 134, 1211-1218 (2014).
- Ramsden, A. E., Mota, L. J., Munter, S., Shorte, S. L., Holden, D. W. The SPI-2 type III secretion system restricts motility of Salmonella-containing vacuoles. Cell Microbiol. 9, 2517-2529 (2007).
- Meseguer, M., et al. Embryo incubation and selection in a time-lapse monitoring system improves pregnancy outcome compared with a standard incubator: a retrospective cohort study. Fertil Steril. 98, 1481-1489 (2012).
- Campbell, A., et al. Modelling a risk classification of aneuploidy in human embryos using non-invasive morphokinetics. Reprod Biomed Online. 26, 477-485 (2013).
- Bingol, B., et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 510, 370-375 (2014).
- Carroll, R. G., Hollville, E., Martin, S. J. Parkin sensitizes toward apoptosis induced by mitochondrial depolarization through promoting degradation of Mcl-1. Cell Rep. 9, 1538-1553 (2014).
- Batlevi, Y., La Spada, A. R. Mitochondrial autophagy in neural function, neurodegenerative disease, neuron cell death, and aging. Neurobiol Dis. 43, 46-51 (2011).
- Frank, M., et al. Mitophagy is triggered by mild oxidative stress in a mitochondrial fission dependent manner. Biochim Biophys Acta. 1823, 2297-2310 (2012).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-845 (1982).
- Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophys Chem. 19, 211-225 (1984).
- Lemasters, J. J. Variants of mitochondrial autophagy: Types 1 and 2 mitophagy and micromitophagy (Type 3). Redox Biol. 2, 749-754 (2014).
- Aggarwal, B. B., Quintanilha, A. T., Cammack, R., Packer, L. Damage to mitochondrial electron transport and energy coupling by visible light. Biochim Biophys Acta. 502, 367-382 (1978).
- Alexandratou, E., Yova, D., Handris, P., Kletsas, D., Loukas, S. Human fibroblast alterations induced by low power laser irradiation at the single cell level using confocal microscopy. Photochem Photobiol Sci. 1, 547-552 (2002).
- Kim, I., Lemasters, J. J. Mitophagy selectively degrades individual damaged mitochondria after photoirradiation. Antioxid Redox Signal. 14, 1919-1928 (2011).
- Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions. J Cell Sci. 126, 3805-3815 (2013).
