Protocol
दोनों अभिव्यक्ति वैक्टर EYFP-Parkin और pDsRed2-Mito साथ तंतुकोशिका 1. Electroporation
- DMEM (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम) मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 mmol / एल एल glutamine, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन के साथ पूरक का उपयोग करते हुए 10 सेंटीमीटर ऊतक संस्कृति की थाली पर अमर माउस भ्रूण fibroblast कोशिकाओं को विकसित, और 100 मिलीग्राम / मिलीलीटर humidified 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 युक्त वातावरण में स्ट्रेप्टोमाइसिन।
- 80% सेल confluency पर, बाँझ सक्शन द्वारा पूरा DMEM मध्यम त्यागने और HPO 4, के.एच. का 2.4 जी (पीबीएस) बाँझ 1x फॉस्फेट बफर समाधान के 10 मिलीलीटर (सोडियम क्लोराइड की 80 ग्राम, KCl की 2.0 ग्राम, ना 2 के 14.4 ग्राम जोड़ें 7.4): 2 पीओ 4 और 1 एल एच 2 ओ, पीएच आसुत।
- बाँझ सक्शन द्वारा पीबीएस त्यागें और trypsin-EDTA 0.25% के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं जब तक कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं (2 - 3 मिनट)। , पूरा DMEM माध्यम के 4 मिलीलीटर जोड़ें कोशिकाओं resuspend और 10 बाहर ले _6; hemocytometer गिनती के लिए सेल निलंबन के एल।
नोट: hemocytometer तो यह है कि 16 कोने वर्गों में से एक सेट में कोशिकाओं की संख्या कोशिकाओं 10 x 4 / एमएल की संख्या के बराबर है बनाया गया है।
- 10 सेमी टिशू कल्चर व्यंजन 24 घंटे electroporation प्रक्रिया से पहले बीज पर 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं।
- बाँझ सक्शन द्वारा पूरा DMEM मध्यम त्यागें और बाँझ पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें। बाँझ सक्शन द्वारा पीबीएस त्यागें और trypsin-EDTA 0.25% के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं जब तक कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं (2 - 3 मिनट)। पूरा DMEM मध्यम के 4 मिलीलीटर जोड़ें और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं resuspend।
- कोशिकाओं को एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र (4 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग कर 5 मिनट के लिए 250 XG पर स्पिन। बाँझ सक्शन से सतह पर तैरनेवाला त्यागें और बाँझ पीबीएस के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend। कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 250 XG पर स्पिन।
- बाँझ सक्शन से सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और 100 μl हे जोड़ेंelectroporation के लिए एफ समाधान मिश्रण सेल गोली (electroporation समाधान वी + 18 पूरक समाधान 1 की μl के 82 μl) और धीरे pipetting द्वारा गोली resuspend (अधिक जानकारी के लिए उपयोगकर्ता के गाइड को देखें)। EYFP-Parkin (उत्तेजना / उत्सर्जन 514/527) और 1 माइक्रोग्राम pDsRed2-Mito (/ उत्तेजना उत्सर्जन 565/620) के 2 माइक्रोग्राम प्रति सेल निलंबन पर जोड़ें।
- बाँझ क्युवेट एक डिस्पोजेबल पाश्चर का उपयोग करने के समाधान (दोनों उपकरण किट के साथ प्रदान की जाती हैं) स्थानांतरण और पूर्व निर्धारित कार्यक्रम एनआईएच / 3T3 यू-030 (एकल पल्स, वोल्टेज 200 वी, समाई 960 μF, नाड़ी समय 20 मिसे का उपयोग कर electroporate , नाड़ी संख्या: 1)।
- इसके तत्काल बाद electroporation के बाद, के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर युक्त 5% सीओ 2 एक humidified वातावरण में ताजा पूर्व गर्म पूरा DMEM माध्यम के 500 μl जोड़ें और एक 6 सेमी ऊतक संस्कृति की थाली रहते इमेजिंग ग्रेड पर सेल बीज के लिए और उन्हें सेते चौबीस घंटे।
2. समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी
- इस बिंदु पर, एक विशिष्ट रहते इमेजिंग मध्यम प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने के लिए तैयार करते हैं। इस प्रकार के रूप में रहते इमेजिंग के माध्यम से तैयार; मिश्रण DMEM फिनोल मुक्त 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 mmol / एल एल glutamine, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, और 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक। 37 डिग्री सेल्सियस पर रहते इमेजिंग मध्यम पूर्व गर्म पानी के स्नान में।
- बाँझ सक्शन द्वारा electroporated कोशिकाओं के मध्यम त्यागें और पूर्व गर्म रहते इमेजिंग के माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, एक P1000 pipet का उपयोग और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए थाली सेते हैं।
- प्लेट ऊष्मायन अवधि, बाढ़ 5% सीओ 2 माइक्रोस्कोप के पहले ही कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर स्थिर दौरान।
- माइक्रोस्कोप के कक्ष प्रमुख आंदोलनों या दोलनों से बचने में electroporated कोशिकाओं के साथ थाली रखें।
- सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस का उपयोग करना, ताकि दोनों fluore पता लगाने के लिए माइक्रोस्कोप सेटसह ट्रांसफ़ेक्ट वैक्टर द्वारा इनकोडिंग संलयन प्रोटीन से Scence का संकेत है, EYFP-Parkin और (उत्तेजना रेंज 495 510 एनएम और उत्सर्जन सीमा 520 करने के लिए 550 एनएम, हरे रंग के लिए) pDsRed2-Mito (उत्तेजना अधिकतम 558 एनएम और उत्सर्जन अधिकतम 583 एनएम, लाल)।
- समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर खोलें। ऊपरी मेनू में pDsRed2-Mito के लिए EYFP-Parkin और rhodamine के लिए FITC का चयन करें। ऊपरी मेनू में बढ़ाई (20X) का चयन करें।
- सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस का उपयोग करना, एकल कोशिका दोनों सह ट्रांसफ़ेक्ट वैक्टर व्यक्त करने के लिए लग रही है और स्थिति रजिस्टर। इस चरण को दोहराएँ जब तक 10 कोशिकाओं की एक न्यूनतम हर प्रयोगात्मक हालत (प्रायोगिक समूह) के लिए एकत्र किया जाता है।
- मेनू "क्षुधा" का चयन करें और बहु आयामी अधिग्रहण पर क्लिक करें। बहु आयामी अधिग्रहण खिड़कियों में इस तरह के अधिग्रहण की संख्या, प्रत्येक अधिग्रहण और दर्ज सेल की स्थिति के बीच समय के अंतराल के रूप में मानकों की जरूरत है, का चयन करें। "मोल पर क्लिक करें"अधिग्रहण की प्रक्रिया शुरू करने के लिए।
- दोनों EYFP-Parkin और DsRed2-Mito फ्लोरोसेंट 15 मिनट की कुल अंतराल के लिए छवियों का संग्रह हर 5 मिनट के संकेत के बेसल अधिग्रहण शुरू करो।
- FCCP के एक एकाग्रता के अंतिम काम एकाग्रता दो बार से अधिक के साथ पूर्व गर्म रहते इमेजिंग के माध्यम से तैयार (0.1 - 10 माइक्रोन, सेल प्रकार पर निर्भर)।
- अधिग्रहण की प्रक्रिया बीच में है और माइक्रोस्कोप के कक्ष के अंदर प्लेट एक P1000 pipet का उपयोग करने में FCCP के साथ पूर्व गर्म रहते इमेजिंग माध्यम की धीरे 1 मिलीलीटर जोड़ें।
- अधिग्रहण की प्रक्रिया पुन: प्रारंभ के रूप में पहले 3 घंटे की कुल अवधि के लिए, वर्णित है, दर्ज की स्थिति का उपयोग। ताकि उन्हें विश्लेषण और जब अधिग्रहण खत्म हो गया है mitophagic प्रक्रिया का एक वीडियो बनाने के लिए सभी का अधिग्रहण छवियों को बचाओ।
3. विश्लेषण
- एक व्यक्तिगत कंप्यूटर पर "झगड़ा" प्रारूप में सभी अधिग्रहीत छवियों लीजिए
- छवियों को एक ग्राफिक मुलायम के साथ खोलेंबर्तन और लौकिक अंतराल को परिभाषित mitochondrial mitochondrial झिल्ली में Parkin की भर्ती दिखा पहली छवि को FCCP के साथ प्रेरित-विध्रुवण से हुई (छवियाँ हर 5 मिनट अर्जित कर रहे हैं)। प्रयोगात्मक समूह में प्रत्येक कक्ष के लिए इस विश्लेषण को दोहराएँ।
- प्रयोगात्मक समूह के नाम के साथ एक स्प्रेडशीट पर स्तंभ की पहली सेल लेबल। प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए, 10 कोशिकाओं की एक न्यूनतम के Parkin भर्ती के लिए अस्थायी अंतराल को मापने। Parkin भर्ती के लिए गणना की अस्थायी अंतराल के एक औसत (एन = मतलब ± एसडी, 10) बनाने के लिए और प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए मानक विचलन को परिभाषित।
- कॉलम एकल गणना अस्थायी अंतराल में व्यवस्थित करें। हर स्तंभ एन = प्रयोगात्मक समूह के 10 माप होता है।
- समारोह 'औसत' फॉर्मूला बिल्डर मेनू से चुनें। स्तंभ में डेटा का चयन करें। फॉर्मूला बिल्डर मेनू से समारोह "मानक विचलन" का चयन करें। Seleस्तंभ में डेटा सीटी।
- एक सांख्यिकीय दृष्टिकोण का प्रयोग, आदेश प्रयोगात्मक समूहों के बीच mitophagy के गतिशील में एक महत्वपूर्ण अंतर को परिभाषित करने में उचित आँकड़ों को लागू करने प्रयोगात्मक समूहों की तुलना करें। (उदाहरण के लिए, दो समूहों = छात्र की टी-टेस्ट, तीन या अधिक समूहों = एनोवा प्लस एक के बाद अस्थायी परीक्षण)
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Representative Results
इस के साथ साथ, हम बताएंगे कि कैसे समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी एक शक्तिशाली तकनीक है कि एक ही सेल में fluorescently टैग प्रोटीन की आणविक घटनाओं का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रतिनिधि परिणाम भी बताएंगे कि कैसे इस तकनीक को उच्च गुणवत्ता के चित्र के अधिग्रहण के लिए अनुमति देता है। जब आणविक प्रक्रिया की छवियों, प्राप्त कर रहे हैं, हम उन्हें विभिन्न तरीकों से विश्लेषण करने का अवसर है। यहाँ, हम प्रेरित mitophagy प्रक्रिया है, जो महत्वपूर्ण आणविक प्रक्रिया है कि सेलुलर homeostasis को बनाए रखने के लिए चुनिंदा क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया को हटाने की दीक्षा के बीच समय के अंतराल विश्लेषण।
इस तकनीक में आवेदनों की एक विस्तृत रेंज founds। यह या तो इस तरह के सेल प्रवास या महत्वपूर्ण प्रक्रिया है कि अध्ययन किया जा में शामिल अणुओं की लेबलिंग के माध्यम से सूक्ष्म आणविक घटनाओं के रूप में मैक्रो सेलुलर प्रक्रिया की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
O: रख-together.within-पेज = "1"> Parkin की मध्यस्थता Mitophagy
क्षतिग्रस्त और बेकार माइटोकॉन्ड्रिया प्रक्रिया के चुनिंदा Parkin की मध्यस्थता हटाने चित्रा 1, जहां एक झिल्ली विध्रुवण uncoupling एजेंट FCCP से प्रेरित हो सके चयनात्मक Parkin की मध्यस्थता mitophagy, बाहरी mitochondrial झिल्ली को PINK1 की भर्ती में संक्षेप। बाद Parkin क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया के लिए भर्ती और PINK1 के साथ सूचना का आदान प्रदान किया जाता है। यह जटिल Parkin-PINK1 क्षतिग्रस्त organelle की ubiquitination और एक autophagosome है, जो एक लाइसोसोम साथ फ़्यूज़ में अपने शामिल करने के लिए जाता है। Mitophagy के रूप में जाना इस प्रक्रिया के क्रम में सेलुलर पर्यावरण को स्वस्थ रखने के लिए और कार्यात्मक माइटोकॉन्ड्रिया 8,15 के उत्थान अनुमति देने के लिए एक महत्वपूर्ण चयापचय की प्रक्रिया माना जाता है।
प्रायोगिक प्रोटोकॉल
NT "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> चित्रा 2 प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल और माइक्रोस्कोप सेट-अप से पहले और FCCP प्रेरित mitophagy प्रक्रिया के बाद EYFP-Parkin की भर्ती के बाद के लिए प्रयोग किया जाता का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाता है।Parkin भर्ती depolarized mitochondrial झिल्ली को
चित्रा 3 ए में, हम Parkin वितरण से पहले और बाद FCCP प्रशासन दिखा। बेसल समय अंक (BT5, BT10 और BT15 मिनट) के दौरान EYFP-Parkin (ग्रीन) ही ढंग सेल भर में फैला हुआ है और माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क (लाल) अच्छी तरह से परस्पर प्रतीत होता है। FCCP प्रशासन (एफटी = 0 मिनट) (चित्रा 3 बी) के बाद, हम माइटोकॉन्ड्रिया विभाजन (एफटी = 5 मिनट) निरीक्षण करते हैं। हालांकि, EYFP-Parkin अभी भी समान रूप से हालांकि बाहर कोशिका द्रव्य दूर तक फैला हुआ है। Mitophagy 55 मिनट पद FCCP प्रशासन पर प्रेरित किया जाता है,EYFP-Parkin क्षतिग्रस्त mitochondrial झिल्ली में भर्ती है mitophagy प्रक्रिया (एफटी = 55) को ट्रिगर।
चित्रा 1. Parkin की मध्यस्थता Mitophagy की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। संभावित झिल्ली (Ψm) की एक कम क्षतिग्रस्त या बेकार माइटोकॉन्ड्रिया में होता है और uncoupling एजेंट FCCP द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। झिल्ली क्षमता की हानि चयनात्मक Parkin की मध्यस्थता mitophagy चलाता है, बाहरी mitochondrial झिल्ली को PINK1 (लाल) की भर्ती। Parkin (ब्लू) सीधे PINK1 के साथ बातचीत से क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया के लिए भर्ती किया गया है। Parkin की उपस्थिति ubiquitination क्षतिग्रस्त organelle की (पीला) और एक autophagosome है, जो एक लाइसोसोम साथ फ़्यूज़ में अपने शामिल करने के लिए होता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. माइक्रोस्कोप सेट-अप और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व। (ए) प्रोटोकॉल खंड में वर्णित प्रयोगात्मक घटनाओं का अवलोकन। सूचना प्रयोगात्मक घटनाओं ऑपरेटर क्षणिक आदेश FCCP प्रेरित mitophagy प्रक्रिया एक (बी) का उपयोग कर समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण के लिए सेट-अप का पालन करने में EYFP-Parkin और pDsRed2-Mito के साथ कोशिकाओं सह transfect करने electroporation द्वारा अनुमति देते हैं। बीटी बेसल समय बिंदु =; एफटी = FCCP समय बिंदु। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. तंतुकोशिका सेल Parkin Recruitme दिखा NT के बाद mitochondrial झिल्ली विध्रुवण द्वारा FCCP। EYFP-Parkin (हरा) माइटोकांड्रिया (लाल) में translocation प्रेरित बेसल समय बिंदु (बीटी) के दौरान समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी द्वारा नजर रखी और पोस्ट FCCP प्रशासन (एफटी) किया गया था। बीटी = 0, EYFP-Parkin और mitochondrial प्रतिदीप्ति हर 5 मिनट पाया गया। (ए) EYFP-Parkin homogenously पूरे बेसल अवधि भर में फैला हुआ है और mitochondrial नेटवर्क बरकरार (सफेद तीर) है। (बी) Mitochondrial FCCP द्वारा झिल्ली विध्रुवण के कारण विभाजन एफटी = 5 मिनट (सफेद तीर) और क्षतिग्रस्त mitochondrial झिल्ली EYFP-Parkin भर्ती पर दर्ज की गई है एफटी = 55 मिनट (सफेद तीर) पर शुरू कर दिया। सफेद बक्से पैनल (5X) का बढ़ाया क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के आवेदन के विषय में अधिक जानकारी के लिए संदर्भ के लिए 8 देखें। (स्केल पट्टी: 10 माइक्रोन)।> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
समय चूक माइक्रोस्कोपी तकनीक उस समय की लंबी अवधि में सेलुलर गतिशीलता का अवलोकन करने के लिए समय में एक भी अवलोकन से लाइव सेल इमेजिंग फैली रूप में परिभाषित किया जा सकता है। क्योंकि यह प्रेक्षक वास्तविक समय में एक भी फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन की पहचान करने और एक भी जीवित कोशिका के अंदर अपनी गतिशील का पालन करने की अनुमति देता है इस पद्धति एक सरल confocal या जीवित कोशिका माइक्रोस्कोपी से विख्यात है। वास्तव में, confocal माइक्रोस्कोपी आसानी से कर सकते इम्युनो-लेबल प्रोटीन फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का उपयोग कर दिखाता है, लेकिन यह सेल और उसके जीवित वातावरण में आणविक घटना के अवलोकन की अनुमति नहीं है।
समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी मुख्य रूप से इस तरह के HEK293 16 के रूप में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं, प्राथमिक न्यूरॉन्स 17 और हेला कोशिकाओं 18 में आणविक प्रक्रियाओं की निगरानी अनुसंधान में इस्तेमाल किया, लेकिन यह भी नैदानिक आवेदन गर्भावस्था के रूप में इस तरह के और aneuploidy 19,20 की भविष्यवाणी की है। समय चूक माइक्रोस्कोपी embryolog प्रदान करता हैएक नैदानिक गर्भावस्था के लिए भ्रूण के विकास के बारे में अतिरिक्त जानकारी के साथ ists, और यह संभव है कि इस जानकारी को हस्तांतरण के लिए व्यवहार्य भ्रूण का चयन करने की क्षमता में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। समय चूक माइक्रोस्कोपी के प्रयोग के अतिरिक्त लाभ भ्रूण के कम से निपटने और मध्यवर्ती टिप्पणियों, जो प्रयोगशाला 19 के भीतर नुकसान या प्रदूषण का खतरा कम हो जाएगा के लिए उनकी व्यंजन शामिल हैं।
प्रकोष्ठों mitophagy के माध्यम से क्षतिग्रस्त और बेकार माइटोकॉन्ड्रिया अपमानजनक द्वारा एक स्वस्थ mitochondrial homeostasis को बनाए रखने में सक्षम हैं। दोषपूर्ण mitophagy, पार्किंसंस रोग 21 से जुड़े 22 apoptosis, उम्र बढ़ने के 23 और कैंसर 24 है। Mitophagy यूबीक्यूटिन ligase Parkin और PINK1 21 से प्रेरित है। इस प्रक्रिया को एक स्वस्थ mitochondrial स्थिति बनाए रखने के लिए के महत्व के कारण, हम यह महत्वपूर्ण इस घटना को एक समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग की गतिशील अध्ययन करने के लिए मिल गया। प्रस्तावित समर्थकtocol कैसे माइटोकॉन्ड्रिया homeostasis जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन कार्यों में परिवर्तन सहित विभिन्न सेलुलर शर्तों के तहत प्रभावित होता है पर सबूत प्रदान करेगा।
इस अध्ययन में, हम क्षणिक electroporation द्वारा fibroblasts ट्रांसफ़ेक्ट। electroporation विधि एक अनुकूलित वोल्टेज सेल निलंबन के लिए कुछ microseconds स्थायी आदेश झिल्ली के फॉस्फोलिपिड bilayer परेशान द्वारा कोशिका झिल्ली की पारगम्यता बढ़ाने के लिए पर एक बिजली पल्स लागू होता है। यह कार्रवाई अस्थायी pores के गठन में यह परिणाम है। झिल्ली permeabilization डीएनए सेल 25 में पेश किए जाने की अनुमति देता है। हम इस प्रक्रिया क्षणिक ताकि दोनों plasmids EYFP-Parkin और pDsRed2-Mito के उच्च अभिकर्मक दक्षता के लिए fibroblasts transfect करने के लिए चुना है। वास्तव में, electroporation प्रक्रिया रासायनिक अभिकर्मक 26 से लगभग दस गुना अधिक प्रभावी है। छवियाँ अधिग्रहण की प्रक्रिया दोनों exte से समझौता किया जा सकता हैrnal कारकों; तापमान में उतार-चढ़ाव, कंपन, नमी और आंतरिक कारकों; पीएच, सेल गतिशीलता। electroporation और फ्लोरोसेंट ट्रैकिंग इस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की सफलता के लिए सबसे महत्वपूर्ण माना जाता दो कदम उठाए हैं। यहां तक कि अगर अभिकर्मक दक्षता अन्य तरीकों की तुलना में अधिक है, electroporation मारता ~ electroporated कोशिकाओं का 20%। एक अन्य प्रमुख मुद्दा निगरानी चरण के दौरान छवियों के अधिग्रहण गुणवत्ता है। चूंकि सेलुलर पर्यावरण गतिशील है, ध्यान विमान आदेश अधिग्रहण की प्रक्रिया के दौरान ध्यान बनाए रखने के लिए निरंतर समायोजन की जरूरत है।
Mitochondrial नुकसान झिल्ली mitochondrial विध्रुवण और oxidative तनाव की वजह से हो सकता है। इन कारकों में एक mitophagic प्रतिक्रिया प्रेरित। सबूत है कि माइटोकॉन्ड्रिया विध्रुवण चयनात्मक mitophagy पैदा कर सकते हैं photodamage प्रयोगों जो आरओएस उत्पादन और mitochondrial चोट 27-30 के लिए नेतृत्व से आता है। आदेश mitochondrial मेम को प्रेरित करने के लिएbrane विध्रुवण और mitophagic प्रतिक्रिया, FCCP protonophore 10 के रूप में इस्तेमाल किया गया है। FCCP एक ionophore प्रोटॉन झिल्ली विध्रुवण उत्प्रेरण लिपिड bilayers पार करने की अनुमति देता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग हम mitophagy प्रेरित और आणविक मार्कर के गतिशील का पालन किया।
के रूप में यह साइटोटोक्सिक हो सकता है और सेलुलर मौत को बढ़ावा देने के कर सकते हैं FCCP की एकाग्रता, महत्वपूर्ण है। चूंकि इस दृष्टिकोण जीवित कोशिकाओं के अवलोकन पर निर्भर करता है, FCCP के अंतिम एकाग्रता के आदेश के बिना mitophagy प्रेरित तंत्र है कि सेलुलर मौत का कारण गति प्रदान करने में एक सेल प्रकार निर्भर तरीके से समायोजित किया गया है।
कुल मिलाकर, हम सोचते हैं कि mitophagy के गतिशील, EYFP-Parkin एक फ्लोरोसेंट मार्कर के रूप में प्रयोग के बाद, mitochondrial समारोह में नए अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा। mitophagy के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रिया के चुनिंदा हटाने mitochondrial गुणवत्ता, सेल व्यवहार्यता और homeostasis को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है। इस लाइव इमेजिंग दृष्टिकोण वह होगाएल.पी. स्वस्थ है और जोर दिया की शर्तों के तहत mitophagic प्रक्रिया को समझने के लिए।
आधुनिक दृष्टिकोण के आगे सेलुलर गतिशीलता की फिल्में बनाने से परे समय चूक माइक्रोस्कोपी टिप्पणियों विस्तार कर रहे हैं। तेजी से इस सीमा के रूप में cytometric तकनीक की निगरानी और कोशिकाओं और subcellular संरचनाओं 31 के गतिशील गतिविधियों को मापने के लिए इमेजिंग तकनीक के साथ एकीकृत किया जा रहा है धुंधला है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning Life Science | 10-013-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Phenol-free DMEM | Corning Life Science | 17-205-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Pre-warm at 37 °C before use |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Penicillin/streptomycin | Corning Life Science | 30-002-CI | Pre-warm at 37 °C before use |
| EYFP-PARKIN expression vector | Addgene | 23955 | |
| pDsRed2-Mito expression vector | Clontech | 632421 | |
| Nucleofector 2B device | LONZA | AAD-1001S | |
| Nucleofector for kit R NIH/3T3 | LONZA | VCA-1001 | |
| ZEISS AXIOVERT 200M inverted microscope | CARL ZEISS | ||
| Carbonyl Cyanide 4-(trifluoromethoxy)-Phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Experimental Builder | |
| ImageJ | National Institute of Health | Experimental Builder |
References
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