מדידות Autoradiographic של [ Published: July 18, 2016 doi: 10.3791/53947

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Andrew Chih Wei Huang*¹, Hsiang-Chin Lu*², Bai Chuang Shyu²

¹Department of Psychology, Fo Guang University, ²Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica

* These authors contributed equally

Introduction

דימום שבץ הוכח להתרחש במשך יותר מ -8% מחולים הסובלים מכאב נוירופתי, התייחס כאב שלאחר הפעימות מרכזיות כמו (CPSP). ^1-3 CPSP יכול לנבוע תפקוד חושי, ובכך גרימת רגישות יתר ו Allodynia. ⁴ עם זאת , את מנגנוני pathophysiological של חוסר תפקוד חושי ב CPSP להישאר בטוחים. לדוגמה, אובדן תחושות גופניות נובע deafferentation העצבית באזור המוח המורגי. Hyperalgesia עלולה להיגרם על ידי לרגשנות היתר של נוירונים nociceptive המרכזיים או ביטול עכבות מרכזיים, ^{5, 6,} אבל התשתית העצבית המעורבים סימפטומי CPSP אינה ידועה. מספר מחקרים הראו כי קליפת המוח הקדם חזיתית דורסולטרלי (dPFC), cingulate קורטקס מקורי (ACC), האמיגדלה, ההיפוקמפוס, אפור periaqueductal (PAG), לשד הוונטרומדיאלי מקורי, והקשרים שלהם אחד עם השני לתווך עיבוד nociceptive. ⁷ נוספיםly, קליפת מוח קדם חזיתית המדיאלי (mPFC) -amygdala המעגלים הוצגו להיות מעורב בתפיסה הקשורות כאב. ⁸ נתונים על מנגנוני pathophysiological של CPSP הם מגוונים, ואת ההפעלה של מצעים עצביים CPSP צריכה בדיקה נוספת.

^[14 C] -Iodoantipyrine (IAP) ספיגת משמש בעקיפין להתבונן זרימת הדם האזורית במוח הקטן (rCBF), בהנחה לקשר בין פעילות המוח CBF. למרות ^[14 C] -IAP אינה יכולה להעריך את פעילות המוח בזמן אמת, כגון עם דימות תהודה מגנטית תפקודית (fMRI), יש לו כמה יתרונות. לדוגמה, ^[14 C] -IAP הוא מתאים למדידת ספונטני התרחשות אירועים מוחיים במהלך מצבים פתולוגיים. ⁹ יתר על כן, ^[14 C] ספיגת -IAP נמדדת בלי הרדמה. זה גם עולה פחות מאשר שיטות הדמיה אחרות, לרבות שיטת ה- fMRI טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET). ה- ^[14 C] השיטה -IAP הוצעה להיות מתאים מודדגרם כאב ספונטני (למשל, CPSP) כי הוא המושרה על ידי נגעים של הגרעין הבסיסי הגחון (VB) של התלמוס. ⁹

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד לבצע את ^[14 C] -IAP שיטה להעריך את מעורבותם של התשתית העצבית של CPSP כי הוא המושרה על ידי נגעים של VB של התלמוס במודל חיה. הטכניקה מציעה דרך של קביעת מנגנוני pathophysiological העומד בבסיס סימפטומי CPSP ברמות התנהגותיות עצביות.

Protocol

הפרוטוקול במחקר הנוכחי קבל את אישור הטיפול בבעלי החיים המוסדי אקדמית Sinica ועדת ניצול בטייוואן.

1. הכנות בעלי חיים

1. השג חולדות Sprague-Dawley זכר (כ -300 - 400 גרם). לשמור על חולדות בחדר ממוזג (21 - 22 מעלות צלזיוס, 50% לחות) תחת אור 12 שעות / 12 שעות / חושך מחזור (אורות בשעה 8:00 בבוקר) עם גישה חופשית למזון ומים.

2. נוהל ניסיוני

1. אפשר את כל החולדות כדי להסתגל לסביבה בכלובים בביתם במשך שבוע 1 לפני הניסויים. במהלך הסתגלות, לבצע את פון פריי בדיקות plantar כדי לקבוע קווי התחלה.
2. פון פריי מבחן
   1. מניחים את החולדה בחלל סגור אקריליק (30 ס"מ × 30 ס"מ × ס"מ 80) למשך 30 דקות למגורי.
   2. השג חוטי פון פריי (נימה לא 11 -. 20) כי יש אותו האורך אבל משתנה בקטרים ​​לספק מגווןכוחות של 2 - ז 100.
   3. כדי להעריך את סף נסיגת הרגליים בדרך של hindpaw חולדה, להשתמש חוטי פון פריי לעורר במרכז hindpaws דרך יציאת נטו דמוי על צלחת אקריליק במרווחי 5 דקות intertrial. כדי להקליט את הלחץ המופעל מרבית, יש להשתמש חוטים בסדר עולה, מהנמוך לגבוה, עד הלחץ המופעל המקסימלי נרשם. ¹⁰
   4. כאשר חולדות להפגין תגובת נסיגה כפה על הגירוי, לרשום את מספר הנימה. לקבוע את תגובת הנסיגה במשפט הזה על פי הגירוי הנמוך ביותר.
   5. חזור על אותו ההליך מייד, עבור סכום כולל של שלוש פעמים ברצף על אותו העכברוש. המרת מספר נימה לכוח המקביל (בגרמים) ומחשבים את הממוצע של הערכים.
3. מבחן plantar
   1. מניחים את החולדה בקופסה פרספקס שקוף (מחולק לארבעה מסגרות, 80 ס"מ × 30 ס"מ × 15 ס"מ) למשך 30 דקות למגורי.
   2. השתמש infקרן rared לעורר במרכז hindpaw באמצעות צלחת זכוכית. התאם את עוצמת אור אינפרא האדומה כדי לקבל חביון תגובת נסיגה כפה ממוצע של כ 10 שניות. לביצוע ניסוי מדכא מפתח המפעיל את מקור האור האינפרא האדום ומתחיל טיימר דיגיטלי מצב מוצק. מניפולציות משך קרן אור אינפרא אדום.
   3. רשום את משך הזמן של האור האינפרה-האדום כאשר החולדות להפגין תגובת נסיגה כפה. משך הארוך לא יעלה על 20 שניות בכל ניסיון כדי למנוע נזק לרקמות. השתמש מרווח intertrial של לפחות 5 דקות כדי למנוע גירוי רצוף.
   4. חזרו על הבדיקה עם שלושה ניסויים עבור hindpaws על ימין ועל שמאל, ולחשב את הממוצע עבור כל hindpaw לכל חולדה.
4. כירורגיה Collagenase נגע
   1. להרדים חולדה עם isoflurane 4% עד אובדן התגובה הבוהן קמצוץ ותגובות סומטיות לגירויים כירורגית להתרחש. לשמור על הרדמה עם 1.5 - 2% isoflurAne למשך הניתוח.
   2. מניחים את עכברוש מכשיר stereotaxic עם כרית חימום פשוט כדי לשמור על טמפרטורת הגוף ב 36.5 - C ° 37.5. החל קרם עיניים על העיניים כדי למנוע יובש לאחר הרדמה.
   3. לגלח את הפרווה עם קוצץ חשמלי מעוקר, ולעשות חתך חלק (כ 2-2.5 סנטימטר) עם אזמל לאורך קו האמצע של הקרקפת. נקו את עור הגולגולת עם לסירוגין יוד ההשגחה פתרון אלכוהול 75% לחיטוי. בשלב כירורגית, להשתמש 75% אלכוהול לעקר כל המכשירים, הכלים, ואת שולחן העבודה שלו כדי לשמור על תנאים סטריליים. לפני כן, כל החומרים כירורגית יש לעקר ב חיטוי קיטור.
   4. השתמש כפפות ומכשירים סטרילי, לקדוח חור קטן (3 מ"מ קוטר) בגולגולת עם מקדחה חשמלית על VB (כולל גרעין התלמוס posteromedial הגחון [VPM] והגרעין התלמוס posterolateral הגחון [VPL]) של התלמוס (3.0 -3.5 מ"מ אחורי, 3.0-3.5 מ"מ לרוחבכדי גבחת, ועומק 5.5-5.8 מ"מ מפני שטח גולגולת).
   5. Microinject 0.5 μl של מלח רגיל או 0.125 U של פתרון collagenase סוג 4 בבקרה וקבוצות ניסיון, בהתאמה.
   6. שמור את מחט הזריקה במקום במשך 5 דקות נוספות כדי לאפשר דיפוזיה תרופה.
   7. השתמש דבק דנטלי כדי למלא את החור בגולגולת, תפר את החתך. לאחר תפר את החתך, להחיל את הרדמת כאבים המקומית (משחה לידוקאין) על הפצע, ולהחזיר אותם בכלובים בביתם.
   8. לאחר ניתוח, ביחידים לשכן החולדות בכלובי פלסטיק עד שהם לשמור שכיבה sternal, ושומר חם עד התאושש מן ההרדמה.
5. בדיקות התנהגותיות לאחר שחזור כירורגי
   1. לאחר 7 ימים של התאוששות מניתוח, וחזור על התהליך המתואר בסעיפים 2.2 ו -2.3 עבור בשלב הבדיקה. בצע בדיקות התנהגותיות מעל 4 שבועות תוך מעקב אחר בריאות ומצב התפתחותי של החיות.
   (למשל, משקל גוף, כמות האכלה, ותנועה חופשית) בין מלא קבוצות ניסוי עבור השלב שלאחר הניתוח.
6. בצע קנית השרשה עם PE-50 Tubing
   1. להרדים חולדה עם 4% isoflurane, וכן לשמור על טמפרטורת הגוף ב 36.5 - 37.5 ° C עם כרית חימום פשוטה.
   2. עם אזמל, לחתוך שני חורים (בקוטר 2 ס"מ כל אחד) ב קו האמצע של החלק הגבי של forelimbs ואת החיתוך של החלק הגחוני של הכתף השמאלי חלל בית החזה, בהתאמה.
   3. לנתק את העור והשרירים עם זוג מספריים בין שני החורים.
   4. חבר קצה אחד של 50 צינורות PE- (20 ס"מ אורך) אל וריד הצוואר חיצוני דרך חור הגחון. חבר את הקצה הסופי של צינורות אותה 50 PE- אל החור הגבי, והדבק על העור.
   5. השתמש מזרק להזריק מלוחים לתוך וריד הצוואר כדי לוודא כי צינורות 50 PE-אינו חסום.
   6. לתפור את החתך, ולהזריק את חולדות עם 6 מ"ג / ק"ג gentamycin (intraperitoneally).
   7. שטוף את צינורות פעם ביומיים לאחר הניתוח עם 0.3 מ"ל של 0.9% מלוחים, ואחריו 0.1 מ"ל של תמיסת מלח עם 20 הפרין U / ml.
7. מבחן התנהגותי סופי
   1. שבוע אחרי צעד 2.6, חזור על שלבים 2.2-2.3 כדי לאשר התנהגות כי הוא יציב לעומת שלב 2.5 לאחר ההתאוששות אחרי הניתוח.
8. הזרקת radiotracer
   1. מניחים את החולדה בכלוב מנוחתם 5 - 10 דקות להסתגלות.
   2. באמצעות מפצל, להתחבר PE- 50 צינורות לשני 1 מ"ל מזרקים. מלאו מזרק אחד עם מלח רגיל ומלא והשני עם ^[14 C] -IAP פתרון (125 μCi / ק"ג בנפח של 0.3 - 0.5 מ"ל).
   3. להזריק את radiotracer לתוך וריד הצוואר חיצוני, ולהחליף את המזרק עם מזרק נוסף מלא 3 M אשלגן כלורי.
   4. עשר שניות לאחר inj radiotracerשיקוף, להזריק 3 M אשלגן כלורי תחת ממנת יתר של isoflurane, ולהקריב את בעלי החיים על פי שיטות המתת חסד סטנדרטיות (כלומר, isoflurane מ מאדה למשך 50 דקות) על פי ההנחיות של הטיפול בבעלי החיים המוסדי אקדמית Sinica ועדת ניצול בטייוואן.
   5. לאחר 1 דקות, לחשוף את הגולגולת, לקצץ את השריר הנותרים. שימוש rongeurs, לקלף את פני השטח הגבי של הגולגולת מן המוח. חתוך משם בצידי הגולגולת באמצעות rongeurs. לאחר מכן, בעזרת מרית, לחתוך את נורות חוש הריח ואת קשרים עצביים לאורך משטח הגחון של המוח, ולהסיר את המוח.
   6. לשימוש בטמפרטורה חיתוך אופטימלי (אוקטובר) מתחם להקפיא את המוח בקרח יבש methylbutane (כ -55 ° C). אחסן את רקמת המוח במקפיא. ^{11, 12}
9. מוח חיתוך
   1. אוריינט רקמת microtome, עם למוח האחורי פונה כלפי מטה. השתמש cryostat לחתוך את המוח לתוך 20 &# 181; סעיפים מטר בעובי.
   2. מניחים את פרוסות המוח על שקופיות מיקרוסקופ בתוך cryostat ב -20 ° C, עם מרווח 240 מיקרומטר בין כל פרוסה.
   3. מניח את השקופיות מיקרוסקופ וחמישה ניירות לסנן רגילים עם רדיואקטיביות מדורגת לתוך קלטות חשיפה במשך 3 ימים ב -20 מעלות צלזיוס. על פי הרצף של פרוסות המוח, לסדר את השקופיות מיקרוסקופ מלמעלה למטה. לבסוף, הניח את הניירות לסנן בתחתית של הקלטות. ¹²
   4. הסר את המסך זרחן מן קלטות חשיפה, ולהשתמש תרמי משתנה מצב לקרוא את המסך זרחן וליצור תמונות להראות ^[14 C] ספיגת -IAP עבור פרוסות המוח.

.3 ניתוח נתונים

1. לאחר שלב 2.9.4, להתאים את התמונות באמצעות מיפוי פרמטרית סטטיסטי (SPM) ותוכנת ImageJ. לשחזר את כל התמונות באמצעות חלקי העטרת סדרתי. חלקה לנרמל את התמונות על פי מודל במוח חולדה התייחסות.12, 13
2. לקבלת הערכות כמותיות, למדוד באזור של עניין (ROI) של תמונות המוח באמצעות תוכנת ImageJ כדי לקבוע את עוצמת האות פיקסל, ולהשתמש בתוכנות סטטיסטיות לניתוח. ^{12, 13}
3. כדי לחקור את הקשר בין מרכזי מוח השונים, להשתמש בתוכנת ניתוח מתאם MATLAB להציג יחס רדיואקטיביות מטריקס קורלציה בין-אזורי, ולדמיין את המטריצות כמפות צבע. לבסוף, להשתמש בתוכנת Pajek לניתוח רשת. ^{12, 13}
4. השתמש 2 × 5 דו סטרי ניתוח מעורב של שונות (ANOVA), עם קבוצה ושבועות כגורמים, להשוות את משך הסובלנות חומה במבחן plantar ואת הכח מכאני במבחן פון פריי בקבוצות הזיוף ו CPSP בתחילת המחקר שבועות 1 - 5. השתמש 2 × 31 דו כיוונית ANOVA למדוד את יחס רדיואקטיביות בהתאם לקבוצה ואזור המוח. בעת הצורך, לנהל הבדל משמעותי בכנות של Tukey (HSD) בדיקות פוסט הוק. קאלמתאם culate פירסון מקדם להעריך מתאמים בין כל אזורי המוח שנבחרו הדמה וקבוצות CPSP.

Representative Results

איור 1 א מציג את ציר הזמן הניסיון. חולדות הומחו דמה וקבוצות CPSP עבור בדיקות התנהגותיות (כלומר, מבחן ו plantar פון פריי). היום הראשון של הניסוי שמש בסיס, ובדיקות חזרו בשבועות 1 - 5. PE-50 צנתור בוצע וריד הצוואר החיצוני בשבוע 4. הפרין (20 U / ml, 0.1 מיליליטר / יום) שהוזרק במהלך 4 שבועות 5. חמש דקות לאחר ההזרקה הפרין, ^[14 C] -IAP הוזרק, ואחריו 10 שניות מאוחר יותר על ידי מנת יתר של חומר הרדמה להקרבה. דקה לאחר מכן, החולדות היו ערופות, ואת פרוסות מוח מוטבעים אוקטובר נעשו. איור 1B מתאר עכברושי מכשיר כירורגית stereotaxic, אתרי השתלת צינורית, ומפה היסטולוגית של פרוסות המוח המבוססים על אטלס מוח עכברוש. תרשים 1C מופעים החור הימני של וריד הצוואר החיצוני באדום, המיקום של צינורות 50 PE-, והגדרת ניסוי סופית.

איור 2 א מראה פרוסות המוח שנחשפו הקלטות. מסך זרחן נותח באמצעות תרמי משתנה מצב. לדוגמא נתונים סטנדרטיים עבור פרוסות המוח נותחו לאחר מכן. איור 2B מראה את עקומות autoradiographic סטנדרטיות. הלוח השמאלי מציג את הקשר בין עוצמת תמונה (פיקסל / מ"מ ²⁾ וספירת רדיואקטיביות לדקה (CPM), ובכך מניב את המשוואה ליניארית החזה הבאה: Y = 44.542X + 196.24. הפאנל הימני מראה כי ההחלטה (פיקסל / מ"מ ²⁾ היה משופר כזמן חשיפה מוגברת (בימים). ההחלטה האופטימלית נצפתה ביום 4.

איור 3 א מציג את הגדרת הניסוי עבור בדיקת plantar, אשר מעריכה כאב תרמית. קבוצת CPSP הציגה ירידה משמעותית את סף הנסיגה כפה p <0.05) איור 3 ב מציגה את הגדרת הניסוי עבור בדיקת פון פריי, אשר מעריכה כאב מכאני. הקבוצה CPSP הציג ירידה משמעותית בכוח מכני (GW) בתחילת המחקר ובשבועות 1 - 5 (כל p <0.05).

איור 4 א מראה את ROIs באטלס אנטומי. ניתוח ROI הראה כי ההפעלה של הקורטקס infralimbic (IL), קליפת prelimbic (PRL), ואת הקליפה cingulate אזור 1 (cg1) הייתה גבוהה משמעותית בקבוצת CPSP במחצית המוח הימני, למעט של VB (איור 4B) .

הבדלים מתאמים בין האזורים של rCBF נצפו בין קבוצות CPSP ואת דמה האונה הימנית (האיור 4C). המטריצה ​​(של פישר Z-statistics) של כל האזורים נותח באמצעות המתאם של פירסון. איור 4C מציג את ההבדלים מתאמים בין אזורי מעורבותם של התשתית העצבית בקבוצת CPSP. תשתית עצבית קשורים כאב נקבעה על ידי ניתוח הבדלים מתאמים בין האזורים של rCBF. הקווים האדומים באיור 4D מצביעים מתאמים חיוביים משמעותיים, ואת קווים כחולים מצביעים מתאמים שליליים מובהקים.

באיור 1. ציר זמן הניסיון של Lesioning שגרעין בסל הגחון (VB) של התלמוס כדי לגרום מרכזית-שבץ הודעת כאב (CPSP) והזרקה ^[14 C] -IAP. (א) נגעי גרעיני הבזליים גחון כדי לגרום CPSP עבור הנחות התנהגותיות וזריקות של ^[14 C] -IAP למדוד את הפעלת תשתית עצבית המעורבים CPSP. (ב) מיקום של VB. (ג) ^[14 C] -IAP זריקות. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. עקומות הסטנדרטיות Autoradiographic. (א) לדוגמא העקומה סטנדרטי התקבלו עבור זמני חשיפה שונים והחלטות תמונה. (ב) עקומת תקן של עוצמת תמונת CPM ו עקום תקן של זמן חשיפה ופתרון. אנא לחצו כאן כדי להציג גדול גרסה של נתון זה.

אלחוטיאיור 3. מבחן Plantar (Thermal הכאב) ופון פריי המבחן (מכני כאב), שנערך במסגרת קבוצות Sham ו CPSP בתחילת המחקר ולאחר שבועות 1 - 5. (א) חולדות CPSP הציגו סף נסיגת כפה נמוך במבחן plantar ( כלומר, פחות סובלנות חומה) לעומת חולדות דמה, המציין כאב תרמית גדול יותר. (ב) חולדות CPSP הציגו סף נסיגת כפה נמוך במבחן פון פריי לעומת חולדות דמה, המציין כאב מכאני גדול. SEM, סטיית התקן של הממוצע. כוכביות גרין (*) מצביעות על הבדל משמעותי בהשוואה לקבוצת הדמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. ניתוח ROI ואת הקשר בין אינטר-Rקורלציות egional בין עצבית מצעים מעורב CPSP. (א) אזורים במוח נקבעו ונותחו על ידי ניסוח יחס. (ב) ROIs ב IL, PRL, cg1, ו- VB היו שונים באופן משמעותי במחצית המוח הימנית. (C) ניתוח של rCBF בתחומי המוח שנבחר. (ד) מתאמים בין אזורים בין אזורים במוח. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

בשנת בדיקות התנהגותיות, הקבוצה CPSP הציג ירידות של סף הנסיגה כפה במבחן הכאב תרמי כוח מכני במבחן פון פריי בתחילת המחקר ובשבועות 1 -. 5. הממצאים היו עקביים עם מחקר קודם ¹⁴

ה- ^[14 C] השיטה -IAP מסתמכת על עוצמת פיקסל של תמונות מוח לניתוח כמותי של פרוסות מוח שונות. כדי להעריך את נתוני תמונות המוח, את עוצמת אות פיקסל הוגדרה. במחקר הנוכחי, אות הרקע הסביבתית הוגדרה 25,811 - 46,979 CPM. האות של ^[14 C] -IAP 0.001 נייר סינון μCi הוגדרה 42 CPM. עוצמת אות פיקסל הייתה <0.001 μCi, אשר מהווה את עוצמת הרקע. עוצמת פיקסל של חמישה מאמרים מסננים נקבעה 0.001, 0.01, 0.1, ו -10 μCi, אשר מהווה את הסולם האפור פיקסל עבור כל אחת מתמונות המוח. ^[14 C] רדיואקטיביות -IAP הראה apמתאם ositive בעצמת פיקסל רדיואקטיביות לסמוך על סולם לוגריתמים. לכן, ההליך הנ"ל ניתן בעקבות לכיול ^[14 C] רדיואקטיביות -IAP כדי פיקסל בעוצמה.

בעת ביצוע ^[14 C] -IAP פרוטוקול הניסוי, כמה נקודות צריך להיחשב. לדוגמה, וריד הצוואר חיצוני יכול להיחסם, ו הנסיינים צריכים להבטיח את patency של צינורות 50 PE- עם הפרין מדי יום. בנוסף, מיקומו של אתרי הנגע יכול לפעמים להיות שלא במקומה, וכתוצאה מכך סימפטומי CPSP לא משמעותיים. לפני זריקות, את הדיוק של המוזרקים ויצירת מקומות ביחס גבחת יש לאשר. הזווית והנפח של כל הזרקה חייבות גם לקבוע במדויק.

מגבלות תמונות המוח גם צריכות להילקח בחשבון. עיוותים של תמונות המוח יכולות להתרחש לאחר חשיפת פרוסות מוח הקלטות למסך זרחן. המוח IMAGES צריך להיות מנורמל אטלס תקן המוח באמצעות תוכנית ניתוח התמונה כדי למנוע עיוותים פוטנציאל בתמונות המוח. יתר על כן, איזוטופים שונים יכולים להניב תוצאות שונות בגלל מנגנוני הפעולה השונים שלהם. לדוגמא, המטבוליט ו מנגנון הפעולה של ^[18 F] -fludeoxyglucose (FDG) דומים לגלוקוז. לכן, ^[18 F] תמונות -FDG הוצגו להיות דומה מסלול של חילוף החומרים של הגלוקוז. בנוסף, זמן מחצית החיים של ^[18 F] -FDG הוא קצר; ולכן, זה חייב להיות משולב עם PET כדי ליצור את התמונות. ^[201 Tl] מתאים להערכת זלוף זרימת דם בשריר לב באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת פליטת פוטון יחיד. לכן, בחירת איזוטופ מתאים להערכת תמונות מוח חשובה.

היישום של ^[14 C] -IAP השיטה להעריך הפעלת המוח ב CPSP היא פחות יקרה מאשר טכניקות מיפוי המוח אחרות (למשל, PET ו- fMRI). Tהוא ^[14 C] שיטת -IAP מתאימה לאירועים המתרחשים באופן ספונטני, אך אין היא יכולה לשמש למיפוי מוח בזמן אמת. השיטה היא שונה טכניקות מיפוי המוח אחרות, כגון PET ו- fMRI. יתר על כן, הפרוטוקול הנוכחי ^[14 C] -IAP יכול למדוד שינויים עדינים rCBF בכל מצב פתולוגי.

ה- ^[14 C] -IAP השיטה יכולה לשמש כדי לבדוק מסלולי הכאב קונבנציונליים, כגון דרכי spinothalamic (STT), התלמוס המדיאלי (MT) -ACC, ו mPFC-האמיגדלה מעגלים עצביים. הפעל כל אחד משפיע מסלולים אלו אחרים. הפעלת המסלולים אלה CPSP כבר מפורטת במאמר הקודם שלנו. ¹²

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic:
Isoflurane	Halocarbon Products Corporation	NDC 12164-002-25	4%
Surgery
homeothermic blanket system	Harvard Apparatus	Model 50–7079	body temperature were maintained at 36.5 - 37.5 °C.
10 µl micro syringe	Hamilton	80008, Model 1701SN	injected with collagenase
polyethylene-50 tubing	Becton, Dickinson and Company	427411	catheterized into external jugular vein
1 c.c syringe	Terumo Medical Products	SS-01T	injected with 14C-IAP and saline.
saline (Sodium Chloride 0.9 gm)	Taiwan Biotech Co., LTD.	100-130-0201	To flush the tube
Drugs
type 4 collagenase	Sigma	C5138-500MG	0.125 U
Gentamicin	Sigma	G1264-250MG	6 mg/kg
Heparin	Sigma	H9399	20 U/ml; 0.1 ml/day
14C-iodoantipyrine (IAP)	PerkinElmer	NEC712	125 mCi/kg in 300 ml of 0.9% saline
Potassium chloride	Merck	1.04936.1000	3 M
Behavior system:
von Frey esthesiometer	Fabrication Enterprises, Inc.	Baseline Tactile Monofilaments 12-1666	mechanical hyperalgesia was assessed by measuring the withdrawal response to a mechanical stimulus
plantar test apparatus	IITC Life Science	IITC 390G Plantar Test	Thermal hyperalgesia was assessed by measuring the hind paw withdrawal latency in response to radiant heat.
Brain slice:
Optimal Cutting Temperature compound	Sakura Fintek Inc	4583	embedded the brain
dry ice			frozen in dry ice/methylbutane (approximately −55 °C)
methylbutane	Sigma	M32631-1L	frozen in dry ice/methylbutane (approximately −55 °C)
Cryostat	Leica Biosystems Nussloch GmbH, Germany	Leica CM1850	Coronal brain slice were sectioned on this machine.
Data analyze
exposure cassettes with a phosphor screen	Amersham Biosciences	20 cm x 25 cm	The slices were dried on glass slides and placed alongside five standard filter papers with graded radioactivity. All of the slides were exposed to the cassettes at −20 °C.
γ-counter	Beckman Coulter	Beckman LS 6500 Liquid Scintillation Counter	To measure the radioactivity count of the filter papers.
Typhoon 9410 Variable Mode Imager	GMI, Inc.	WS-S9410	To read  phosphor screen which was exposed by brain slice
Statistical Parametric Mapping (SPM)	Wellcome Centre for Neuroimaging	version 8	all of the brains were averaged to create the final brain template. To determine significant differences between the images in these two groups, the images were derived by subtracting the sham group from the CPSP group.
ImageJ	http://imagej.nih.gov/ij	version 1.46	Adjacent sections were aligned both manually and using Stack- Reg, an automated pixel-based registration algorithm in ImageJ software. All of the original three-dimensionally reconstructed brains were smoothed and normalized to the reference rat brain model.
Matlab	MathWorks	version 2009b	used Pearson correlation coefficients to examine the relationships between the CPSP and sham groups. An inter-regional correlation matrix was calculated across animals from each group.
Pajek	http://Pajek.imfm.si/	version 3.06	Graphical theoretical analysis was performed on networks defined by the above correlation matrices using Pajek software.