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Medicine

के autoradiographic माप [ Published: July 18, 2016 doi: 10.3791/53947
Automatic Translation
*1, *2, 2
1Department of Psychology, Fo Guang University, 2Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica
* These authors contributed equally

Introduction

स्ट्रोक नकसीर रोगियों जो न्यूरोपैथिक दर्द से पीड़ित हैं और अधिक से अधिक 8% में होते दिखाया गया है, के रूप में केंद्रीय पोस्ट स्ट्रोक दर्द (CPSP) के लिए भेजा। 1-3 CPSP somatosensory रोग, जिससे अतिसंवेदनशीलता और परपीड़ा उत्प्रेरण से परिणाम कर सकते हैं। हालांकि 4 , CPSP में somatosensory शिथिलता के pathophysiological तंत्र अनिश्चित बनी हुई हैं। उदाहरण के लिए, दैहिक उत्तेजना के नुकसान रक्तस्रावी मस्तिष्क क्षेत्र में neuronal deafferentation से यह परिणाम है। अत्यधिक पीड़ा केंद्रीय nociceptive न्यूरॉन्स या केंद्रीय disinhibition, 5, 6, लेकिन तंत्रिका substrates कि CPSP लक्षणों में शामिल हैं अनजान रहते हैं की hyperexcitability की वजह से हो सकता है। कुछ अध्ययनों से सुझाव दिया है कि dorsolateral प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (dPFC), व्याख्यान चबूतरे वाला पूर्वकाल सिंगुलेट प्रांतस्था (एसीसी), प्रमस्तिष्कखंड, हिप्पोकैम्पस, periaqueductal ग्रे (पीएजी), व्याख्यान चबूतरे वेंट्रोमीडिअल मज्जा, और एक दूसरे के साथ उनके कनेक्शन nociceptive प्रसंस्करण मध्यस्थता। 7 अतिरिक्तLY, औसत दर्जे का प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (mPFC) -amygdala सर्किट दर्द से संबंधित धारणा में शामिल होना दिखाया गया। CPSP के pathophysiological तंत्र पर 8 डेटा विविध रहे हैं, और CPSP में तंत्रिका substrates की सक्रियता के आगे जांच की जरूरत है।

[14 सी] -Iodoantipyrine (आईएपी) तेज मस्तिष्क की गतिविधियों और CBF के बीच एक संबंध मानते हुए, परोक्ष रूप से क्षेत्रीय मस्तिष्क में रक्त प्रवाह (rCBF) का निरीक्षण करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि [14 सी] -IAP ऐसे कार्यात्मक चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (fMRI) के साथ के रूप में वास्तविक समय में मस्तिष्क की गतिविधियों का आकलन नहीं कर सकते हैं, यह कई फायदे हैं। उदाहरण के लिए, [14 सी] -IAP इसके अलावा अनायास मापने रोग राज्यों के दौरान मस्तिष्क की घटनाओं से होने वाली के लिए उपयुक्त है। 9, [14 सी] -IAP तेज संज्ञाहरण के बिना मापा जाता है। यह भी अन्य तरीकों इमेजिंग, fMRI और पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी (पीईटी) सहित कम से कम लागत। [14 सी] -IAP विधि measurin के लिए उपयुक्त होने के लिए सुझाव दिया गया हैजी सहज दर्द (जैसे, CPSP) कि चेतक के उदर बेसल नाभिक (वीबी) के घावों से प्रेरित है। 9

वर्तमान प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे [14 सी] -IAP कि एक पशु मॉडल में चेतक की वीबी के घावों से प्रेरित है CPSP के तंत्रिका substrates की भागीदारी का आकलन करने के लिए विधि प्रदर्शन करने के लिए। तकनीक pathophysiological तंत्र है कि व्यवहार और न्यूरोनल स्तरों पर CPSP लक्षण आबाद निर्धारण करने का एक तरीका प्रदान करता है।

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Protocol

वर्तमान अध्ययन में प्रोटोकॉल ताइवान में और शिक्षा सिनिका संस्थागत पशु की देखभाल से अनुमोदन उपयोगिता समिति प्राप्त किया।

1. पशु तैयारी

  1. (- 400 ग्राम लगभग 300) पुरुष Sprague-Dawley चूहों प्राप्त करते हैं। एक वातानुकूलित कमरे में चूहों को बनाए रखें (21 - 22 डिग्री सेल्सियस, आर्द्रता 50%) एक 12 घंटा / 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र के तहत भोजन और पानी के लिए स्वतंत्र पहुँच के साथ (8:00 PM पर रोशनी)।

2. प्रायोगिक प्रक्रिया

  1. चूहों के सभी प्रयोगों से पहले 1 सप्ताह के लिए उनके घर पिंजरों में पर्यावरण के लिए अनुकूल करने की अनुमति दें। अनुकूलन के दौरान आधार रेखा की स्थापना के लिए वॉन फ्रे और तल का परीक्षण करते हैं।
  2. वॉन फ्रे टेस्ट
    1. एक एक्रिलिक बाड़े (30 सेमी × 30 सेमी × 80 सेमी) में चूहे बस्ती के लिए 30 मिनट के लिए रखें।
    2. प्राप्त वॉन फ्रे तंतु (रेशा कोई 11 -। 20) एक ही लंबाई है, लेकिन व्यास बदलती एक सीमा प्रदान करने के लिए100 ग्राम - के 2 बलों की।
    3. चूहे की hindpaw में पंजा वापसी सीमा का आकलन करने के लिए, 5 मिनट के अंतराल पर intertrial एक्रिलिक थाली पर एक शुद्ध-तरह पोर्ट के माध्यम से hindpaws के केंद्र प्रोत्साहित करने के लिए वॉन फ्रे तंतु का उपयोग करें। जब तक अधिकतम लागू दबाव दर्ज की गई है अधिकतम लागू दबाव रिकॉर्ड करने के लिए, आरोही क्रम में तंतु का उपयोग उच्च करने के लिए कम से। 10
    4. जब चूहों उत्तेजना के लिए एक पंजा वापसी प्रतिक्रिया दिखा रहे हैं, रेशा संख्या रिकॉर्ड है। सबसे कम प्रोत्साहन के अनुसार इस परीक्षण में वापसी प्रतिक्रिया निर्धारित करते हैं।
    5. एक ही प्रक्रिया तुरंत दोहराएँ, एक ही चूहे पर लगातार तीन बार की कुल के लिए। इसी बल (ग्राम में) में रेशा संख्या में कनवर्ट और मूल्यों औसत।
  3. तल टेस्ट
    1. एक पारदर्शी Plexiglas बॉक्स बस्ती के लिए 30 मिनट के लिए (चार फ्रेम, 80 सेमी × 30 सेमी × 15 सेमी में विभाजित) में चूहे रखें।
    2. एक INF का प्रयोग करेंrared बीम एक गिलास प्लेट के माध्यम से hindpaw के केंद्र को प्रोत्साहित करने के लिए। लगभग 10 सेकंड के एक औसत पंजा वापसी प्रतिक्रिया विलंबता प्राप्त करने के लिए अवरक्त प्रकाश की तीव्रता को समायोजित करें। एक चाबी है कि अवरक्त प्रकाश स्रोत पर बदल जाता है और एक डिजिटल ठोस राज्य टाइमर शुरू होता है निराशाजनक द्वारा एक परीक्षण का संचालन। अवरक्त प्रकाश किरण की अवधि में हेरफेर।
    3. अवरक्त प्रकाश की अवधि के रिकॉर्ड जब चूहों एक पंजा वापसी प्रतिक्रिया दिखा रहे हैं। सबसे लंबी अवधि प्रत्येक परीक्षण में 20 सेकंड से अधिक नहीं होनी चाहिए ऊतकों को नुकसान से बचने के लिए। लगातार उत्तेजना से बचने के लिए कम से कम 5 मिनट की एक intertrial अंतराल का प्रयोग करें।
    4. बाएँ और दाएँ hindpaws के लिए तीन परीक्षण के साथ परीक्षण दोहराना, और प्रत्येक चूहे के लिए प्रत्येक hindpaw के लिए औसत की गणना।
  4. कोलेजिनेस घाव सर्जरी
    1. और पैर के अंगूठे चुटकी प्रतिक्रिया के नुकसान दैहिक प्रतिक्रियाओं तक 4% isoflurane के साथ चूहे anesthetize की शल्य उत्तेजनाओं होते हैं। 2% isoflur - 1.5 के साथ संज्ञाहरण बनाए रखेंसर्जरी की अवधि के लिए ane।
    2. एक stereotaxic डिवाइस में चूहे एक सरल हीटिंग पैड के साथ की जगह 36.5 पर शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए - 37.5 डिग्री सेल्सियस। आँखों पर आँख क्रीम लगाओ जबकि संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए।
    3. निष्फल बिजली कतरनी के साथ फर दाढ़ी, और खोपड़ी के midline के साथ एक छुरी के साथ एक चिकनी चीरा (लगभग 2-2.5 सेमी) बनाते हैं। त्वचा और प्रोविडेंस आयोडीन और कीटाणुशोधन के लिए 75% शराब समाधान के साथ बारी खोपड़ी को साफ करें। शल्य चरण के दौरान, सभी उपकरणों, उपकरण बाँझ 75% शराब का उपयोग करें, और कार्यक्षेत्र बाँझ स्थिति बनाए रखने के लिए। इससे पहले, सभी सर्जिकल सामग्री एक भाप आटोक्लेव में निष्फल किया जाना चाहिए।
    4. एक बिजली के चेतक की (उदर posteromedial thalamic नाभिक [VPM] और उदर posterolateral thalamic नाभिक [VPL] सहित) वीबी खत्म ड्रिल के साथ खोपड़ी में बाँझ दस्ताने और उपकरणों का उपयोग करें, और एक छोटा सा छेद ड्रिल (3 मिमी व्यास) (3.0 -3.5 पीछे मिमी, 3.0-3.5 मिमी पार्श्वशीर्षस्थान के लिए, और 5.5-5.8 मिमी खोपड़ी की सतह से गहराई)।
    5. Microinject सामान्य नमक के 0.5 μl या नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों में क्रमश प्रकार 4 collagenase समाधान के 0.125 यू।
    6. एक अतिरिक्त 5 मिनट दवा प्रसार के लिए अनुमति देने के लिए के लिए जगह में इंजेक्शन की सुई रखें।
    7. दंत सीमेंट का प्रयोग खोपड़ी में छेद को भरने के लिए, और चीरा सिवनी। सीवन चीरा के बाद, घाव करने के लिए स्थानीय एनाल्जेसिक anesthetics (lidocaine मरहम) लागू होते हैं, और उन्हें अपने घर पिंजरों में वापस।
    8. सर्जरी के बाद, अकेले प्लास्टिक पिंजरों में चूहों के घर जब तक वे स्टर्नल लेटना बनाए रखने, और गर्म रहता है संज्ञाहरण से बरामद तक।
  5. सर्जिकल वसूली के बाद व्यवहार परीक्षण
    1. सर्जरी से वसूली के 7 दिनों के बाद, वर्गों 2.2 और 2.3 परीक्षण चरण के लिए प्रक्रियाओं को दोहराएँ। स्वास्थ्य और जानवरों के विकास की स्थिति की निगरानी करते हुए 4 सप्ताह से अधिक व्यवहार परीक्षण प्रदर्शन करना।
      2. (जैसे, शरीर के वजन, राशि खिला, और मुक्त आंदोलन) की निगरानी।
  6. पीई 50 ट्यूबिंग के साथ प्रवेशनी आरोपण प्रदर्शन करना
    1. 4% isoflurane के साथ चूहे anesthetize, और 36.5 पर शरीर का तापमान बनाए रखने - एक सरल हीटिंग पैड के साथ 37.5 डिग्री सेल्सियस।
    2. एक छुरी के साथ, आगे के हाथ के पृष्ठीय भाग और बाएं कंधे और वक्ष गुहा, क्रमशः के उदर भाग के चौराहे के midline में दो छेद (2 सेमी व्यास प्रत्येक) काटा।
    3. त्वचा और दो छेद के बीच कैंची की एक जोड़ी के साथ मांसपेशियों अलग कर देना।
    4. उदर छेद के माध्यम से पीई 50 ट्यूबिंग (20 सेमी लंबाई) बाहरी गले नस के एक छोर से कनेक्ट। पृष्ठीय छेद करने के लिए एक ही पीई 50 ट्यूबिंग के टर्मिनल अंत कनेक्ट, और त्वचा के लिए प्रत्यय।
    5. गले नस में खारा इंजेक्षन करने के लिए एक सिरिंज का प्रयोग करें सत्यापित करने के लिए कि पीई 50 ट्यूबिंगबाधित नहीं है।
    6. चीरा सीवन, और 6 मिलीग्राम / किग्रा (intraperitoneally) gentamycin के साथ चूहों इंजेक्षन।
    7. ट्यूबिंग 0.9% की 0.3 मिलीलीटर नमक के साथ सर्जरी के बाद हर दूसरे दिन फ्लश, 20 यू / एमएल हेपरिन के साथ खारा की 0.1 मिलीलीटर द्वारा पीछा किया।
  7. अंतिम व्यवहार परीक्षण
    1. एक सप्ताह 2.6 कदम के बाद, दोहराने कदम 2.2-2.3 कि व्यवहार की पुष्टि करने के लिए शल्य चिकित्सा की वसूली के बाद 2.5 कदम के साथ तुलना में स्थिर है।
  8. Radiotracer इंजेक्शन
    1. अनुकूलन के लिए 10 मिनट - 5 के लिए एक आराम पिंजरे में चूहे रखें।
    2. एक फाड़नेवाला का उपयोग करना, दो 1 मिलीलीटर सीरिंज से कनेक्ट पीई 50 ट्यूबिंग। सामान्य नमक के साथ एक सिरिंज भरें और (0.3 की मात्रा में 125 μCi / किलो - 0.5 एमएल) के साथ [14 सी] -IAP समाधान अन्य भरें।
    3. बाहरी गले नस में radiotracer इंजेक्षन, और 3 एम पोटेशियम क्लोराइड के साथ भरा एक और सिरिंज के साथ सिरिंज की जगह।
    4. दस सेकंड radiotracer inj के बादection, मानक इच्छामृत्यु तरीकों के अनुसार isoflurane की अधिक मात्रा के तहत इंजेक्षन 3 एम पोटेशियम क्लोराइड, और बलिदान जानवरों (यानी, 50 मिनट के लिए एक vaporizer से isoflurane) ताइवान में एकेडेमिया सिनिका संस्थागत पशु की देखभाल के दिशा निर्देशों और उपयोगिता समिति पर आधारित है।
    5. 1 मिनट के बाद, खोपड़ी का पर्दाफाश, और शेष पेशी बंद ट्रिम। rongeurs का उपयोग करना, मस्तिष्क से खोपड़ी के पृष्ठीय सतह दूर छील। खोपड़ी rongeurs का उपयोग के पक्ष दूर ट्रिम। इसके बाद, एक रंग का उपयोग, घ्राण बल्ब और मस्तिष्क के उदर सतह के साथ तंत्रिका कनेक्शन काट, और मस्तिष्क को हटा दें।
    6. (लगभग -55 डिग्री सेल्सियस) सूखी बर्फ और methylbutane में मस्तिष्क फ्रीज करने के लिए इष्टतम काटने तापमान (अक्टूबर) यौगिक प्रयोग करें। एक फ्रीजर में मस्तिष्क के ऊतकों की दुकान। 11, 12
  9. मस्तिष्क टुकड़ा करने की क्रिया
    1. एक microtome में ऊतक ओरिएंट, hindbrain नीचे का सामना करना पड़ के साथ। में 20 और मस्तिष्क टुकड़ा करने के लिए एक cryostat का प्रयोग करें# 181; M-मोटी वर्गों।
    2. खुर्दबीन स्लाइड पर मस्तिष्क स्लाइस -20 डिग्री सेल्सियस पर एक cryostat में रखें, प्रत्येक टुकड़ा के बीच एक 240 माइक्रोन अंतराल के साथ।
    3. माइक्रोस्कोप स्लाइड और -20 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए जोखिम कैसेट में वर्गीकृत रेडियोधर्मिता के साथ पांच मानक फिल्टर कागजात रखें। मस्तिष्क के स्लाइस के अनुक्रम के अनुसार, ऊपर से नीचे तक खुर्दबीन स्लाइड की व्यवस्था। अंत में, कैसेट के तल में फिल्टर कागजात जगह है। 12
    4. जोखिम कैसेट से भास्वर स्क्रीन निकालें, और एक चर-मोड इमेजर का उपयोग मस्तिष्क स्लाइस के लिए दिखाने के लिए [14 सी] -IAP तेज भास्वर स्क्रीन छवियों पढ़ सकते हैं और उत्पन्न करते हैं।

3. डेटा विश्लेषण

  1. कदम 2.9.4 के बाद, सांख्यिकीय पैरामीट्रिक मानचित्रण (एसपीएम) और ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों को समायोजित। सीरियल राज्याभिषेक वर्गों का उपयोग कर छवियों के सभी पुनर्निर्माण किया। चिकनी और एक संदर्भ चूहे के मस्तिष्क मॉडल के अनुसार छवियों मानक के अनुसार।12, 13
  2. मात्रात्मक आकलन के लिए, ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग पिक्सेल संकेत तीव्रता का निर्धारण, और विश्लेषण के लिए सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए इस क्षेत्र के हित मस्तिष्क छवियों की (आरओआई) को मापने। 12, 13
  3. अलग मस्तिष्क नाभिक के बीच कनेक्शन की जांच करने के लिए, एक अंतरक्षेत्रीय सहसंबंध मैट्रिक्स में रेडियोधर्मिता अनुपात प्रदर्शित करने के लिए MATLAB सहसंबंध विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग, और रंग नक्शे के रूप में matrices कल्पना। अंत में, नेटवर्क विश्लेषण के लिए Pajek सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। 12, 13
  4. का प्रयोग करें 2 × 5 दो तरह से विचरण के मिश्रित विश्लेषण (एनोवा), समूह के साथ और कारकों के रूप में सप्ताह, बेस लाइन पर तल का परीक्षण और दिखावा और CPSP समूहों में वॉन फ्रे परीक्षा में यांत्रिक शक्ति में गर्मी सहिष्णुता की अवधि की तुलना करने और सप्ताह 1 - 5. एक 2 × 31 दो तरह एनोवा समूह और मस्तिष्क क्षेत्र के अनुसार रेडियोधर्मिता अनुपात को मापने के लिए प्रयोग करें। जब उचित हो, Tukey की ईमानदारी से महत्वपूर्ण अंतर (एचएसडी) पोस्ट अस्थायी परीक्षण का संचालन। कालculate पियर्सन सहसंबंध का दिखावा और CPSP समूहों में चुना मस्तिष्क क्षेत्रों के सभी के बीच सह-संबंध का आकलन करने के गुणांक।

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Representative Results

चित्रा 1 ए प्रयोगात्मक समय दर्शाया गया है। चूहे दिखावा और व्यवहार परीक्षण के लिए CPSP समूह (यानी, वॉन फ्रे परीक्षण और तल का परीक्षण) को सौंपा गया। प्रयोग के पहले दिन आधारभूत रूप में सेवा की है, और परीक्षण सप्ताह 1 में दोहराया गया है - सप्ताह में 5. पीई 50 कैथीटेराइजेशन बाहरी गले नस में प्रदर्शन किया गया था 4. हेपरिन (20 यू / एमएल, 0.1 मिलीग्राम / दिन) के दौरान इंजेक्ट किया गया था सप्ताह 4 और हेपरिन इंजेक्शन के बाद 5. पांच मिनट, [14 सी] -IAP इंजेक्ट किया गया था, बलिदान के लिए संवेदनाहारी की अधिक मात्रा से 10 सेकंड के बाद हुई। एक मिनट बाद, चूहों decapitated थे, और अक्टूबर-एम्बेडेड मस्तिष्क स्लाइस किए गए थे। चित्रा 1 बी एक शल्य stereotaxic डिवाइस, प्रवेशनी आरोपण साइटों, और मस्तिष्क एक चूहे के मस्तिष्क एटलस के आधार पर स्लाइस की ऊतकीय नक्शे में चूहों को दर्शाया गया है। 1C शो चित्रा लाल रंग में बाहरी गले नस की सही छेद, पीई 50 ट्यूबिंग का स्थान है, औरअंतिम प्रयोगात्मक सेटअप।

चित्रा 2A मस्तिष्क स्लाइस कि कैसेट में अवगत कराया गया पता चलता है। भास्वर स्क्रीन एक चर-मोड इमेजर का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था। नमूना और मस्तिष्क स्लाइस के लिए मानक डेटा तो विश्लेषण किया गया। चित्रा 2 बी मानक autoradiographic घटता से पता चलता है। बाएं पैनल, छवि तीव्रता (पिक्सेल / 2 मिमी) और प्रति मिनट रेडियोधर्मिता मायने रखता है (सीपीएम) के बीच संबंध को दर्शाता है इस प्रकार की भविष्यवाणी की निम्न रेखीय समीकरण उपज: वाई = 44.542X + 196.24। सही पैनल से पता चलता है कि संकल्प (पिक्सेल / 2 मिमी) समय जोखिम में वृद्धि हुई (दिनों में) के रूप में बढ़ाया गया था। इष्टतम संकल्प दिवस 4 पर मनाया गया।

चित्रा 3 ए तल का परीक्षण है, जो थर्मल दर्द का आकलन के लिए प्रयोगात्मक स्थापना से पता चलता है। CPSP समूह पंजा वापसी सीमा में एक महत्वपूर्ण कमी का प्रदर्शन पी <0.05) चित्रा 3 बी वॉन फ्रे परीक्षण है, जो यांत्रिक दर्द का आकलन के लिए प्रयोगात्मक स्थापना से पता चलता है। 5 (सभी पी <0.05) - CPSP समूह आधारभूत यांत्रिक बल (जीडब्ल्यू) में एक महत्वपूर्ण कमी और सप्ताह 1 का प्रदर्शन किया।

चित्रा -4 ए एक संरचनात्मक एटलस में ROIs पता चलता है। रॉय विश्लेषण से पता चला है infralimbic कोर्टेक्स (IL) prelimbic कोर्टेक्स (पीआरएल), और सिंगुलेट प्रांतस्था क्षेत्र 1 (CG1) की सक्रियता के दाएँ गोलार्द्ध में CPSP समूह में काफी अधिक था कि, वीबी के अपवाद के साथ (चित्रा 4 बी) ।

RCBF का अंतर-क्षेत्रीय सह-संबंध में मतभेद दाएँ गोलार्द्ध (चित्रा 4C) में CPSP और नकली समूहों के बीच मनाया गया। मैट्रिक्स (फिशर के जेड-Statistics) क्षेत्रों के सभी के पियर्सन के सह-संबंध का उपयोग कर। चित्रा 4C CPSP समूह में तंत्रिका substrates के शामिल होने की अंतर-क्षेत्रीय सह-संबंध में मतभेद से पता चलता विश्लेषण किया गया था। दर्द से संबंधित तंत्रिका substrates rCBF का अंतर-क्षेत्रीय सह-संबंध में मतभेद का विश्लेषण करके निर्धारित किया गया है। चित्रा 4D में लाल लाइनों महत्वपूर्ण सकारात्मक सहसंबंध संकेत मिलता है, और नीले रंग की लाइनों महत्वपूर्ण नकारात्मक सहसंबंध संकेत मिलता है।

आकृति 1
चित्रा 1. प्रायोगिक थैलेमस के उदर बेसल नाभिक (वीबी) lesioning प्रेरित करने के लिए केंद्रीय पोस्ट-स्ट्रोक दर्द (CPSP) और इंजेक्शन [14 सी] -IAP का समय। (ए) उदर बेसल नाभिक घावों व्यवहार के मूल्यांकन और [14 सी] -IAP के इंजेक्शन के लिए प्रेरित करने के लिए CPSP तंत्रिका substrates कि CPSP में शामिल कर रहे हैं की सक्रियता को मापने के लिए। (बी) वीबी का स्थान। (सी) [14 सी] -IAP इंजेक्शन। स्केल बार = 1 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. मानक autoradiographic घटता। (ए) नमूना और मानक घटता अलग जोखिम बार और छवि संकल्प के लिए प्राप्त किया गया। (बी) छवि तीव्रता और सीपीएम और जोखिम समय और संकल्प के मानक वक्र के मानक वक्र। एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा का संस्करण।

चित्र तीन
फाईआंकड़ा 3. तल टेस्ट (थर्मल दर्द) और वॉन फ्रे टेस्ट (यांत्रिक दर्द) बेस लाइन पर शाम में और CPSP समूह का आयोजन किया गया और सप्ताह 1 - 5. (क) CPSP चूहों तल की परीक्षा में एक कम पंजा वापसी सीमा (प्रदर्शन किया यानी, कम गर्मी सहिष्णुता) दिखावा चूहों, अधिक से अधिक थर्मल दर्द का संकेत के साथ तुलना में। (बी) CPSP चूहों वॉन फ्रे की परीक्षा में एक कम पंजा वापसी सीमा का प्रदर्शन किया दिखावा चूहों के साथ तुलना में, अधिक से अधिक यांत्रिक दर्द का संकेत है। एसईएम, मतलब की मानक त्रुटि। ग्रीन तारे (*) दिखावा समूह के साथ तुलना एक महत्वपूर्ण अंतर से संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. रॉय विश्लेषण और रिश्ता इंटर-आर के बीचतंत्रिका substrates CPSP में शामिल बीच egional Correlations। (ए) मस्तिष्क क्षेत्रों और निर्धारित अनुपात सूत्रीकरण द्वारा विश्लेषण किया गया। (बी) आईएल, पीआरएल, CG1, और वीबी में ROIs दाएँ गोलार्द्ध में काफी अलग थे। (सी) विश्लेषण चुने हुए क्षेत्रों में मस्तिष्क rCBF। (डी) मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच अंतर-क्षेत्रीय सह-संबंध की। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

व्यवहार परीक्षण में, CPSP समूह आधारभूत पर थर्मल दर्द परीक्षण और वॉन फ्रे परीक्षण में यांत्रिक शक्ति में पंजा वापसी सीमा की कटौती और सप्ताह 1 का प्रदर्शन किया -। 5. निष्कर्षों पिछले एक अध्ययन के साथ संगत कर रहे थे 14

[14 सी] -IAP विधि अलग मस्तिष्क स्लाइस की मात्रात्मक विश्लेषण के लिए मस्तिष्क छवियों के पिक्सेल तीव्रता पर निर्भर करता है। मस्तिष्क छवियों में डेटा का मूल्यांकन करने के लिए, पिक्सेल संकेत तीव्रता परिभाषित किया गया था। 46.979 सीपीएम - वर्तमान अध्ययन में, पर्यावरण पृष्ठभूमि संकेत के रूप में परिभाषित किया गया था 25.811। [14 सी] -IAP 0.001 μCi फिल्टर पेपर के संकेत 42 सीपीएम के रूप में परिभाषित किया गया था। पिक्सेल संकेत तीव्रता 0.001 μCi, पृष्ठभूमि तीव्रता के रूप में सेवारत था <। पांच फिल्टर कागजात के पिक्सेल तीव्रता 0.001, 0.01, 0.1, और 10 के लिए निर्धारित किया गया था μCi, मस्तिष्क छवियों में से प्रत्येक के लिए पिक्सेल ग्रे पैमाने के रूप में कार्यरत हैं। [14 सी] -IAP रेडियोधर्मिता एपी से पता चलापिक्सेल तीव्रता और रेडियोधर्मिता के साथ सह-संबंध ositive एक लघुगणकीय पैमाने पर भरोसा। इसलिए, उपरोक्त प्रक्रिया [14 सी] -IAP रेडियोधर्मिता तीव्रता पिक्सेल की जांच के लिए पीछा किया जा सकता है।

जब [14 सी] -IAP प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रदर्शन, कुछ बिंदुओं पर विचार करने की जरूरत है। उदाहरण के लिए, बाहरी गले नस अवरुद्ध हो सकता है, और प्रयोगकर्ताओं हर दिन हेपरिन के साथ पीई 50 ट्यूबिंग की प्रत्यक्षता सुनिश्चित करने की जरूरत है। इसके अतिरिक्त, घाव साइटों के स्थान कभी कभी गलत हो सकता है, nonsignificant CPSP लक्षणों में जिसके परिणामस्वरूप। इंजेक्शन से पहले, इंजेक्शन साइटों और शीर्षस्थान के सापेक्ष स्थानों की सटीकता की पुष्टि की जानी चाहिए। कोण और प्रत्येक इंजेक्शन की मात्रा भी सही निर्धारित किया जाना चाहिए।

मस्तिष्क छवियों की सीमाएं भी विचार किया जाना चाहिए। मस्तिष्क छवियों की विकृतियों एक भास्वर स्क्रीन करने के लिए कैसेट में मस्तिष्क स्लाइस को प्रकाश में लाने के बाद हो सकता है। मस्तिष्क आईएमएGES एक छवि विश्लेषण प्रोग्राम का उपयोग कर मस्तिष्क छवियों में संभावित विकृतियों से बचने के लिए एक मानक मस्तिष्क एटलस के लिए सामान्यीकृत किए जाने की जरूरत है। इसके अलावा, विभिन्न आइसोटोप क्योंकि उनके अलग तंत्र और कार्रवाई के विभिन्न परिणाम निकल सकते हैं। उदाहरण के लिए, मेटाबोलाइट और [18 एफ] -fludeoxyglucose (FDG) की कार्रवाई के तंत्र ग्लूकोज के समान हैं। इसलिए, [18 एफ] -FDG छवियों ग्लूकोज चयापचय के मार्ग के लिए समान होना दिखाया गया था। इसके अतिरिक्त, [18 एफ] -FDG के आधे-जीवन छोटा है; इसलिए, यह छवियों को उत्पन्न करने के लिए पीईटी के साथ संयुक्त किया जाना चाहिए। [201 tl] एकल फोटान उत्सर्जन गणना टोमोग्राफी का उपयोग कर दौरे रक्त प्रवाह छिड़काव का आकलन करने के लिए उपयुक्त है। इसलिए, मस्तिष्क छवियों का आकलन करने के लिए एक उपयुक्त आइसोटोप का चयन महत्वपूर्ण है।

[14 सी] -IAP विधि के आवेदन मस्तिष्क सक्रियण का आकलन करने के CPSP में अन्य ब्रेन मैपिंग तकनीक (जैसे, पीईटी और fMRI) की तुलना में कम महंगा है। टीवह [14 सी] -IAP विधि अनायास होने वाली घटनाओं के लिए उपयुक्त है, लेकिन यह वास्तविक समय में ब्रेन मैपिंग के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता। विधि पीईटी और fMRI के रूप में अन्य ब्रेन मैपिंग तकनीक, से अलग है। इसके अलावा, वर्तमान [14 सी] -IAP प्रोटोकॉल किसी भी रोग की स्थिति में rCBF में सूक्ष्म परिवर्तन उपाय कर सकते हैं।

[14 सी] -IAP विधि ऐसे spinothalamic पथ (एसटीटी), औसत दर्जे का चेतक (एमटी) -ACC, और mPFC-प्रमस्तिष्कखंड तंत्रिका सर्किट के रूप में पारंपरिक दर्द रास्ते, परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इन रास्ते प्रभावों दूसरों से प्रत्येक के सक्रियण। CPSP में इन रास्ते की सक्रियता के हमारे पिछले पत्र में विस्तृत किया गया है। 12

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

वर्तमान अध्ययन डॉ बाई-चुआंग shyu (एनएससी 99-2320-बी-001-016-MY3, एनएससी 100-2311-बी-001-003-MY3, और एनएससी 102-2320- करने के लिए राष्ट्रीय विज्ञान परिषद अनुदान द्वारा समर्थित किया गया बी-001-026-MY3)। इस काम बायोमेडिकल साइंसेज, जो एकेडेमिया सिनिका से धन प्राप्त संस्थान में आयोजित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetic:
Isoflurane Halocarbon Products Corporation  NDC 12164-002-25 4%
Surgery
homeothermic blanket system Harvard Apparatus Model 50–7079 body temperature were maintained at 36.5 - 37.5 °C.
10 µl micro syringe Hamilton 80008, Model 1701SN injected with collagenase
polyethylene-50 tubing Becton, Dickinson and Company 427411 catheterized into external jugular vein
1 c.c syringe Terumo Medical Products SS-01T injected with 14C-IAP and saline.
saline (Sodium Chloride 0.9 gm) Taiwan Biotech Co., LTD. 100-130-0201 To flush the tube
Drugs
type 4 collagenase Sigma C5138-500MG 0.125 U
Gentamicin Sigma G1264-250MG 6 mg/kg
Heparin Sigma H9399 20 U/ml; 0.1 ml/day
14C-iodoantipyrine (IAP) PerkinElmer NEC712 125 mCi/kg in 300 ml of 0.9% saline
Potassium chloride Merck 1.04936.1000 3 M
Behavior system:
von Frey esthesiometer Fabrication Enterprises, Inc. Baseline Tactile Monofilaments 12-1666 mechanical hyperalgesia was assessed by measuring the withdrawal response to a mechanical stimulus
plantar test apparatus IITC Life Science IITC 390G Plantar Test Thermal hyperalgesia was assessed by measuring the hind paw withdrawal latency in response to radiant heat.
Brain slice:
Optimal Cutting Temperature compound Sakura Fintek Inc 4583 embedded the brain
dry ice frozen in dry ice/methylbutane (approximately −55 °C)
methylbutane Sigma M32631-1L frozen in dry ice/methylbutane (approximately −55 °C)
Cryostat  Leica Biosystems Nussloch GmbH, Germany Leica CM1850 Coronal brain slice were sectioned on this machine.
Data analyze
exposure cassettes with a phosphor screen Amersham Biosciences  20 cm x 25 cm The slices were dried on glass slides and placed alongside five standard filter papers with graded radioactivity. All of the slides were exposed to the cassettes at −20 °C.
γ-counter Beckman Coulter Beckman LS 6500 Liquid Scintillation Counter To measure the radioactivity count of the filter papers.
Typhoon 9410 Variable Mode Imager  GMI, Inc. WS-S9410 To read  phosphor screen which was exposed by brain slice
Statistical Parametric Mapping (SPM) Wellcome Centre for Neuroimaging version 8 all of the brains were averaged to create the final brain template. To determine significant differences between the images in these two groups, the images were derived by subtracting the sham group from the CPSP group.
ImageJ http://imagej.nih.gov/ij version 1.46 Adjacent sections were aligned both manually and using Stack- Reg, an automated pixel-based registration algorithm in ImageJ software. All of the original three-dimensionally reconstructed brains were smoothed and normalized to the reference rat brain model.
Matlab MathWorks version 2009b used Pearson correlation coefficients to examine the relationships between the CPSP and sham groups. An inter-regional correlation matrix was calculated across animals from each group.
Pajek http://Pajek.imfm.si/ version 3.06 Graphical theoretical analysis was performed on networks defined by the above correlation matrices using Pajek software.

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चिकित्सा अंक 113 autoradiography Central Post स्ट्रोक दर्द आइसोटोप मस्तिष्क सर्किट,
के autoradiographic माप [<sup&gt; 14</sup&gt; सी] चूहे के मस्तिष्क में -Iodoantipyrine Central Post-स्ट्रोक के बाद दर्द
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Huang, A. C. W., Lu, H. C., Shyu, B. C. Autoradiographic Measurements of [14C]-Iodoantipyrine in Rat Brain Following Central Post-Stroke Pain. J. Vis. Exp. (113), e53947, doi:10.3791/53947 (2016).

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