Introduction
스트로크 출혈이 신경 병증 성 통증으로 고통 환자의 8 % 이상에서 발생하는 것으로 나타났다과 같은 중앙 뇌졸중 후 통증 (CPSP)라고합니다. 1-3 CPSP가 체 감각 장애, 이에 과민과 이질통을 유도 발생할 수 있습니다. (4) 그러나 , CPSP의 체성 감각 기능 장애의 병태 생리 학적 메커니즘은 불확실 남아있다. 예를 들어, 체성 감각의 손실은 출혈성 뇌 영역에서 신경 deafferentation 기인. 통각 과민은 중앙 통각 신경 세포 또는 중앙 탈 억제, 5, 6하지만 CPSP 증상에 관여하는 신경 기판을 알 수없는 남아의 hyperexcitability에 의해 발생할 수 있습니다. 일부 연구에서는 전전두엽 피질 (dPFC), 주동이의 앞쪽에 cingulate 피질 (ACC), 편도체, 해마, periaqueductal 그레이 (PAG), 주동이의 ventromedial 수질, 서로와의 연결이 침해 처리를 중재 할 것을 제안했다. 추가 7LY, 내측 전두엽 피질 (mPFC) -amygdala 회로는 CPSP의 병태 생리 학적 메커니즘에 8 데이터가 다양하다. 통증 관련 인식에 관여하는 것으로 도시 및 CPSP에 신경 기판의 활성화는 더 조사가 필요했다.
[14 C] -Iodoantipyrine (IAP) 흡수는 뇌 활동 CBF의 관계를 가정하여, 간접적으로 지방 뇌 혈류 (rCBF)을 관찰하는 데 사용된다. 비록 [14 C] -IAP 이러한 기능 자기 공명 영상 (fMRI)와 같이, 실시간으로 뇌 활동을 평가할 수 없으며, 이는 여러 가지 장점을 갖는다. 예를 들어, [14 C] -IAP는 자발적으로 측정 병적 인 상태 동안 뇌 이벤트를 발생하기에 적합하다. (9) 또한, [14 C] -IAP 흡수가 마취없이 측정한다. 또한, 자기 공명과 양전자 방출 단층 촬영 (PET)를 포함하는 다른 이미징 방법보다 적은 비용이 든다. 에서 [14 C] -IAP 방법은 measurin에 적합한 것으로 제안되었다시상의 복부 기저 핵 (VB)의 병변에 의해 유도되는 g 자발 통증 (예를 들어, CPSP). (9)
본 프로토콜은 동물 모델에서 시상의 VB의 병변에 의해 유도되는 CPSP의 신경 기판의 참여를 평가하는 [14 C] -IAP 방법을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 이 기술은 행동과의 연결 수준 CPSP 증상을 기초 병리 생리 학적 메카니즘을 결정하는 방법을 제공한다.
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Protocol
본 연구의 프로토콜은 대만의 중앙 연구원 기관 동물 관리의 승인 및 이용위원회를 받았다.
1. 동물 준비
- (- 400g 약 300) 수컷 흰쥐를 가져옵니다. 음식과 물을 무료로 이용할 수로 (오전 8:00에 불이) 12 시간 / 12 시간 빛 / 어둠 사이클에서 - (22 °의 C, 습도 50 % 21) 에어컨 방에 쥐를 유지한다.
2. 실험 절차
- 쥐의 모든 실험 전에 1 주간 자신의 홈 케이지의 환경에 적응하도록 허용합니다. 적응하는 동안, 기준을 설정하는 데 프레이와 발바닥 테스트를 수행합니다.
- 프레이 테스트
- 거주 30 분 동안 아크릴 케이스 (30 cm × 30 cm × 80 cm)에 쥐를 놓습니다.
- (. 아니 필라멘트 11-20) 본 프레이 필라멘트를 구하는 동일한 길이를 가지고 있지만, 직경이 변화하는 범위를 제공하도록100g - 2의 힘.
- 쥐의 뒷발의 발 움츠림 역치를 평가 5 분 intertrial 간격 아크릴 판에 그물 형 포트를 통해 hindpaws의 중심을 자극 프레이 필라멘트를 사용한다. 최대인가 된 압력이 기록 될 때까지 로우에서 하이로 오름차순으로 필라멘트를 사용하여, 최대인가 된 압력을 기록한다. (10)
- 쥐 자극에 대한 발 움츠림 반응을 나타낼 때, 필라멘트 수를 기록한다. 가장 낮은 자극에 따라이 재판에서 철수 응답을 확인합니다.
- 동일한 래트에 연속 3 회, 총 즉시 동일한 절차를 반복한다. (g)에 대응하는 힘에 필라멘트 번호를 변환하고 값을 평균.
- 발바닥 테스트
- 거주 30 분 (4 개의 프레임 80 cm × 30 cm × 15 센티미터로 구분) 투명한 플렉시 글라스 상자에 쥐를 놓습니다.
- INF를 사용하여rared 광선은 유리판을 통해 뒷발의 중심을 자극한다. 약 10 초의 평균 발 움츠림 응답 대기 시간을 얻기 위해 적외선 강도를 조정한다. 적외선 광원을 켜고 디지털 솔리드 스테이트 타이머를 시작하는 키를 누름으로써 시험을 실시한다. 적외선 광선의 지속 시간을 조작 할 수 있습니다.
- 래트가 발 움츠림 반응을 나타낼 때에 외광의 지속 시간을 기록한다. 최장 기간은 조직의 손상을 방지하기 위해 각 시험에서 20 초를 초과 할 수 없습니다. 연속적인 자극을 피하기 위해 적어도 5 분의 intertrial 간격을 사용합니다.
- 좌우 hindpaws 세 실험 테스트를 반복하고, 각 래트 뒷발에 대한 각각의 평균을 계산한다.
- 콜라게나 병변 수술
- 수술 자극이 발생에 발가락 - 핀치 응답의 손실과 체세포 응답 할 때까지 4 % 이소 플루 란과 쥐를 마취. 2 % isoflur - 1.5 마취 유지수술 시간 동안 메탄.
- 37.5 °의 C - 36.5에서 체온을 유지하기 위해 간단한 가열 패드와 정위 장치에서 쥐를 놓습니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 아이 크림을 적용합니다.
- 멸균 전기 면도기로 털을 면도하고 두피의 정중선을 따라 메스와 부드러운 절개 (약 2-2.5 cm)를 확인합니다. 섭리의 요오드 및 소독 75 % 알코올 용액을 교대로 피부와 두개골을 청소합니다. 수술 단계 동안 모든 기기, 도구 살균 75 %의 알코올을 사용하고, 작업대는 무균 상태를 유지하기. 그 전에, 모든 수술 재료는 증기 오토 클레이브 멸균해야합니다.
- (시상의 (복부 후 내측 시상 핵 [VPM]와 복부 외측 시상 핵 [VPL] 포함) VB를 통해 전기 드릴로 두개골에 3.0 작은 구멍 (3 mm 직경)를 멸균 장갑과 악기를 사용하여 드릴 -3.5 mm 후방, 3.0-3.5 mm 측면) 정수리, 두개골 표면 5.5-5.8 mm 깊이합니다.
- Microinject 생리 식염수 0.5 μL 또는 각각 제어 및 실험 그룹에서 4 형 콜라겐 용액 0.125 U.
- 약물의 확산을 허용하도록 추가로 5 분 동안 곳에 주사 바늘을 유지.
- 두개골에 구멍을 채우기 위해 치과 시멘트를 사용하고 절개를 봉합. 봉합 절개 후 상처 로컬 진통 마취제 (리도카인 연고)를 적용하고, 자신의 홈 케이지로 돌아갑니다.
- 수술 후 단독으로 그들은 흉골 드러 누움을 유지할 때까지 플라스틱 케이지의 쥐를 수용하고, 마취에서 회복 될 때까지 따뜻하게 유지합니다.
- 수술 회복 후 행동 테스트
- 수술에서 회복 7 일 후, 섹션 테스트 단계 2.2과 2.3의 절차를 반복합니다. 건강과 동물의 발달 상태를 모니터링하면서 사주를 통해 행동 테스트를 수행합니다.
- 4 % 이소 플루 란 마취 래트 및 36.5에서 체온을 유지 - 단순한 가열 패드와 37.5 ° C.
- 메스로 각각 왼쪽 어깨와 흉강의 복부 부분의 지느러미 앞발의 일부 교차로의 중간 선에 두 개의 구멍 (2cm 직경 각)을 잘라.
- 두 구멍 사이 가위로 피부와 근육을 떼어 놓다.
- 복부 구멍을 통해 외부 경정맥에 PE-50 튜브 (20cm 길이)의 한쪽 끝을 연결합니다. 지느러미 구멍 같은 PE-50 튜브의 말단을 연결하고, 피부에 부착합니다.
- 확인하기 위해 경정맥에 식염수를 주입하는 주사기를 사용하여 그 PE-50 튜브방해하지 않습니다.
- 절개 부위를 봉합하고, 6 ㎎ / ㎏ 겐타 마이신 (복강 내)로 쥐를 주입.
- 20 U / ㎖ 헤파린과 생리 식염수 0.1 ml의 다음에, 0.3 ml의 0.9 %의 식염수로 튜브를 수술 후 매일을 플래시합니다.
- 반복이 그 동작을 확인 2.2-2.3 단계 단계 2.6 이후 1 주일 수술 복구 후 단계 2.5에 비해 안정적이다.
- 적응을위한 10 분 - 5 휴식 케이지에 쥐를 놓습니다.
- 스플리터를 사용하여, 두 1ml를 주사기에 PE-50 튜브를 연결합니다. 생리 식염수 하나의 주사기를 입력하고 (- 0.5 ml의 0.3의 볼륨에 125 μCi를 / kg) [14 C] -IAP 솔루션을 다른 입력합니다.
- 외부 경정맥에 추적자를 주입하고, 3 M 염화칼륨 가득 다른 주사기 주사기를 교체합니다.
- 텐 초 추적자의 INJ 후ection, 표준 안락사 방법에 따라 동물을 이소 플루 란의 과다 복용에서 3 M 염화칼륨을 주입하고, 희생 (즉, 50 분 동안 기화기에서 이소 플루 란) 대만하여 중앙 연구원 기관 동물 관리의 지침과 이용위원회를 기반으로.
- 1 분 후, 두개골을 노출하고, 나머지 근육 잘라내. rongeurs를 사용하여 뇌에서 두개골의 지느러미 표면을 벗겨. rongeurs을 이용하여 두개골의 측면을 얻어 낸다. 다음에, 주걱을 이용하여, 뇌의 복부 표면을 따라 후각 신경 전구 연결을 잘라 뇌를 제거한다.
- 드라이 아이스와 메틸 부탄의 두뇌를 동결 최적의 절삭 온도 OCT () 화합물을 사용하여 (약 -55 ° C). 냉동실에 뇌 조직을 저장합니다. 11, 12
- 후뇌이 아래를 향하도록하여, 마이크로톰에서 조직의 방향. 20로 뇌를 슬라이스 그라 이오 스탯을 사용하여# 181; m 두께의 섹션.
- 각 조각 사이에 240 μm의 간격으로, -20 ° C에서 저온 유지 장치에 현미경 슬라이드에 뇌 조각을 놓습니다.
- 현미경 슬라이드와 -20 ° C에서 3 일간 노출 카세트에 등급 방사능 다섯 표준 필터 종이를 놓습니다. 뇌 조각의 순서에 따라 위에서 아래로 현미경 슬라이드를 준비. 마지막으로, 카세트의 저부에 여과지를 배치했다. 12
- 노광 카세트로부터 형광면을 제거하고 뇌 슬라이스 [14 C] -IAP 흡수를 보여주기 위해 이미지를 형광체 스크린을 읽고 생성하는 가변 모드 이미 저를 사용한다.
3. 데이터 분석
- 단계 2.9.4 후에 통계적 매개 변수 사상 (SPM) 및 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 이미지를 조정한다. 직렬 관상 섹션을 사용하여 모든 이미지를 재구성. 부드럽고 기준 쥐 뇌 모델에 따라 이미지를 정규화.12 13
- 정량적 평가를 위해, 픽셀 신호 강도를 판정하고, 통계 해석 소프트웨어를 사용 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 관심 영역 뇌 영상 (ROI)을 측정한다. (12, 13)
- 다른 뇌 핵 사이의 연결을 조사하기 위해, 지역간 상관 행렬의 방사능 비율을 표시하는 MATLAB 상관 분석 소프트웨어를 사용하여 컬러 맵 행렬로 시각화. 마지막으로, 네트워크 분석 Pajek 소프트웨어를 사용한다. (12) (13)
- 베이스 라인에서 가짜 및 CPSP 그룹의 프레이 시험에서 발바닥 시험 및 기계적 힘에 열 관용의 지속 기간을 비교, 2 × 편차의 5 양방향 혼합 분석 (ANOVA), 그룹 및 주 요인으로 사용하고 주 1 - 5. ANOVA 그룹 뇌 영역에있어서 방사능 비율을 측정하는 2 × 31 양방향. 적절한 경우, Tukey에의 정직 유의 한 차이 (HSD) 사후 검사를 실시하고 있습니다. 칼culate 피어슨 상관 관계는 가짜와 CPSP 그룹에서 선택된 뇌 영역의 모든 사이에 상관 관계를 평가하는 계수.
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Representative Results
도 1a는 실험적인 타임 라인을 도시한다. 쥐가 행동 검사에 대한 사기 및 CPSP 그룹 (즉, 본 프레이 시험 및 발바닥 시험)에 할당되었다. 실험의 첫 날 기준으로 제공하고, 시험 1 주에 반복 - 4 헤파린 (20 U / ㎖, 0.1 ㎖ / 일) 동안 주입 일주일에 5 PE-50 카테터 외부 경정맥을 시행 하였다 주 (4)과 헤파린 주사 후 5. 5 분, [14 C] -IAP가 주입, 희생 마취제의 과다 복용으로 10 초 이상 따랐다. 한 분 후, 래트를 참수시키고, 옥트 매립 뇌 조각이 만들어졌다.도 1b는 외과 정위 장치 정맥 주입 사이트, 래트 뇌 아틀라스에 기초하여 상기 뇌 조각 학적 맵에 쥐를 나타낸다.도 1c 방송 도표 빨간색 외부 경정맥의 오른쪽 구멍은 PE-50 튜브의 위치,최종 실험 장치.
도 2a는 카세트에 노출 된 뇌 조각을 보여줍니다. 형광면은 가변 모드 이미 저를 사용하여 분석 하였다. 뇌 조각의 샘플 및 표준 데이터는 분석 하였다. 그림 2b는 표준 방사 법적 곡선을 보여줍니다. 왼쪽 패널은 따라서 다음과 같은 선형 예측 식을 산출 이미지 세기 (화소 / mm 2) 분당 방사능 계수 (CPM)의 관계를 나타낸다 : Y = 44.542X + 196.24. 오른쪽 패널 해상도 (픽셀 / mm 2) (일) 증가 노출 시간으로 개선 된 것을 알 수있다. 최적의 해상도는 4 일에 관찰되었다.
그림 3a는 열 통증을 평가 발바닥 테스트를위한 실험 구성도이다. CPSP 그룹은 발 움츠림 역치의 상당한 감소를 나타내
도 4a는 해부학 아틀라스의 ROI를 보여줍니다. 관심 영역 분석은 infralimbic 피질 (IL) prelimbic 피질 (PRL) 및에 cingulate 피질 영역 1 (CG1)의 활성화가 VB 제외한 우반구에 CPSP 그룹에서 훨씬 더 높은 것으로 나타났다 (도 4b) .
rCBF의 지역간 상관 관계의 차이는 오른쪽 반구 (그림 4C)에서 CPSP과 가짜 그룹 사이에서 관찰되었다. 매트릭스 (피셔의 Z-일atistics) 지역의 모든 피어슨의 상관 관계를 사용하여. 그림 4C는 CPSP 그룹의 신경 기판의 참여의 지역 간 상관 관계의 차이를 보여줍니다 분석의. 통증 관련 신경 기판은 rCBF의 지역간 상관 관계의 차이를 분석하여 측정 하였다. 그림 4D의 붉은 선은 유의 한 양의 상관 관계를 나타내고, 파란색 선은 유의 한 음의 상관 관계를 나타냅니다.
중앙 후 스트로크 통증 (CPSP) 및 주입 [14 C] -IAP을 유도하기 위해 시상의 복부 기저 핵 (VB)를의 lesioning 그림 1. 실험 타임 라인. (A) 복부 기저 핵 병변 CPSP에 관여하는 신경 기판의 활성을 측정하기 위해 행동 평가 및 [14 C] -IAP의 주사를 CPSP을 유도VB의. (B) 위치. (C) [14 C] -IAP 주사. 스케일 바 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 표준 방사 법적 곡선. (A) 샘플 및 표준 곡선은 노출 시간과 이미지 해상도 다른 얻어졌다. (B) 이미지 강도와 CPM 및 노출 시간 해상도의 표준 곡선의 표준 곡선. 더 큰 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 버전입니다.
인터넷gure 3. 발바닥 시험 (열 통증)과 본 프레이 시험 (기계 통증) 기준에 위장 및 CPSP 그룹에서 실시하고, 주 1 - 5. (A) CPSP 쥐 발바닥 시험에서 낮은 발 철수 임계 값 (전시 큰 열 통증을 나타내는 모의 래트와 비교 예 이하의 열 내성). (B) CPSP 래트 큰 기계적 통증을 나타내는 모의 쥐와 비교하여 본 프레이 시험에서 낮은 발 움츠림 역치를 나타내었다. SEM, 평균의 표준 오차. 녹색 별표 (*)가 가짜 그룹에 비해 유의 한 차이를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
간 R 사이에 그림 4. 투자 수익 (ROI) 분석 및 관계CPSP에 관여하는 신경 기판 사이 egional 상관 관계. (A) 뇌 영역이 결정되고, 비 제제에 의해 분석 하였다. (B)를 IL, PRL, CG1 및 VB에서의 ROI는 우반구에 크게 달랐다. (C) 분석 선택된 뇌 영역에서 rCBF. (D) 뇌 영역 사이의 지역간 상관 관계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
행동 검사에서 CPSP 그룹 기준의 본 프레이 시험 열 통증 검사 기계적 힘의 발 움츠림 역치의 감소 및 일주 전시 -. 5. 결과는 이전의 연구와 일치 하였다 14
에서 [14 C] -IAP있어서 다른 뇌 조각의 정량적 분석을 위해 뇌 영상의 화소 강도에 의존한다. 뇌 영상의 데이터를 평가하기 위해, 픽셀 신호 강도를 정의 하였다. 46.979 CPM - 본 연구에서, 환경 배경 신호는 25.811로 정의 하였다. 에서 [14 C] -IAP 0.001 μCi를 여과지의 신호는 CPM (42)로 정의 하였다. 픽셀 신호 강도는 백그라운드 강도로서 <μCi를 0.001이었다. 다섯 여과지의 화소 강도 뇌 영상의 각 화소의 계조로서, 0.001, 0.01, 0.1 및 10 μCi를 결정 하였다. [14 C]는 -IAP 방사능은 AP 통신을 보였다픽셀 강도 및 방사능와 ositive 상관 관계 대수 규모로 계산합니다. 따라서, 상기 방법은 강도가 화소 [(14) C] -IAP 방사능의 교정에 이어 수있다.
에서 [14 C] -IAP 실험 프로토콜을 수행 할 때, 어떤 점이 고려되어야한다. 예를 들어, 외부 경정맥 차단하고, 실험자는 매일 헤파린과 PE- 50 관의 개방성을 보장하기 위해 필요 될 수있다. 또한, 병변 부위의 위치는 종종 비 유효 CPSP 현상의 결과로 잘못 될 수있다. 주사 전에, 주사 부위와 정수리 상대적인 위치의 정확성이 확인되어야한다. 각각의 분사의 각 볼륨은 정확하게 결정되어야한다.
뇌 영상의 제한도 고려 될 필요가있다. 뇌의 이미지 왜곡이 형광면에 카세트 뇌 조각을 노광 한 후 발생할 수있다. 뇌 심상GES 뇌 이미지에서 잠재적 인 왜곡을 방지하기 위해, 화상 해석 프로그램을 사용하여 표준 뇌 아틀라스 정규화 할 필요가있다. 또한, 다른 동위 원소 때문에 다른 메커니즘과 행동의 서로 다른 결과를 얻을 수 있습니다. 예를 들어, 대사 산물과 [18 F] -fludeoxyglucose (FDG)의 작용 메커니즘은 포도당과 비슷합니다. 따라서, [18는 F] -FDG 이미지 글루코스 대사 경로와 유사한 것으로 나타났다. 또한, [18 F] -FDG의 반감기가 짧다; 따라서, 이미지를 생성하기 위해 PET와 결합해야한다. [T1 내지 201]은 단일 광자 방출 전산화 단층 촬영을 이용하여 심근 혈류 관류를 평가하기에 적합하다. 따라서, 뇌 이미지를 평가하기에 적합한 동위 원소를 선택하는 것이 중요합니다.
CPSP 다른 뇌 매핑 기법 (예를 들면, PET 및 자기 공명)보다 비싸다 상기 [14 C] -IAP 방법의 적용은 뇌의 활성을 평가한다. 티그는 [14 C] -IAP 방법은 자발적으로 발생하는 이벤트에 적합하지만, 이는 실시간으로 뇌 매핑에 사용될 수 없다. 이 방법은 자기 공명 PET와 같은 다른 뇌 맵핑 기술과 다르다. 또한, 본 [14 C] -IAP 프로토콜은 병리 상태 rCBF의 미묘한 변화를 측정 할 수있다.
에서 [14 C] -IAP 방법은 같은 spinothalamic 기관 (STT), 내측 시상 (MT) -ACC 및 mPFC - 편도체 신경 회로와 같은 기존의 통증 경로를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 경로의 영향을 다른 사람의 각각의 활성화. CPSP에서 이러한 경로의 활성화는 우리의 이전 논문에서 설명되었다. (12)
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
본 연구는 박사 바이 - 추앙 Shyu (NSC 99-2320-B-001-016-MY3, NSC 100-2311-B-001-003-MY3 및 NSC 102-2320-에 국가 과학위원회의 보조금 지원 B-001-026-MY3). 이 작품은 중앙 연구원에서 자금을받은 생명 과학 연구소에서 실시 하였다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: | |||
| Isoflurane | Halocarbon Products Corporation | NDC 12164-002-25 | 4% |
| Surgery | |||
| homeothermic blanket system | Harvard Apparatus | Model 50–7079 | body temperature were maintained at 36.5 - 37.5 °C. |
| 10 µl micro syringe | Hamilton | 80008, Model 1701SN | injected with collagenase |
| polyethylene-50 tubing | Becton, Dickinson and Company | 427411 | catheterized into external jugular vein |
| 1 c.c syringe | Terumo Medical Products | SS-01T | injected with 14C-IAP and saline. |
| saline (Sodium Chloride 0.9 gm) | Taiwan Biotech Co., LTD. | 100-130-0201 | To flush the tube |
| Drugs | |||
| type 4 collagenase | Sigma | C5138-500MG | 0.125 U |
| Gentamicin | Sigma | G1264-250MG | 6 mg/kg |
| Heparin | Sigma | H9399 | 20 U/ml; 0.1 ml/day |
| 14C-iodoantipyrine (IAP) | PerkinElmer | NEC712 | 125 mCi/kg in 300 ml of 0.9% saline |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936.1000 | 3 M |
| Behavior system: | |||
| von Frey esthesiometer | Fabrication Enterprises, Inc. | Baseline Tactile Monofilaments 12-1666 | mechanical hyperalgesia was assessed by measuring the withdrawal response to a mechanical stimulus |
| plantar test apparatus | IITC Life Science | IITC 390G Plantar Test | Thermal hyperalgesia was assessed by measuring the hind paw withdrawal latency in response to radiant heat. |
| Brain slice: | |||
| Optimal Cutting Temperature compound | Sakura Fintek Inc | 4583 | embedded the brain |
| dry ice | frozen in dry ice/methylbutane (approximately −55 °C) | ||
| methylbutane | Sigma | M32631-1L | frozen in dry ice/methylbutane (approximately −55 °C) |
| Cryostat | Leica Biosystems Nussloch GmbH, Germany | Leica CM1850 | Coronal brain slice were sectioned on this machine. |
| Data analyze | |||
| exposure cassettes with a phosphor screen | Amersham Biosciences | 20 cm x 25 cm | The slices were dried on glass slides and placed alongside five standard filter papers with graded radioactivity. All of the slides were exposed to the cassettes at −20 °C. |
| γ-counter | Beckman Coulter | Beckman LS 6500 Liquid Scintillation Counter | To measure the radioactivity count of the filter papers. |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | GMI, Inc. | WS-S9410 | To read phosphor screen which was exposed by brain slice |
| Statistical Parametric Mapping (SPM) | Wellcome Centre for Neuroimaging | version 8 | all of the brains were averaged to create the final brain template. To determine significant differences between the images in these two groups, the images were derived by subtracting the sham group from the CPSP group. |
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij | version 1.46 | Adjacent sections were aligned both manually and using Stack- Reg, an automated pixel-based registration algorithm in ImageJ software. All of the original three-dimensionally reconstructed brains were smoothed and normalized to the reference rat brain model. |
| Matlab | MathWorks | version 2009b | used Pearson correlation coefficients to examine the relationships between the CPSP and sham groups. An inter-regional correlation matrix was calculated across animals from each group. |
| Pajek | http://Pajek.imfm.si/ | version 3.06 | Graphical theoretical analysis was performed on networks defined by the above correlation matrices using Pajek software. |
References
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