Introduction
脳卒中の出血は、神経因性疼痛に苦しむ患者の8％以上で起こることが示されており、中央の脳卒中後疼痛（CPSP）と呼ばれる。1-3 CPSPそれにより過敏症および異痛症を誘発する、感覚機能不全から生じ得る。4が、CPSPにおける体性感覚機能障害の病態生理学的メカニズムは不明のまま。例えば、体性感覚の喪失は出血性脳領域の神経求心路遮断に起因します。痛覚過敏は、中央侵害受容ニューロンまたは中枢脱抑制、5、6しかしCPSP症状に関与している神経基盤は不明のままの過剰興奮によって引き起こされることがあります。いくつかの研究は、背外側前頭前野（DPFC）、吻側前帯状皮質（ACC）、扁桃体、海馬、中脳水道周囲灰白質（PAG）、吻側腹内側髄質、および互いの接続が侵害受容処理を仲介することを示唆している。追加の7LY、内側前頭前皮質（のmPFC）-amygdala回路は、疼痛関連の知覚に関与していることが示された。CPSPの病態生理学的メカニズムの8データは多様であり、かつCPSPの神経基質の活性化がさらに精査が必要です。
[14 C] -Iodoantipyrine（IAP）の取り込みは、脳活動とCBFの関係を仮定して、間接的に局所脳血流量（のrCBF）を観察するために使用されます。 [14 C] -IAPは、機能的磁気共鳴画像法（fMRI）のように、リアルタイムで脳活動を評価することはできないが、それはいくつかの利点を有します。たとえば、[14 C] -IAPは自然に測定する病理学的状態の間に、脳のイベントを発生するのに適している。9また、[14 C] -IAPの取り込みは麻酔なしで測定されます。また、fMRIの陽電子放出断層撮影（PET）を含む他の画像化方法、より少ないコスト。 [14 C] -IAP方法はmeasurinために適切であることが示唆されています視床の腹側基底核（VB）の病変によって誘発されるグラム自発痛（ 例えば 、CPSP）。9
現在のプロトコルは、動物モデルにおける視床のVBの病変によって誘発されるCPSPの神経基盤の関与を評価するための[14 C] -IAP方法を実行する方法について説明します。技術は、行動と神経細胞レベルでCPSP症状の根底にある病態生理学的メカニズムを決定する方法を提供しています。
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Protocol
本研究におけるプロトコルは、台湾で中央研究院動物実験からの承認及び利用委員会を受け取りました。
1.動物の準備
- （ - 400グラム約300）のオスのSprague-Dawleyラットを入手します。食料と水に自由にアクセスして、12時間/ 12時間の明/暗サイクル（午前8:00に点灯）下に - （22°C、湿度50％21）エアコン付きの部屋にラットを維持します。
2.実験方法
- ラットのすべてが実験前に1週間のために彼らのホームケージ内の環境に適応できるようにします。適応中に、ベースラインを確立するために、フォン・フレイと足底テストを実行します。
- フォン・フレイテスト
- 居住のための30分間のアクリルエンクロージャ（30センチ×30センチ×80センチ）にラットを置きます。
- （ノーフィラメント11から20）のvon Freyフィラメントを得る同じ長さを持っていますが、直径を変化させることの範囲を提供するために、100グラム - 2の力の。
- ラットの後肢に足引っ込め閾値を評価するために、5分の試行間隔でアクリル板上に網目状のポートを介して後足の中心を刺激するためのvon Freyフィラメントを使用します。最大印加圧力が記録されるまで、ローからハイに、昇順にフィラメントを使用し、最大印加圧力を記録する。10
- ラットは刺激に対する足引っ込め応答を示す場合には、フィラメント数を記録します。最低の刺激に応じて、この裁判で撤退応答を決定します。
- 同じラットに連続して3回の合計、すぐに同じ手順を繰り返します。 （グラム）の対応力にフィラメント数を変換した値を平均します。
- 足底テスト
- 居住のための30分間（4つのフレームに分かれて80センチ×30センチ×15センチ）透明プレキシガラス箱にラットを置きます。
- infファイルを使用してくださいraredビームは、ガラス板を介して後肢の中心を刺激します。約10秒の平均足引っ込め応答待ち時間を得るために、赤外光の強度を調整します。赤外線光源をオンにし、デジタルソリッドステートタイマを起動するキーを押すことにより、トライアルを実施しています。赤外光の持続時間を操作します。
- ラットが足引っ込め応答を示すときに、赤外光の持続時間を記録します。最長の期間は、組織の損傷を避けるために、各試験で20秒を超えてはなりません。連続的な刺激を避けるために、少なくとも5分の試行間間隔を使用してください。
- 左右の後足のための3つの臨床試験でテストを繰り返し、各ラットについて各後足の平均を計算します。
- コラゲナーゼ病変手術
- つま先ピンチ応答と発生し、外科的刺激に対する身体的応答の喪失まで4％イソフルランでラットを麻酔。 1.5で麻酔を維持 - 2％isoflur手術の期間ANE。
- ℃〜37.5から36.5に体温を維持するための簡単な加熱パッドと定位装置にラットを置きます。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目にアイクリームを適用します。
- 滅菌電気バリカンで毛を剃る、と頭皮の正中線に沿ってメスでスムーズな切開（約2〜2.5センチメートル）を作ります。摂理のヨウ素と消毒のための75％アルコール溶液を交互に皮膚や頭蓋骨を清掃してください。外科的なフェーズでは、無菌状態を維持するために、すべてのデバイス、ツール、およびワークベンチを滅菌するために75％のアルコールを使用しています。その前に、すべての外科的材料は、蒸気オートクレーブで滅菌する必要があります。
- 滅菌手袋や楽器を使用し、視床の（腹側後内側視床核[VPM]および腹側後外側視床核[VPL]を含む）VB以上の電気ドリルで頭蓋骨に小さな穴（直径3mm）をドリル（3.0 -3.5ミリメートルの後方、3.0〜3.5ミリメートル、横）ブレグマ、および頭蓋表面5.5〜5.8ミリメートルの深さにします。
- それぞれ通常の生理食塩水または対照群と実験群における4型コラゲナーゼ溶液の0.125 Uの顕微注入する0.5μlを、。
- 薬物拡散を可能にするために追加の5分間の代わりに注射針を保管してください。
- 頭蓋骨に穴を埋めるために歯科用セメントを使用し、切開部を縫合。縫合切開後、創傷に局所鎮痛剤麻酔薬（リドカイン軟膏）を適用し、ホームケージに戻します。
- 彼らは胸骨横臥位を維持し、麻酔から回復するまで暖かく保つまで手術後、単独でプラスチックケージにラットを収容します。
- 外科回復後の行動試験
- 手術からの回復の7日後、セクション2.2およびテストフェーズ2.3の手順を繰り返します。動物の健康と発育状態を監視しながら、4週間以上の行動試験を行います。
- 4％イソフルランでラットを麻酔し、36.5で体温を維持する - 単純な加熱パッドで37.5°C。
- メスで、それぞれ、左肩の腹側部分と胸腔の前肢と交差点の背部の正中線に二つの穴（直径2cmずつ）カット。
- 二つの穴の間にはさみで皮膚と筋肉を解離。
- 腹穴から外頸静脈にPE-50チューブ（長さ20cm）の一方の端を接続します。背側の穴に同じPE-50チューブの終端に接続し、皮膚に貼り付けます。
- PE-50チュービングことを確認するために、頸静脈に生理食塩水を注入するために注射器を使用して、妨害されません。
- 切開部を縫合糸、および6ミリグラム/ kgのゲンタマイシン（腹腔内）でラットを注入します。
- 20 U / mlのヘパリン生理食塩水の0.1ミリリットル、続いて0.3ミリリットルの0.9％の生理食塩水でチューブを手術後一日おきにフラッシュします。
- 一週間ステップ2.6の後、繰り返しは、手術回復後のステップ2.5に比べて安定している、その動作を確認するために、2.2から2.3を繰り返します。
- 適応のための10分 - 5のための休憩ケージにラットを置きます。
- スプリッタを使用して、2つの1ミリリットルのシリンジにPE-50チューブを接続します。生理食塩水で1注射器を記入し、[14 C] -IAP溶液（0.3容積の125μCiの/キロ- 0.5ミリリットル）で他を記入してください。
- 外頚静脈に放射性トレーサーを注入し、そして3 M塩化カリウムで満たされた別の注射器で注射器を交換してください。
- 放射性トレーサーのINJ後10秒ectionは、イソフルランの過剰摂取の下で3 M塩化カリウムを注入し、台湾の中央研究院動物実験及び利用委員会のガイドラインに基づいて、標準的な安楽死の方法（50分間の気化器からのすなわち 、イソフルラン）によると、動物を生け贄に捧げます。
- 1分後、頭蓋骨を露出させ、残りの筋肉を切り落とします。鉗子を使用して、脳から頭蓋骨の背側表面をはがします。骨鉗子を用いて、頭蓋骨の側面を切り取ります。次に、スパチュラを用いて、脳の腹側表面に沿って嗅球と神経接続を切断し、脳を取り出します。
- （約-55℃）ドライアイスとメチルブタンで脳を凍結する最適な切削温度（OCT）化合物を使用してください。冷凍庫に脳組織を保管してください。11、12
- 後脳を下に向けて、ミクロトームで組織を向けます。 20＆に脳をスライスするクライオスタットを使用します＃181;メートルの厚さの切片。
- 各スライスの間に240μmの間隔で、-20℃でクライオスタットに顕微鏡スライド上に脳スライスを配置します。
- -20℃で3日間露光カセットに顕微鏡スライドと段階的な放射能を持つ5つの標準の濾紙を置きます。脳スライスの順序に従って、上から下に顕微鏡スライドを配置します。最後に、カセットの底にろ紙を置きます。12
- 露光カセットから蛍光体スクリーンを外し、脳切片のための[14 C] -IAPの取り込みを示すために、蛍光体スクリーンを読み、画像を生成する可変モードイメージャーを使用しています。
3.データ解析
- ステップ2.9.4の後、統計的パラメトリックマッピング（SPM）およびImageJソフトウェアを使用して画像を調整します。シリアル冠状切片を用いて、すべての画像を再構成します。スムーズで参照ラット脳モデルに応じた画像を正規化します。12、13
- 定量的評価のために、画素の信号強度を決定するために、ImageJソフトウェアを使用して、脳画像の関心領域（ROI）を測定し、分析のための統計ソフトウェアを使用する。12、13
- 異なる脳核の間の接続を調べるため、地域間の相関マトリックス中の放射能比を表示するMATLAB相関解析ソフトウェアを使用し、カラーマップとして行列を可視化します。最後に、ネットワーク分析のためPajekソフトウェアを使用しています。12、13
- ベースライン時に偽とCPSPグループに、von Frey試験で足底試験及び機械的な力で耐熱性の持続時間を比較するために、因子のようなグループと数週間で、分散の2×5の双方向混合分析（ANOVA）を使用し、週1 - 5は、グループと脳の領域に応じて放射能比を測定するために、2×31 2ウェイANOVAを使用してください。適切な場合、TukeyのHSD（HSD） 事後試験を行います。カルculateピアソン相関は、偽とCPSPグループ内の選択された脳領域のすべての間で相関を評価するために係数。
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Representative Results
図1Aは、実験的なタイムラインを示しています。ラットを行動試験（ すなわち 、フォン・フレイテストと足底試験）のための偽とCPSP群に割り当てました。実験の最初の日は、ベースラインを務め、およびテストは1週間後に繰り返された - 4.ヘパリン（20 U / mlの、0.1ミリリットル/日）中に注入した週に5 PE-50カテーテル法は、外頸静脈に行きました週4とヘパリン注射後5五分、[14 C] -IAPを注入し、犠牲のための麻酔薬の過剰投与により10秒後に続きます。 1分後、ラットを断頭し、及びOCT-埋め込 み脳切片を作製した。 図1Bは、手術定位デバイス、カニューレ移植部位、およびラット脳アトラスに基づいて、脳切片の組織学的マップにラットを示している。 図1Cに示す図赤外頸静脈の右の穴、PE-50チューブの位置、および最終的な実験。
図2Aは、カセットに暴露された脳スライスを示しています。蛍光スクリーンは、可変モードイメージャーを用いて分析しました。脳スライスのサンプルおよび標準データが分析された。 図2Bは、標準的なオートラジオグラフィー曲線を示します。 Y = 44.542X + 196.24：左側のパネルには、このように、次の予測一次方程式が得られる、画像強度（ピクセル/ mm 2）とし、分あたりの放射能カウント（CPM）との関係を示しています。右側のパネルは、解像度（ピクセル/ mm 2とは ）（日中）増加し、露光時間として強化されたことを示しています。最適な解像度は、4日目に観察されました。
図3Aは、熱、痛みを評価する足底のテストのための実験を示しています。 CPSP基は、足引っ込め閾値の有意な減少を示しました
図4Aは、解剖学アトラスでのROIを示しています。 ROI分析がinfralimbic皮質（IL）、縁前方の皮質（PRL）、および帯状皮質領域1（Cg1を）の活性化は、VBの例外を除いて、右半球でCPSP群で有意に高いことを示した（ 図4B） 。
局所脳血流の地域間の相関関係の違いは右半球（ 図4C）にCPSPおよび偽群の間で観察されました。マトリックス（フィッシャーのZ-ST地域のすべてのatistics）はピアソン相関を用いて分析した。 図4Cは、CPSPグループ内の神経基盤の関与の地域間の相関関係の違いを示しています。疼痛に関連する神経基質は局所脳血流の地域間の相関関係の差異を分析することによって決定しました。 図4Dの赤い線は、有意な正の相関を示し、青い線は有意な負の相関を示しています。
中央郵便ストローク痛み（CPSP）およびジェクト[14 C] -IAPを誘導するために視床の腹側基底核（VB）をLesioningの 図1. 実験のタイムライン。 （A）腹側基底核病変がCPSPに関与している神経基盤の活性化を測定するために[14 C] -IAPの行動評価および注射用CPSPを誘導します。（B）VBのロケーション（C）[14 C] -IAP注射。スケールバー= 1mmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. 標準的なオートラジオグラフィー曲線。（A）サンプルおよび標準曲線は異なる露光時間と画像解像度についても得られた。（B）画像強度とCPMと露光時間及び分解能の標準曲線の標準曲線。 大きい方を表示するには、こちらをクリックしてください。この図のバージョン。
Fiのグレ3. 足底試験（熱痛）とのvon Frey試験（機械痛みは）ベースラインでシャムとCPSPグループで行ったし、週1 - 5（A）CPSPラットは、足底のテストで低い足引っ込め閾値を（展示しましたすなわち 、より少ない熱トレランス）シャムラットと比較して、大きな熱の痛みを示す。（B）CPSPラットは、より大きな機械的苦痛を示す、偽のラットと比較して、von Frey試験においてより低い足引っ込め閾値を示しました。 SEM、平均値の標準誤差。グリーンアスタリスク（*）は、偽群と比較して有意な差を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
インター-Rのうち、 図4 のROI分析との関係CPSPに関与する神経回路基板間のegional相関。（A）脳領域が決定され、比製剤により分析した。（B）IL、PRL、Cg1を、とVBでのROIは右半球で有意に異なっていた。（C）分析脳領域の間（D）地域間の相関関係。選択された脳領域における局所脳血流の。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
行動試験では、CPSPグループは、ベースライン時に、von Frey試験における熱痛試験および機械的な力で足引っ込め閾値の削減と1週間展示- 。5.調査結果は先行研究と一致していたが14
[14 C] -IAP方法は、異なる脳切片の定量分析のために脳画像のピクセル強度に依存しています。脳画像のデータを評価するために、画素の信号強度を定義しました。 46.979 CPM - 本研究では、環境バックグラウンド信号は25.811と定義しました。 [14 C] -IAP 0.001μCiの濾紙の信号は、42 CPMとして定義しました。画素の信号強度は、バックグラウンド強度として、<μCiの0.001でした。 5濾紙のピクセル強度は、脳の画像の各々のピクセルのグレースケールとして、0.001、0.01、0.1、および10μCiのために決定されました。 [14 C] -IAP放射能は、pを示しましたピクセル強度と放射能とのositive相関関係は、対数スケールでカウントされます。したがって、上記の手順は、[14 C]強度を画素-IAP放射能の較正のために追跡することができます。
[14 C] -IAP実験プロトコルを実行する際に、いくつかの点を考慮する必要があります。例えば、外頸静脈をブロックし、実験者は毎日ヘパリンとPE-50管の開通性を確保するために必要になることができます。また、病変部位の位置は、時々非有意CPSP症状をもたらす、紛失することができます。注射の前に、注射部位とブレグマへの相対位置の精度が確認されなければなりません。各注入の角度と量も正確に決定する必要があります。
脳画像の制限も考慮する必要があります。脳画像の歪みは、蛍光体スクリーンにカセットに脳スライスを露出させた後に発生することがあります。脳IMAGESは、脳画像における潜在的な歪みを回避するために、画像解析プログラムを使用して、標準脳アトラスに正規化される必要があります。さらに、異なる同位体は、それらの異なるメカニズムとアクションで異なる結果をもたらすことができます。例えば、代謝物および[18 F] -fludeoxyglucose（FDG）の作用機序は、グルコースに似ています。したがって、[18 F] -FDG画像は、グルコース代謝の経路に類似することが示されました。加えて、[18 F] -FDGの半減期が短いです。したがって、画像を生成するPETと組み合わせる必要があります。 [201タリウム]は、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法を使用して心筋の血流灌流を評価するのに適しています。したがって、脳画像を評価するための適切な同位体を選択することが重要です。
CPSPで脳の活性化を評価するための[14 C] -IAP法の適用は、他の脳マッピング技術（ 例えば 、PETやfMRIの）よりも低コストです。 T彼[14 C] -IAP方法は自発的にイベントを発生するのに適しているが、それはリアルタイムで脳のマッピングに使用することができません。この方法は、PETやfMRIのような他の脳マッピング技術とは異なります。また、本[14 C] -IAPプロトコルは、任意の病的状態における局所脳血流の微妙な変化を測定することができます。
[14 C] -IAP方法は、脊髄視床路（STT）、内側視床（MT）-ACCとのmPFC-扁桃体神経回路のような従来の疼痛経路を試験するために使用することができます。これらの経路に影響を与える他のそれぞれの活性化。 CPSPにおけるこれらの経路の活性化は、我々の以前の論文で詳述されている。12
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
本研究は、博士白-荘Shyu（NSC 99から2320-B-001から016-MY3、NSC 100から2311-B-001-003-MY3、およびNSCに国家科学委員会の助成金によってサポートされていました102-2320- B-001-026-MY3）。この作品は、中央研究院から資金提供を受け医科学研究所、で行いました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: | |||
| Isoflurane | Halocarbon Products Corporation | NDC 12164-002-25 | 4% |
| Surgery | |||
| homeothermic blanket system | Harvard Apparatus | Model 50–7079 | body temperature were maintained at 36.5 - 37.5 °C. |
| 10 µl micro syringe | Hamilton | 80008, Model 1701SN | injected with collagenase |
| polyethylene-50 tubing | Becton, Dickinson and Company | 427411 | catheterized into external jugular vein |
| 1 c.c syringe | Terumo Medical Products | SS-01T | injected with 14C-IAP and saline. |
| saline (Sodium Chloride 0.9 gm) | Taiwan Biotech Co., LTD. | 100-130-0201 | To flush the tube |
| Drugs | |||
| type 4 collagenase | Sigma | C5138-500MG | 0.125 U |
| Gentamicin | Sigma | G1264-250MG | 6 mg/kg |
| Heparin | Sigma | H9399 | 20 U/ml; 0.1 ml/day |
| 14C-iodoantipyrine (IAP) | PerkinElmer | NEC712 | 125 mCi/kg in 300 ml of 0.9% saline |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936.1000 | 3 M |
| Behavior system: | |||
| von Frey esthesiometer | Fabrication Enterprises, Inc. | Baseline Tactile Monofilaments 12-1666 | mechanical hyperalgesia was assessed by measuring the withdrawal response to a mechanical stimulus |
| plantar test apparatus | IITC Life Science | IITC 390G Plantar Test | Thermal hyperalgesia was assessed by measuring the hind paw withdrawal latency in response to radiant heat. |
| Brain slice: | |||
| Optimal Cutting Temperature compound | Sakura Fintek Inc | 4583 | embedded the brain |
| dry ice | frozen in dry ice/methylbutane (approximately −55 °C) | ||
| methylbutane | Sigma | M32631-1L | frozen in dry ice/methylbutane (approximately −55 °C) |
| Cryostat | Leica Biosystems Nussloch GmbH, Germany | Leica CM1850 | Coronal brain slice were sectioned on this machine. |
| Data analyze | |||
| exposure cassettes with a phosphor screen | Amersham Biosciences | 20 cm x 25 cm | The slices were dried on glass slides and placed alongside five standard filter papers with graded radioactivity. All of the slides were exposed to the cassettes at −20 °C. |
| γ-counter | Beckman Coulter | Beckman LS 6500 Liquid Scintillation Counter | To measure the radioactivity count of the filter papers. |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | GMI, Inc. | WS-S9410 | To read phosphor screen which was exposed by brain slice |
| Statistical Parametric Mapping (SPM) | Wellcome Centre for Neuroimaging | version 8 | all of the brains were averaged to create the final brain template. To determine significant differences between the images in these two groups, the images were derived by subtracting the sham group from the CPSP group. |
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij | version 1.46 | Adjacent sections were aligned both manually and using Stack- Reg, an automated pixel-based registration algorithm in ImageJ software. All of the original three-dimensionally reconstructed brains were smoothed and normalized to the reference rat brain model. |
| Matlab | MathWorks | version 2009b | used Pearson correlation coefficients to examine the relationships between the CPSP and sham groups. An inter-regional correlation matrix was calculated across animals from each group. |
| Pajek | http://Pajek.imfm.si/ | version 3.06 | Graphical theoretical analysis was performed on networks defined by the above correlation matrices using Pajek software. |
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