Introduction
İnme kanama nöropatik ağrı muzdarip hastaların% 8'den fazla meydana geldiği görülmüştür olarak merkezi felç sonrası ağrı (CSKA) atıfta bulundu. 1-3 CSKA somatosensör disfonksiyonu, böylece aşırı duyarlılık ve allodini uyaran neden olabilir. 4 Ancak , CSKA somatosensoriyel disfonksiyonu patofizyolojik mekanizmaları belirsizdir. Örneğin, somatik duyu kaybının hemorajik beyin bölgesinde nöronal deafferentasyonu kaynaklanır. Hiperaljezi merkezi nosiseptif sinir hücrelerinin ya da merkezi disinhibisyon, 5, 6, ancak CSKA semptomlar yer sinirsel substratlar halen bilinmemektedir hiper uyarılabilirliğine neden olabilir. Bazı çalışmalar dorsolateral prefrontal korteks (dPFC), rostral anterior singulat korteks (ACC), amigdala, hipokampus, periakuaduktal gri (PAG), rostral ventromedyal medulla ve birbirleriyle olan bağlantılarını nosiseptif işleme aracılık ileri sürmüşlerdir. Ek 7ly, medial prefrontal korteks (MPFC) -amygdala devreleri CSKA patofizyolojik mekanizmaları üzerinde 8 Veri çeşitlidir. ağrıya bağlı algısında rol oynadığı gösterilmiştir ve CSKA nöral substratların aktivasyonu daha fazla inceleme ihtiyacı vardı.
[14 C] -Iodoantipyrine (IAP) alımı beyin aktivitesi ve CBF arasında bir ilişki varsayarak, dolaylı olarak bölgesel serebral kan akımı (rCBF) gözlemlemek için kullanılır. Her ne kadar [14 C] -IAP gibi fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme (fMRI) ile olduğu gibi, gerçek zamanlı olarak beyin aktivitesini değerlendirmek olamaz, bu çeşitli avantajları vardır. Örneğin, [14C] -IAP kendiliğinden ölçüm patolojik durumları sırasında beyin olay meydana için uygundur. 9 Ayrıca, [14C] -IAP alım anestezi olmadan ölçülür. Aynı zamanda fMRI ve pozitron emisyon tomografisi (PET) gibi diğer görüntüleme yöntemleri, daha az maliyeti. [14C] -IAP yöntemi Ölçme ve uygun olduğu ileri sürülmüştürtalamusun ventral bazal nükleus (VB) lezyonlarının indüklenir g spontan ağrı (örneğin, CSKA). 9
Mevcut protokol hayvan modelinde talamus VB lezyonları ile indüklenir CSKA nöral yüzeylerde katılımını değerlendirmek için [14C] -IAP yöntemi gerçekleştirmek açıklamaktadır. teknik, davranışsal ve nöronal düzeyde CSKA belirtileri altında yatan patofizyolojik mekanizmaları belirleme yol sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada protokol Tayvan Academia Sinica Kurumsal Hayvan Bakım onay ve Kullanımı Komitesi aldı.
1. Hayvan Hazırlıklar
- (- 400 gr yaklaşık 300) erkek Sprague-Dawley sıçanları edinin. yiyecek ve suya serbest erişimi (8:00 ışıklar), 12 saat / 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü altında - (22 ° C,% 50 nem 21) klimalı bir odada sıçan koruyun.
2. Deneysel Prosedür
- Bütün sıçan deney önce 1 hafta boyunca kendi kafeslerine ortama uyum sağlar. adaptasyon sırasında, taban kurmak von Frey ve plantar testleri gerçekleştirmek.
- von Frey testi
- yerleşim 30 dakika boyunca bir akrilik muhafaza (30 cm x 30 cm x 80 cm) sıçan yerleştirin.
- (. Hayır filamanın 11 - 20) von Frey filamentleri elde aynı uzunluğa sahip, ancak değişen çaplarda bir dizi sağlamak için100 g 2 - güçlerinin.
- hayvanın pençesinin cinsinden pençe çekme eşiğini belirlemek için, 5 dakika intertrial aralıklarla ile akrilik plaka üzerinde ağ benzeri bir bağlantı noktası üzerinden pençelerin merkezi uyarma von Frey filamentleri kullanın. Maksimum uygulanan basınç kaydedilir kadar, düşükten yükseğe, küçükten büyüğe iplikçikler kullanmak, maksimum uygulanan basıncı kaydetmek için. 10
- Sıçanlar stimülasyon bir pençe çekme yanıtı sergilemek zaman filament numarasını kaydedin. en düşük uyaran göre bu denemede çekilme yanıtı belirleyin.
- Aynı sıçan arkaya üç kez olmak üzere toplam, hemen aynı işlemi tekrarlayın. (Gram olarak) karşılık gelen yürürlüğe iplik numarasını dönüştürmek ve değerlerinin ortalamasını alın.
- plantar test
- yerleşim 30 dakika boyunca (dört kare, 80 cm x 30 cm x 15 cm ayrılmıştır) saydam pleksiglas kutuya sıçan yerleştirin.
- Bir inf kullanındefa rar ile sıkıştırılmış çubuk, bir cam levha ile arka ayağın merkezi uyarmak için. yaklaşık 10 saniye ortalama pençe çekme yanıtı gecikme elde etmek için kızılötesi ışık yoğunluğunu ayarlayın. kızılötesi ışık kaynağı yanar ve dijital solid-state zamanlayıcı başlatır bir tuşa basarak bir deneme yapmak. kızılötesi ışık demetinin süresini işleyin.
- sıçanlar bir pençe geri çekme yanıtı arzeden kızılötesi ışık süresini kaydedin. En uzun süre doku hasarını önlemek için her denemede 20 saniye geçmemelidir. birbirini takip eden uyarımı engellemek için en az 5 dakika bir intertrial aralığını kullanın.
- Sol ve sağ pençelerin üç çalışmalar ile testi tekrarlamak ve her sıçan için her hindpaw için ortalama hesaplamak.
- Kollajenaz Lezyon Cerrahisi
- Cerrahi uyaranlara oluştuğu ayak-tutam yanıt kaybı ve somatik tepkiler kadar% 4 izofluran ile sıçan anestezisi. % 2 isoflur - 1.5 anestezi korumakAmeliyat süresince ane.
- 37.5 ° C - 36.5 vücut ısısını korumak için basit bir ısıtma yastığı ile bir stereotaksik cihazda sıçan yerleştirin. anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözleri göz kremi uygulayın.
- sterilize elektrik kesme makineleri ile kürk Tıraş ve kafa derisi orta hat boyunca bir neşter ile düzgün bir kesi (yaklaşık 2-2.5 cm) yapmak. providence iyot ve dezenfeksiyonu için% 75 alkol solüsyonu alternatif ile deri ve kafatası temizleyin. Cerrahi aşamasında, tüm cihazlar, aletler sterilize etmek% 75 alkol kullanımı ve tezgah steril koşulları sağlamak için. Bundan önce, tüm cerrahi malzemelerin buhar otoklavda sterilize edilmelidir.
- (Talamus (ventral posteromedial talamik nükleus [VPM] ve ventral posterolateral talamik çekirdek [VPL] dahil) VB üzerinde elektrikli matkap ile kafatasında 3.0 küçük bir delik (3 mm çapında), steril eldiven ve aletler kullanın ve matkap -3.5 mm arka, 3,0-3,5 mm yanal) Bregma ve kafatası yüzeyi 5,5-5,8 mm derinlik için.
- Microinject serum fizyolojik 0.5 ul veya sırasıyla deney ve kontrol gruplarında tip 4 kollajenaz çözüm 0.125 U.
- İlaç dağılımı için izin vermek için ek 5 dakika boyunca bir yerde bir iğne tutun.
- Kafatasında boşluğu doldurmak için diş çimento kullanın ve kesi sütür. sütür insizyon sonra yaraya lokal analjezik anestezikler (lidokain merhem) uygulamak ve evlerinde kafeslerde onları geri.
- Ameliyattan sonra, tek başına da sternum yatma korumak kadar plastik kafeslerde sıçan ev ve anestezi kurtarıldı kadar sıcak tutuyor.
- Cerrahi Kurtarma sonrasında davranışsal Testler
- Cerrahi işlemden 7 gün sonra, bölümler test aşamasında 2.2 ve 2.3 işlemleri tekrarlayın. sağlık ve hayvanların gelişim durumunu izlerken 4 hafta boyunca davranışsal testleri gerçekleştirin.
- % 4 izofluran ile sıçan anestezisi ve 36.5 de vücut ısısını korumak - Basit bir ısıtma yastığı ile 37.5 ° C.
- bir neşter ile sırasıyla sol omuz ve göğüs boşluğu, karın kısmı dorsal ön ayakları kısmı ile kesişme orta hatta iki delik (2 cm çaplı her) kesti.
- İki delik arasındaki bir makas ile deri ve kas ayırmak.
- ventral delikten dış juguler ven PE 50 tüp (20 cm uzunluğunda) bir ucunu. dorsal deliğine aynı PE 50 boru terminal ucunu ve cilde yapıştırın.
- doğrulamak için şah damara tuzlu enjekte etmek için bir şırınga kullanın olduğunu PE 50 boruengellenmez.
- kesi dikiş, 6 mg / kg gentamisin (intraperitonal) farelere enjekte edilir.
- 20 U / ml heparin ile tuzlu su, 0.1 ml, ardından, 0.3 ml% 0.9 tuzlu su ile boru ameliyat sonrası her gün yıkayın.
- Tekrarlayın bu davranışı onaylamak için 2.2-2.3 adımları adım 2.6 bir hafta sonra cerrahi kurtarma sonra adım 2.5 ile karşılaştırıldığında kararlıdır.
- uyum için 10 dakika - 5 için bir dinlenme kafeste sıçan yerleştirin.
- Bir ayırıcı kullanarak, iki adet 1 ml'lik şırınga PE 50 boru bağlayın. Normal tuzlu su bir kez şırınga doldurun ve (- 0.5 ml 0.3 bir hacimde 125 uCi / kg) [14C] -IAP çözeltisi ile diğer dolgu.
- Eksternal juguler ven içine radyotracer enjekte ve 3 M potasyum klorür ile dolu başka bir şırınga ile şırınga değiştirin.
- On saniye Radyoaktif inj sonraection, standart ötenazi yöntemlerine göre hayvanların izofluran aşırı dozda altında 3 M potasyum klorür enjekte ve kurban (yani, 50 dakika boyunca bir buharlaştırıcı gelen izofluran) Tayvan Academia Sinica Kurumsal Hayvan Bakım yönergelerine ve Kullanımı Komitesi dayalı.
- 1 dakika sonra, kafatası maruz ve kalan kas keserek. rongeurs kullanılarak, beyinden kafatası dorsal yüzeyini soyularak. rongeurs kullanılarak kafatası kenarlarını uzak kesin. Sonra, bir spatula kullanarak, beynin ventral yüzeyi boyunca koku ampuller ve sinir bağlantılarını kesti ve beyin kaldırmak.
- kuru buz ve metilbütana beyin dondurmak için optimum kesim sıcaklık (OKT) bileşik kullanın (yaklaşık -55 ° C). Dondurucuda beyin dokusunu saklayın. 11, 12
- Beyin aşağıya bakacak şekilde, bir mikrotom doku yönlendirin. 20 & halinde beyin dilim bir Kriyostat kullanın# 181; m kalınlığındaki kesitler.
- Her bir dilim arasında bir 240 um aralığında olan, -20 ° C'de, bir kriyostat mikroskop lamları üzerinde beyin dilimleri yerleştirin.
- mikroskop slaytlar ve -20 ° C'de 3 gün boyunca poz kasetleri içine kademeli radyoaktivite ile beş standart filtre kağıtları yerleştirin. beyin dilimleri sırasına göre, yukarıdan aşağıya doğru mikroskop slaytlar düzenlemek. Son olarak, Kasetlerin alt filtre kağıtları yerleştirin. 12
- Pozlama kasetlerden fosfor ekran çıkarın ve beyin dilimleri için [14C] -IAP alımını göstermek için görüntüleri fosfor ekran okuma ve üretmek için bir değişken mod görüntüleyici kullanın.
3. Veri Analizi
- Adım 2.9.4 sonra İstatistiksel Parametrik Haritalama (SPM) ve ImageJ yazılımı kullanarak görüntüleri ayarlayın. seri koronal kesitler kullanarak tüm görüntüleri yeniden yapılandırma. Pürüzsüz ve referans sıçan beyin modeline göre görüntüleri normalleştirmek.12, 13
- Nicel değerlendirmeler için, piksel sinyal yoğunluğunu belirlemek ve analiz için istatistiksel yazılımı kullanmak için ImageJ yazılımı kullanarak bölgeyi-faiz beyin görüntüleri (YG) ölçün. 12, 13
- Farklı beyin çekirdekleri arasındaki bağlantıları araştırmak için, bir bölgelerarası korelasyon matrisi radyoaktivite oranını görüntülemek için MATLAB korelasyon analizi yazılımı kullanmak ve renk haritaları gibi matrisleri görselleştirmek. Son olarak, ağ analizi için Pajek yazılımını kullanın. 12, 13
- Başlangıçta sahte ve CSKA gruplarında von Frey testi plantar testi ve mekanik kuvvet ısı tolerans süresini karşılaştırmak için, 2 × Varyans 5 çift yönlü karışık analizi (ANOVA), grup ve haftalar faktörler olarak kullanın ve hafta 1 - 5. ANOVA grubu ve beyin alanına göre radyoaktivite oranını ölçmek için 2 × 31 iki yönlü. Uygun olduğunda, Tukey Dürüst Önemli Fark (HSD) post hoc testleri yürütmek. Calhesaplanmalıdır Pearson korelasyon sham ve CSKA gruplarında seçilen beyin alanlarının tümü arasında korelasyon değerlendirmek katsayıları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1A deneysel zaman çizelgesi göstermektedir. Sıçanlar davranış testleri için sahte ve CSKA gruplar (örneğin, von Frey testi ve plantar testi) tahsis edilmiştir. Deneyin ilk gün taban olarak görev yaptı ve testler 1 hafta tekrarlandı - 4. Heparin (20 U / ml, 0.1 ml / gün) boyunca enjekte edildi haftada 5. PE-50 kateterizasyon dış juguler ven yapıldı hafta 4 ve heparin enjeksiyonundan sonra 5. Beş dakika, [14 C] -IAP enjekte edildi, kurban anestezik aşırı dozda 10 saniye sonra izledi. Bir dakika sonra, sıçanlar dekapite edildi ve Ekim gömülü beyin dilimleri yapılmıştır. Şekil 1B cerrahi stereotaksik cihaz kanül implantasyon siteleri ve sıçan beyin atlası dayalı beyin dilimleri histolojik haritası fareleri göstermektedir. 1C gösterir Şekil kırmızı eksternal juguler venin sağ delik, PE 50 boru yeri veNihai deney düzeneği.
Şekil 2A kasetlerinde maruz bırakıldı beyin dilimleri gösterir. fosfor ekran değişken mod görüntüleyici kullanılarak analiz edildi. Beyin dilimleri için Numune ve standart veri daha sonra analiz edilmiştir. Şekil 2B, standart oto radyografik eğrilerini gösterir. Sol panel, böylece aşağıdaki tahmin doğrusal denklem verimli, görüntü yoğunluğu (piksel / mm 2) ve dakika başına radyoaktivite sayımları (CPM) arasındaki ilişkiyi gösterir: Y = 44.542X + 196,24. Sağ panel çözünürlüğü (piksel / mm 2) (gün) artarak pozlama süresi gibi gelişmiş olduğunu göstermektedir. En iyi çözünürlük Gün 4 gözlendi.
Şekil 3A termal ağrı değerlendirir plantar test için deney düzeneği gösterir. CSKA grubu pençe geri çekme eşiği önemli bir azalma sergiledi
Şekil 4A anatomik atlas İB'leri gösterir. ROI analizi infralimbic korteks (IL), prelimbic korteks (PRL), ve singulat korteks bölgesi 1 (CG1) aktivasyonu VB hariç olmak üzere, sağ yarımkürede CSKA grupta anlamlı olarak daha yüksek olduğunu gösterdi (Şekil 4B) .
RCBF'nin bölgeler arası korelasyon farklılıklar sağ hemisfer (Şekil 4C) de CSKA ve sahte gruplar arasında gözlendi. Matris (Fisher'in Z-statistics) bölgelerinin tüm Pearson korelasyon kullanılarak. Şekil 4C CSKA grubunda nöral substratların katılımı bölgeler arası korelasyon farklılıkları gösterir analiz edildi. Ağrı ile ilgili sinir yüzeyler rCBF'nin bölgeler arası korelasyon farklılıkları analiz edilerek belirlenmiştir. Şekil 4D kırmızı çizgiler anlamlı derecede pozitif korelasyon gösterir ve mavi çizgiler önemli negatif korelasyon göstermektedir.
Merkez inme sonrası ağrı (CSKA) ve enjekte [14 C] -IAP tetikleyebilecek Thalamus Ventral Bazal Nucleus'u (VB) hasarının Şekil 1. Deneysel Timeline. (A), ventral bazal nükleus lezyonlar CSKA katılan nöral substratların aktivasyonunu ölçmek için davranışsal değerlendirme ve [14C] -IAP enjeksiyonu için CSKA indüklemeVB. (B) Location. (C) [14 C] -IAP enjeksiyonları. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Standart otoradyografik Eğrileri. (A) Örnek ve standart eğrileri pozlama süreleri ve görüntü çözünürlükleri farklı elde edilmiştir. (B) görüntü yoğunluğu ve CPM ve maruz kalma süresi ve çözünürlük standart eğrinin standart eğri. Bir büyük görmek için tıklayınız Bu rakamın sürümü.
Fişekil 3. Plantar test (Termal Ağrı) ve von Frey Testi (Mekanik Ağrı) Baseline Sham ve CSKA Gruplarda Yapılan ve Haftalık 1 - 5. (A) CSKA sıçan plantar testinde düşük bir pençe çekme eşiğini (sergiledi büyük bir termal ağrı gösteren grup sıçanlarda ile karşılaştırıldığında örneğin, daha az ısı tolerans). (B) CSKA fareler daha fazla mekanik ağrı gösteren, sahte sıçanlarla karşılaştırıldığında, von Frey testi daha düşük bir pençe çekme eşiği göstermiştir. SEM, standart ortalama hatası. Yeşil yıldız işaretleri (*) sham grubuna göre anlamlı bir farklılık göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Inter-R arasında Şekil 4. YG Analizi ve İlişkiCSKA ilgilendim Sinir Yüzeyler Arasında geçirilebilirliğini Korelasyonlar. (A) Beyin alanları belirlenmiş ve oran formülasyonu ile analiz edildi. (B) IL, PRL, CG1 ve VB ROI sağ hemisfer anlamlı farklı idi. (C) Analiz seçilen beyin bölgelerindeki bBKA. (D) beyin alanları arasındaki bölgeler arası korelasyon içinde. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Davranışsal testlerde, CSKA grubu başlangıçta von Frey testi termal ağrı testi ve mekanik kuvvet pençe çekme eşiği azalmaları ve 1 hafta sergilendi -. 5. bulguları önceki bir çalışmada uyumluydu 14
[14 C] -IAP yöntem farklı beyin dilimleri kantitatif analiz için beyin görüntülerinin piksel yoğunluğuna dayanır. beyin görüntüleri verileri değerlendirmek için, piksel sinyal yoğunluğu tanımlanmıştır. 46,979 CPM - Bu çalışmada, çevre arka plan sinyali 25,811 olarak tanımlandı. [14C] -IAP 0.001 uCi filtre kağıdı sinyali 42 CPM olarak tanımlandı. piksel sinyal yoğunluğu arka plan yoğunluğu olarak hizmet veren, <uCI 0.001 idi. beş filtre kağıtlarının piksel yoğunluğu beyin görüntüleri her biri için piksel gri skala olarak hizmet veren, 0.001, 0.01, 0.1, ve 10 için uCi belirlenmiştir. [14C] -IAP radyoaktivite ap gösterdiPiksel yoğunluğu ve radyoaktivite ile kablo bağlantısının artı yeri korelasyon logaritmik ölçekte saymak. Bu nedenle, yukarıdaki prosedür, yoğunluk pikseline [14C] -IAP radyoaktivite kalibrasyonu için takip edilebilir.
[14 C] -IAP deneysel protokol yaparken, bazı noktalar göz önünde bulundurulması gerekmektedir. Örneğin, dış juguler ven engellenir ve deneyci her gün heparin ile PE 50 boru açıklığını sağlamak için gereken hale gelebilir. Buna ek olarak, lezyon bölgelerinin konumu, bazen anlamlı olmayan CSKA semptomlar ile sonuçlanan, yanlış olabilir. enjeksiyonlar önce, enjeksiyon siteleri ve bregma göre konumları doğruluğu teyit edilmesi gerekir. Her bir enjeksiyonun açısı ve hacmi doğru bir şekilde tespit edilmelidir.
beyin görüntüleri sınırlılıkları da göz önünde bulundurulması gerekmektedir. Beyin görüntüleri çarpıtmalar bir fosfor ekranına kasetlerde beyin dilimleri maruz sonra ortaya çıkabilir. beyin images beyin görüntüleri potansiyel bozulmaları önlemek için bir görüntü analiz programı kullanarak standart bir beyin atlası normalize edilmesi gerekir. Ayrıca, farklı izotoplar nedeniyle farklı mekanizmalar ve eylem farklı sonuçlar verebilir. Örneğin, metaboliti ve [18F] -fludeoxyglucose (FDG) etki mekanizması glikoz benzerdir. Bu nedenle, [18F] -FDG görüntüler glikoz metabolizmasının yoluna benzer olduğu gösterildi. Buna ek olarak, [18F] -FDG yarı ömrü kısadır; Bu nedenle, görüntülerin üretilmesi için, PET ile birleştirilmelidir. [201 Tl] tek foton emisyon bilgisayarlı tomografi kullanılarak miyokard kan akımı perfüzyon değerlendirmek için uygundur. Bu nedenle, beyin görüntüleri değerlendirmek için uygun bir izotop seçimi çok önemlidir.
CSKA diğer beyin haritalama teknikleri (örneğin, PET ve fMRI) daha az maliyetlidir [14 C] -IAP yöntemin uygulama beyin aktivasyonunu değerlendirmek için. TO [14C] -IAP yöntemi kendiliğinden meydana gelen olaylar için uygun olmakla birlikte, gerçek zamanlı olarak, beyin haritalama için kullanılamaz. yöntem, PET ve fMRI'ın gibi beyin haritalama teknikleri, farklıdır. Ayrıca, mevcut [14 C] -IAP protokolü herhangi bir patolojik durum bBKA ince değişiklikleri ölçebilirsiniz.
[14C] -IAP yöntem, spinotalamik yolu (STT) medial talamus (MT) -ACC ve MPFC-amigdalanın nöral devreleri gibi geleneksel ağrı yolları, test etmek için de kullanılabilir. Bu yollar etkilerin bazıları her aktivasyonu. CSKA bu yollarının aktivasyonu, önceki yazıda ayrıntılı edilmiştir. 12
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışmada Dr. Bai-Chuang Shyu (MGK 99-2320-B-001-016-My3, MGK 100-2311-B-001-003-My3 ve MGK 102-2320- Ulusal Bilim Konseyi hibe ile desteklenmiştir B-001-026-My3). Bu çalışma Academia Sinica fon aldı Biyomedikal Bilimler, Enstitüsünde yürütülmüştür.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: | |||
| Isoflurane | Halocarbon Products Corporation | NDC 12164-002-25 | 4% |
| Surgery | |||
| homeothermic blanket system | Harvard Apparatus | Model 50–7079 | body temperature were maintained at 36.5 - 37.5 °C. |
| 10 µl micro syringe | Hamilton | 80008, Model 1701SN | injected with collagenase |
| polyethylene-50 tubing | Becton, Dickinson and Company | 427411 | catheterized into external jugular vein |
| 1 c.c syringe | Terumo Medical Products | SS-01T | injected with 14C-IAP and saline. |
| saline (Sodium Chloride 0.9 gm) | Taiwan Biotech Co., LTD. | 100-130-0201 | To flush the tube |
| Drugs | |||
| type 4 collagenase | Sigma | C5138-500MG | 0.125 U |
| Gentamicin | Sigma | G1264-250MG | 6 mg/kg |
| Heparin | Sigma | H9399 | 20 U/ml; 0.1 ml/day |
| 14C-iodoantipyrine (IAP) | PerkinElmer | NEC712 | 125 mCi/kg in 300 ml of 0.9% saline |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936.1000 | 3 M |
| Behavior system: | |||
| von Frey esthesiometer | Fabrication Enterprises, Inc. | Baseline Tactile Monofilaments 12-1666 | mechanical hyperalgesia was assessed by measuring the withdrawal response to a mechanical stimulus |
| plantar test apparatus | IITC Life Science | IITC 390G Plantar Test | Thermal hyperalgesia was assessed by measuring the hind paw withdrawal latency in response to radiant heat. |
| Brain slice: | |||
| Optimal Cutting Temperature compound | Sakura Fintek Inc | 4583 | embedded the brain |
| dry ice | frozen in dry ice/methylbutane (approximately −55 °C) | ||
| methylbutane | Sigma | M32631-1L | frozen in dry ice/methylbutane (approximately −55 °C) |
| Cryostat | Leica Biosystems Nussloch GmbH, Germany | Leica CM1850 | Coronal brain slice were sectioned on this machine. |
| Data analyze | |||
| exposure cassettes with a phosphor screen | Amersham Biosciences | 20 cm x 25 cm | The slices were dried on glass slides and placed alongside five standard filter papers with graded radioactivity. All of the slides were exposed to the cassettes at −20 °C. |
| γ-counter | Beckman Coulter | Beckman LS 6500 Liquid Scintillation Counter | To measure the radioactivity count of the filter papers. |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | GMI, Inc. | WS-S9410 | To read phosphor screen which was exposed by brain slice |
| Statistical Parametric Mapping (SPM) | Wellcome Centre for Neuroimaging | version 8 | all of the brains were averaged to create the final brain template. To determine significant differences between the images in these two groups, the images were derived by subtracting the sham group from the CPSP group. |
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij | version 1.46 | Adjacent sections were aligned both manually and using Stack- Reg, an automated pixel-based registration algorithm in ImageJ software. All of the original three-dimensionally reconstructed brains were smoothed and normalized to the reference rat brain model. |
| Matlab | MathWorks | version 2009b | used Pearson correlation coefficients to examine the relationships between the CPSP and sham groups. An inter-regional correlation matrix was calculated across animals from each group. |
| Pajek | http://Pajek.imfm.si/ | version 3.06 | Graphical theoretical analysis was performed on networks defined by the above correlation matrices using Pajek software. |
References
- Finnerup, N. B. A review of central neuropathic pain states. Curr Opin Anaesthesiol. 21 (5), 586-589 (2008).
- Andersen, G., Vestergaard, K., Ingeman-Nielsen, M., Jensen, T. S.
- Chen, B., Stitik, T. P., Foye, P. M., Nadler, S. F., DeLisa, J. A. Central post-stroke pain syndrome: yet another use for gabapentin? Am J Phys Med Rehabil. 81 (9), 718-720 (2002).
- Greenspan, J. D., Ohara, S., Sarlani, E., Lenz, F. A. Allodynia in patients with post-stroke central pain (CPSP) studied by statistical quantitative sensory testing within individuals. Pain. 109 (3), 357-366 (2004).
- Klit, H., Finnerup, N. B., Jensen, T. S. Central post-stroke pain: clinical characteristics, pathophysiology, and management. Lancet Neurol. 8 (9), 857-868 (2009).
- Kumar, G., Soni, C. R. Central post-stroke pain: current evidence. J Neurol Sci. 284 (1-2), 10-17 (2009).
- Denk, F., McMahon, S. B., Tracey, I.
- Ji, G., et al. Cognitive impairment in pain through amygdala-driven prefrontal cortical deactivation. J Neurosci. 30 (15), 5451-5464 (2010).
- Jungehulsing, G. J., et al. Levetiracetam in patients with central neuropathic post-stroke pain: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Eur J Neurol. 20 (2), 331-337 (2013).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53, 55-63 (1994).
- Jay, T. M., Luciqnani, G., Crane, A. M., Jehle, J., Sokoloff, L. Measurement of local cerebral blood flow with [14C]iodoantipyrine in the mouse. J Cereb Blood Flow Metab. 8 (1), 121-129 (1988).
- Lu, H. C., Chang, W. J., Kuan, Y. H., Huang, A. C., Shyu, B. C. A [14C]iodoantipyrine study of inter-regional correlations of neural substrates following central post-stroke pain in rats. Mol Pain. 11 (1), (2015).
- Wang, Z., et al. Functional brain activation during retrieval of visceral pain-conditioned passive avoidance in the rat. Pain. 152, 2746-2756 (2011).
- Wasserman, J. K., Koeberle, P. D. Development and characterization of a hemorrhagic rat model of central post-stroke pain. Neuroscience. 161 (1), 173-183 (2009).
![otoradyografik Ölçümler [<sup> 14</sup> Orta İnme Sonrası Ağrı ardından Rat Beyin C] -Iodoantipyrine](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/53947.jpg)
