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Medicine

的放射自显影测量[ Published: July 18, 2016 doi: 10.3791/53947
Automatic Translation
*1, *2, 2
1Department of Psychology, Fo Guang University, 2Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica
* These authors contributed equally

Introduction

中风出血已被证明是谁的神经性疼痛患者遭受超过8％的发生，4称为中央中风后疼痛（CPSP）1-3 CPSP可以从体感功能障碍，从而诱发过敏和异常性造成的。但是，体感功能障碍的CPSP病理生理机制仍然不明朗。例如，躯体感觉的损失从出血脑区的神经元传入神经阻滞造成的。痛觉过敏可由中央伤害感受神经元或中央去抑制，5，6，但所涉及的CPSP症状神经基板保持未知的过度兴奋引起的。一些研究表明，背外侧前额叶皮层（DPFC），喙前扣带皮层（ACC），杏仁核，海马，脑导水管周围灰质（PAG），喙腹内侧髓质，以及它们相互连接的调解处理痛觉7附加被证明LY，内侧前额叶皮质（内侧前额叶皮质）-amygdala电路参与疼痛相关的看法。在CPSP的病理生理机制8数据是多种多样的，神经基板的CPSP的激活需要进一步推敲。

[14 C] -Iodoantipyrine（IAP）的摄取来间接观察区域脑血流量（rCBF），假设大脑活动和CBF之间的关系。尽管[14 C] -IAP不能实时评估脑活动，如与功能性磁共振成像（fMRI），它具有若干优点。例如，[14 C] -IAP适合测量自发过程的病理状态中发生脑活动。9此外，[14 C] -IAP摄取没有麻醉测量。它还成本低于其它成像方法，包括磁共振成像和正电子发射断层扫描（PET）。的[14 C] -IAP方法已经建议适合measurin克自发性疼痛（ 例如 ，CPSP）由丘脑的腹侧基底核（VB）的病变引起的。9

本协议描述了如何执行[14 C] -IAP的方法来评估由丘脑VB的病变动物模型引起CPSP的神经基础的参与。该技术提供了确定所依据的行为和神经元水平CPSP症状的病理生理机制的一种方式。

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Protocol

在本研究中的协议接收来自中科院动物管理审批和利用委员会在台湾。

1.动物准备

  1. 获取雄性SD大鼠（约300 - 400克）。保持在空调房间的老鼠 - 12小时/ 12小时光/暗周期下（21 22°C，湿度为50％）（在8:00 am开灯），自由获取食物和水。

2.实验步骤

  1. 允许所有的大鼠的实验前适应环境在他们的家笼1周。在适应，执行冯弗雷和足底测试，以建立基线。
  2. 冯弗雷测试
    1. 放置在丙烯酸类外壳（30厘米×30厘米×80厘米）的大鼠用于居住30分钟。
    2. 得到的von Frey长丝（长丝没有11日 - 20）具有相同的长度，但变化的直径，以提供范围的2力量 - 百克。
    3. 为了评估在大鼠后爪的爪缩回阈值，使用的von Frey长丝通过一个网状端口刺激后爪的中心上丙烯酸板在5分钟intertrial间隔。以记录最大施加压力，使用长丝以升序，从低到高，直到最大施加压力被记录。10
    4. 当大鼠显示出爪缩回响应于刺激，记录长丝数目。按最低刺激确定本试验的戒断反应。
    5. 立即重复相同的方法，对在连续共三次在同一老鼠。转换长丝数为相应的力（克）和平均值。
  3. 足底测试
    1. 放置老鼠在一个透明的有机玻璃盒（分为四个帧80厘米* 30厘米* 15厘米）对于居住30分钟。
    2. 用INFrared光束通过玻璃板刺激后爪的中心。调整的红外光的强度来获得大约10秒的平均缩爪反应潜伏期。通过按下，轮流红外光源，并启动数字固态计时器一键进行审判。操纵红外光束的持续时间。
    3. 记录的红外光的持续时间时，大鼠表现出缩爪反应。最长持续时间不应该在每次试验中超过20秒，以避免组织损伤。使用至少5分钟的intertrial间隔，以避免相继的刺激。
    4. 重复试验用三个试验用于左和右后爪，并计算平均每个后爪每只大鼠。
  4. 胶原酶病变手术
    1. 麻醉用4％的异氟醚大鼠直到脚趾捏失去响应和躯体反应，手术刺激的发生。保持与1.5麻醉 - 2％isoflur烷手术的持续时间。
    2. 放置在立体定位装置中的鼠以简单的加热垫维持体温在36.5 - 37.5℃。对眼睛涂抹眼霜，以防止干燥时的麻醉下。
    3. 刮皮毛用无菌电推剪，并进行了切口光滑（约2-2.5厘米），沿头皮中线手术刀。清洁皮肤和颅骨交替普罗维登斯碘和消毒75％的酒精溶液。在手术阶段中，使用75％的酒精消毒的所有设备，工具和工作台保持无菌条件。在此之前，所有的手术材料必须在蒸汽高压灭菌器进行灭菌。
    4. 使用无菌手套和工具，以及钻一小孔（直径3mm）的头骨用电钻在VB（包括腹后丘脑核[VPM]和腹后外侧丘脑核[VPL]）丘脑（3.0 -3.5毫米后，3.0-3.5毫米横向到前囟门，从颅骨表面5.5-5.8毫米深）。
    5. Microinject 0.5微升生理盐水或分别在对照组和实验组，4型胶原酶溶液0.125Ú。
    6. 保持到位注射针对另外5分钟，以允许药物扩散。
    7. 使用牙科水泥填补在颅骨孔，缝合切口。缝合切口后，应用局部止痛麻醉剂（利多卡因软膏）的伤口，他们回到自己的家乡笼。
    8. 手术后，单独的房子在塑料保持架的老鼠，直到他们保持胸骨斜卧，直到从麻醉中恢复保持温暖。
  5. 手术后的恢复行为测试
    1. 经过7天手术后恢复的，重复的部分2.2和2.3的测试阶段的过程。在4周内进行行为测试，同时监测健康和动物的发育状况。
      2. 例如 ，体重，摄食量，和自由运动）。
  6. 与PE-50管插管进行植入
    1. 麻醉，用4％的异氟醚的大鼠，和在36.5保持体温 - 37.5℃，用简单的加热垫。
    2. 用手术刀，在前肢的背侧部和交汇分别左肩和胸腔，腹部分的中线切开两个孔（直径2厘米每个）。
    3. 解离的皮肤和肌肉有一对的两个孔之间剪刀。
    4. PE-50管（20厘米长），以颈外静脉的一端连接通过腹孔。连接相同的PE-50管向背侧孔的终端，并加盖到皮肤上。
    5. 用注射器注入盐水进入颈静脉，以验证该PE-50管不受阻碍。
    6. 缝合切口，并与6毫克/公斤庆大霉素（腹膜内）注射大鼠。
    7. 冲洗管手术后每隔一天用0.3毫升0.9％盐水，随后用0.1毫升20单位/毫升肝素的生理盐水。
  7. 最终的行为测试
    1. 手术后恢复的步骤相比2.5 2.6步后，重复步骤2.2-2.3，以确认该行为一周是稳定的。
  8. 注射放射性示踪剂
    1. 放置老鼠在静止笼5 - 10分钟的适应。
    2. 使用分离器，PE-50管连接两个1毫升注射器。填充一个针筒生理盐水并填充其它与[14 C] -IAP溶液（125微居里/公斤的0.3体积- 0.5毫升）中。
    3. 注入示踪剂进入外部颈静脉，用填充有氯化物的3M钾另一个注射器更换注射器。
    4. 放射性示踪剂注射十秒钟后，挠度，按照标准的安乐死方法注入3氯化钾异氟醚过量之下，牺牲动物（ 即从50分钟蒸发器异氟醚）的基础上中央研究院机构动物护理在台湾的指导方针和利用委员会。
    5. 1分钟后，暴露颅骨，并剪掉剩余的肌肉。用咬骨钳，剥远离大脑头骨的背水面。剪掉用咬骨钳头骨的侧面。接着，用刮刀，切割沿脑腹面嗅球和神经的连接，并取出大脑。
    6. 使用最佳切割温度（OCT）化合物冻结脑在干冰和甲基丁烷（约-55℃）。存储脑组织中的冷冻11,12
  9. 脑切片
    1. 定向组织的切片，与后脑朝下。使用低温恒温器向大脑切成20＆＃181;微米厚的切片。
    2. 放置在显微镜玻片上的脑切片中，在-20℃的低温恒温器，其中每个切片之间的240微米的间隔。
    3. 放置在显微镜载玻片并用分级放射性成曝光盒在-20°C 3天五个标准滤纸。根据脑切片的顺序，安排在显微镜载玻片从上到下。最后，将滤纸在盒的底部。12
    4. 从曝光盒除去荧光屏，并使用可变模式成像器读取荧光屏并生成图像显示[14 C] -IAP摄取对大脑切片。

3.数据分析

  1. 2.9.4步后，使用统计参数映射（SPM）和ImageJ的软件调整图像。重建全部采用串行冠状面图像。平滑和根据参考大鼠脑模型标准化图像。12,13
  2. 为定量评估，使用ImageJ软件，以确定该像素的信号强度，并使用统计软件，用于分析测量该区域的感兴趣的脑图像（ROI）12，13
  3. 为了研究不同的大脑核团之间的连接，使用MATLAB相关分析软件在区域间相关矩阵，显示放射性比值，和可视化矩阵彩色地图。最后，使用Pajek软件进行网络分析。12，13
  4. 用2×5双向方差混合分析（ANOVA），用基团和周为因素，耐热性的持续时间在基线比较在假和CPSP组的von Frey试验的足底试验和机械力和周1 - 5，使用2×31双向ANOVA根据组和大脑区域测量放射性比。在适当的时候，进行Tukey的真实显着性差异（HSD） 事后检验。卡尔culate Pearson相关系数在所有的假和CPSP组选定的大脑区域，以评估相关性。

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Representative Results

图1A描绘了实验时间表。大鼠被分配到假和CPSP群体的行为测试（ 即冯弗雷测试和足底试验）。在实验的第一天担任基线，并在周1重复测试 - 在周中的外颈静脉进行5 PE-50导管4.肝素（20单位/毫升，0.1毫升/天）期间，注射周4和5的肝素注射后五分钟，[14 C] -IAP注射，接着10秒后通过麻醉剂的牺牲过量。一分钟后，将大鼠断头，和OCT包埋脑切片进行的。 图1B示出了在外科立体装置，插管植入部位，并且基于大鼠脑图谱的脑切片的组织学图的影响。 图1C示出颈外静脉的红色右侧孔，所述PE-50管的位置，和最后的实验装置。

图2A示出暴露于卡匣该脑切片。使用可变模式成像分析荧光屏。然后样品和标准数据对大脑切片进行了分析。 图2B示出的标准自显影曲线。左侧面板显示图像亮度（象素/毫米2）和每分钟的放射活性计数（CPM）之间的关系，因而产生下列预测线性方程：Y = 44.542X + 196.24。右侧面板显示分辨率（象素/毫米2）的增强作为曝光时间的增加（天）。观察到第4天的最佳分辨率。

图3A示出了用于足底测试，评估热痛的实验装置。该CPSP集团展出的缩足阈值的下降显著p <0.05） 图3B示出了的von Frey试验，其评价机械性疼痛的实验装置。该CPSP集团展出的机械力（GW）在基线和显著下跌周1 - 5（均P <0.05）。

图4A显示了在解剖图谱的投资回报。投资回报率分析表明，infralimbic皮层（IL），前度皮层（PRL）和扣带皮质区1（CG1）的激活是右半球的CPSP组显著走高，VB的异常（ 图4B） 。

在右半球（ 图4C）的CPSP和假组之间未观察到局部脑血流量的区域间的相关性差异。矩阵（Fisher的Z-STatistics）的所有区域的使用Pearson相关。 图4C示出在神经基板的CPSP组中的参与的区域间的相关性的差异进行分析。疼痛相关的神经基础，通过分析脑​​血流在区域间的相关性差异决定的。红线图4D表明显著的正相关关系，而蓝线表示显著负相关。

图1
图1. 损毁丘脑腹侧基底核（VB）来诱导中央脑卒中后疼痛（CPSP）和注射[14 C] -IAP的实验时间轴。 （A）的腹侧基底核病变以诱导CPSP的行为评估和[14 C] -IAP注射来测量所涉及的CPSP神经基板的活化VB的（B）位置。（C）[14 C] -IAP注射。比例尺= 1毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
针对不同的曝光时间和图像分辨率，得到图2 标准曲线放射自显影（A）样品和标准曲线。（B）图像亮度和CPM和曝光时间和分辨率的标准曲线的标准曲线。 请点击此处查看大图版本这个数字。

图3
网络连接古尔3.足底试验（热痛）和冯弗雷测试（机械性疼痛）在深水和CPSP组在基线传导和周1 - 5（A）CPSP大鼠表现出足底测试更低的缩足阈值（ 即少耐热性）与假手术组，显示更大的热痛比较。（B）CPSP大鼠假手术组相比，表现出冯弗雷测试更低的缩足阈值，显示更大的机械性疼痛。扫描电镜，平均值的标准误差。绿星号（*）表示与假手术组相比显著差异。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
国米-R中 图4. 投资回报分析和关系在CPSP参与神经基板之间egional相关性。（A）的大脑区域进行确定，由比例配方进行分析。（B）的投资回报率在IL，PRL，CG1和VB分别在右半球显著不同。（C）分析脑血流量在选定的大脑区域。（D）脑区之间的区域间相关性。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

在行为测试中，CPSP集团展出在冯弗雷测试热痛试验和机械力在基线和缩足阈值的降低周1 - 5，发现与先前的研究相一致14

的[14 C] -IAP方法依赖于大脑图像的不同的脑切片的定量分析的像素强度。为了评估在大脑的图像数据，所述像素信号强度被定义。在本研究中，对环境的背景信号定义为25.811 - 46.979 CPM。在[14 C] -IAP 0.001微居里滤纸的信号被定义为42 CPM。像素信号强度<0.001微居里，作为背景强度。五个滤纸的像素亮度确定为0.001，0.01,0.1和10微居里，作为对每个脑图像的像素的灰度。 [14 C] -IAP放射性表明AP与像素强度和放射性ositive相关计数的对数尺度。因此，上述过程可以遵循为[14 C] -IAP放射性到像素强度的校准。

当执行[14 C] -IAP实验方案，几点需要考虑。例如，颈外静脉会被阻塞，和实验者需要确保PE-50管的通畅与每天肝素。此外，病变部位的位置有时可以错位，从而导致不​​显着的CPSP症状。注射前，注射部位并相对于前囟点位置的精度必须进行确认。每次注射的角度和体积也必须精确地确定。

脑图像的局限性也需要考虑。大脑的图像扭曲可以在磁带暴露大脑切片到荧光屏后发生。大脑IMAGES需要被标准化为使用图像分析程序，以避免在大脑图像潜在畸变的标准脑图谱。此外，不同的同位素可以产生，因为他们的不同的机制和作用不同的结果。例如，代谢物和[18 F] -fludeoxyglucose脱氧葡萄糖（FDG）的作用机制类似于葡萄糖。因此，[18 F] -FDG的图像显示是类似于葡萄糖代谢的途径。此外，[18 F] -FDG的半衰期短;因此，它必须与PET进行组合以生成图像。 [201铊]适合使用单光子发射计算机断层扫描评估心肌血流灌注。因此，选择合适的同位素用于评估脑图像是重要的。

在[14 C] -IAP方法的应用，以评估大脑激活CPSP比其他脑映射技术（ 如 PET和fMRI）技术成本更低。 ŧ他[14 C] -IAP方法适合于自发发生的事件，但它不能被用于实时脑映射。该方法是从其他脑映射技术，如PET与fMRI不同。此外，本〔14 C〕-IAP协议可以测量在脑血流中的任何病理状态的细微变化。

的[14 C] -IAP方法可用于测试常规疼痛途径，如脊髓丘脑束（STT），内侧丘脑（MT）-ACC和mPFC的-杏仁核神经回路。每个这些途径影响的其他的激活。在CPSP这些途径的激活已在我们以前的纸张被详细说明。12

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Acknowledgments

本研究是由国家科学委员会授予柏庄徐中雄博士（NSC 99-2320-B-001-016-MY3，NSC 100-2311-B-001-003-MY3和NSC 102-2320-支持B-001-026-MY3）。这项工作是在生物医学科学，并获得资助中央研究院研究所进行。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetic:
Isoflurane Halocarbon Products Corporation  NDC 12164-002-25 4%
Surgery
homeothermic blanket system Harvard Apparatus Model 50–7079 body temperature were maintained at 36.5 - 37.5 °C.
10 µl micro syringe Hamilton 80008, Model 1701SN injected with collagenase
polyethylene-50 tubing Becton, Dickinson and Company 427411 catheterized into external jugular vein
1 c.c syringe Terumo Medical Products SS-01T injected with 14C-IAP and saline.
saline (Sodium Chloride 0.9 gm) Taiwan Biotech Co., LTD. 100-130-0201 To flush the tube
Drugs
type 4 collagenase Sigma C5138-500MG 0.125 U
Gentamicin Sigma G1264-250MG 6 mg/kg
Heparin Sigma H9399 20 U/ml; 0.1 ml/day
14C-iodoantipyrine (IAP) PerkinElmer NEC712 125 mCi/kg in 300 ml of 0.9% saline
Potassium chloride Merck 1.04936.1000 3 M
Behavior system:
von Frey esthesiometer Fabrication Enterprises, Inc. Baseline Tactile Monofilaments 12-1666 mechanical hyperalgesia was assessed by measuring the withdrawal response to a mechanical stimulus
plantar test apparatus IITC Life Science IITC 390G Plantar Test Thermal hyperalgesia was assessed by measuring the hind paw withdrawal latency in response to radiant heat.
Brain slice:
Optimal Cutting Temperature compound Sakura Fintek Inc 4583 embedded the brain
dry ice frozen in dry ice/methylbutane (approximately −55 °C)
methylbutane Sigma M32631-1L frozen in dry ice/methylbutane (approximately −55 °C)
Cryostat  Leica Biosystems Nussloch GmbH, Germany Leica CM1850 Coronal brain slice were sectioned on this machine.
Data analyze
exposure cassettes with a phosphor screen Amersham Biosciences  20 cm x 25 cm The slices were dried on glass slides and placed alongside five standard filter papers with graded radioactivity. All of the slides were exposed to the cassettes at −20 °C.
γ-counter Beckman Coulter Beckman LS 6500 Liquid Scintillation Counter To measure the radioactivity count of the filter papers.
Typhoon 9410 Variable Mode Imager  GMI, Inc. WS-S9410 To read  phosphor screen which was exposed by brain slice
Statistical Parametric Mapping (SPM) Wellcome Centre for Neuroimaging version 8 all of the brains were averaged to create the final brain template. To determine significant differences between the images in these two groups, the images were derived by subtracting the sham group from the CPSP group.
ImageJ http://imagej.nih.gov/ij version 1.46 Adjacent sections were aligned both manually and using Stack- Reg, an automated pixel-based registration algorithm in ImageJ software. All of the original three-dimensionally reconstructed brains were smoothed and normalized to the reference rat brain model.
Matlab MathWorks version 2009b used Pearson correlation coefficients to examine the relationships between the CPSP and sham groups. An inter-regional correlation matrix was calculated across animals from each group.
Pajek http://Pajek.imfm.si/ version 3.06 Graphical theoretical analysis was performed on networks defined by the above correlation matrices using Pajek software.

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References

  1. Finnerup, N. B. A review of central neuropathic pain states. Curr Opin Anaesthesiol. 21 (5), 586-589 (2008).
  2. Andersen, G., Vestergaard, K., Ingeman-Nielsen, M., Jensen, T. S. Incidence of central post-stroke pain. Pain. 61 (2), 187-193 (1995).
  3. Chen, B., Stitik, T. P., Foye, P. M., Nadler, S. F., DeLisa, J. A. Central post-stroke pain syndrome: yet another use for gabapentin? Am J Phys Med Rehabil. 81 (9), 718-720 (2002).
  4. Greenspan, J. D., Ohara, S., Sarlani, E., Lenz, F. A. Allodynia in patients with post-stroke central pain (CPSP) studied by statistical quantitative sensory testing within individuals. Pain. 109 (3), 357-366 (2004).
  5. Klit, H., Finnerup, N. B., Jensen, T. S. Central post-stroke pain: clinical characteristics, pathophysiology, and management. Lancet Neurol. 8 (9), 857-868 (2009).
  6. Kumar, G., Soni, C. R. Central post-stroke pain: current evidence. J Neurol Sci. 284 (1-2), 10-17 (2009).
  7. Denk, F., McMahon, S. B., Tracey, I. Pain vulnerability: a neurobiological perspective. Nat Neurosci. 17 (2), 192-200 (2014).
  8. Ji, G., et al. Cognitive impairment in pain through amygdala-driven prefrontal cortical deactivation. J Neurosci. 30 (15), 5451-5464 (2010).
  9. Jungehulsing, G. J., et al. Levetiracetam in patients with central neuropathic post-stroke pain: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Eur J Neurol. 20 (2), 331-337 (2013).
  10. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53, 55-63 (1994).
  11. Jay, T. M., Luciqnani, G., Crane, A. M., Jehle, J., Sokoloff, L. Measurement of local cerebral blood flow with [14C]iodoantipyrine in the mouse. J Cereb Blood Flow Metab. 8 (1), 121-129 (1988).
  12. Lu, H. C., Chang, W. J., Kuan, Y. H., Huang, A. C., Shyu, B. C. A [14C]iodoantipyrine study of inter-regional correlations of neural substrates following central post-stroke pain in rats. Mol Pain. 11 (1), (2015).
  13. Wang, Z., et al. Functional brain activation during retrieval of visceral pain-conditioned passive avoidance in the rat. Pain. 152, 2746-2756 (2011).
  14. Wasserman, J. K., Koeberle, P. D. Development and characterization of a hemorrhagic rat model of central post-stroke pain. Neuroscience. 161 (1), 173-183 (2009).

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医药，113期，放射自显影，中央中风后疼痛，同位素，大脑回路，
的放射自显影测量[<sup&gt; 14</sup&gt; J] -Iodoantipyrine大鼠脑继中央脑卒中后疼痛
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