Introduction
Schlaganfall Blutung wurde in mehr als 8% der Patienten auftreten gezeigt , die unter neuropathischen Schmerzen leiden, die als zentrale nach Schlaganfall Schmerz (CPSP). 1-3 CPSP von somatosensorischen Dysfunktion führen kann, wodurch die Induktion Überempfindlichkeits und Allodynie. 4 jedoch bleiben die pathophysiologischen Mechanismen der somatosensorischen Dysfunktion in CPSP unsicher. Beispielsweise führt der Verlust von Körperempfindungen von neuronalen Deafferentation im hämorrhagischen Hirnareals. Hyperalgesie kann durch die Übererregbarkeit des zentralen nozizeptiven Neuronen oder zentrale Enthemmung, 5, 6 , aber die neuronalen Substrate verursacht werden , die in CPSP Symptome beteiligt sind , bleiben unbekannt. Einige Studien haben vorgeschlagen , dass die dorsolateralen präfrontalen Kortex (DPFC), rostralen anterioren cingulären Cortex (ACC), der Amygdala, Hippocampus, periaqueductal grau (PAG), rostral ventromedialen Medulla und ihre Verbindungen miteinander nozizeptiven Verarbeitung vermitteln. 7 Zusätzlichein Schmerzen im Zusammenhang mit der Wahrnehmung beteiligt. 8 Daten über die pathophysiologischen Mechanismen von CPSP sind vielfältig, und die Aktivierung der neuronalen Substrate in CPSP muss eine weitere Prüfung ly wurden medialen präfrontalen Kortex (mPFC) -amygdala Schaltungen gezeigt.
[14 C] -Iodoantipyrine (IAP) Aufnahme wird verwendet , indirekt zu beobachten , regionale Hirndurchblutung (rCBF), die eine Beziehung zwischen Gehirnaktivität und CBF übernimmt. Obwohl [14 C] -IAP nicht die Gehirnaktivität in Echtzeit, wie zum Beispiel mit der funktionellen Magnetresonanztomographie (fMRI) beurteilen kann, hat es mehrere Vorteile. Zum Beispiel [14 C] -IAP ist zur Messung von spontan auftretenden Gehirn Ereignisse während pathologischen Zuständen geeignet. 9 Außerdem [14 C] -IAP Aufnahme ohne Anästhesie gemessen wird. Es kostet auch weniger als andere Abbildungsverfahren, einschließlich fMRI und Positronen-Emissions-Tomographie (PET). Die [14 C] -IAP Verfahren ist vorgeschlagen worden , für measurin geeignet seing spontane Schmerzen (zB CPSP) , die durch Läsionen des ventralen Nucleus basalis (VB) des Thalamus induziert wird. 9
Das vorliegende Protokoll beschreibt , wie die [14 C] -IAP Verfahren auszuführen , um die Beteiligung von neuronalen Substrate CPSP zu bewerten , die durch Läsionen der VB des Thalamus in einem Tiermodell induziert wird. Die Technik bietet eine Möglichkeit, die pathophysiologischen Mechanismen der Bestimmung, dass CPSP Symptome an den Verhaltens- und neuronale Ebenen zugrunde liegen.
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Protocol
Das Protokoll in der vorliegenden Studie erhielt die Genehmigung von der Academia Sinica Institutional Animal Care and Utilization Ausschuss in Taiwan.
1. Tierpräparate
- Erhalten männliche Sprague-Dawley-Ratten (etwa 300-400 g). Pflegen Sie die Ratten in einem klimatisierten Raum (21 - 22 ° C, 50% Luftfeuchtigkeit) unter einem 12 h / 12 h Hell / Dunkel-Zyklus (Licht um 8:00 Uhr auf) mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser.
2. Experimentelles Verfahren
- Lassen Sie all die Ratten in die Umwelt in ihre Käfige für 1 Woche vor den Experimenten anzupassen. Während der Adaption, führen Sie die von Frey und Plantar-Tests Basislinien zu etablieren.
- von Frey - Test
- Legen Sie die Ratte in einem Acryl-Gehäuse (30 cm × 30 cm × 80 cm) für 30 min für Wohnzwecke.
- Erhalten von Frey Filamenten (Filament-Nr. 11 - 20), die die gleiche Länge haben, aber Durchmesser variierende einen Bereich zu schaffen,der Kräfte von 2-100 g.
- Um die Pfotenrückzugsschwelle in der Hinterpfote einer Ratte beurteilen zu können, verwenden von Frey Filamenten das Zentrum der hindpaws durch einen netzartigen Anschluss auf der Acrylplatte bei 5 min intertrial Abständen zu stimulieren. Um den maximalen ausgeübten Druck aufnehmen, verwenden Sie die Fäden in aufsteigender Reihenfolge von niedrig bis hoch, bis die maximale angelegte Druck aufgezeichnet wird. 10
- Bei Ratten, die eine Pfote Rückzug Reaktion auf die Stimulation zeigen, notieren Sie die Glühfaden-Nummer. Bestimmen Sie die Entzugserscheinungen, die in dieser Studie entsprechend dem niedrigsten Reiz.
- Wiederholen der gleichen Prozedur sofort für insgesamt dreimal hintereinander auf der gleichen Ratte. Konvertieren Sie die Glühfaden-Nummer in die entsprechende Kraft (in Gramm) und die Werte im Durchschnitt.
- Plantar - Test
- Legen Sie die Ratte in einem transparenten Plexiglas-Box (unterteilt in vier Rahmen, 80 cm × 30 cm × 15 cm) für 30 min für Wohnzwecke.
- Verwenden Sie ein infrared Strahl die Mitte der Hinterpfote durch eine Glasplatte zu stimulieren. Stellen Sie die Infrarot-Lichtintensität eine durchschnittliche Pfotenrückzugsantwortlatenzzeit von etwa 10 Sekunden zu erhalten. Führen Sie eine Studie durch Drücken einer Taste, die auf der Infrarot-Lichtquelle dreht sich um und startet einen digitalen Solid-State-Timer. Manipulieren die Dauer des Infrarot-Lichtstrahl.
- Notieren Sie sich die Dauer des Infrarotlichts, wenn die Ratten eine Pfotenrückzugsreaktion zeigen. Die längste Dauer sollte nicht mehr als 20 Sekunden in jedem Versuch Gewebeschäden zu vermeiden. Verwenden Sie ein intertrial Abstand von mindestens 5 min sukzessive Stimulation zu vermeiden.
- Den Test mit drei Versuche für die linken und rechten Hinterpfoten, und berechnet den Mittelwert für jede Hinterpfote für jede Ratte.
- Kollagenase Lesion Chirurgie
- Anesthetize die Ratte mit 4% Isofluran bis Verlust der Zehen Prise Reaktion und somatischen Reaktionen auf chirurgische Stimuli auftreten. Pflegen Anästhesie mit 1,5-2% isoflurane für die Dauer der Operation.
- Legen Sie die Ratte in einem stereotaktischen Gerät mit einem einfachen Heizkissen auf Körpertemperatur bei 36,5 aufrechtzuerhalten - 37,5 ° C. Tragen Sie Augencreme auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
- Shave das Fell mit sterilisiertem elektrischen Haarschneider und einen glatten Schnitt zu machen (ca. 2-2,5 cm) mit einem Skalpell entlang der Mittellinie der Kopfhaut. Reinigen Sie die Haut und Schädel mit wechselnden Vorsehung Jod und 75% Alkohollösung zur Desinfektion. Während der chirurgischen Phase, verwenden 75% Alkohol alle Geräte, Werkzeuge zu sterilisieren, und die Werkbank sterilen Bedingungen zu halten. Vor, dass alle chirurgischen Materialien müssen in einem Dampfautoklaven sterilisiert werden.
- Verwenden Sie die sterile Handschuhe und Instrumente, und bohren Sie ein kleines Loch (3 mm Durchmesser) in den Schädel mit einer elektrischen Bohrmaschine über die VB (einschließlich ventralen posteromedial Thalamuskern [VPM] und ventralen posterolateral Thalamuskern [VPL]) des Thalamus (3,0 -3,5 mm posterior, 3,0-3,5 mm lateralzu Bregma und von Schädeloberfläche 5,5-5,8 mm Tiefe).
- Microinject 0,5 & mgr; l normaler Salzlösung oder 0.125 U des Typs 4 Kollagenase-Lösung in den Kontroll- und Testgruppen, respectively.
- Halten Sie die Injektionsnadel an Ort und Stelle für weitere 5 min für Arzneimitteldiffusion zu ermöglichen.
- Verwenden Sie Zahnzement das Loch in den Schädel zu füllen, und die Inzision vernähen. Nach Naht der Einschnitt, gelten die lokalen analgetischen Betäubungsmittel (Lidocain-Salbe) auf die Wunde, und bringt sie in ihre Heimatkäfige.
- Nach der Operation Haus einzeln die Ratten in Plastikkäfigen, bis sie Brustlage halten und warm hält von der Anästhesie erholt, bis.
- Verhaltenstests nach der chirurgischen Wiederherstellung
- Nach 7 Tagen der Genesung von der Operation, wiederholen Sie die Prozeduren in den Abschnitten 2.2 und 2.3 für die Testphase. Führen Sie die Verhaltenstests über 4 Wochen, während die Gesundheitsüberwachung und Entwicklungsstand der Tiere.
- Anästhesieren die Ratte mit 4% Isofluran und Aufrechterhaltung der Körpertemperatur bei 36,5 bis 37,5 ° C mit einer einfachen Heizkissen.
- Mit einem Skalpell geschnitten, um zwei Löcher (2 cm Durchmesser jeweils) in der Mittellinie des Rückenteils der vorderen Gliedmaßen und Schnitt des ventralen Teil der linken Schulter und Brusthöhle sind.
- Dissoziieren die Haut und Muskel mit einer Schere zwischen den beiden Löchern.
- Ein Ende des PE- 50-Schlauch (20 cm Länge) an die äußere Jugularvene durch das ventrale Loch. Schließen Sie das Anschlussende des gleichen PE- 50 Schlauch mit dem Rückenloch und bringt an der Haut.
- Verwenden Sie eine Spritze Kochsalzlösung in die Halsvene zu injizieren, um sicherzustellen, dass die PE- 50 Schlauchnicht behindert wird.
- Nähen Sie den Schnitt, und injizieren die Ratten mit 6 mg / kg Gentamicin (intraperitoneal).
- Spülen Sie den Schlauch jeden zweiten Tag nach der Operation mit 0,3 ml 0,9% Kochsalzlösung, gefolgt von 0,1 ml Kochsalzlösung mit 20 U / ml Heparin.
- Eine Woche nach dem Schritt 2.6, wiederholen Sie die Schritte 2,2-2,3 dieses Verhalten zu bestätigen ist stabil im Vergleich zu Schritt 2.5 nach der chirurgischen Wiederherstellung.
- Legen Sie die Ratte in einer Ruhe Käfig 5 - 10 min für die Anpassung.
- Mit einem Splitter verbinden PE- 50 Schlauch mit zwei 1 ml Spritzen. Füllen einer Spritze mit normaler Kochsalzlösung und füllt das andere mit [14 C] -IAP Lösung (125 uCi / kg in einem Volumen von 0,3-0,5 ml).
- Injizieren Sie die Radiotracer in die externe Halsvene, und ersetzen Sie die Spritze mit einer anderen Spritze mit 3 M Kaliumchlorid gefüllt.
- Zehn Sekunden nach dem Radiotracer injection, injizieren 3 M Kaliumchlorid unter einer Überdosierung von Isofluran und opfern , um die Tiere nach Standard Euthanasie Methoden (dh Isofluran aus einem Verdampfer für 50 min) , basierend auf den Richtlinien der Academia Sinica Institutional Animal Care and Utilization Ausschuss in Taiwan.
- Nach 1 min, setzen den Schädel, und schneiden Sie die verbleibenden Muskel ab. Mit rongeurs, ziehen Sie die dorsale Oberfläche des Schädels aus dem Gehirn entfernt. Schneiden Sie die Seiten des Schädels mit rongeurs. Als nächstes wird mit einem Spatel, schneiden Sie die Riechkolben und Nervenverbindungen entlang der ventralen Oberfläche des Gehirns, und das Gehirn zu entfernen.
- Verwenden Sie optimale Schnitttemperatur (OCT) -Verbindung das Gehirn in Trockeneis einzufrieren und Methylbutan (ca. -55 ° C). Lagern Sie das Hirngewebe in einem Gefrierschrank. 11, 12
- Richten Sie das Gewebe in einem Mikrotom, mit dem Rautenhirns nach unten zeigt. Verwenden Sie ein Kryostat das Gehirn in 20 & zu schneiden# 181; m-dicke Abschnitte.
- Platzieren Sie die Hirnschnitten auf Objektträgern in einem Kryostaten bei -20 ° C, mit einem 240 um Intervall zwischen jeder Scheibe.
- Legen Sie die Objektträger und fünf Standard-Filterpapiere mit abgestuften Radioaktivität in Belichtungskassetten für 3 Tage bei -20 ° C. Entsprechend der Reihenfolge der Gehirnscheiben, die Mikroskop-Objektträger von oben nach unten anordnen. Schließlich legen Sie die Filterpapiere in der Unterseite der Kassetten. 12
- Entfernen Sie den Phosphorschirm von den Belichtungskassetten und eine Variable-Modus Imager den Phosphorschirm und erzeugen Bilder zu lesen , um zu zeigen , [14 C] -IAP Aufnahme für die Hirnschnitten.
3. Datenanalyse
- Nach dem Schritt 2.9.4, passen Sie die Bilder Statistische Parametric Mapping (SPM) und ImageJ-Software. Rekonstruieren alle Bilder seriellen Koronalschnitte verwenden. Glatte und normalisieren die Bilder gemäß einem Referenzrattenhirnmodell.12, 13
- Für die quantitative Einschätzungen, messen Sie die Region-of-Interest (ROI) des Gehirns Bilder mit ImageJ Software die Pixelsignalintensität, um zu bestimmen , und statistische Software für die Analyse verwendet werden . 12, 13
- Um die Verbindungen zwischen verschiedenen Hirnkernen zu untersuchen, verwenden MATLAB Korrelationsanalyse-Software Radioaktivität Verhältnis in einer überregionalen Korrelationsmatrix anzuzeigen, und visualisieren die Matrizen als Farbkarten. Schließlich verwenden für Netzwerkanalyse Pajek Software. 12, 13
- Verwenden Sie 2 x 5 Zwei-Wege-Mischvarianzanalyse (ANOVA), mit Gruppen- und Wochen als Faktoren, die Dauer der Hitzetoleranz in der Plantar-Test und mechanische Kraft in der von-Frey-Test in den Schein und CPSP Gruppen zu Beginn der Studie zu vergleichen und Woche 1 - 5. Mit einem 2 × 31 zwei-Wege-ANOVA die Radioaktivität Verhältnis gemäß Gruppe und Gehirnbereich zu messen. Wenn es angebracht ist , führen Tukey ehrlich signifikante Differenz (HSD) Post - hoc - Tests. Calculate Pearson Korrelationskoeffizienten Korrelationen zwischen allen ausgewählten Gehirnbereiche in der Sham und CPSP Gruppen zu bewerten.
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Representative Results
1A zeigt die experimentelle Zeitleiste. Die Ratten wurden auf den Schein und CPSP Gruppen für die Verhaltenstests (dh von Frey - Test und Plantar - Test) zugeordnet. Am ersten Tag des Experiments diente als Basislinie, und Tests in den Wochen wurden wiederholt, 1 - 5 PE-50-Katheterisierung wurde die Vena jugularis externa in Woche 4 durchgeführt Heparin (20 U / ml, 0,1 ml / Tag) während injiziert wurde Woche 4 und 5 Fünf Minuten nach der Heparin - Injektion, [14 C] -IAP injiziert wurde, gefolgt 10 Sekunden später durch eine Überdosis des Anästhetikums für Opfer. Eine Minute später wurden die Ratten enthauptet und OCT eingebettet Gehirnscheiben wurden hergestellt. 1B zeigt die Ratten in einem chirurgischen stereotaxische Gerät, Kanüle Implantationsstellen und histologische Karte der Hirnschnitten basierend auf einem Rattenhirnatlas. 1C zeigt das rechte Loch der äußeren Jugularvene in rot, die Lage des PE- 50 Schläuche undletzte Versuchsaufbau.
2A zeigt Gehirnschnitte , die in den Kassetten ausgesetzt waren. Der Phosphorschirm wurde mit einem variablen Modus Imager analysiert. Proben- und Standarddaten für die Gehirnscheiben wurden dann analysiert. 2B zeigt die Standard Autoradiographiebild Kurven. Die linke Tafel zeigt die Beziehung zwischen der Bildintensität (Pixel / mm 2) und die Radioaktivität Counts pro Minute (CPM), wodurch die folgenden vorhergesagten lineare Gleichung ergibt: Y = 44.542X + 196,24. Das rechte Bild zeigt , dass die Auflösung (Pixel / mm 2) wurde als die Belichtungszeit (in Tagen) erhöht verbessert. Die optimale Auflösung wurde am Tag 4 beobachtet.
3A zeigt den Versuchsaufbau für die Fußsohlen Test, der thermischen Schmerz beurteilt. Die CPSP Gruppe zeigte eine signifikante Abnahme der Pfotenrückzugsschwelle
4A zeigt die ROIs in einem anatomischen Atlas. Die ROI - Analyse zeigte , dass die Aktivierung des infralimbischen Kortex (IL), prälimbischen Kortex (PRL) und cingulären Cortex - Bereich 1 (Cg1) war signifikant höher in der CPSP Gruppe in der rechten Hemisphäre, mit Ausnahme der VB (4B) .
Die Unterschiede in der interregionalen Korrelationen von rCBF wurden zwischen den CPSP und Scheingruppen in der rechten Hemisphäre (4C) beobachtet. Die Matrix (Fishers Z-statistics) von allen Regionen analysiert Pearson Korrelation verwendet wird . 4C zeigt Unterschiede in der interregionalen Korrelationen der Beteiligung von neuronalen Substrate in der CPSP Gruppe. Schmerzen im Zusammenhang mit neuronalen Substrate wurden durch die Analyse von Unterschieden in der interregionalen Korrelationen von rCBF bestimmt. Die roten Linien in 4D zeigen signifikante positive Korrelationen und blauen Linien zeigen signifikante negative Korrelationen.
Abbildung 1. Experimentelle Chronologie der Läsion der ventralen Basal Nucleus (VB) der Thalamus Central Post-Stroke Pain (CPSP) und Einspeisen zu induzieren [14 C] -IAP. (A) Ventral Basalganglien Läsionen CPSP für die Verhaltensabschätzungen und Injektionen von [14 C] -IAP zu induzieren die Aktivierung von neuralen Substrate zu messen , die in CPSP beteiligt sindLage von VB. (B). (C) [14 C] -IAP Injektionen. Maßstabsbalken = 1 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Standard Autoradiographie Kurven. (A) Probe und Standardkurven wurden für verschiedene Belichtungszeiten und Bildauflösungen erhalten. (B) Standardkurve der Bildintensität und CPM und Standardkurve von Belichtungszeit und Auflösung. Bitte klicken Sie hier um ein , um zu vergrößern Version dieser Figur.
Fi5. (A) CPSP Ratten zeigten eine geringere Pfotenrückzugsschwelle im Plantar - Test (- Abbildung 3. Die Plantar - Test (Thermal Pain) und von Frey - Test (mechanische Schmerz) wurden in den Sham und CPSP Gruppen zu Beginn der Studie und Wochen 1 Dirigiert dh weniger Hitzetoleranz) , verglichen mit sham - Ratten, was darauf hinweist größere thermische Schmerzen. (B) CPSP Ratten zeigten eine geringere Pfotenrückzugsschwelle im Test von Frey im Vergleich zu sham - Ratten, was darauf hinweist größere mechanische Schmerzen. SEM, Standardfehler des Mittelwerts. Grüne Sternchen (*) zeigen einen signifikanten Unterschied mit der Sham - Gruppe verglichen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. ROI - Analyse und Beziehung zwischen Inter-REGIONALE Korrelationen zwischen Neural beteiligten Substrate in CPSP. (A) Hirnbereiche wurden durch das Verhältnis Formulierung bestimmt und analysiert. (B) Die ROIs in der IL, PrL, Cg1 und VB in der rechten Hemisphäre signifikant verschieden waren. (C) Analyse von rCBF in den ausgewählten Bereichen des Gehirns. (D) interregionale Korrelationen zwischen Hirnarealen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
In den Verhaltenstests zeigten die CPSP Gruppe Reduzierungen des Pfotenrückzugsschwelle bei der thermischen Schmerztest und mechanische Kraft in der Prüfung von Frey zu Beginn der Studie und Wochen . 1 - 5. Die Ergebnisse mit einer früheren Studie waren konsistent 14
Die [14 C] -IAP Verfahren beruht auf der Pixel - Intensität von Gehirnbildern für die quantitative Analyse von Gehirnschnitten. Um die Daten in den Gehirnbilder auszuwerten, wurde die Pixelsignalintensität definiert. 46,979 CPM - In der vorliegenden Studie wurden die Umwelthintergrundsignal wurde als 25,811 definiert. Das Signal des [14 C] -IAP 0,001 uCi Filterpapier wurde als CPM 42 definiert. Die Pixelsignalintensität war <0,001 uCi, die als die Hintergrundintensität. Die Pixelintensität von fünf Filterpapieren wurde 0,001 bestimmt, 0,01, 0,1, und 10 & mgr; Ci, für jede der Gehirnbilder als Pixelgrauskala dient. [14 C] -IAP Radioaktivität zeigte apositive Korrelation mit Pixelintensität und die Radioaktivität auf einer logarithmischen Skala zählen. Daher kann das obige Verfahren für die Kalibrierung von [14 C] -IAP Radioaktivität Intensität zu Pixel folgen.
Wenn die [14 C] Durchführung -IAP experimentelle Protokoll müssen einige Punkte beachtet werden. Zum Beispiel kann die äußere Jugularvene blockiert werden, und Experimentatoren müssen die Durchgängigkeit des PE- 50 Schlauch mit Heparin täglich zu gewährleisten. Zusätzlich kann manchmal die Lage der Läsionsstellen verlegt werden, was zu nicht signifikanten CPSP Symptome. Vor den Injektionen muss die Genauigkeit der Injektionsstellen und Stellen relativ zu Bregma bestätigt werden. Der Winkel und die Volumen jeder Injektion auch genau bestimmt werden muss.
Beschränkungen von Gehirnbildern müssen auch berücksichtigt werden. Eine Verspannung des Gehirns Bilder können nach dem Aussetzen der Gehirnscheiben in den Kassetten zu einem Phosphorschirm auftreten. Das Gehirn images benötigen ein Bildanalyseprogramm zu einem Standard-Gehirnatlas normalisiert werden mit möglichen Verzerrungen im Gehirn Bilder zu vermeiden. Darüber hinaus können verschiedene Isotope unterschiedlichen Ergebnissen führen aufgrund ihrer unterschiedlichen Mechanismen und Aktion. Zum Beispiel sind der Metabolit und Wirkungsmechanismus von [18 F] fluordeoxyglukose (FDG) ähnlich Glucose. Daher wurden die [18 F] -FDG Bilder auf den Weg des Glukosestoffwechsels als ähnlich gezeigt. Darüber hinaus ist die Halbwertszeit von [18 F] -FDG kurz; daher muß es mit PET kombiniert werden, um die Bilder zu erzeugen. [201 Tl] ist geeignet für myokardiale Blutfluß Perfusion mit Single-Photon - Emissions - Computertomographie Beurteilung. Daher ist ein geeignetes Isotop Wahl für die Beurteilung der Gehirnbildern wichtig.
Die Anwendung der [14 C] -IAP Verfahren Gehirnaktivierung zu bewerten in CPSP ist weniger kostspielig als andere Gehirnkartierungstechniken (beispielsweise PET und fMRI). Ter [14 C] -IAP Methode ist für spontan auftretende Ereignisse geeignet, aber es kann nicht für Brain Mapping in Echtzeit verwendet werden. Das Verfahren unterscheidet sich von anderen Gehirnkartierungstechniken, wie beispielsweise PET und fMRI. Weiterhin kann die vorliegende [14 C] -IAP Protokoll subtile Veränderungen in rCBF in irgendeinem pathologischen Zustand messen.
Die [14 C] -IAP Verfahren können herkömmliche Schmerzbahnen, wie der spinothalamic - Darm - Trakt (STT), medialen Thalamus (MT) -ACC und mPFC-Amygdala neuronale Schaltkreise zu testen. Die Aktivierung jeder dieser Wege Auswirkungen die anderen. Die Aktivierung dieser Wege in CPSP wurde in unserer früheren Arbeit beschrieben. 12
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die vorliegende Studie wurde vom National Science Council gewährt Dr. Bai-Chuang Shyu (NSC 99-2320-B-001-016-MY3, NSC 100-2311-B-001-003-MY3 und NSC unterstützt 102-2320- B-001-026-MY3). Diese Arbeit wurde am Institut für Biomedizinische Wissenschaften durchgeführt, die Finanzierung von Academia Sinica erhalten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: | |||
| Isoflurane | Halocarbon Products Corporation | NDC 12164-002-25 | 4% |
| Surgery | |||
| homeothermic blanket system | Harvard Apparatus | Model 50–7079 | body temperature were maintained at 36.5 - 37.5 °C. |
| 10 µl micro syringe | Hamilton | 80008, Model 1701SN | injected with collagenase |
| polyethylene-50 tubing | Becton, Dickinson and Company | 427411 | catheterized into external jugular vein |
| 1 c.c syringe | Terumo Medical Products | SS-01T | injected with 14C-IAP and saline. |
| saline (Sodium Chloride 0.9 gm) | Taiwan Biotech Co., LTD. | 100-130-0201 | To flush the tube |
| Drugs | |||
| type 4 collagenase | Sigma | C5138-500MG | 0.125 U |
| Gentamicin | Sigma | G1264-250MG | 6 mg/kg |
| Heparin | Sigma | H9399 | 20 U/ml; 0.1 ml/day |
| 14C-iodoantipyrine (IAP) | PerkinElmer | NEC712 | 125 mCi/kg in 300 ml of 0.9% saline |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936.1000 | 3 M |
| Behavior system: | |||
| von Frey esthesiometer | Fabrication Enterprises, Inc. | Baseline Tactile Monofilaments 12-1666 | mechanical hyperalgesia was assessed by measuring the withdrawal response to a mechanical stimulus |
| plantar test apparatus | IITC Life Science | IITC 390G Plantar Test | Thermal hyperalgesia was assessed by measuring the hind paw withdrawal latency in response to radiant heat. |
| Brain slice: | |||
| Optimal Cutting Temperature compound | Sakura Fintek Inc | 4583 | embedded the brain |
| dry ice | frozen in dry ice/methylbutane (approximately −55 °C) | ||
| methylbutane | Sigma | M32631-1L | frozen in dry ice/methylbutane (approximately −55 °C) |
| Cryostat | Leica Biosystems Nussloch GmbH, Germany | Leica CM1850 | Coronal brain slice were sectioned on this machine. |
| Data analyze | |||
| exposure cassettes with a phosphor screen | Amersham Biosciences | 20 cm x 25 cm | The slices were dried on glass slides and placed alongside five standard filter papers with graded radioactivity. All of the slides were exposed to the cassettes at −20 °C. |
| γ-counter | Beckman Coulter | Beckman LS 6500 Liquid Scintillation Counter | To measure the radioactivity count of the filter papers. |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | GMI, Inc. | WS-S9410 | To read phosphor screen which was exposed by brain slice |
| Statistical Parametric Mapping (SPM) | Wellcome Centre for Neuroimaging | version 8 | all of the brains were averaged to create the final brain template. To determine significant differences between the images in these two groups, the images were derived by subtracting the sham group from the CPSP group. |
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij | version 1.46 | Adjacent sections were aligned both manually and using Stack- Reg, an automated pixel-based registration algorithm in ImageJ software. All of the original three-dimensionally reconstructed brains were smoothed and normalized to the reference rat brain model. |
| Matlab | MathWorks | version 2009b | used Pearson correlation coefficients to examine the relationships between the CPSP and sham groups. An inter-regional correlation matrix was calculated across animals from each group. |
| Pajek | http://Pajek.imfm.si/ | version 3.06 | Graphical theoretical analysis was performed on networks defined by the above correlation matrices using Pajek software. |
References
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