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Las mediciones de autorradiografía de [ Published: July 18, 2016 doi: 10.3791/53947
Automatic Translation
*1, *2, 2
1Department of Psychology, Fo Guang University, 2Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica
* These authors contributed equally

Introduction

Hemorragia Stroke se ha demostrado que se producen en más de 8% de los pacientes que sufren de dolor neuropático, que se refiere al dolor posterior al accidente cerebrovascular como central (CPSP). 1-3 CPSP puede resultar de disfunción somatosensorial, induciendo de ese modo la hipersensibilidad y la alodinia. 4 Sin embargo , los mecanismos fisiopatológicos de la disfunción somatosensorial en CPSP siguen siendo inciertas. Por ejemplo, la pérdida de las sensaciones somáticas resulta de desaferenciación neuronal en la zona hemorrágica cerebral. La hiperalgesia puede ser causada por la hiperexcitabilidad de las neuronas nociceptivas centrales o desinhibición centro, 5, 6, pero los sustratos neurales que están implicados en los síntomas CPSP siguen siendo desconocidos. Algunos estudios han sugerido que la corteza prefrontal dorsolateral (CPFD), corteza cingulada anterior rostral (ACC), la amígdala, el hipocampo, gris periacueductal (PAG), la médula rostral ventromedial, y sus conexiones entre sí median el procesamiento nociceptivo. 7 adicionalLy, corteza prefrontal (córtex prefrontal medial) -amygdala circuitos, se mostró a estar implicado en la percepción relacionada con el dolor. 8 Los datos sobre los mecanismos fisiopatológicos de CPSP son diversos, y la activación de los sustratos neurales en CPSP necesita un examen más detallado.

[14 C] -Iodoantipyrine (IAP) absorción se utiliza para observar indirectamente regional del flujo sanguíneo cerebral (rCBF), suponiendo una relación entre la actividad cerebral y CBF. A pesar de [14C] -IAP no puede evaluar la actividad cerebral en tiempo real, como por ejemplo con imágenes de resonancia magnética funcional (fMRI), que tiene varias ventajas. Por ejemplo, [14 C] -IAP es adecuado para medir de forma espontánea se producen eventos cerebrales durante los estados patológicos. 9 Por otra parte, [14 C] captación -IAP se mide sin anestesia. También cuesta menos que otros métodos de imagen, incluyendo fMRI y tomografía por emisión de positrones (PET). El [14 C] -IAP método ha sido sugerido para ser apropiado para measuring dolor espontáneo (por ejemplo, CPSP) que es inducido por lesiones del núcleo basal ventral (VB) del tálamo. 9

El presente protocolo describe cómo realizar la [14 C] -IAP método para evaluar la participación de los sustratos neurales de CPSP que es inducida por lesiones de la VB del tálamo en un modelo animal. La técnica ofrece una manera de determinar los mecanismos fisiopatológicos que subyacen a los síntomas CPSP en los niveles de comportamiento y neuronales.

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Protocol

El protocolo en el presente estudio recibió la aprobación de la Academia Sinica Institucional Cuidado de Animales y el Utilización de Taiwán.

1. Preparativos Animal

  1. Obtener ratas macho Sprague-Dawley (aproximadamente 300 a 400 g). Mantener las ratas en una habitación con aire acondicionado (21 - 22 ° C, 50% de humedad) en virtud de un / 12 horas de luz / oscuridad ciclo de 12 horas (luces encendidas a las 8:00 AM) con acceso libre a comida y agua.

2. Procedimiento experimental

  1. Permitir todas las ratas para adaptarse al medio ambiente en sus jaulas durante 1 semana antes de los experimentos. Durante la adaptación, realizar las pruebas plantares von Frey y establecer líneas de base.
  2. Prueba Frey von
    1. Coloque la rata en un recinto de acrílico (30 cm × 30 cm × 80 cm) durante 30 min para la habitación.
    2. Obtener filamentos de von Frey (filamento no 11 -. 20) que tienen la misma longitud, pero variando los diámetros para proporcionar una gamade las fuerzas de 2-100 g.
    3. Para evaluar el umbral de retirada de la pata en la pata trasera de la rata, usar filamentos de von Frey para estimular el centro de las patas traseras a través de un puerto en forma de red en la placa de acrílico en intervalos entre ensayos 5 min. Para registrar la presión máxima aplicada, utilizar los filamentos en orden ascendente, de abajo hacia arriba, hasta que se registró la presión máxima aplicada. 10
    4. Cuando las ratas exhiben una respuesta de retirada de la pata a la estimulación, registrar el número de filamentos. Determinar la respuesta de retirada en este ensayo de acuerdo con el estímulo más bajo.
    5. Repetir el mismo procedimiento inmediato, para un total de tres veces consecutivas en la misma rata. Convertir el número de filamentos en la fuerza correspondiente (en gramos) y el promedio de los valores.
  3. Prueba Plantar
    1. Coloque la rata en una caja de plexiglás transparente (dividido en cuatro cuadros, 80 cm × 30 cm × 15 cm) durante 30 minutos para la habitación.
    2. Use un infhaz rared para estimular el centro de la pata trasera a través de una placa de vidrio. Ajustar la intensidad de la luz infrarroja para obtener una latencia media de respuesta de retirada de la pata de aproximadamente 10 segundos. Llevar a cabo un ensayo oprimiendo una tecla que activa la fuente de luz infrarroja y se inicia un temporizador de estado sólido digital. Manipular la duración del haz de luz infrarroja.
    3. Registrar la duración de la luz infrarroja cuando las ratas exhiben una respuesta de retirada de la pata. La duración más larga no debe exceder de 20 segundos en cada ensayo para evitar el daño tisular. Utilice un intervalo entre ensayos de al menos 5 min para evitar la estimulación sucesiva.
    4. Repita la prueba con tres ensayos para las patas traseras izquierda y derecha, y calcular el promedio de cada pata trasera de cada rata.
  4. Cirugía Lesión colagenasa
    1. Anestesiar la rata con isoflurano al 4% hasta la pérdida de la respuesta del dedo del pie para los dedos y las respuestas somáticas que producen estímulos quirúrgicos. Mantener la anestesia con 1,5 - 2%, isoflurane para la duración de la cirugía.
    2. Coloque la rata en un dispositivo estereotáxico con una simple resistencia de calentamiento para mantener la temperatura corporal a 36,5 - 37,5 ° C. Aplicar crema para los ojos en los ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia.
    3. Afeitarse el pelo con una maquinilla eléctrica esterilizados, y hacer una incisión suave (aproximadamente 2-2,5 cm) con un bisturí a lo largo de la línea media del cuero cabelludo. Limpiar la piel y el cráneo con la alternancia de yodo providencia y la solución de alcohol al 75% para la desinfección. Durante la fase quirúrgica, utilice% de alcohol 75 para esterilizar todos los dispositivos, herramientas, y la mesa de trabajo para mantener las condiciones estériles. Antes de eso, todos los materiales quirúrgicos deben esterilizarse en un autoclave de vapor.
    4. Utilice los guantes e instrumentos estériles, y perfore un agujero pequeño (3 mm de diámetro) en el cráneo con un taladro eléctrico sobre la VB (incluyendo ventral núcleo posteromedial del tálamo [VPM] y ventral núcleo talámico posterolateral [VPL]) del tálamo (3,0 -3,5 mm posterior, 3.0-3.5 mm lateralal bregma, y ​​5.5 a 5.8 mm de profundidad desde la superficie del cráneo).
    5. Microinyectar 0,5 l de solución salina normal o 0.125 U de solución de colagenasa de tipo 4 en el grupo control y experimental, respectivamente.
    6. Mantenga la aguja de inyección en lugar de una 5 minutos adicionales para permitir la difusión del fármaco.
    7. Utilizar cemento dental para llenar el agujero en el cráneo, y la sutura de la incisión. Después de la sutura de la incisión, se aplican los anestésicos analgésicos locales (lidocaína) de ungüento en la herida, y devolverlos a sus jaulas.
    8. Después de la cirugía, por separado albergar las ratas en jaulas de plástico hasta que mantienen decúbito esternal, y mantiene caliente hasta que se recupere de la anestesia.
  5. Las pruebas de comportamiento después de la recuperación quirúrgica
    1. Después de 7 días de recuperación de la cirugía, repita los procedimientos descritos en las secciones 2.2 y 2.3 para la fase de prueba. Llevar a cabo las pruebas de comportamiento durante 4 semanas, mientras que el seguimiento de la salud y el estado de desarrollo de los animales.
      2. (por ejemplo, el peso corporal, la cantidad de la alimentación, y la libre circulación) entre los grupos control y experimentales para la fase posterior a la cirugía.
  6. Realizar la cánula de implantación con PE-50 Tubería
    1. Anestesiar la rata con isoflurano al 4%, y mantener la temperatura corporal a 36,5 - 37,5 ° C con una simple resistencia de calentamiento.
    2. Con un escalpelo, cortar dos agujeros (2 cm de diámetro cada uno) en la línea media de la parte dorsal de las extremidades anteriores y la intersección de la parte ventral del hombro izquierdo y la cavidad torácica, respectivamente.
    3. Disociar la piel y el músculo con un par de tijeras entre los dos orificios.
    4. Conecte un extremo del tubo de PE 50 (20 cm de longitud) a la vena yugular externa a través del orificio ventral. Conectar el extremo terminal de la misma PE- 50 tubo en el orificio dorsal, y colocar sobre la piel.
    5. Utilice una jeringa para inyectar solución salina en la vena yugular para verificar que el tubo PE- 50no está obstruido.
    6. Suturar la incisión, e inyectar las ratas con 6 mg / kg de gentamicina (por vía intraperitoneal).
    7. Enjuague el tubo cada dos días después de la cirugía con 0,3 ml de 0,9% de solución salina, seguido de 0,1 ml de solución salina con 20 U de heparina / ml.
  7. Prueba de comportamiento final
    1. Una semana después del paso 2.6, repita los pasos 2.2-2.3 para confirmar que el comportamiento es estable en comparación con el paso 2.5 después de la recuperación quirúrgica.
  8. La inyección del radiotrazador
    1. Coloque la rata en una jaula en reposo durante 5 - 10 minutos a la adaptación.
    2. El uso de un divisor, conecte PE-50 tubos a dos jeringas de 1 ml. Llene una jeringa con solución salina normal y llenar la otra con [14 C] -IAP solución (125 Ci / kg en un volumen de 0,3 - 0,5 ml).
    3. Inyectar el radiotrazador en la vena yugular externa, y reemplazar la jeringa con otra jeringa llena de cloruro de potasio 3 M.
    4. Diez segundos después de que el radiotrazador injreflexión, inyectar cloruro de 3 M de potasio en virtud de una sobredosis de isoflurano, y el sacrificio de los animales de acuerdo a los métodos de eutanasia estándar (es decir, isoflurano de un vaporizador durante 50 min) sobre la base de las directrices de la Academia Sinica Institucional Cuidado de Animales y el Utilización de Taiwán.
    5. Después de 1 minuto, exponer el cráneo, y recorte el músculo restante. Usando unas pinzas, retire la superficie dorsal del cráneo del cerebro. Recorte los lados del cráneo usando unas pinzas. A continuación, utilizando una espátula, cortar los bulbos olfatorios y las conexiones nerviosas a lo largo de la superficie ventral del cerebro, y quitar el cerebro.
    6. Use un compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) para congelar el cerebro en hielo seco y metilbutano (aproximadamente -55 ° C). Almacenar el tejido cerebral en un congelador. 11, 12
  9. El rebanar el cerebro
    1. Oriente el tejido en un micrótomo, con el cerebro posterior hacia abajo. Use un criostato para cortar el cerebro en 20 y# 181; m de espesor secciones.
    2. Coloque las rodajas de cerebro en portaobjetos de microscopio en un criostato a -20 ° C, con un intervalo de 240 m entre cada rebanada.
    3. Colocar los portaobjetos de microscopio y cinco papeles de filtro estándar con radiactividad se nivelan en casetes de exposición durante 3 días a -20 ° C. De acuerdo con la secuencia de las rodajas de cerebro, disponer los portaobjetos de microscopio de arriba a abajo. Por último, colocar los papeles de filtro en la parte inferior de los cassettes. 12
    4. Retire la pantalla de fósforo de las gavetas de la exposición, y el uso de un generador de imágenes en modo variable para leer la pantalla de fósforo y generar imágenes para mostrar [14C] captación -IAP para los cortes de cerebro.

Análisis 3. Datos

  1. Después del paso 2.9.4, ajustar las imágenes usando Statistical Parametric Mapping (SPM) y el software ImageJ. Reconstruir todas las imágenes utilizando secciones coronales en serie. Suavizar y normalizar las imágenes de acuerdo con un modelo de cerebro de rata referencia.12, 13
  2. Para las evaluaciones cuantitativas, mida la región de interés (ROI) de las imágenes cerebrales utilizando el software ImageJ para determinar la intensidad de la señal de píxeles, y el uso de software estadístico para el análisis. 12, 13
  3. Para investigar las conexiones entre los diferentes núcleos del cerebro, usar software de análisis de correlación de MATLAB para visualizar relación de radiactividad en una matriz de correlación interregional, y visualizar las matrices como mapas de colores. Por último, utilizar software para el análisis de redes Pajek. 12, 13
  4. Utilice 2 × 5 bidireccional análisis mixto de la varianza (ANOVA), con el grupo y semanas como factores, para comparar la duración de la tolerancia al calor en la prueba plantar y fuerza mecánica en la prueba de von Frey en los grupos sham y CPSP al inicio del estudio y semana 1 - 5. uso de un 2 × 31 ANOVA de dos vías para medir la relación de radiactividad en función del grupo y área del cerebro. Cuando sea apropiado, llevar a cabo la diferencia honestamente significativa de Tukey (HSD) de las pruebas post hoc. Californiacorrelación de Pearson coeficientes cular para evaluar las correlaciones entre todas las áreas del cerebro seleccionados en la farsa y grupos CPSP.

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Representative Results

La figura 1A representa la línea de tiempo experimental. Las ratas fueron asignadas a la farsa y grupos CPSP para las pruebas de comportamiento (es decir, von Frey prueba y plantar test). El primer día del experimento sirvió como línea de base, y las pruebas se repitieron en las semanas 1 - 5. PE-50 cateterismo se realizó en la vena yugular externa en la semana 4. Se inyectó heparina (20 U / ml, 0,1 ml / día) durante las semanas 4 y 5. Cinco minutos después de la inyección de heparina, se inyectó [14C] -IAP, seguido 10 segundos después por una sobredosis de anestesia para el sacrificio. Un minuto después, las ratas se decapitaron y se hicieron secciones de cerebro embebidas-OCT. La Figura 1B representa las ratas en un dispositivo quirúrgico estereotáxica, sitios cánula de implantación, y el mapa histológico de los cortes de cerebro en base a una rata atlas del cerebro. La Figura 1C muestra el agujero derecho de la vena yugular externa en rojo, la ubicación de la tubería de PE 50, yconfiguración experimental final.

La figura 2A muestra las secciones de cerebro que fueron expuestos en los casetes. La pantalla de fósforo se analizó usando un formador de imágenes en modo variable. A continuación, se analizaron muestras y de datos estándar para los cortes de cerebro. La Figura 2B muestra las curvas de autorradiografía estándares. El panel izquierdo muestra la relación entre la intensidad de la imagen (píxeles / mm 2) y el recuento de radiactividad por minuto (CPM), lo que se obtiene la siguiente ecuación lineal predicho: Y = 44.542X + 196.24. El panel derecho muestra que la resolución (píxel / mm 2) se mejoró como el tiempo de exposición incrementado (en días). Se observó que la resolución óptima en el Día 4.

La figura 3A muestra la configuración experimental para la prueba plantar, que evalúa el dolor térmico. El grupo CPSP exhibió una disminución significativa en el umbral de retirada de la pata p <0,05) Figura 3B muestra el montaje experimental para la prueba de von Frey, que evalúa el dolor mecánico. El grupo CPSP exhibió una disminución significativa en la fuerza mecánica (GW) al inicio y semanas 1-5 (todos p <0,05).

Figura 4A muestra las regiones de interés en un atlas anatómico. El análisis ROI mostró que la activación de la corteza infralimbic (IL), corteza prelimbic (PRL), y cingulada área de la corteza 1 (Cg1) fue significativamente mayor en el grupo CPSP en el hemisferio derecho, con la excepción de la VB (Figura 4B) .

No se observaron diferencias en las correlaciones inter-regionales de rCBF entre los grupos CPSP y simulados en el hemisferio derecho (Figura 4C). La matriz (de Fisher Z-statistics) de todas las regiones se analizó mediante la correlación de Pearson. La figura 4C muestra las diferencias en las correlaciones inter-regionales de la participación de los sustratos neurales en el grupo CPSP. sustratos neuronales relacionados con el dolor se determinaron mediante el análisis de las diferencias en las correlaciones entre las regiones de flujo sanguíneo cerebral. Las líneas rojas en la Figura 4D indican correlaciones positivas significativas, y las líneas azules indican correlaciones negativas significativas.

Figura 1
Figura 1. Experimental Cronología de la Lesioning ventral Núcleo Basal (VB) del tálamo central para inducir dolor posterior al accidente cerebrovascular (CPSP) y la inyección de [14C] -IAP. (A) las lesiones núcleos basales ventrales para inducir CPSP para las evaluaciones de comportamiento y las inyecciones de -IAP [14 C] para medir la activación de sustratos neurales que están implicados en CPSP. (B) Localización de VB. (C) [14 C] -IAP inyecciones. Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Se obtuvieron Figura 2. Curvas estándar autorradiográficos. (A) de la muestra y las curvas de calibración para diferentes tiempos de exposición y resoluciones de imagen. (B) Curva patrón de intensidad de la imagen y de la RPC y la curva estándar del tiempo de exposición y resolución. Por favor, haga clic aquí para ver una mayor versión de esta figura.

figura 3
Figura 3. La prueba plantar (dolor térmico) y la prueba de von Frey (dolor mecánico) se llevaron a cabo en los grupos sham y CPSP momento basal y en las semanas 1 - 5. (A) ratas CPSP exhibió un umbral más bajo retirada de la pata en el ensayo plantar ( es decir, menos tolerancia al calor) en comparación con el simulacro de ratas, lo que indica una mayor dolor térmico. (ratas B) CPSP exhibió un umbral de retirada de la pata inferior en la prueba de von Frey en comparación con las ratas sham, lo que indica una mayor dolor mecánico. SEM, error estándar de la media. Asteriscos verdes (*) indican una diferencia significativa en comparación con el grupo de tratamiento simulado. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Análisis ROI y la relación entre el Inter-RLas correlaciones egionales Entre neuronales sustratos involucrados en CPSP. (A) Las áreas del cerebro se determinaron y se analizaron mediante la formulación relación. (B) El rendimiento de la inversión en el IL, PRL, Cg1, y VB fueron significativamente diferentes en el hemisferio derecho. (C) Análisis del flujo sanguíneo cerebral en las áreas cerebrales seleccionados. (D) entre las correlaciones regionales entre las áreas del cerebro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En las pruebas de comportamiento, el grupo CPSP exhibió una reducción del umbral de retirada de la pata en la prueba de dolor térmico y la fuerza mecánica en la prueba de von Frey al inicio del estudio y las semanas 1 -. 5. Los resultados fueron consistentes con un estudio previo 14

El [14 C] -IAP método se basa en la intensidad de los píxeles de imágenes del cerebro para el análisis cuantitativo de los diferentes cortes de cerebro. Para evaluar los datos de las imágenes del cerebro, se definió la intensidad de la señal de píxel. En el presente estudio, la señal de fondo ambiental se define como 25,811 a 46,979 CPM. La señal del papel de filtro [14C] -IAP 0.001 Ci se definió como 42 CPM. La intensidad de la señal de píxeles fue <0.001 Ci, que sirve como la intensidad de fondo. Se determinó la intensidad de los píxeles de cinco papeles de filtro para 0,001, 0,01, 0,1, y 10 Ci, sirviendo como la escala de grises de pixel para cada una de las imágenes del cerebro. [14C] radiactividad -IAP mostró apositivo correlación con la intensidad de los píxeles y la radiactividad contar con una escala logarítmica. Por lo tanto, el procedimiento anterior puede ser seguido para la calibración de [14 C] radiactividad -IAP al píxel intensidad.

Al realizar la [14C] -IAP protocolo experimental, algunos puntos deben tenerse en cuenta. Por ejemplo, la vena yugular externa puede ser bloqueada, y experimentadores necesidad de garantizar la permeabilidad de la tubería de PE-50 con heparina de todos los días. Además, la ubicación de los sitios de lesión a veces puede estar fuera de lugar, resultando en síntomas CPSP no significativos. Antes de las inyecciones, la exactitud de los sitios de inyección y ubicaciones relativas a bregma debe ser confirmada. El ángulo y el volumen de cada inyección también deben ser determinados con precisión.

Limitaciones de imágenes cerebrales también deben ser considerados. Las distorsiones de las imágenes cerebrales pueden ocurrir después de la exposición de las secciones de cerebro en los cassettes a una pantalla de fósforo. El cerebro images necesitan ser normalizados a un atlas del cerebro estándar utilizando un programa de análisis de imagen para evitar posibles distorsiones en las imágenes cerebrales. Por otra parte, los diferentes isótopos pueden dar resultados diferentes debido a sus diferentes mecanismos y acciones. Por ejemplo, el metabolito y mecanismo de acción de [18 F] -fludeoxyglucose (FDG) son similares a la glucosa. Por lo tanto, el [18 F] FDG imágenes, se mostró a ser similar a la vía de metabolismo de la glucosa. Además, la vida media de [18 F] FDG es corta; Por lo tanto, debe ser combinado con PET para generar las imágenes. [201 Tl] es adecuado para la evaluación de la perfusión el flujo sanguíneo miocárdico usando tomografía computarizada de emisión de fotón único. Por lo tanto, la elección de un isótopo adecuado para evaluar imágenes del cerebro es importante.

La aplicación de la [14C] -IAP método para evaluar la activación cerebral en CPSP es menos costosa que otras técnicas de mapeo cerebral (por ejemplo, PET y fMRI). Tél [14 C] método -IAP es adecuado para los eventos que ocurren de forma espontánea, pero no se puede utilizar para la cartografía cerebral en tiempo real. El método es diferente de otras técnicas de mapeo cerebral, tales como PET y resonancia magnética funcional. Además, el presente protocolo -IAP [14C] puede medir los cambios sutiles en el flujo sanguíneo cerebral en cualquier condición patológica.

El [14 C] -IAP método se puede utilizar para poner a prueba las vías del dolor convencionales, tales como el tracto espinotalámico (STT), el tálamo medial (MT) -ACC, y los circuitos neuronales mPFC-amígdala. La activación de cada una de estas vías impactos de los otros. La activación de estas vías en CPSP se ha detallado en nuestro anterior documento. 12

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El presente estudio fue apoyado por becas del Consejo Nacional de Ciencia al Dr. Bai-Chuang Shyu (NSC 99-2320-B-001-016-MY3, NSC 100-2311-B-001-003-MY3, y NSC 102-2320- B-001-026-MY3). Este trabajo se llevó a cabo en el Instituto de Ciencias Biomédicas, que han recibido recursos de la Academia Sinica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetic:
Isoflurane Halocarbon Products Corporation  NDC 12164-002-25 4%
Surgery
homeothermic blanket system Harvard Apparatus Model 50–7079 body temperature were maintained at 36.5 - 37.5 °C.
10 µl micro syringe Hamilton 80008, Model 1701SN injected with collagenase
polyethylene-50 tubing Becton, Dickinson and Company 427411 catheterized into external jugular vein
1 c.c syringe Terumo Medical Products SS-01T injected with 14C-IAP and saline.
saline (Sodium Chloride 0.9 gm) Taiwan Biotech Co., LTD. 100-130-0201 To flush the tube
Drugs
type 4 collagenase Sigma C5138-500MG 0.125 U
Gentamicin Sigma G1264-250MG 6 mg/kg
Heparin Sigma H9399 20 U/ml; 0.1 ml/day
14C-iodoantipyrine (IAP) PerkinElmer NEC712 125 mCi/kg in 300 ml of 0.9% saline
Potassium chloride Merck 1.04936.1000 3 M
Behavior system:
von Frey esthesiometer Fabrication Enterprises, Inc. Baseline Tactile Monofilaments 12-1666 mechanical hyperalgesia was assessed by measuring the withdrawal response to a mechanical stimulus
plantar test apparatus IITC Life Science IITC 390G Plantar Test Thermal hyperalgesia was assessed by measuring the hind paw withdrawal latency in response to radiant heat.
Brain slice:
Optimal Cutting Temperature compound Sakura Fintek Inc 4583 embedded the brain
dry ice frozen in dry ice/methylbutane (approximately −55 °C)
methylbutane Sigma M32631-1L frozen in dry ice/methylbutane (approximately −55 °C)
Cryostat  Leica Biosystems Nussloch GmbH, Germany Leica CM1850 Coronal brain slice were sectioned on this machine.
Data analyze
exposure cassettes with a phosphor screen Amersham Biosciences  20 cm x 25 cm The slices were dried on glass slides and placed alongside five standard filter papers with graded radioactivity. All of the slides were exposed to the cassettes at −20 °C.
γ-counter Beckman Coulter Beckman LS 6500 Liquid Scintillation Counter To measure the radioactivity count of the filter papers.
Typhoon 9410 Variable Mode Imager  GMI, Inc. WS-S9410 To read  phosphor screen which was exposed by brain slice
Statistical Parametric Mapping (SPM) Wellcome Centre for Neuroimaging version 8 all of the brains were averaged to create the final brain template. To determine significant differences between the images in these two groups, the images were derived by subtracting the sham group from the CPSP group.
ImageJ http://imagej.nih.gov/ij version 1.46 Adjacent sections were aligned both manually and using Stack- Reg, an automated pixel-based registration algorithm in ImageJ software. All of the original three-dimensionally reconstructed brains were smoothed and normalized to the reference rat brain model.
Matlab MathWorks version 2009b used Pearson correlation coefficients to examine the relationships between the CPSP and sham groups. An inter-regional correlation matrix was calculated across animals from each group.
Pajek http://Pajek.imfm.si/ version 3.06 Graphical theoretical analysis was performed on networks defined by the above correlation matrices using Pajek software.

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