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Bioengineering

3 डी बातचीत का अध्ययन के लिए 3 डी कोलेजन जैल और microchannels की तैयारी Published: May 9, 2016 doi: 10.3791/53989
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 2,3,4, 1,2,5
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 4Morgridge Institute for Research, University of Wisconsin-Madison, 5Paul P. Carbone Comprehensive Cancer center, University of Wisconsin-Madison

Summary

कोलेजन ईसीएम का एक प्रमुख घटक है, और कई सेलुलर प्रवास से भेदभाव और प्रसार को लेकर प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक संकेतों प्रदान करता है। यहाँ प्रदान की 3 डी कोलेजन हाइड्रोजेल भीतर कोशिकाओं embedding के लिए एक प्रोटोकॉल, और बेतरतीब या गठबंधन कोलेजन PDMS microchannels का उपयोग कर matrices पैदा करने के लिए एक और अधिक उन्नत तकनीक है।

Protocol

1. निराकरण, कमजोर पड़ने और 3 डी जांच और सेलुलर संकुचन Assays के लिए कोलेजन समाधान के polymerization

  1. बाँझ टिशू कल्चर हुड में बर्फ पर, कोलेजन (1: 1) बेअसर 2x पीबीएस में बाँझ, ठंडा 100 मिमी HEPES, 7.4 पीएच, एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के साथ। प्लास्टिक विंदुक के साथ अच्छी तरह मिक्स जब तक समाधान समरूप है और मिश्रण swirls नहीं रह दिखाई दे रहे हैं। सावधान रहो मिश्रण प्रक्रिया के दौरान हवा बुलबुले परिचय नहीं। बर्फ पर संक्षेप में स्टोर।
  2. सेल मीडिया के साथ उचित एकाग्रता (जैसे RPMI, DMEM, आदि के रूप में) को निष्प्रभावी कोलेजन पतला।
    1. निष्प्रभावी वांछित कोलेजन एकाग्रता को बनाने के लिए आवश्यक कोलेजन की राशि की गणना करने के लिए, समीकरण एन = (डी * वि) / (एस / 2), जहां एन निष्प्रभावी आवश्यक कोलेजन की राशि है, डी वांछित कोलेजन एकाग्रता है, वी है का उपयोग करें वांछित कोलेजन एकाग्रता की अंतिम मात्रा, और एस टी हैवह शेयर कोलेजन एकाग्रता शुरू।
    2. एक सेल और सेल मीडिया समाधान के अलावा द्वारा मात्रा को निष्प्रभावी कोलेजन की राशि को ले आओ। अच्छी तरह मिक्स और बर्फ पर दुकान कास्ट करने के लिए तैयार है जब तक।
      1. उदाहरण: एक 2 मिलीग्राम / 1 मिलीलीटर जेल मात्रा में मिलीलीटर जेल (6 अच्छी तरह से थाली या 50 मिमी गिलास नीचे डिश में एक जेल कलाकारों के लिए विशिष्ट मात्रा) के लिए, पहली वांछित एकाग्रता (2 मिलीग्राम / एमएल) के वांछित अंतिम मात्रा से गुणा करें (1 मिलीलीटर)। इस संख्या (2 मिलीग्राम) ले लो और बोतल पर सूचीबद्ध शेयर एकाग्रता (9.49 मिलीग्राम / एमएल) के आधे से विभाजित। इस मामले में, निष्प्रभावी कोलेजन के 0.42 मिलीलीटर मीडिया / सेल मिश्रण के 0.58 मिलीलीटर के साथ पतला कर रहे हैं।
  3. Pipet ठंडा कोलेजन / सेल / मीडिया या तो एक गैर टिशू कल्चर में मिश्रण 6 अच्छी तरह से थाली या एक 50 मिमी गिलास नीचे पकवान का इलाज किया। pipet टिप का उपयोग समान रूप से हल निकालने का प्रसार करने के लिए।
    नोट: यह collag के बाहर लगाव या कोशिकाओं के विकास को कम करने के लिए इलाज की थाली एक गैर टिशू कल्चर का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण हैजेल एन।
  4. 15 मिनट - लगभग 10 के लिए कमरे के तापमान पर भाजन करने की अनुमति दें। जैल polymerization पर अपारदर्शी बारी चाहिए।
  5. polymerization खत्म करने के लिए 60 मिनट के बाद - यह अपारदर्शी हो गया है, अतिरिक्त 45 के लिए 37 सी के लिए थाली या पकवान ले जाते हैं।
  6. 45 के बाद - अच्छी तरह से या पकवान की परिधि के चारों ओर एक P200 pipet टिप चलाने के द्वारा अच्छी तरह से की तरफ से जैल मीडिया के 3 मिलीलीटर और रिलीज - 60 मिनट, 2 जोड़ें। भंवर पकवान धीरे जेल जारी करने के लिए। कोलेजन जेल मीडिया में चल जाना चाहिए।

2. पश्चिमी सोख्ता, सेल Morphogenesis और जेल Gontractility परख

  1. कठोरता ईसीएम के संबंध में प्रोटीन का स्तर, आकृति विज्ञान या सेलुलर सिकुड़ना का आकलन करने के लिए, कोलेजन जैल गिरने से शुरू 1.1 के अनुसार - 1.6, एक 7 के लिए कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त - 10 दिन परख। विकास दर और confluency के आधार पर अनुभव से प्रत्येक कोशिका लाइन बोने दर निर्धारित करते हैं। 100,000 कोशिकाओं / जेल - एक दिन में 10 परख के लिए, बोने घनत्व 20,000 से लेकर कर सकते हैं।
  2. मापने के लिएसेल सिकुड़ना, एक शासक या एक कैमरा हर 24 घंटा का या उचित समय अंतराल पर जेल व्यास को मापने।
    नोट: इसके अतिरिक्त, एक माइक्रोस्कोप से एकत्र इसी छवियों ऐसे acini संरचनाओं की तरह, उपकला नलिकाओं, सेलुलर उभार, और lameliapodia के रूप में, जेल में वरीयता प्राप्त सेल लाइन की रूपात्मक सुविधाओं विशेषता के लिए जांच की जा सकती है।
  3. प्रोटीन के स्तर का आकलन करने के लिए, एट अल। Wozniak 17 और Gallagher एट अल। 18 में वर्णित के रूप में ब्याज की प्रोटीन के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए RIPA में जैल बफर lyse और प्रक्रिया।
    1. महत्वपूर्ण: सेल लाइनों के बीच सिकुड़ना की तुलना में, कुल डीएनए है, जो जैल से निकाला जा सकता है के रूप में Lui द्वारा उल्लिखित के लिए सिकुड़ना मानक के अनुसार, एट अल 19, या एक अपरिवर्तनीय, हाउसकीपिंग प्रोटीन (histones, GAPDH, आदि) पश्चिमी द्वारा करने के लिए। धब्बा विश्लेषण, Wozniak एट अल। 17 और Gallagher एट अल में वर्णित है। 18। जेल के भीतर गिनती कोशिकाओं को एक hemocytometer का उपयोग करते हैं, तो करार जेल कोशिकाओं ध्यान देना होगा के रूप में कुल जेल क्षेत्र के लिए सेल नंबर को सामान्य करने के लिए सुनिश्चित करें।
  4. मीडिया के 1 मिलीलीटर हटाने और ताजा मीडिया के 1 मिलीलीटर के साथ जगह से 4 दिन - फ़ीड जैल हर 3। जैल को खिलाने के लिए के बाद माप ताजा मीडिया / सीरम के अलावा के रूप में लिया जाता सिकुड़ना में एक कील का कारण होगा सुनिश्चित करें।

3. कोलेजन फाइबर संरेखण के लिए PDMS microchannels की पीढ़ी

नोट: गठबंधन कोलेजन matrices उत्पन्न करने के लिए, PDMS microchannels (2A चित्रा) के लिए एक मोल्ड एक SU-8 सिलिकॉन मास्टर नरम लिथोग्राफी 15 के माध्यम से किया की आवश्यकता है।

  1. PDMS चैनलों बनाने के लिए, PDMS अच्छी तरह से एक शिल्प छड़ी के साथ एक डिस्पोजेबल कप में मिश्रण। एक 6 इंच सिलिकॉन मास्टर के लिए, इलास्टोमेर आधार के 20 ग्राम मिश्रण इलाज के एजेंट के 2 जी के साथ।
  2. डी-गैस का एक निर्वात दबाव में एक निर्वात चैम्बर में डिस्पोजेबल कप रखकर PDMS मिश्रण550 मिमी पारा। 1.5 घंटे - 1 के लिए डी-गैस।
  3. जबकि PDMS de-बक, घनघोर के लिए सिलिकॉन मास्टर तैयार करते हैं। एक hotplate सिलिकॉन मास्टर द्वारा पीछा किया पर पारदर्शिता फिल्म का एक स्वच्छ पत्र रखकर तैयार करें। सुनिश्चित करें कि microchannel ढालना तक चेहरे।
    नोट: PDMS कास्टिंग और इलाज के दौरान, सिलिकॉन मास्टर पारदर्शिता फिल्म के दो चादरें के बीच sandwiched हो जाएगा।
  4. 1 के बाद - 1.5 घंटे, निर्वात चैम्बर से de-मार डाला PDMS हटाने, और धीरे-धीरे सिलिकॉन मास्टर पर डाल देना।
    महत्वपूर्ण: हवा के बुलबुले से बचें। गुरु के केंद्र में डालना, और गुरुत्वाकर्षण यह समान रूप से प्रसार करने की अनुमति के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: PDMS बूंद गुरु के किनारे करने के लिए सभी तरह का विस्तार करने की जरूरत नहीं है।
  5. PDMS के बाद मास्टर पर डाल दिया गया है, सिलिकॉन मास्टर और PDMS के शीर्ष पर पारदर्शिता फिल्म के एक दूसरे चादर लागू होते हैं। ध्यान से, दूसरे पारदर्शिता चादर PDMS / सिलिकॉन मास्टर के शीर्ष पर नीचे रोल हवा के बुलबुले से बचने के लिए। जल्दी मत करो। PDMS अब समान रूप से ओ प्रसार किया जाना चाहिएदेखें गुरु।
  6. धीरे पारदर्शिता के शीर्ष पर एक रबड़ शीट, एक 1/8 "एक्रिलिक पत्र के द्वारा पीछा जगह है।
  7. एक्रिलिक शीट के शीर्ष पर तीन 10 पौंड वजन जोड़ें। प्रारंभ में, वजन "नाव" होगा। उन्हें व्यवस्थित करने और आगे बढ़ने से पहले स्थिर करने की अनुमति दें।
  8. 4 घंटे के लिए 70 सी और इलाज के लिए PDMS hotplate तापमान सेट करें। परेशान करने से पहले 1 अतिरिक्त मानव संसाधन का न्यूनतम के लिए शांत करने के लिए अनुमति दें।
  9. ध्यान से वेफर से पारदर्शिता फिल्म के शीर्ष चादर छील, और एक संदंश के साथ चैनलों को हटा दें।
  10. तैयार है जब तक धूल से मुक्त डिश में स्टोर का उपयोग करने के लिए।

उपयोग के लिए 4. Prepping PDMS microchannels

  1. उल्टा नया, स्वच्छ पारदर्शिता फिल्म पर नीचे रखें चैनल। स्वच्छ सभी बंदरगाहों (चित्रा 2 बी) एक तेज संदंश के साथ परिपत्र गति का उपयोग। PDMS के किसी टुकड़े निकालें।
  2. एक कील कपड़े के रूप में पैकिंग टेप का एक टुकड़ा का उपयोग करके स्वच्छ चैनलों। बेंच की सतह (अप चिपचिपा पक्ष) को टेप लागू करें, और उसके बाद चैनल ओ सेटn शीर्ष। अच्छा संपर्क सुनिश्चित करने के संदंश के दौर के अंत के साथ चैनलों पर नीचे प्रेस। निकालें और दोनों पक्षों पर दोहराएँ जब तक दिखाई मलबा हटा दिया जाता है।
  3. स्थानांतरण साफ है, 70% EtOH के साथ एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार में PDMS चैनलों तैयार। 30 सेकंड के लिए अधिकतम गति से भंवर। EtOH त्यागें और नए सिरे से 70% EtOH के साथ बदलें। तैयार है जब तक 70% EtOH में स्टोर का उपयोग करने के लिए।
  4. टिशू कल्चर हुड और सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करते हुए, एक स्वच्छ और बाँझ कवर गिलास या गिलास नीचे बर्तन करने के लिए PDMS चैनलों हस्तांतरण। चैनल ऊपर की ओर और यूवी इलाज रखो जब तक EtOH सुखाया गया है।
  5. एक बार सूखा, PDMS फ्लिप इसलिए चैनलों coverglass की ओर नीचे का सामना करना पड़ रहे हैं। एक अच्छा मुहर बनाने के लिए कांच पर PDMS चैनल नीचे दबाएँ। बाँझ PDMS कवर करने के लिए एक पैच जोड़ें / केंद्र पोर्ट बंद (बंदरगाह बी चित्रा 2 बी)। आगे बढ़ने से पहले अच्छी तरह से सूखे की अनुमति दें।
  6. प्री-कोट बाँझ पानी में 10 माइक्रोग्राम / एमएल कोलेजन के साथ चैनल के अंदर। कोट करने के लिए, एक Chann के शीर्ष पर एक 100 μl छोटी बूंद जगहईएल, और वैक्यूम के साथ के माध्यम से आकर्षित। 37 सी पर 1 घंटे के बाद, एक रेफ्रिजरेटर के लिए कोलेजन कोटिंग समाधान के साथ भरा हस्तांतरण चैनल। 30 मिनट - लगभग 15 के लिए शांत रहो।
  7. Aspirator या pipet के साथ कोलेजन कोटिंग समाधान निकालें, और कोलेजन तैयारी शुरू करते हैं।

Microchannels में उपयोग के लिए 5. कोलेजन तैयारी

  1. 2x पीबीएस, 7.4 पीएच में ठंडा 100 मिमी HEPES के साथ: बर्फ पर, कोलेजन (1 1) बेअसर। समरूप जब तक अच्छी तरह मिक्स (अधिक जानकारी के लिए, अनुभाग 1.1 देखें)।
  2. सेल मीडिया के साथ उचित सांद्रता के निष्प्रभावी कोलेजन पतला (अधिक जानकारी के लिए, अनुभाग 1.2 देखें)। बर्फ पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. इसी समय, सर्द बर्फ पर चैनलों मुहिम शुरू की।
    ध्यान दें: लक्ष्य 4 सी या नीचे में चैनल प्रक्रिया के लिए सभी घटकों के लिए है। कोलेजन nucleation तापमान और समय polymerization की प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण मानकों हैं, और, आगे अनुकूलन के लिए प्रारंभिक बिंदु हो सकता है अगर जरूरत है।
  4. देशइस समय उचित बोने घनत्व पर एक hemacytometer और resuspend के साथ टी कोशिकाओं। 3 लाख कोशिकाओं / एमएल - गणना की आसानी के लिए, 1 से resuspend। (अधिक जानकारी के लिए, यह भी खंड 2.1 देखें)।
  5. एक बार कोशिकाओं की गिनती की गई है और 15 मिनट बीत चुके हैं, घनघोर कोलेजन लिए आगे बढ़ें।

6. गठबंधन और रैंडम कोलेजन microchannels डालने का कार्य

  1. चैनलों के माध्यम से कोलेजन ड्राइंग से पहले, को समायोजित करने और एक इनलाइन निर्वात नियामक के साथ वैक्यूम दबाव निर्धारित किया है। वैक्यूम दबाव प्रेरित और कोलेजन के प्रवाह की दर है, जो संरेखण की डिग्री निर्धारित करता है को नियंत्रित करने के लिए बल प्रदान करता है।
    1. बिना सोचे समझे या असंरेखित matrices के लिए, 10 मिमी पारा या उससे कम की एक वैक्यूम दबाव के साथ एक विस्तृत चैनल (3 मिमी चौड़ा x 200 माइक्रोन लंबा) का उपयोग करें।
    2. गठबंधन matrices के लिए, 60 मिमी पारा या अधिक की एक वैक्यूम दबाव के साथ संकीर्ण चैनल (1 मिमी चौड़ा x 200 माइक्रोन लंबा) का उपयोग करें।
  2. बर्फ से मुहिम शुरू चैनल निकालें और लामिना का प्रवाह घंटा की स्वच्छ, साफ सतह पर जगहOOD।
  3. जल्दी से काम करते हैं और 120 से लोड - (चित्रा 2 बी) के बंदरगाह में निष्प्रभावी कोलेजन के 150 μl।
  4. एक 25 मिलीलीटर pipet बंदरगाह ग (चित्रा 2 बी) पर शून्य रेखा से जुड़ी रखकर चैनल के माध्यम से कोलेजन ड्रा। एक एकल, एक समान गति में के माध्यम से कोलेजन ड्रा। महत्वपूर्ण: यादृच्छिक या असंरेखित matrices के लिए, चैनल पर धीरे-धीरे कोलेजन आकर्षित (लगभग 0.5 - 1 प्रति दूसरी मिमी), और एक बार यह अंत तक पहुँच बंद करो। गठबंधन matrices के लिए, और अधिक तेजी से भर में कोलेजन आकर्षित है, लेकिन हवा के बुलबुले से बचने के लिए ध्यान रखना।
  5. ध्यान P200 Pipetman या खींचने की मशीन के साथ बंदरगाह क्षेत्र से अतिरिक्त कोलेजन को हटा दें।
  6. दोनों बंदरगाहों ए और सी सभी बंदरगाहों अब कवर किया जाना चाहिए पर बाँझ PDMS पैच रखें।
  7. 2 के बाद - 3 मिनट, केंद्र PDMS पैच (बंदरगाह बी) को हटाने और 2 जोड़ - केंद्र पोर्ट में - (10 हजार कोशिकाओं 5) कोशिकाओं के 3 μl। 15 मिनट - (अपारदर्शी बारी) एक और 10 के लिए कमरे के तापमान पर आंशिक रूप से भाजन करने की अनुमति दें।
  8. 10 के बाद- 15 मिनट, अतिरिक्त 15 के लिए 37 सी के लिए स्थानांतरण - polymerization खत्म करने के लिए 30 मिनट। PDMS कवर निकालें और जरूरत के रूप में पूरी तरह से चैनल और संस्कृति कोशिकाओं को कवर करने के लिए मीडिया जोड़ें। प्रकोष्ठों पुराने मीडिया के एक मिलीलीटर हटाने, और नए मीडिया के एक मिलीलीटर के साथ जगह से खिलाया जा सकता है।

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Representative Results

3 डी assays कोलेजन जेल की एक ही कठोरता के भीतर किया जा सकता है, जेल कठोरता बदलती निर्धारित करने के लिए कैसे कोशिकाओं को उनके सेलुलर microenvironment में यांत्रिक परिवर्तन का जवाब देंगे इस्तेमाल किया जा सकता है। एक कठोर कोलेजन हाइड्रोजेल एक जेल जहां एम्बेडेड कोशिकाओं स्थानीय स्तर पर आसपास के कोलेजन अनुबंध करने में असमर्थ हैं के रूप में परिभाषित किया गया है। विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के आंतरिक सिकुड़ना अद्वितीय है, और इस प्रकार यह सबसे अच्छा है एक सरल सिकुड़ना वक्र कोलेजन एकाग्रता है कि अनुरूप और कड़ी के रूप में महसूस किया जा जाएगा स्थापित करने के साथ शुरू करने के लिए है।

सेल नंबर लगातार पकड़े और कोलेजन जेल की एकाग्रता बढ़ाने के द्वारा शुरू करो। के रूप में पहले 10,20 दिखाए जेल की कठोरता एकाग्रता के साथ तेजी पैमाने पर होगा। एक सिकुड़ना परख का एक प्रतिनिधि उदाहरण चित्र 1 में दिखाया गया है। इधर, 50,000 4T1 कोशिकाओं eithe में एम्बेडेड रहे हैंआर ए 2 मिलीग्राम / एमएल या 5 दिनों के लिए 3.5 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन जेल। 4T1 सेल लाइन एक उच्च सिकुड़ा, मेटास्टेटिक कैंसर लाइन है, लेकिन केवल लगभग 10% से उच्च घनत्व जेल अनुबंध करने के लिए सक्षम है (चित्रा 1 ए, सी)। संकुचन का यह निम्न स्तर एक कड़ा जेल वर्गीकरण के लिए विशिष्ट है। तुलनात्मक कम घनत्व जैल (2 मिलीग्राम / एमएल, चित्रा 1 बी, सी) 57% (एन = 4) अनुबंधित कर रहे हैं एक ही समय सीमा के दौरान। यह ध्यान रखें कि कोलेजन ligand की मात्रा बढ़ रही है सेल संकेत दे रास्ते कठोरता भिन्न करने के लिए इसलिए एक दूसरे साधन को प्रभावित कर सकता है, कोलेजन एकाग्रता लगातार पकड़ और छोड़ दिया जा रहा के नीचे से जुड़े द्वारा जैल कि संयमित कर रहे हैं (कठोर) की तुलना करने के लिए महत्वपूर्ण है डिश या सिकुड़ा (अनुरूप), क्योंकि वे सेल माध्यम में स्वतंत्र रूप से नाव के लिए जारी किया गया है। यह एक अच्छा नियंत्रण के रूप में सेवा निर्धारित किया जाए सेलुलर संकेत में परिवर्तन वृद्धि हुई कोलेजन ligand या मैट्रिक्स की कठोरता से परिणाम कर सकते हैं।

एक बार 3 डी matrices के भीतर कोशिकाओं embedding की महारत हासिल की है, assays संगठन और कोलेजन फाइबर के उन्मुखीकरण को बदलने के लिए संशोधित किया जा सकता है। इस PDMS microfluidic चैनलों (चित्रा 2) के उपयोग से हासिल की है। इस पांडुलिपि के प्रयोजन के लिए इसी तरह के दो रचना इस्तेमाल किया गया, एक संकीर्ण और एक व्यापक चैनल, 3 खुलने या बंदरगाहों (चित्रा 2 बी) के साथ। गठबंधन matrices की तुलना में यादृच्छिक करने के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया निर्धारित करने के लिए एक ठेठ प्रयोग में, unpolymerized कोलेजन microfluidic चैनल के माध्यम से बंदरगाह एक से पोर्ट सी के लिए कोशिकाओं बंदरगाह बी को जोड़ा जा रहा कोलेजन संरेखण की डिग्री कोलेजन की दर से ठीक किया जाता है के साथ तैयार की है इस तरह के प्रवाह कि उच्च कोलेजन प्रवाह दरों बेहतर तालमेल निकलेगा। संकरा चैनलों के उपयोग के उच्चतर के साथ युग्मितवैक्यूम दबाव, कोलेजन नेटवर्क के संरेखण को बढ़ाता है, जबकि एक व्यापक कम निर्वात दबाव के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया चैनल यादृच्छिक matrices उत्पन्न करता है। Fibrillar नेटवर्क के संगठन, दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी से देखे जा सकते हैं के रूप में प्रतिनिधि छवियों (चित्रा -2 सी, डी) में दिखाया गया है। इन चित्रों में, कोलेजन फाइबर (तीर द्वारा संकेत दिया है और बैंगनी रंग में pseudocolored) संकीर्ण चैनल (चित्रा 2 डी) में कोलेजन प्रवाह की धुरी के साथ अधिक लगातार संरेखित। विस्तृत चैनलों में कोलेजन फाइबर झुकाव की एक किस्म है, और एक अधिक यादृच्छिक वितरण (चित्रा 2 सी) है।

व्यापक और संकीर्ण चैनलों के बीच अंतर मानव आंखों के लिए discernable है, लेकिन यह भी फाइबर विश्लेषण के लिए विशेष रूप से विकसित सॉफ्टवेयर के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है। सीटी आग, एक खुला स्रोत और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर, पूर्व प्रसंस्करण के द्वारा पीछा के लिए एक curvelet आधारित एल्गोरिथ्म का इस्तेमालएक फाइबर निकासी एल्गोरिथ्म फाइबर कोण, मोटाई, लंबाई, और सीधा 21 यों की। हर हालत के लिए, 500 से अधिक छवियों को बेतरतीब ढंग से चैनलों के भीतर विभिन्न स्थानों से नमूना थे, और अधिक से अधिक 125,000 फाइबर निकाले और सीटी-आग से विश्लेषण किया गया। बाद में फाइबर कोण संकीर्ण चैनल (चित्रा 2 एफ) के लिए उत्पन्न हिस्टोग्राम प्रवाह की दिशा के लिए उन्मुख समानांतर फाइबर का एक स्पष्ट संवर्धन से पता चलता है। इसके विपरीत, विस्तृत चैनलों के लिए एक अधिक बराबर फाइबर कोण वितरण (चित्रा 2 ई) जो एक और अधिक यादृच्छिक मैट्रिक्स के साथ सुसंगत है।

महत्वपूर्ण बात है, microfluidic उपकरणों का उपयोग करते हैं, एक तकनीक संगठन और कोलेजन फाइबर के उन्मुखीकरण को नियंत्रित करने के रूप में, बदल मैट्रिक्स की स्थिति के लिए विभिन्न सेलुलर प्रतिक्रियाओं के आकलन के लिए अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, सुंग एट अल। निर्धारित किया है कि मानव स्तन fibrobasts की व्यवहार्यता कोलेजन फाइबर पर निर्भर है।15 इसके अतिरिक्त, हमारी प्रयोगशाला से हाल ही में काम दर्शाता है कि स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं यादृच्छिक कोलेजन matrices की तुलना में गठबंधन कोलेजन तंतुओं पर अधिक लगातार पलायन। 3 ये परिणाम बेहतर स्तन जीव विज्ञान और स्तन कैंसर के संदर्भ में microenvironment की भूमिका को परिभाषित करने के लिए मदद करते हैं। आगे बढ़ने ठीक 3 डी सेलुलर microenvironment को नियंत्रित करने के लिए कई अलग अलग रोग राज्यों के संदर्भ में महत्वपूर्ण सेलुलर प्रतिक्रियाओं के निरंतर जांच के लिए अनुमति देगा क्षमता।

आकृति 1
चित्रा 1. सेल सिकुड़ना और सेलुलर प्रतिक्रियाओं को मापने ईसीएम कठोरता के लिए 3 डी कोलेजन जैल। 4T1 कोशिकाओं दोनों में चढ़ाया गया (क) 3.5 मिलीग्राम / एमएल और (ख) 2 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन जैल और 5 दिनों के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दी। समय के साथ, कोलेजन जेल (ग्रे क्षेत्रबिंदीदार रेखा के अंदर) के अनुबंध होगा और व्यास मापा जाता है और में मात्रा निर्धारित है (सी, छात्र की टी परीक्षण, त्रुटि सलाखों +/- एसडी)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. जनरेटिंग रैंडम और गठबंधन कोलेजन Matrices PDMS microchannels का उपयोग करना। एक छह इंच सिलिकॉन वेफर (क) दोनों व्यापक और संकीर्ण PDMS microchannels (ख) के लिए एक टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया गया था। समान कोलेजन सांद्रता चैनलों के दोनों प्रकार के माध्यम से तैयार किया गया है, और व्यक्तिगत फाइबर (तीर, सी, डी) के प्रवाह की दिशा के साथ पंक्ति में संकीर्ण microchannels में (तीर) (घ)। वाइड microchannels अधिक यादृच्छिक matrices झुकेंगे। फाइबर anglछवि के नीचे करने के लिए सम्मान के साथ es गिना और में (ई) और (च) दिखाया गया। स्केल बार = 26 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

3 डी कोलेजन जैल हमारे उपकरण बॉक्स के लिए एक मूल्यवान इसके अतिरिक्त समझते हैं कि कैसे कोशिकाओं की व्याख्या और उनके स्थानीय microenvironment करने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए कर रहे हैं। यह पांडुलिपि एक 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स के भीतर कोशिकाओं embedding के लिए एक बहुत ही बुनियादी प्रोटोकॉल प्रदान की गई है, और reproducibly यादृच्छिक या गठबंधन कोलेजन फाइबर के साथ matrices उत्पन्न करते हैं। दोनों प्रोटोकॉल के रूप में अनुकूलनीय प्लेटफार्मों जहां विभिन्न कोलेजन isoforms, crosslinkers, या अन्य मैट्रिक्स प्रोटीन संभावित polymerization के समय में जोड़ा जा सकता है काम करते हैं। यह भी जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन के उत्पादन के लिए अलग अलग समय-सीमा और समापन का आकलन करने के लिए प्लेटफार्मों को संशोधित करने के लिए आसान है। इमेजिंग, आकलन प्रोटीन और आरएनए का स्तर, और चयापचय प्रोफाइल पढ़ने इन सभी 3 डी तकनीक के साथ बहुत संगत कर रहे हैं।

जैसा कि सभी तकनीकों के साथ महत्वपूर्ण है, यह जेल और परख की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक अच्छी गुणवत्ता के कोलेजन जेल का संकेत है कि एक मैनुअल हेरफेर संभाल सकता है। उदाहरण के लिए, एक 1 मिलीलीटर [1 मिलीग्राम / एमएल] कोलेजन जेल एक छह अच्छी तरह से थाली आसानी से एक संदंश के साथ उठाया जाना चाहिए और चालाकी में डाल दिया। अगर जेल आँसू या टुकड़े, जेल की गुणवत्ता suboptimal है, और कदम कोलेजन polymerization में सुधार के लिए उठाए जाने की जरूरत है। तापमान और पीएच अच्छा फाइबर गठन और जमाना लिए आवश्यक सबसे महत्वपूर्ण मानकों हैं। सुनिश्चित करें कि सभी घटकों को तैयार है जब तक बर्फ पर रखा जाता है जमाना घटित करने के लिए बनाने के द्वारा समस्या निवारण की प्रक्रिया शुरू करते हैं। यह भी सुनिश्चित करें कि निराकरण बफर और कोलेजन स्टॉक समाधान अच्छी तरह से मिश्रित किया जा रहा है बनाने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। अगले, सत्यापित करें कि निराकरण बफर का पीएच 7.4 पीएच पर है। एक HEPES बफर क्योंकि यह ऊतक संस्कृति के लिए बहुत संगत है पीबीएस की सिफारिश की है, एक व्यापक बफरिंग रेंज है, और शेयर समाधान समय की लंबी अवधि के लिए 4 सेल्सियस पर बहुत स्थिर हो जाते हैं। यह भी लंबी, अधिक घुमावदार फाइबर जो अधिक शारीरिक स्थिति 15 के समान हैं उत्पादन के अतिरिक्त लाभ है। NaOH के एक और commo हैnly समाधान को निष्क्रिय करते थे, लेकिन और अधिक बारीकी से titered की जरूरत है। यह भी छोटा, मोटा तंतुओं 15 उत्पादन का असर हो गया लगता है। भले ही, निष्प्रभावी कोलेजन का पीएच 7.4 का पीएच पर होना चाहिए। उन सभी शर्तों को संतुष्ट किया जा रहा है, और जैल की अखंडता को अभी भी संतोषजनक नहीं है, तो इस समस्या के समाधान के साथ शेयर कोलेजन निहित है। हालांकि शेयर कोलेजन समाधान 4 सेल्सियस पर 6 महीने की एक सूचीबद्ध शैल्फ जीवन है, हमने पाया है कि यह आम तौर पर कम जब 3 डी जैल के लिए इस्तेमाल की तुलना में वाणिज्यिक सूत्रों का दावा है। पुरानी बोतल, और एक नया बहुत से आदेश त्यागें। यह असामान्य के लिए निर्माता से कोलेजन की गुणवत्ता में बहुत से बहुत कुछ करने के लिए काफी भिन्न करने के लिए नहीं है।

गुणवत्ता के कोलेजन जैल की पहचान करने के अलावा, यह भी कदम है कि PDMS microchannel भीतर अच्छा संरेखण की पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण हैं की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस तकनीक का मूल सिद्धांत है कि coll की दरmicrochannel के माध्यम से प्रवाह एजेंसियों बाद में रेशा संरेखण लाती है। इसलिए, फाइबर संरेखण की डिग्री को नियंत्रित करने में सबसे महत्वपूर्ण कदम वैक्यूम दबाव के समुचित मॉडुलन है। एक microchannel में यादृच्छिक कोलेजन संरेखण के लिए, वैक्यूम दबाव कम होना चाहिए, और कोलेजन चैनल धीरे धीरे नीचे प्रवाह होगा। कोलेजन भी जल्दी से होकर बहती हैं, फाइबर के लिए पंक्ति में शुरू हो जाएगा। एक व्यापक चैनल इस प्रस्ताव को आसान बनाता है। इसके विपरीत, अच्छा कोलेजन संरेखण के लिए, उच्च वैक्यूम के दबाव इस्तेमाल किया जाना चाहिए और कोलेजन समाधान अधिक जल्दी के माध्यम से निकाला जाना चाहिए। गठबंधन matrices की पीढ़ी में एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम तापमान है। यह सुनिश्चित करें कि सभी घटकों और समाधान बर्फ का उपयोग करने से पहले पर ठंडा कर रहे हैं बनाने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। चैनलों का उपयोग करने से पहले ठंडा नहीं कर रहे हैं, तो चैनलों में कोलेजन भी जल्दी भाजन जाएगा, और पतले, छोटे फाइबर में परिणाम होगा। निष्प्रभावी कोलेजन 4 सेल्सियस पर ठंडा किया जाता है और बर्फ पर नहीं, enhancएड nucleation बड़ा फाइबर व्यास जो प्रवाह से तालमेल करने के लिए और अधिक मुश्किल हो जाता है को जन्म देगा। यह भी microchannel में ही ठंडा करने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रायर हल्का बिना, कोलेजन की छोटी मात्रा बहुत तेजी से गर्म गरीब परिणाम उपज जाएगा।

कोलेजन microchannels एक बहुत ही उपयोगी तकनीक रहे हैं, लेकिन वहाँ कुछ सीमाएं हैं। एक के लिए, एक प्रवाह प्रेरित microchannel में संरेखण सही नहीं है, और एक तनाव प्रेरित संरेखण तकनीक के बराबर कभी नहीं होगा। वहाँ हमेशा कुछ फाइबर प्रवाह की दिशा को सीधा उन्मुख हो जाएगा, लेकिन reproducibility, अनुकूलनशीलता, और उपयोग में आसानी चैनल के भीतर संरेखण में छोटे बदलाव पल्ला झुकना। इससे भी महत्वपूर्ण बात, कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से संरेखण में छोटे परिवर्तन भावना है, और इन चैनलों 3,15 में अधिक लगातार पलायन के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए दिखाया गया है। के रूप में उनकी संख्या बढ़ाने के लिए और वे पलायन करने के लिए शुरू की कोशिकाओं को भी चैनल के संरेखण में वृद्धि होगी। यदि अधिक से अधिक संरेखण मैंअपेक्षित रहा है, PDMS microchannels आसानी से संकरा आयामों को संशोधित किया जा सकता है या संरेखण को बढ़ाने के लिए छोटे constrictions है। दोनों प्रभावी हो सकता है, लेकिन अन्य संबद्ध व्यापार-नापसंद 16 है दिखाया गया है। microchannel तकनीक के लिए एक और सीमा PDMS चैनल दवाओं या फ्लोरोसेंट रंगों को थोड़ा पारगम्यता गया है। इसका मतलब यह है कि इन यौगिकों बंदरगाहों, जो आश्चर्यजनक रूप से धीमी है से चैनल नीचे फैलाना करने की जरूरत है, और उपचार के बाहर धोने में कठिनाई पैदा कर सकते हैं।

वहाँ इस microchannel मंच करने के लिए कुछ सीमाएं हैं, हालांकि, यह मौजूदा तकनीक पर कई लाभ प्रदान करता है। ऐसा लगता है जैसे यह भारी उपकरणों 3,13 या संरेखण पैदा करने के लिए कोशिकाओं की छोटी आबादी की आवश्यकता नहीं है और अधिक प्रयोगात्मक सुलभ है। यह भी बहिर्जात चुंबकीय मोती 13,14 जो और autofluorescent हो जाते हैं कृत्रिम रूप से कोलेजन नेटवर्क crosslink कर सकता है की आवश्यकता नहीं है। कोलेजन microchannel हैभी बस और अधिक लागत प्रभावी और किफायती है। वर्तमान फायदे के लिए इसके अलावा, यह भी कई लाभ है कि भविष्य अनुप्रयोगों में उपयोग किया जा सकता है। एक के लिए, कोलेजन microchannel बनाया गया है या लगभग किसी भी विन्यास या प्रयोग में संशोधित किया जा सकता है। उन्नत डिजाइन चैनलों खोखला कोलेजन ट्यूब या 3 डी संरचना बनाने के लिए सरल बनाया अंगों या ट्यूमर 22 की वास्तुकला की नकल करने की अनुमति देते हैं। इसके अलावा, चैनलों PDMS के अलावा अन्य सामग्री का बनाया जा सकता है। यह संभवतः एम्बेडेड कोलेजन नेटवर्क या matrices करने के लिए विभिन्न यांत्रिक गुणों को व्यक्त कर सकता है। अन्त में, इस परख के लिए इस्तेमाल किया अभिकर्मकों की छोटी राशि भी यह आकर्षक और छोटे उच्च throughput स्क्रीन के लिए किफायती बना सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है

Acknowledgments

लेखक इस काम के वित्तपोषण के लिए अनुदान संख्या UO1CA143069, R01CA142833, R01CA114462, RO1CA179556, T32-AG000213-24, और T32-GM008692-18 स्वीकार करना चाहते हैं। हम यह भी सीटी-आग विश्लेषण के साथ के विकास और सहायता के लिए जेरेमी Bredfelt और लोकी के Yuming लियू स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High Concentration Rat Tail Collagen Corning 354249
SylGard184 elastomer kit Corning NC9285739 Elastomer for PDMS channels
HEPES Fisher BP310 For HEPES neutralization buffer
KCl  Fisher BP366 For HEPES neutralization buffer
KH2PO4 Fisher BP362 For HEPES neutralization buffer
Na2HPO4 Fisher S374 For HEPES neutralization buffer
NaCl Fisher BP358 For HEPES neutralization buffer
Levy Improved Neubauer Hemacytometer Fisher 15170-208 cell counting
6-well non-tissue culture plate  Corning 351146
50 mm glass bottom dish MatTek P50g-1.5-30-f
Bel-Art Plastic Vacuum Desiccator Bel-Art F4200-2021 Degassing chamber for PDMS
transparency film  3M pp2950 Plastic film for pouring pdms channels
ThermoScientific CimaRec ThermoScientific  HP141925 Hot plate for curing PDMS microchannels
Vacuum regulator Precision Medical PM3100 Vacuum regulator for collagen microchannels
8" x 8" rubber sheet Amazon - Rubber-Cal Silicone - 60A rubber sheet for pouring PDMS microchannel
8" x 8" x 0.125" acrylic sheet Amazon Plexiglass sheets for pouring PDMS microchannels
10 lb weights Amazon CAP Barbell for pouring PDMS microchannels
15 ml Conical tubes Fisher 352097
50 ml Conical tubes Fisher 352098
Plastic pipets Dot Scientific 229202B, 229206B, and 667225B 2 ml, 5 ml, and 25 ml
70% EtOH Fisher NC9663244

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 111 मज्जा microfluidic चैनलों 3 डी matrices ईसीएम कोलेजन संरेखण ट्यूमर microenvironment
3 डी बातचीत का अध्ययन के लिए 3 डी कोलेजन जैल और microchannels की तैयारी<em&gt; Vivo</em
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Burkel, B., Morris, B. A., Ponik, S. … More

Burkel, B., Morris, B. A., Ponik, S. M., Riching, K. M., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo. J. Vis. Exp. (111), e53989, doi:10.3791/53989 (2016).

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