Summary
Коллаген является одним из основных компонентов внеклеточного матрикса и обеспечивает необходимые сигналы для нескольких клеточных процессов, начиная от миграции к дифференциации и пролиферации. При условии, здесь является протоколом для встраивания клеток в 3D гидрогелей коллагена, и более продвинутый метод для генерации рандомизированные или выровненные матрицы коллагена с использованием PDMS микроканалов.
Protocol
1. Нейтрализация, разбавление и Полимеризация Коллаген решений для 3D Исследование и клеточных контракции Assays
- На льду в стерильной культуре ткани капот, нейтрализовать коллаген (1: 1) со стерильной, охлажденной льдом 100 мМ HEPES в 2 раза PBS, рН 7,4, в 15 мл коническую пробирку. Тщательно перемешать с пластиковой пипеткой до тех пор, пока раствор не станет однородным и смесительные завихрения больше не видны. Будьте осторожны, чтобы не вводить пузырьков воздуха в процессе смешивания. Хранить на короткое время на льду.
- Развести нейтрализованного коллагена в соответствующей концентрации клеток средах (таких , как RPMI, DMEM и т.д.).
- Для того, чтобы рассчитать количество нейтрализованного коллагена , необходимого , чтобы компенсировать желаемой концентрации коллагена, используют уравнение N = (D + V) / (S / 2), где N является количество нейтрализованного коллагена , необходимого, D является требуемая концентрация коллагена, V является конечный объем требуемой концентрации коллагена, и S является тон начинает концентрацию запас коллагена.
- Поднимают количество нейтрализованного коллагена до нужного объема с помощью добавления клеток и клеточных сред раствором. Тщательно перемешать и не хранить на льду до готовности бросить.
- Пример: 2 мг геля / мл в объеме геля в 1 мл (типичного объема для геля отлит в 6-луночный планшет или 50 мм со стеклянным дном тарелки), сначала умножают требуемую концентрацию (2 мг / мл) до желаемого конечного объема (1 мл). Возьмите это число (2 мг) и разделить его на половину акций концентрации перечисленных на бутылке (9,49 мг / мл). В этом случае 0,42 мл нейтрализованного коллагена разбавляют 0,58 мл смеси носителя / клеток.
- Пипетируйте леденящий коллаген / клетки / смесь носитель в любой культуре, не ткани обрабатывают 6-луночного планшета или 50 мм блюдо со стеклянным дном. Используйте наконечник пипетки, чтобы равномерно разложить решение.
Примечание: Важно, чтобы использовать культуру без ткани обрабатывают пластины, чтобы свести к минимуму или прикрепление роста клеток за пределами collagан геля. - Разрешить полимеризуется при комнатной температуре в течение приблизительно 10 - 15 мин. Гели должны непрозрачной при полимеризации.
- После того, как она превратилась непрозрачным, переместить тарелку или блюдо до 37 ° С в течение дополнительных 45 - 60 мин для завершения полимеризации.
- Через 45 - 60 мин, добавляют 2 - 3 мл среды и освободить гели от сторон скважины, запустив p200 пипеткой наконечник вокруг периметра колодца или блюдо. Вихревой блюдо аккуратно, чтобы освободить гель. Гель коллаген должен быть плавающим в средствах массовой информации.
2. Вестерн блот, Cell Морфогенез и гель Gontractility анализа
- Для оценки уровня белка, морфология или клеточного сократимость по отношению к ECM жесткости, начинают выливая коллагеновые гели, в соответствии с 1.1 - 1.6, засевали клетками для 7 - дневного анализа 10. Определите каждую норму высева клеточной линии эмпирически в зависимости от скорости роста и сплошности. Для 10-дневного теста на плотность посева может колебаться от 20000 - 100000 клеток / гель.
- Измерятьячейки сократимость, измерить диаметр геля с помощью линейки или камеры через каждые 24 ч или на соответствующем временном интервале.
Примечание: Кроме того, соответствующие изображения, собранные с помощью микроскопа можно исследовать на морфологические черты, характерные для клеточной линии высевают в геле, такие как ацинусов-подобных структур, эпителиальных канальцев, клеточных выступов и lameliapodia. - Для оценки уровня белка, лизировать гели в RIPA буфере и процесс для Вестерн - блот - анализ белков , представляющих интерес , как это описано в Возняком и др. 17 и Gallagher и др. 18.
- ВАЖНО: При сравнении сократительной между клеточными линиями, нормализуют сократительную к тотальной ДНК, которые могут быть извлечены из гелей , как это изложено Lui и др 19, или неизменного, ведение домашнего хозяйства белка (гистонов, GAPDH и т.д.) со стороны западных. блот - анализ, как описано в разделе Возняк и др. 17 и Gallagher и др. 18, Если подсчет клеток в геле с помощью гемоцитометра, убедитесь, чтобы нормализовать количество клеток в общей площади геля в качестве геля-заказчика будет концентрировать клетки.
- Кормовые гели каждые 3 - 4 дня путем удаления 1 мл среды и заменив его на 1 мл свежей среды. Убедитесь в том, чтобы кормить гели после измерения берется в качестве добавления свежего носителя / сыворотки вызовет всплеск сократимость.
3. Генерация PDMS микроканалов для выравнивания коллагеновых волокон
Примечание: Для создания выровненных матриц коллагена, пресс - форма для PDMS микроканалов (Рисунок 2А) требует мастер кремния SU-8 , сделанное с помощью мягкой литографии 15.
- Для того, чтобы PDMS каналов, перемешать тщательно PDMS в одноразовую чашку с корабля палкой. Для 6 дюймов Silicone Master, смешайте 20 г эластомерной основе с 2 г отвердителя.
- Де-газ смесь PDMS путем размещения одноразовые чашки в вакуумной камере под вакуумом давлением550 мм ртутного столба. Де-газ в течение 1 - 1,5 ч.
- В то время как де-газообразования PDMS, подготовить мастер силиконовый для заливки. Подготовьте, помещая чистый лист прозрачной пленки на плитке с последующим мастером силикона. Убедитесь в том, что Микроканал формы обращена вверх.
Примечание: во время литья и отверждения PDMS, мастер силикон будет зажат между двумя листами прозрачной пленки. - Через 1 - 1,5 ч, удалить дегазировали PDMS из вакуумной камеры, и медленно полить мастер силикона.
ВАЖНО: Избегайте пузырьков воздуха. Продолжайте вливать в центре мастера, и позволить силе тяжести равномерно распределяют его.
Примечание: Падение PDMS не нужно расширить весь путь до края мастера. - После того, как PDMS вылили на хозяина, нанесите второй лист прозрачной пленки поверх мастера силикона и PDMS. Осторожно, раскатать вторую прозрачность листа вниз на верхней части мастера PDMS / силикона, чтобы избежать воздушных пузырей. Не спеши. PDMS должны быть равномерно распределены в настоящее время омастер вер.
- Аккуратно поместите резиновый лист на верхней части прозрачности, а затем 1/8 "акриловый лист.
- Добавьте три 10 фунтов веса на верхней части акрилового листа. Изначально весовые коэффициенты будут "плавать". Позвольте им урегулировать и стабилизировать, прежде чем продолжить.
- Установите температуру конфорки до 70 ° С и вылечить PDMS в течение 4 часов. Дайте остыть в течение минимум 1 дополнительный час, прежде чем нарушать.
- Аккуратно снимите верхний лист прозрачной пленки из пластины, и удалить каналы с пинцетом.
- Хранить в защищенном от пыли блюдо до готовности к использованию.
4. Преппинг PDMS Микроканалы для использования
- Место каналы вниз головой на новую, чистую прозрачную пленку. Очистить все порты (Рисунок 2b) с помощью кругового движения с острыми щипцами. Удалите все фрагменты PDMS.
- Чистые каналы, используя кусок упаковочной ленты в качестве гвоздя ткани. Нанесите ленту на поверхности скамейки (липкой стороной вверх), а затем установить канал Oп сверху. Надавите на каналах с круглым концом щипцов, чтобы обеспечить хороший контакт. Удалить и повторите с обеих сторон до образования видимого мусора не будет удален.
- Передача очищено, PDMS каналы нацелен в 50 мл коническую с 70% этанола. Vortex на максимальной скорости в течение 30 сек. Откажитесь этанола и заменить свежим 70% этанола. Хранить в 70% этанола до готовности к использованию.
- В культуре ткани капюшоном и с использованием асептических методов, передавать PDMS каналы чистой и стерильной стеклянной крышкой или стеклянным дном посуды. Поместите канал стороной вверх и УФ лечить, пока этанол не испарится.
- После высыхания, переверните PDMS поэтому каналы должны быть обращены вниз к покровного стекла. Нажмите канал PDMS вниз на стекло, чтобы сделать хорошее уплотнение. Добавить участок стерильной PDMS , чтобы покрыть / закрыть центральный порт (порт B, рис 2b). Дайте полностью высохнуть, прежде чем продолжить.
- Предварительное покрытие внутри канала с 10 мкг / мл коллагена в стерильной воде. Для покрытия, поместите 100 мкл капельку а на вершине Channэль, и проведем через с вакуумом. Через 1 ч при 37 ° С, передаточные каналы, заполненные раствором коллагена покрытия к холодильнику. Холод в течение приблизительно 15 - 30 мин.
- Удалить коллагена раствора покрытия с аспиратором или пипетку, и начать подготовку коллагена.
5. Коллаген Подготовка к использованию в микроканалов
- На льду, нейтрализуют коллаген (1: 1) с охлажденным льдом 100 мМ HEPES в 2 раза PBS, рН 7,4. Тщательно перемешивайте до получения однородной консистенции (Для получения более подробной информации, смотрите раздел 1.1).
- Развести нейтрализованного коллагена в соответствующих концентрациях с клеточной среды (Для получения более подробной информации, смотрите раздел 1.2). Выдержите в течение 15 мин на льду.
- В то же время, озноб установлены каналы на льду.
Примечание: Цель состоит в том, чтобы иметь все компоненты, необходимые для процесса канала при 4 ° С или ниже. Коллаген температура и время нуклеации являются ключевыми параметрами в процессе полимеризации, и может быть отправной точкой для дальнейшей оптимизации, если это необходимо. - CounТ-клетки с гематоцитометре и ресуспендируют при соответствующей плотности посева в это время. Для простоты вычислений, ресуспендируют в 1 - 3 миллиона клеток / мл. (Для получения более подробной информации, смотрите также раздел 2.1).
- После того, как клетки были подсчитаны и 15 мин прошло, приступить к заливке коллагена.
6. Обливание Унифицированные и случайный Коллагеновые Микроканалы
- Перед нанесением коллагена через каналы, отрегулировать и установить давление вакуума с инлайн регулятором вакуума. Давление вакуума обеспечивает силу, чтобы вызвать и контролировать скорость потока коллагена, который определяет степень выравнивания.
- Для случайных или выровненными матриц, используют широкий канал (3 мм в ширину х 200 мкм в высоту) с вакуумным давлением 10 мм рт.ст. или менее.
- Для совмещенных матриц, использовать узкий канал (1 мм в ширину х 200 мкм высотой) с вакуумным давлением 60 мм рт.ст. и более.
- Удалить установленный канал из льда и поместите на чистую, продезинфицировать поверхность ламинарного потока чООД.
- Работают быстро и загрузить 120 - 150 мкл нейтрализованного коллагена в порт A (рис 2b).
- Draw коллаген через канал, помещая 25 мл пипетку , прикрепленную к вакуумной линии через порт C (рисунок 2b). Draw коллаген через в едином равномерном движении. ВАЖНО: Для случайных или выровненным матриц, рисовать коллаген медленно через канал (примерно 0,5 - 1 мм в секунду), и остановиться, как только он достигает конца. Для совмещенных матриц, рисовать коллаген через более быстро, но будьте осторожны, чтобы избежать воздушных пузырей.
- Осторожно удалите избыток коллагена из региона порта с P200 Pipetman или аспиратора.
- Поместите стерильные PDMS участки над обоими портами А и С. Все порты в настоящее время должны быть охвачены.
- Через 2 - 3 минут, снимите центральный PDMS патч (порт B) и добавьте 2 - 3 мкл клеток (5 - 10 тысяч клеток) в центральный порт. Разрешить частично полимеризуется (непрозрачной) при комнатной температуре в течение еще 10 - 15 мин.
- После того, как 10- 15 мин, передача до 37 ° С в течение дополнительных 15 - 30 мин для завершения полимеризации. Удалить PDMS крышки и добавлять носители, чтобы полностью покрыть канал и культуры клеток по мере необходимости. Клетки могут быть поданы путем удаления мл старых средств массовой информации, и заменив его на мл новых средств массовой информации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В то время как 3D-анализы могут быть сделано в пределах той же жесткости коллагеновый гель, изменяя жесткость гель может быть использован, чтобы определить, каким образом клетки будут реагировать на механические изменения в их клеточной микросреде. Жесткая коллагеновый гидрогель определяется как гель, когда вложенное клетки не способны локально сжиматься окружающий коллаген. Внутреннюю сократимость различных типов клеток является уникальным, и, таким образом, лучше всего начать с простой кривой сократимости, чтобы установить концентрацию коллагена, который будет ощущаться как податливыми и жесткими.
Сначала удерживая постоянные числа клеток и увеличение концентрации коллагенового геля. Жесткость геля масштабируется экспоненциально с концентрацией, как было показано ранее 10,20. Характерным примером анализа на сократимость показано на рисунке 1. Здесь, 50000 4T1 клетки встраиваются в eitheра 2 мг / мл или 3,5 мг / мл коллагеновый гель в течение 5 дней. Клеточная линия 4T1 является весьма сократительной, метастатического рака линии, но только в состоянии заключить контракт геля высокой плотности примерно на 10% (рис 1а, с). Такой низкий уровень сжатия является типичным для жесткой классификации геля. Сопоставимые гели низкой плотности (2 мг / мл, 1б, в) сжимаются на 57% (п = 4) в течение того же периода времени. Важно отметить, что увеличение количества коллагена лиганда может воздействовать на клеточные сигнальные пути, поэтому второе средство для изменения жесткости для удержания постоянной концентрации коллагена и сравнить гели, которые удерживаются (жесткие) оставляются прикреплен к нижней части блюдо или сократительной (совместимый), потому что они были выпущены в свободное плавание в клеточной среде. Это может служить хорошим контролем, чтобы определить, являются ли изменения клеточной сигнализации результатом повышенного коллагена лиганда или жесткости матрицы.
После того, как мастерство встраивания клеток в 3D-матриц достигается, анализы могут быть модифицированы, чтобы изменить организацию и ориентацию волокон коллагена. Это достигается за счет использования PDMS микроканалов (рисунок 2). Для целей этой рукописи, были использованы две подобные конформации, узкий и широкий канал, с 3 - мя отверстиями или портами (Рисунок 2b). В типичном эксперименте с целью определения клеточного ответа на случайным образом по сравнению с выровненными матрицами, неполимеризованного коллаген протягивается через микрожидком канал из порта А в порт C с клетками добавляется в порт B. Степень выравнивания коллагена модулируется скоростью коллагена течь таким образом, что скорость потока выше коллагена дают лучшее выравнивание. Использование более узких каналов в сочетании с улучшеннымразрежение повышает выравнивание коллагеновой сети, в то время как более широкий канал, используемый в сочетании с низким давлением вакуума генерирует случайные матрицы. Организация сети фибриллярного могут быть визуализированы генерации второй гармоники, как показано на репрезентативных изображений (рис 2с, д). В этих изображениях, коллагеновые волокна (показаны стрелками и псевдоцветной фиолетовым цветом) выравнивать более последовательно с осью коллагеновой потока в узких каналах (рис 2d). Коллагеновые волокна в широких каналах имеют различные ориентации, и имеют более случайное распределение (фиг.2с).
Различие между широкими и узкими каналами различимой человеческим глазом, но также могут быть проанализированы с помощью программного обеспечения, разработанного специально для анализа волокон. CT-FIRE, с открытым исходным кодом и свободно доступное программное обеспечение, использует curvelet на основе алгоритма для предварительной обработки с последующейалгоритм извлечения волокна для количественного определения угла волокон, толщины, длины и прямолинейности 21. Для каждого условия, более 500 изображений были случайным образом выборку из разных мест внутри каналов, и более чем 125000 волокна были извлечены и проанализированы с помощью КТ-FIRE. Последующий угол волокна гистограммы генерируется для узких каналов (рис 2F) показывает четкую обогащение волокон , ориентированных параллельно направлению потока. В отличие от этого , широкие каналы имеют более эквивалентное угловое распределение волокон (рис 2E) , которая согласуется с более случайной матрицы.
Важно отметить, что использование микроканалов устройств, в качестве методики для управления организации и ориентации коллагеновых волокон, позволяет для оценки различных клеточных реакций на измененных условиях матрицы. Например, Сунг и др. Установлено, что жизнеспособность молочных желез fibrobasts человека зависит от коллагеновых волокон.15 Кроме того, недавние работы нашей лаборатории показывает , что карциномы молочной железы клетки мигрируют более настойчиво на выровненных коллагеновых волокон по сравнению с случайных матриц коллагена. 3 Эти результаты помогают лучше определить роль микросреды в контексте молочной биологии и рака молочной железы. Перемещение вперед, способность точно контролировать клеточное микроокружение 3D позволит продолжить исследование важных клеточных реакций, в контексте многих различных болезненных состояний.
Рисунок 1. 3D Коллаген Гели для измерительной ячейки сократимость и клеточных реакций на ECM Жесткость. 4T1 клетки высевают в обоих (А) 3,5 мг / мл и (Б) 2 мг / мл коллагена гели и оставляли расти в течение 5 дней. Со временем, коллагеновый гель (область Grayв пределах пунктирной линии) будет сокращаться , а диаметр измеряется и количественно (с, т-тест Стьюдента, столбики ошибок +/- SD). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Генерация случайных и выравниванием Коллаген матрицы Используя PDMS микроканалов. Шесть дюймов кремниевой пластины (а) был использован в качестве шаблона для обеих сторон широкие и узкие PDMS микроканалов (б). Одинаковые концентрации коллагена были сделаны с помощью обоих типов каналов, и отдельные волокна (Наконечники, в, г) совпадают с направлением потока (стрелки) в узких микроканалов (D). Широкие микроканалы дали несколько случайных матриц. волокно УголкиЕ. С. по отношению к нижней части изображения подсчитывали и показано в (е) и (е). Шкала бар = 26 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D гели коллагена являются ценным дополнением к нашей панели инструментов, чтобы понять, как клетки интерпретировать и реагировать на их микроокружения. Эта рукопись предоставила очень простой протокол для встраивания клеток в 3D-матрицу коллагена и воспроизводимо генерировать матрицы со случайными или выровненных коллагеновых волокон. Оба протокола работают, как адаптивные платформы, на которых потенциально могут быть добавлены различные изоформы коллагена, сшиватели, или другие матричные белки во время полимеризации. Это также легко модифицировать платформы для оценки различных временных рамок и конечных точек для экспрессии генов и синтеза белка. Imaging, оценки белка и уровни РНК, и чтение профилей метаболические все очень совместимы с этими 3D методами.
Как важно со всеми методами, важно, чтобы оценить качество геля и анализа. Признак хорошего качества геля коллагена является тот, который может обрабатывать ручного манипулирования. Например, 1 мл [1 мг / мл] Коллагеновый гель вливают в шесть хорошо пластины должны быть легко подобрал с пинцетом и манипулировать ими. Если слезы геля или фрагментов, качество геля является неоптимальным, и шаги должны быть предприняты для улучшения полимеризации коллагена. Температура и рН являются наиболее важными параметрами, необходимые для хорошего формирования волокон и гелеобразования. Начните процесс устранения неполадок, убедившись, что все компоненты не держат на льду до готовности к желатинизации произойти. Кроме того, очень важно, чтобы убедиться, что буфер нейтрализации и коллаген раствор которые тщательно смешивают. Затем убедитесь, что рН буфера нейтрализации при рН 7,4. HEPES забуференного PBS, рекомендуется, так как он очень совместим с культурой ткани, имеет широкий диапазон буферизацию, и маточные растворы, как правило, очень стабилен при 4 ° С в течение длительных периодов времени. Она также имеет дополнительное преимущество производить более длинные, более изогнутые волокна , которые больше похожи на физиологическое состояние 15. NaOH является еще одним Коммоолько использовали нейтрализующим раствором, но должно быть титруют более тесно. Кроме того , по- видимому, иметь эффект получения более короткие, более толстые волокна 15. Независимо от того, рН нейтрализованного коллагена должен быть при рН 7,4. Если все эти условия удовлетворяются, и целостность гелей до сих пор не является удовлетворительным, то проблема заключается в запас раствора коллагена. Хотя запас коллаген раствор имеет перечисленный срок годности 6 месяцев при 4 ° С, мы обнаружили, что это, как правило, короче, чем коммерческие источники утверждают, когда она используется для 3D-гелей. Выбросьте старую бутылку, и заказ от новой партии. Это не является необычным для качества коллагена от производителя значительно варьироваться от партии к партии.
В дополнение к определению качества коллагена гели, также важно, чтобы определить шаги, которые имеют решающее значение для создания хорошего выравнивания внутри микроканала PDMS. Основным принципом этого метода является то, что скорость CollАжен поток через микроканалов впоследствии вызывает выравнивание нити накала. Таким образом, наиболее важным шагом в контроле степени выравнивания волокон собственно модуляция вакуумного давления. Для получения случайного выравнивания коллагена в микроканале, вакуумное давление должно быть низким, и коллаген должен медленно течь вниз по каналу. Если коллаген протекает через слишком быстро, волокна начнут выравнивать. Более широкий канал делает это предложение проще. И наоборот, для хорошего выравнивания коллагена, более высокое давление вакуума необходимо использовать и раствор коллагена должен протягивать через более быстро. Вторым важным шагом в генерации выровненных матриц является температура. Очень важно, чтобы убедиться, что все компоненты и решения охлажденным на льду до использования. Если каналы не охлажденным до использования, коллаген в каналах будет полимеризоваться слишком быстро, и приведет к более тонкими, более мелких волокон. Если нейтрализованы коллагена охлажденным при температуре 4 ° С, а не на льду Enhancред зарождение будет приводить к большим диаметрам волокна, которые труднее выровнять по потоку. Кроме того, важно, чтобы охладить Микроканал себя. Без предварительного охлаждения, малый объем коллагена будет согревать очень быстро приносит плохие результаты.
Коллагеновые микроканалы являются очень полезным методом, но есть определенные ограничения. С одной стороны, выравнивание в микроканале потока индуцированных никогда не является совершенным, и никогда не будет равняться деформационного метод выравнивания. Там всегда будут некоторые волокна, ориентированные перпендикулярно направлению потока, но воспроизводимость, технологичность и простота использования перевешивают небольшие вариации в выравнивании внутри канала. Что еще более важно, клетки , как было показано, эффективно ощущать небольшие изменения в выравнивании, и реагировать с более стойкой миграции в этих каналах 3,15. Клетки также усиливают выравнивание канала, как их число увеличится, и они начинают мигрировать. Если больше выравнивания Iы требуется, микроканалы PDMS могут быть легко изменены, чтобы более узкие размеры или иметь небольшие сужений, чтобы усилить согласованность. Оба , как было показано , чтобы быть эффективными, но есть и другие связанные компромиссы 16. Другим ограничением для техники микроканальной является то, что канал ПДМС имеет небольшую проницаемость для лекарственных средств или флуоресцентные красители. Это означает, что эти соединения должны диффундировать вниз канал из портов, что на удивление медленно, и может создавать трудности в вымывания лечения.
Хотя есть определенные ограничения на эту микроканальным платформе, он предлагает ряд преимуществ по сравнению с существующими методами. Более экспериментально доступной , поскольку она не требует громоздких инструментов 3,13 или небольшие популяции клеток для генерации выравнивания. Он также не требует экзогенных магнитных шариков 13,14 , которые имеют тенденцию быть autofluorescent и может искусственно сшивки коллагена сети. Коллаген микроканалеКроме того, просто экономически более эффективным и экономичным. В дополнение к существующим преимуществам, он также имеет многочисленные преимущества, которые могут быть использованы в будущих приложениях. С одной стороны, коллаген Микроканал могут быть разработаны или изменены практически в любой конфигурации или эксперимента. Дополнительные конструкции позволяют каналы , чтобы создать полые коллагеновые трубки или 3D - структуры , чтобы имитировать архитектуру упрощенных органов или опухолей 22. Кроме того, каналы могут быть изготовлены из других материалов, чем PDMS. Это потенциально может передать различные механические свойства, вложенному коллагеновых сетей или матриц. И наконец, небольшое количество реагентов, используемых в этом анализе, возможно, также делают его привлекательным и экономичным для небольших экранов высокой пропускной способностью.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить номера грантов UO1CA143069, R01CA142833, R01CA114462, RO1CA179556, Т32-AG000213-24 и T32-GM008692-18 для финансирования этой работы. Мы также признаем, Джереми Bredfelt и Yuming Лю локусов для развития и помощи при анализе КТ-FIRE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High Concentration Rat Tail Collagen | Corning | 354249 | |
| SylGard184 elastomer kit | Corning | NC9285739 | Elastomer for PDMS channels |
| HEPES | Fisher | BP310 | For HEPES neutralization buffer |
| KCl | Fisher | BP366 | For HEPES neutralization buffer |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | For HEPES neutralization buffer |
| Na2HPO4 | Fisher | S374 | For HEPES neutralization buffer |
| NaCl | Fisher | BP358 | For HEPES neutralization buffer |
| Levy Improved Neubauer Hemacytometer | Fisher | 15170-208 | cell counting |
| 6-well non-tissue culture plate | Corning | 351146 | |
| 50 mm glass bottom dish | MatTek | P50g-1.5-30-f | |
| Bel-Art Plastic Vacuum Desiccator | Bel-Art | F4200-2021 | Degassing chamber for PDMS |
| transparency film | 3M | pp2950 | Plastic film for pouring pdms channels |
| ThermoScientific CimaRec | ThermoScientific | HP141925 | Hot plate for curing PDMS microchannels |
| Vacuum regulator | Precision Medical | PM3100 | Vacuum regulator for collagen microchannels |
| 8" x 8" rubber sheet | Amazon - Rubber-Cal | Silicone - 60A | rubber sheet for pouring PDMS microchannel |
| 8" x 8" x 0.125" acrylic sheet | Amazon | Plexiglass sheets | for pouring PDMS microchannels |
| 10 lb weights | Amazon | CAP Barbell | for pouring PDMS microchannels |
| 15 ml Conical tubes | Fisher | 352097 | |
| 50 ml Conical tubes | Fisher | 352098 | |
| Plastic pipets | Dot Scientific | 229202B, 229206B, and 667225B | 2 ml, 5 ml, and 25 ml |
| 70% EtOH | Fisher | NC9663244 |
References
- Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. Am J Pathol. 178, 1221-1232 (2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, 38 (2006).
- Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophys J. 107, 2546-2558 (2014).
- Even-Ram, S., Yamada, K. M.
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188, 11-19 (2010).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197, 439-455 (2012).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).
- Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. J Cell Biol. 163, 583-595 (2003).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
- Tlsty, T. D., Coussens, L. M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu Rev Pathol. 1, 119-150 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys J. 95, 5374-5384 (2008).
- Guo, C., Kaufman, L. J. Flow and magnetic field induced collagen alignment. Biomaterials. 28, 1105-1114 (2007).
- Sung, K. E., et al. Control of 3-dimensional collagen matrix polymerization for reproducible human mammary fibroblast cell culture in microfluidic devices. Biomaterials. 30, 4833-4841 (2009).
- Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomed Microdevices. 8, 35-41 (2006).
- Wozniak, M. A., Keely, P. J. Use of three-dimensional collagen gels to study mechanotransduction in T47D breast epithelial cells. Biol Proced Online. 7, 144-161 (2005).
- Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 10, Unit 10 18 (2008).
- Liu, X., Harada, S. DNA isolation from mammalian samples. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 2, Unit 2 14 (2013).
- Roeder, B. A., Kokini, K., Sturgis, J. E., Robinson, J. P., Voytik-Harbin, S. L. Tensile mechanical properties of three-dimensional type I collagen extracellular matrices with varied microstructure. J Biomech Eng. 124, 214-222 (2002).
- Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. J Biomed Opt. 19, 16007 (2014).
- Bischel, L. L., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microfluidic model of ductal carcinoma in situ with 3D, organotypic structure. BMC Cancer. 15, 12 (2015).
