Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

إعداد 3D الهلام الكولاجين وMicrochannels لدراسة التفاعلات 3D Published: May 9, 2016 doi: 10.3791/53989
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 2,3,4, 1,2,5
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 4Morgridge Institute for Research, University of Wisconsin-Madison, 5Paul P. Carbone Comprehensive Cancer center, University of Wisconsin-Madison

Summary

الكولاجين هو العنصر الأساسي للECM، ويوفر منبهات أساسية لعدة عمليات الخلوية التي تتراوح بين الهجرة إلى التمايز والانتشار. المقدمة هنا هو بروتوكول لدمج الخلايا داخل الهلاميات المائية الكولاجين 3D، وتقنية أكثر تقدما لتوليد مصفوفات الكولاجين العشوائية أو الانحياز باستخدام microchannels PDMS.

Protocol

1. تحييد، التخفيف وبلمرة الكولاجين حلول للتحقيق 3D والخلوية تقلص فحوصات

  1. على الجليد في معقم غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة، وتحييد الكولاجين (1: 1) مع معقم، المثلج 100 ملي HEPES في 2X في برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4، في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. تخلط جيدا مع ماصة بلاستيكية حتى الحل هو متجانس والدوامات الاختلاط لم تعد مرئية. يجب الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء أثناء عملية الخلط. تخزين لفترة وجيزة على الجليد.
  2. تمييع الكولاجين تحييد لتركيز مناسب مع وسائل الاعلام الخلية (مثل RPMI، DMEM، وما إلى ذلك).
    1. لحساب كمية الكولاجين تحييد اللازمة لتعويض تركيز الكولاجين المطلوب، استخدم المعادلة N = (D * V) / (S / 2)، حيث N هو كمية الكولاجين تحييد المطلوبة، D هو تركيز الكولاجين المطلوب، والخامس هو الحجم النهائي للتركيز الكولاجين المطلوب، وS هو رانه ابتداء من تركيز الأسهم الكولاجين.
    2. طرح كمية الكولاجين تحييد لحجم بإضافة حل الخلية وسائل الاعلام الخلية. تخلط جيدا وتخزينها على الجليد حتى جاهزة للادلاء.
      1. مثال: ل2 ملغ هلام مل / في حجم هلام 1 مل (حجم نموذجي ليلقي جل في 6 لوحة جيدا أو 50 ملم الزجاج طبق السفلي)، لأول مرة تتضاعف التركيز المطلوب (2 ملغ / مل) من الحجم النهائي المطلوب (1 مل). خذ هذا الرقم (2 ملغ) ونقسمه نصف تركيز الأسهم المدرجة في زجاجة (9.49 ملغ / مل). في هذه الحالة، يتم تخفيفه 0.42 مل من الكولاجين تحييد مع 0.58 مل من وسائل الاعلام / خلية الخليط.
  3. الماصة الكولاجين / خلية / خليط سائل الإعلام الجليد الباردة إلى أي ثقافة غير الأنسجة تعامل وحة 6 جيدا أو 50 ملم الزجاج طبق أسفل. استخدام طرف الماصة لموزعة بالتساوي على الحل.
    ملاحظة: من المهم استخدام ثقافة غير الأنسجة لوحة المعالجة للحد من المرفق أو نمو الخلايا خارج collagأون هلام.
  4. السماح لبلمرة في درجة حرارة الغرفة لحوالي 10-15 دقيقة. يجب أن المواد الهلامية تتحول مبهمة على البلمرة.
  5. بعد أن حولته مبهمة، نقل لوحة أو طبق إلى 37 مئوية لمدة إضافية 45 - 60 دقيقة لإنهاء البلمرة.
  6. بعد 45 - 60 دقيقة، إضافة 2-3 مل من وسائل الاعلام والافراج عن المواد الهلامية من جوانب البئر عن طريق تشغيل طرف P200 الماصة حول محيط البئر أو الطبق. طبق دوامة بلطف للافراج عن هلام. جل الكولاجين يجب أن يتحرك في وسائل الإعلام.

2. الغربية التنشيف، خلية التشكل وجل Gontractility الفحص

  1. لتقييم مستويات البروتين، مورفولوجيا أو انقباض الخلوية فيما يتعلق ECM صلابة، وتبدأ بصب المواد الهلامية الكولاجين، وفقا ل1،1-1،6، المصنف مع الخلايا لمدة 7 - فحص 10 يوم. تحديد كل معدل البذر خط الخلية تجريبيا اعتمادا على معدل النمو وconfluency. لفحص 10 يوما، يمكن للكثافة البذر تتراوح بين 20،000 - 100،000 خلية / هلام.
  2. لقياسانقباض الخلايا، وقياس قطرها هلام باستخدام مسطرة أو كاميرا كل 24 ساعة أو في الفاصل الزمني المناسب.
    ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك، الصور المقابلة التي جمعت من مجهر يمكن فحص للميزات المورفولوجية سمة من خط الخلية المصنف في هلام، مثل هياكل تشبه عنيبات، الأنابيب الظهارية، نتوءات الخلوية، وlameliapodia.
  3. لتقييم مستويات البروتين، ليز المواد الهلامية في المعهد الملكي العازلة وعملية تحليل لطخة غربية من البروتينات ذات الاهتمام كما هو موضح في وزنياك وآخرون. 17 و غالاغر وآخرون. 18.
    1. هام: في مقارنات انقباض بين خطوط الخلايا، وتطبيع انقباض في مجموع الحمض النووي، التي يمكن استخلاصها من المواد الهلامية على النحو المبين من قبل لوي، وآخرون 19، أو إلى لا تتغير، والبروتين التجهيزات المنزلية (الهستونات، GAPDH، الخ) عن طريق ويسترن. تحليل لطخة، كما هو موضح في وزنياك وآخرون. 17 و غالاغر وآخرون. 18. إذا عد الخلايا داخل الجل باستخدام عدادة الكريات، للتأكد من تطبيع عدد الخلايا إلى مجموع مساحة جل مثل هلام التعاقد سوف تركز الخلايا.
  4. المواد الهلامية تغذية كل 3-4 أيام عن طريق إزالة 1 مل من وسائل الإعلام واستبدالها مع 1 مل من وسائل الإعلام الجديدة. تأكد لتغذية المواد الهلامية بعد أخذ قياس كما وبالاضافة الى وسائل الإعلام الجديدة / المصل يؤدي إلى ارتفاع في انقباض.

3. الجيل من PDMS Microchannels لالكولاجين الألياف محاذاة

ملاحظة: لتوليد مصفوفات الكولاجين الانحياز، قالبا للmicrochannels PDMS (الشكل 2A) يتطلب السيليكون سيد SU-8 التي تتم عن طريق لينة الطباعة الحجرية 15.

  1. لجعل قنوات PDMS، مزيج PDMS جيدا في كوب المتاح بعصا الحرفية. للسيد سيليكون 6 بوصة، مزج 20 غراما من قاعدة المطاط الصناعي مع 2 غرام من وكيل علاج.
  2. دي من الغاز الطبيعي في خليط PDMS عن طريق وضع كوب المتاح في فراغ الغرفة تحت ضغط الفراغ550 ملم زئبق. دي الغاز ل1-1،5 ساعة.
  3. في حين دي بالغاز في PDMS، وإعداد سيد السيليكون للصب. إعداد من خلال وضع ورقة نظيفة من فيلم الشفافية على موقد تليها سيد السيليكون. تأكد من أن القالب متناهية يواجه عقوبة تصل.
    ملاحظة: أثناء الصب PDMS والمعالجة، سوف تكون محصورة سيد سيليكون بين ورقتين من فيلم الشفافية.
  4. بعد 1-1،5 ساعة، وإزالة PDMS بالغاز دي من فراغ الغرفة، وببطء أكثر من صب سيد السيليكون.
    هام: تجنب فقاعات الهواء. يواصل صب في مركز الرئيسي، والسماح خطورة لانتشار بالتساوي.
    ملاحظة: انخفاض PDMS لا يحتاج إلى تقديم كل الطريق إلى حافة الرئيسي.
  5. بعد أن تم سكب PDMS على الماجستير، وتطبيق الورقة الثانية من فيلم الشفافية على رأس سيد السيليكون وPDMS. بعناية، ولفة ورقة الشفافية الثانية أسفل على رأس سيد PDMS / سيليكون لتجنب فقاعات الهواء. لا تستعجل. PDMS يجب الآن موزعة بالتساوي سالنسخة الرئيسية.
  6. وضع بلطف ورقة المطاط على أعلى من الشفافية، تليها "الاكريليك ورقة 1/8.
  7. إضافة ثلاثة 10 رطل الأوزان على الجزء العلوي من الاكريليك ورقة. في البداية، سوف الأوزان "تعويم". تسمح لهم لتسوية وتحقيق الاستقرار قبل المضي قدما.
  8. ضبط درجة الحرارة موقد 70 ج وعلاج PDMS لمدة 4 ساعة. السماح لتبرد لمدة لا تقل عن 1 ساعة إضافية قبل إزعاج.
  9. بعناية قشر ورقة أعلى من فيلم الشفافية من الرقاقة، وإزالة القنوات مع ملقط.
  10. متجر في طبق خالية من الغبار حتى جاهزة للاستخدام.

4. الإستعداد PDMS Microchannels للاستخدام

  1. قنوات المكان رأسا على عقب الجديد، فيلم الشفافية نظيفة. نظيف كافة المنافذ (الشكل 2B) باستخدام حركة دائرية مع ملقط حادة. إزالة أي أجزاء من PDMS.
  2. قنوات نظيفة باستخدام قطعة من التعبئة الشريط باعتباره القماش تك. تطبيق الشريط إلى سطح مقاعد البدلاء (الجانب زجة متابعة)، ثم قم بتعيين قناة سن أعلى. اضغط لأسفل على قنوات مع نهاية الجولة من ملقط لضمان اتصالات جيدة. إزالة وتكرار على كلا الجانبين حتى تتم إزالة الحطام وضوحا.
  3. نقل تنظيفها، وهيأهم قنوات PDMS إلى 50 مل المخروطية مع 70٪ ETOH. دوامة في سرعة قصوى تصل لمدة 30 ثانية. تجاهل ETOH واستبدالها مع الطازجة 70٪ ETOH. متجر في 70٪ ETOH حتى جاهزة للاستخدام.
  4. في نسيج الثقافة هود وباستخدام تقنيات العقيم، ونقل قنوات PDMS لغطاء زجاجي نظيف ومعقم أو أطباق أسفل الزجاج. وضع القناة حتى الجانب والأشعة فوق البنفسجية علاج حتى يتبخر ETOH.
  5. الجاف مرة واحدة، والوجه PDMS بحيث تواجه القنوات أسفل نحو ساترة. اضغط على قناة PDMS لأسفل على الزجاج لجعل ختم جيدة. إضافة رقعة من PDMS العقيمة لتغطية / إغلاق المنفذ مركز (منفذ B، الشكل 2B). السماح ليجف تماما قبل المتابعة.
  6. قبل معطف داخل القناة مع 10 ميكروغرام الكولاجين / مل في الماء المعقم. إلى معطف، ضع قطرات 100 ميكرولتر على الجزء العلوي من channايل، ورسم طريق مع فراغ. بعد 1 ساعة على 37 ج، وقنوات نقل مملوءة بمحلول الكولاجين طلاء للثلاجة. البرد لمدة حوالي 15-30 دقيقة.
  7. إزالة الكولاجين حل طلاء مع الشافطة أو الماصة، والبدء في إعداد الكولاجين.

5. إعداد الكولاجين للاستخدام في Microchannels

  1. على الجليد، تحييد الكولاجين (1: 1) مع المثلج 100 ملي HEPES في 2X في برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4. تخلط جيدا حتى متجانسة (لمزيد من التفاصيل، انظر القسم 1.1).
  2. تمييع الكولاجين تحييد لتركيزات مناسبة مع وسائل الإعلام خلية (لمزيد من التفاصيل، انظر القسم 1.2). احتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد.
  3. في نفس الوقت، والبرد شنت القنوات على الجليد.
    ملاحظة: إن الهدف هو أن تكون جميع مكونات العملية القناة عند 4 مئوية أو أقل. الكولاجين درجة الحرارة التنوي والوقت هي المعايير الأساسية لعملية البلمرة، ويمكن أن تكون نقطة انطلاق لمزيد من التحسين، إذا لزم الأمر.
  4. اشعرخلايا تي مع عدادة الكريات و resuspend في مناطق ذات كثافة البذر المناسبة في هذا الوقت. لسهولة الحسابات، و resuspend إلى 1-3٬000٬000 خلية / مل. (لمزيد من التفاصيل، انظر أيضا القسم 2.1).
  5. مرة واحدة وقد تم فرز الخلايا ومرت 15 دقيقة، انتقل إلى الكولاجين صب.

6. صب الانحياز والكولاجين عشوائية Microchannels

  1. قبل الرسم الكولاجين من خلال القنوات، وضبط وتحديد ضغط الفراغ مع منظم فراغ المضمنة. يوفر ضغط فراغ القوة لحمل والسيطرة على معدلات تدفق الكولاجين، الذي يحدد درجة من التوافق.
    1. للمصفوفات عشوائية أو الصغيرة المحايدة، استخدام قناة واسعة (3mm ويوسع x 200 ميكرون طويل القامة) مع الضغط فراغ من 10 ملم زئبق أو أقل.
    2. للمصفوفات الانحياز، استخدام قناة ضيقة (1MM واسعة × 200 ميكرون طويل القامة) مع الضغط فراغ من 60 ملم زئبق أو أكثر.
  2. إزالة قناة شنت من الجليد وضعها على سطح نظيف، مطهرة من تدفق الصفحي حالعود.
  3. العمل بسرعة وتحميل 120-150 ميكرولتر من الكولاجين تحييد بمنفذ ألف (الشكل 2B).
  4. رسم الكولاجين من خلال القناة من خلال وضع 25 مل الماصة تعلق على خط فراغ عبر منفذ ج (الشكل 2B). رسم الكولاجين من خلال في واحد، وحركة موحدة. هام: للمصفوفات عشوائية أو الصغيرة المحايدة، رسم الكولاجين ببطء عبر قناة (حوالي 0،5-1 ملم في الثانية الواحدة)، ووقف مرة واحدة تصل إلى نهاية. للمصفوفات الانحياز، رسم الكولاجين عبر بسرعة أكبر، ولكن الحرص على تجنب فقاعات الهواء.
  5. إزالة بعناية الكولاجين الزائد من منطقة الميناء مع pipetman P200 أو الشافطة.
  6. ضع PDMS بقع معقمة على كل المنافذ الآن يجب أن تكون مشمولة ألف وجيم جميع المنافذ.
  7. بعد 2-3 دقائق، وإزالة مركز PDMS التصحيح (منفذ B) وإضافة 2-3 ميكرولتر من الخلايا (5-10000 الخلايا) في منفذ المركز. السماح لبلمرة جزئيا (إيقاف مبهمة) في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 آخر - 15 دقيقة.
  8. بعد 10- 15 دقيقة، ونقل إلى 37 مئوية لمدة إضافية 15 - 30 دقيقة لإنهاء البلمرة. إزالة أغطية PDMS وإضافة وسائل الإعلام لتغطية تماما الخلايا قناة والثقافة حسب الحاجة. الخلايا ويمكن تغذية عن طريق إزالة مل من وسائل الإعلام القديمة، واستبدالها مل من وسائل الإعلام الجديدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في حين المقايسات 3D يمكن القيام به في نفس صلابة من هلام الكولاجين، وتختلف صلابة هلام يمكن استخدامها لتحديد كيفية الخلايا سترد على التغييرات الميكانيكية في المكروية الخلوية. ويعرف هيدروجيل الكولاجين قاسية كما هلام حيث الخلايا جزءا لا يتجزأ من غير قادرة على التعاقد محليا الكولاجين المحيطة بها. انقباض لا يتجزأ من أنواع مختلفة من الخلايا هي فريدة من نوعها، وبالتالي فمن الأفضل أن تبدأ مع منحنى انقباض بسيط لإنشاء تركيز الكولاجين التي سيتم مست المتوافقة وقاسية.

تبدأ من خلال عقد ثابت أعداد الخلايا وزيادة تركيز جل الكولاجين. فإن صلابة من هلام تحجيم بشكل كبير، مع التركيز، كما هو موضح سابقا 10،20. ويرد مثال ممثل فحص انقباض في الشكل 1. هنا، هي جزء لا يتجزأ 50،000 4T1 الخلايا في eithe را 2 ملغ / مل أو 3.5 ملغ / هلام الكولاجين مل لمدة 5 أيام. خط الخلية 4T1 هو مقلص للغاية، خط السرطان النقيلي، ولكن هي قادرة على التعاقد هلام عالية الكثافة من قبل ما يقرب من 10٪ فقط (الشكل 1A، ج). هذا المستوى المتدني من الانكماش هو الحال بالنسبة للتصنيف هلام قاسية. مقارنة المواد الهلامية منخفض الكثافة (2 ملغ / مل، الشكل 1B، ج) ويتم التعاقد مع 57٪ (ن = 4) خلال نفس الإطار الزمني. من المهم أن نلاحظ أن زيادة كمية يجند الكولاجين يمكن أن تؤثر على خلية مسارات إشارات، وبالتالي وسيلة ثانية لتغيير صلابة هو عقد ثابت تركيز الكولاجين ومقارنة المواد الهلامية التي هي مقيدة (قاسية) من قبل أن تترك تعلق على الجزء السفلي من الطبق أو مقلص (متوافق) لأنهم قد أفرج عنهم لتعويم سعر الصرف في المدى المتوسط ​​الخلية. هذه يمكن أن تكون بمثابة مراقبة جيدة لتحديد ما إذا كانت التغييرات في إشارة الخلوية ناتجة عن زيادة يجند الكولاجين أو صلابة من المصفوفة.

ether.within الصفحات = "1"> بينما المقايسات جل الكولاجين انكماش هي واضحة، وهناك عدد قليل من البنود لتكون على علم عند استخدام هذه الأنواع من المقايسات. لأحد، وتحت ظروف عالية الكثافة فمن المهم التحقق من أن ليس هناك فقدان للبقاء الخلية. وقد لاحظنا أن هناك سقف للتصلب المكروية أن خلية لن تتسامح، ولقد لوحظ زيادة الخلايا أو موت الخلية في بعض خطوط الخلايا، والتي يمكن أن تسبب نتائج لاحقة إلى أن يساء تفسيرها. يجب أن يكون هناك ضياع الكثير من بقاء الخلية بين ظروف ارتفاع وانخفاض صلابة. ويمكن تحديد ذلك قبل الغرب النشاف للنشاط كاسباس أو بعض فحص آخر لقياس بقاء الخلية. ثانيا، والمواد الهلامية الكولاجين ويمكن أيضا أن يتم التعاقد مع أكثر من اللازم وبالتالي خلق بيئة أكثر صرامة، والتقليل من الاختلافات بين ظروف ارتفاع وانخفاض صلابة. نوصي لا تزيد الانقباضات من 60-70٪. لتحقيق أقصى قدر من استنساخ، فمن المهم لتحسين وقتإطار التجربة، الأولى كثافة الخلية البذر، وصلابة من المصفوفة إلى انقباض نوع من الخلايا في الاستخدام.

مرة واحدة ويتحقق التمكن من دمج الخلايا داخل المصفوفات 3D، فحوصات يمكن تعديلها لتغيير التنظيم والتوجيه من ألياف الكولاجين. ويتحقق ذلك من خلال استخدام القنوات ميكروفلويديك PDMS (الشكل 2). لغرض هذه المخطوطة، واستخدمت اثنين من التشكل مماثلة، ضيقة وقناة واسعة، مع 3 فتحات أو منافذ (الشكل 2B). في تجربة نموذجية لتحديد الاستجابة الخلوية لعشوائية مقارنة مع المصفوفات الانحياز، ويوجه الكولاجين unpolymerized من خلال قناة ميكروفلويديك من الميناء إلى الميناء C مع الخلايا التي تضاف إلى ميناء B. درجة المواءمة الكولاجين وعن طريق التضمين معدل الكولاجين تتدفق مثل أن معدلات التدفق العالي الكولاجين تسفر مواءمة أفضل. استخدام القنوات أضيق جانب أعلىضغوط الفراغ من شأنه أن يعزز المواءمة بين شبكة الكولاجين، في حين أن قناة أوسع تستخدم جنبا إلى جنب مع الضغوط فراغ منخفضة يولد المصفوفات عشوائية. تنظيم شبكة ييفي يمكن تصور من قبل الجيل الثاني التوافقي، كما هو مبين في الصور التمثيلية (الشكل 2C، د). في هذه الصور، وألياف الكولاجين (المشار إليها بواسطة رؤوس سهام وpseudocolored في اللون الأرجواني) محاذاة أكثر اتساقا مع محور تدفق الكولاجين في قنوات ضيقة (الشكل 2D). ألياف الكولاجين في قنوات واسعة ومجموعة متنوعة من التوجهات، ولها أكثر عشوائية التوزيع (الشكل 2C).

الفرق بين قنوات واسعة وضيقة هو ملحوظ للعين البشرية، ولكن يمكن أيضا أن تحلل عبر برنامج تم تطويره خصيصا لتحليل الألياف. CT إطلاق النار، مفتوح المصدر والبرمجيات المتاحة بحرية، يستخدم خوارزمية القائم على curvelet لمرحلة ما قبل المعالجة تليهااستخراج خوارزمية الألياف لقياس زاوية الألياف، سمك، طول، واستقامة 21. لكل حالة، وأخذت عينات من أكثر من 500 صورة عشوائيا من مواقع مختلفة داخل القنوات، واستخرجت أكثر من 125،000 الألياف وتحليلها بواسطة CT إطلاق النار. اللاحقة الرسم البياني زاوية الألياف المولدة للقنوات ضيقة (الشكل 2F) يظهر تخصيب اضح من الألياف الموجهة موازية لاتجاه تدفق. في المقابل، قنوات واسعة لديها أكثر يعادل توزيع زاوية الألياف (2E الشكل) وهو ما يتسق مع مصفوفة أكثر عشوائية.

الأهم من ذلك، استخدام أجهزة ميكروفلويديك، كأسلوب للسيطرة على التنظيم والتوجيه من ألياف الكولاجين، ويسمح لتقييم مختلف الاستجابات الخلوية لظروف مصفوفة المتغيرة. على سبيل المثال، سونغ وآخرون. قرر أن بقاء fibrobasts الثديية البشرية تعتمد على الألياف الكولاجين.15 وبالإضافة إلى ذلك، عمل مؤخرا من مختبرنا يدل على أن خلايا سرطان الثدي تهاجر أكثر بإصرار على ألياف الكولاجين الانحياز مقارنة مع المصفوفات الكولاجين عشوائية. 3 هذه النتائج تساعد على تحديد أفضل لدور المكروية في سياق البيولوجيا الثدي وسرطان الثدي. تتحرك إلى الأمام، والقدرة على التحكم بدقة في المكروية الخلوية 3D سيسمح لاستمرار التحقيق في الاستجابات الخلوية مهمة في سياق العديد من الحالات المرضية المختلفة.

الشكل 1
الشكل 1. 3D الهلام الكولاجين لقياس انقباض الخلايا والردود الخليوي الى ECM صلابة. كانت مطلية 4T1 الخلايا في كل من (أ) 3.5 ملغ / مل و (ب) 2 ملغ / مل المواد الهلامية الكولاجين وسمح لتنمو لمدة 5 أيام. مع مرور الوقت، وهلام الكولاجين (منطقة الرماديداخل الخط المنقط) ستتعاقد ويتم قياس القطر وكميا في (ج، طالبة اختبار t، أشرطة الخطأ + SD). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
وقد استخدم الشكل 2. توليد عشوائية والانحياز الكولاجين مصفوفة باستخدام PDMS Microchannels. وهناك ستة بوصة رقاقة السيليكون (أ) كنموذج لPDMS واسعة وضيقة على حد سواء microchannels (ب). ووضعت تركيزات الكولاجين متطابقة من خلال هذين النوعين من القنوات، والألياف الفردية (النصال، ج، د) تتماشى مع اتجاه تدفق (الأسهم) في microchannels الضيقة (د). أسفرت microchannels واسعة مصفوفات أكثر عشوائية. الألياف ANGLاحصي وفاق فيما يتعلق الجزء السفلي من الصورة ويظهر في (ه) و (و). شريط النطاق = 26 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

المواد الهلامية الكولاجين 3D هي إضافة قيمة إلى الأدوات لفهم كيفية تفسير الخلايا والرد على المكروية المحلية. وقد وفرت هذه المخطوطة بروتوكول أساسي جدا لدمج خلايا داخل مصفوفة الكولاجين 3D، وتوليد بتكاثر المصفوفات مع ألياف الكولاجين عشوائية أو الانحياز. كلا البروتوكولين متنقلة كما قابلة للتكيف حيث يحتمل أن يضاف مختلفة الأشكال الإسوية الكولاجين، crosslinkers، أو البروتينات مصفوفة أخرى في وقت البلمرة. كما أنه من السهل لتعديل منصات لتقييم الأطر الزمنية ونقاط النهاية مختلفة للتعبير عن الجينات وإنتاج البروتينات. التصوير، وتقييم بروتين ومستويات الحمض النووي الريبي، وقراءة ملامح التمثيل الغذائي كلها متوافقة جدا مع هذه التقنيات 3D.

كما من المهم مع كل التقنيات، فمن المهم لتقييم جودة جل والفحص. لافتة من هلام نوعية الكولاجين الجيد هو الذي يستطيع التعامل مع التلاعب اليدوي. على سبيل المثال، 1 مل [1 ملغ / مل] هلام الكولاجين تصب لوحة جيدا ستة وينبغي أن ينتبه بسهولة مع ملقط والتلاعب بها. إذا كانت الدموع هلام أو شظايا، ونوعية الجل هي دون المستوى الأمثل، ويجب أن تؤخذ لتحسين بلمرة الكولاجين الخطوات. درجة الحرارة ودرجة الحموضة هي أهم المعايير المطلوبة لتشكيل الألياف الجيدة ودبق. بدء عملية استكشاف الأخطاء وإصلاحها عن طريق التأكد من وتحفظ كل المكونات على الجليد حتى جاهزة للدبق تحدث. بل هو أيضا مهم جدا للتأكد من أن المخزن المؤقت تحييد والكولاجين حل الأوراق المالية يتم خلطها بشكل تام. بعد ذلك، تحقق من أن الرقم الهيدروجيني للالعازلة تحييد هي في درجة الحموضة 7.4. مخزنة وHEPES ينصح PBS لأنه متوافق جدا لزراعة الأنسجة، لديها مجموعة واسعة التخزين المؤقت، والحلول الأسهم تميل إلى أن تكون مستقرة جدا في 4 ج لفترات طويلة من الزمن. كما أن لديها فائدة إضافية تتمثل في إنتاج أطول، والألياف أكثر المنحنية والتي هي أكثر مشابهة لحالة فسيولوجية 15. هيدروكسيد الصوديوم هو commo آخرنلي استخدمت تحييد الحل، لكنه يحتاج إلى titered عن كثب. ويبدو أيضا أن يكون له أثر على انتاج أقصر، والألياف سمكا 15. بغض النظر، يجب أن تكون درجة الحموضة من الكولاجين تحييدها في الرقم الهيدروجيني من 7.4. إذا كان يتم استيفاء جميع الشروط التي وسلامة المواد الهلامية لا تزال غير مرضية، ثم المشكلة تكمن مع محلول المخزون الكولاجين. على الرغم من أن محلول المخزون الكولاجين لديه الصلاحية المدرجة من 6 أشهر في 4 ج، وجدنا أنه من أقصر عموما من تدعي مصادر تجارية عندما تستخدم لالهلام 3D. تجاهل زجاجة القديمة، والنظام من الكثير الجديد. ليس من غير المألوف بالنسبة لنوعية الكولاجين من الشركة المصنعة لتختلف كثيرا عن الكثير الكثير.

بالإضافة إلى تحديد المواد الهلامية نوعية الكولاجين، فمن المهم أيضا تحديد الخطوات التي تعتبر بالغة الأهمية لتوليد محاذاة جيدة داخل متناهية PDMS. والمبدأ الذي تقوم عليه هذه التقنية هو أن معدل كولتدفق آجا من خلال متناهية يدفع في وقت لاحق محاذاة خيوط. ولذلك، فإن الخطوة الأكثر أهمية في السيطرة على درجة من التوافق الألياف هي التشكيل المناسب للضغط الفراغ. لمحاذاة الكولاجين عشوائية في متناهية، يجب أن يكون الضغط فراغ منخفض، والكولاجين يجب أن تتدفق ببطء إلى أسفل القناة. إذا يتدفق الكولاجين من خلال بسرعة كبيرة جدا، وسوف تبدأ الألياف لمحاذاة. قناة أوسع يجعل هذا الاقتراح أسهل. على العكس من ذلك، لمحاذاة الكولاجين جيدة، والضغوط فراغ أعلى يجب أن تستخدم ويجب أن سحبت حل الكولاجين من خلال بسرعة أكبر. والخطوة الثانية الحاسمة في توليد المصفوفات الانحياز هي درجة الحرارة. من المهم جدا للتأكد من فتور جميع المكونات والحلول على الجليد قبل استخدامها. إذا لم يتم فتور القنوات قبل استخدامها، فإن الكولاجين في القنوات تتبلمر بسرعة كبيرة جدا، وسوف يؤدي إلى أرق الألياف، وأصغر. إذا فترت الكولاجين تحييدها في 4 ج وليس على الجليد، وenhancسوف إد التنوي تؤدي إلى أقطار الألياف أكبر والتي هي أكثر صعوبة في محاذاة طريق التدفق. ومن المهم أيضا أن يبرد متناهية نفسها. دون تقشعر لها الأبدان قبل، فإن كمية صغيرة من الكولاجين الحارة بسرعة كبيرة للغاية تعطي نتائج سيئة.

و microchannels الكولاجين هي تقنية مفيدة جدا، ولكن هناك بعض القيود. لأحد، والمحاذاة في متناهية الناجم عن تدفق أبدا الكمال، وسوف تساوي أبدا تقنية الانحياز التي يسببها التوتر. سيكون هناك دائما بعض الألياف الموجهة عمودي على اتجاه تدفق، ولكن استنساخ والقدرة على التكيف، وسهولة الاستخدام تفوق الاختلافات الصغيرة في محاذاة داخل القناة. الأهم من ذلك، وقد ثبت أن الخلايا على الإحساس بفعالية تغييرات صغيرة في محاذاة، والاستجابة مع الهجرة أكثر ثباتا في هذه القنوات 3،15. فإن الخلايا أيضا تعزيز المواءمة بين قناة مع تزايد أعدادهم، وأنها تبدأ في الهجرة. إذا أكبر ط محاذاةق المطلوبة، و microchannels PDMS يمكن تعديلها بسهولة لأبعاد أضيق أو أن يكون التضيق صغيرة لتعزيز التوافق. وقد تبين أن كلا أن تكون فعالة، ولكن لديها الأخرى المرتبطة المقايضات 16. الحد آخر لتقنية متناهية هو أن قناة PDMS لها نفاذية قليلا المخدرات أو الأصباغ الفلورية. وهذا يعني أن هذه المركبات تحتاج لنزع فتيل أسفل القناة من الموانئ، التي هي بطيئة من المستغرب، ويمكن أن تشكل صعوبة في غسل من العلاجات.

بالرغم من وجود بعض القيود على هذه المنصة متناهية، وأنها لا تقدم العديد من المزايا التقنيات الحالية. ومن أكثر تجريبيا للوصول لأنها لا تتطلب أدوات ضخمة 3،13 أو المجموعات الصغيرة من الخلايا لتوليد المحاذاة. كما أنها لا تتطلب حبات مغناطيسية خارجية 13،14 والتي تميل إلى أن تكون autofluorescent ويمكن تشعبي مصطنع شبكة الكولاجين. متناهية الكولاجين هيأيضا ببساطة أكثر واقتصادية فعالة من حيث التكلفة. وبالإضافة إلى المزايا الحالية، كما أن لديها العديد من الفوائد التي يمكن الاستدانة في التطبيقات المستقبلية. لأحد، ومتناهية الكولاجين ويمكن تصميم أو تعديل في أي تكوين أو تجربة تقريبا. تصاميم متقدمة تسمح القنوات لخلق أنابيب الكولاجين جوفاء أو هياكل 3D لتقليد بنية الأجهزة أو أورام 22 مبسطة. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء القنوات من مواد أخرى من PDMS. هذا يحتمل أن ينقل الخواص الميكانيكية المختلفة لشبكات الكولاجين جزءا لا يتجزأ أو المصفوفات. وأخيرا، قد كمية صغيرة من الكواشف المستخدمة لهذا الاختبار أيضا جعلها جذابة واقتصادية للشاشات الصغيرة إنتاجية عالية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما تكشف

Acknowledgments

فإن الكتاب أن نعترف أرقام منحة UO1CA143069، R01CA142833، R01CA114462، RO1CA179556، T32-AG000213-24، وT32-GM008692-18 لتمويل هذا العمل. ونحن نعترف أيضا جيريمي Bredfelt ويو مينغ ليو من المساحات اللازمة للتنمية والمساعدة مع تحليل CT إطلاق النار.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High Concentration Rat Tail Collagen Corning 354249
SylGard184 elastomer kit Corning NC9285739 Elastomer for PDMS channels
HEPES Fisher BP310 For HEPES neutralization buffer
KCl  Fisher BP366 For HEPES neutralization buffer
KH2PO4 Fisher BP362 For HEPES neutralization buffer
Na2HPO4 Fisher S374 For HEPES neutralization buffer
NaCl Fisher BP358 For HEPES neutralization buffer
Levy Improved Neubauer Hemacytometer Fisher 15170-208 cell counting
6-well non-tissue culture plate  Corning 351146
50 mm glass bottom dish MatTek P50g-1.5-30-f
Bel-Art Plastic Vacuum Desiccator Bel-Art F4200-2021 Degassing chamber for PDMS
transparency film  3M pp2950 Plastic film for pouring pdms channels
ThermoScientific CimaRec ThermoScientific  HP141925 Hot plate for curing PDMS microchannels
Vacuum regulator Precision Medical PM3100 Vacuum regulator for collagen microchannels
8" x 8" rubber sheet Amazon - Rubber-Cal Silicone - 60A rubber sheet for pouring PDMS microchannel
8" x 8" x 0.125" acrylic sheet Amazon Plexiglass sheets for pouring PDMS microchannels
10 lb weights Amazon CAP Barbell for pouring PDMS microchannels
15 ml Conical tubes Fisher 352097
50 ml Conical tubes Fisher 352098
Plastic pipets Dot Scientific 229202B, 229206B, and 667225B 2 ml, 5 ml, and 25 ml
70% EtOH Fisher NC9663244

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. Am J Pathol. 178, 1221-1232 (2011).
  2. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, 38 (2006).
  3. Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophys J. 107, 2546-2558 (2014).
  4. Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Curr Opin Cell Biol. 17, 524-532 (2005).
  5. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188, 11-19 (2010).
  6. Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197, 439-455 (2012).
  7. Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).
  8. Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. J Cell Biol. 163, 583-595 (2003).
  9. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
  10. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
  11. Tlsty, T. D., Coussens, L. M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu Rev Pathol. 1, 119-150 (2006).
  12. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
  13. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys J. 95, 5374-5384 (2008).
  14. Guo, C., Kaufman, L. J. Flow and magnetic field induced collagen alignment. Biomaterials. 28, 1105-1114 (2007).
  15. Sung, K. E., et al. Control of 3-dimensional collagen matrix polymerization for reproducible human mammary fibroblast cell culture in microfluidic devices. Biomaterials. 30, 4833-4841 (2009).
  16. Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomed Microdevices. 8, 35-41 (2006).
  17. Wozniak, M. A., Keely, P. J. Use of three-dimensional collagen gels to study mechanotransduction in T47D breast epithelial cells. Biol Proced Online. 7, 144-161 (2005).
  18. Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 10, Unit 10 18 (2008).
  19. Liu, X., Harada, S. DNA isolation from mammalian samples. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 2, Unit 2 14 (2013).
  20. Roeder, B. A., Kokini, K., Sturgis, J. E., Robinson, J. P., Voytik-Harbin, S. L. Tensile mechanical properties of three-dimensional type I collagen extracellular matrices with varied microstructure. J Biomech Eng. 124, 214-222 (2002).
  21. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. J Biomed Opt. 19, 16007 (2014).
  22. Bischel, L. L., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microfluidic model of ductal carcinoma in situ with 3D, organotypic structure. BMC Cancer. 15, 12 (2015).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 111، الكولاجين، وقنوات ميكروفلويديك، المصفوفات 3D، ECM، والمحاذاة الكولاجين، المكروية الورم
إعداد 3D الهلام الكولاجين وMicrochannels لدراسة التفاعلات 3D<em&gt; في فيفو</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Burkel, B., Morris, B. A., Ponik, S. … More

Burkel, B., Morris, B. A., Ponik, S. M., Riching, K. M., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo. J. Vis. Exp. (111), e53989, doi:10.3791/53989 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter