Summary
胶原是细胞外基质的核心组件,并提供必要的暗示了几个细胞过程,从移植到分化和增殖。这里提供了一种用于三维胶原凝胶内嵌入电池的协议,和用于产生使用的PDMS微通道的随机或对齐胶原基质的更先进的技术。
Protocol
1.中和,稀释和3D调查和细胞收缩测定胶原蛋白溶液聚合
- 在无菌组织培养罩冰,中和胶原(1:1)用无菌,冰冷的100mM HEPES在2×PBS中,pH为7.4,在15ml锥形管中。用塑料吸管调匀直至溶液均匀混合漩涡不再可见。要小心,不要在混合过程中引入气泡。简单地存放在冰上。
- 稀释中和胶原蛋白与细胞介质适当浓度(如RPMI,DMEM 等 )。
- 来计算,以弥补所需胶原浓度所需中和胶原蛋白的量,使用等式N =(D * V)/(S / 2),其中N为所需中和胶原蛋白的量,D是所需的胶原浓度,V是所需胶原浓度的最终体积,以及S是叔他首发股票的胶原蛋白浓度。
- 通过加入细胞和细胞培养基溶液的中和胶原的量带来补足体积。调匀并在冰上储存直至准备施法。
- 例如:对于在1ml凝胶体积有2毫克/毫升凝胶(典型体积为在6孔板或50毫米的玻璃底皿的凝胶浇铸)中,首先通过将所需最终体积乘以所希望的浓度(2毫克/毫升) (1毫升)中。借此号码(2毫克)和由瓶列出的原料浓度(9.49毫克/毫升)的一半除以它。在这种情况下,0.42毫升中和胶原蛋白与0.58毫升介质/细胞混合物的稀释。
- 吸管冰冷胶原/细胞/培养基混合物变成一个非组织培养物处理的6孔板或50毫米的玻璃底培养皿中。用枪头均匀摊开的解决方案。
注意:使用非组织培养处理板向细胞的附着或生长减少collag之外是很重要恩凝胶。 - 允许在室温下聚合大约10 - 15分钟。凝胶应当在聚合变成不透明的。
- 它已经变成不透明后,移动板或盘,以37℃额外45 - 60分钟以完成聚合。
- 经过45 - 通过运行以及周围或盘周边P200的枪头从井两侧的3ml媒体和释放凝胶 - 60分钟,加2。漩涡菜轻轻地释放凝胶。胶原凝胶应该在媒体上浮动。
2.免疫印迹,细胞形态和凝胶含量Gontractility
- 评估与蛋白质水平,形态或细胞收缩到ECM刚度,浇胶原凝胶开始,按照1.1 - 1.6,与细胞的接种7 - 10天检测。根据增长率和融合凭经验确定每个细胞系播种量。为10天的试验中,接种密度的范围可以从20,000 - 100,000个细胞/凝胶。
- 测量细胞收缩,通过使用尺子或照相机每24小时或在适当的时间间隔测量的凝胶直径。
注意:另外,从显微镜收集对应的图像可以检查在凝胶接种,如腺泡状结构,上皮小管,蜂窝突起,和lameliapodia细胞系的形态特征的特征。 - 为了评估蛋白质水平,如在沃兹尼亚克等人 17和Gallagher 等人 18所述裂解在RIPA凝胶缓冲液和处理为感兴趣的蛋白质的Western印迹分析。
- 重要信息:在细胞系之间的收缩的比较,正常化收缩到总DNA,其可从凝胶中提取由吕所概述, 等人 19,或到一个不变,管家蛋白(组蛋白,GAPDH 等 )通过Western。印迹分析,如在沃兹尼亚克等人 17和Gallagher 等人所述。18。如果凝胶内的细胞计数使用血球,确保正常化细胞数占总凝胶面积承包凝胶将集中细胞。
- 4天通过除去将1ml培养基并用1ml新鲜培养基更换它 - 每3饲料凝胶。确保测量之后的加入新鲜的媒体/血清会引起收缩穗养活凝胶。
胶原蛋白光纤对准PDMS微通道3代
注:要对齐产生胶原基质,用于PDMS微通道( 图 2A)的模具,需要通过软光刻15取得了SU-8硅主。
- 为了使PDMS通道,彻底的一次性杯具一门手艺棒混合PDMS。对于一个6英寸的硅主人,用2克固化剂混用20克橡胶基地。
- 解气体的PDMS混合物通过的真空压力下放置一次性杯在真空室550毫米汞柱。解气体为1 - 1.5小时。
- 虽然脱气的PDMS,准备硅主浇注。通过将透明胶片丢球到烤盘其次是有机硅主做准备。确保微模具朝上。
注:在PDMS浇铸和固化,硅氧烷主将透明膜的两片之间夹入。 - 后1 - 1.5小时,从真空室取出脱气的PDMS,慢慢倒在硅氧烷主。
重要提示:避免气泡。继续主中心纷至沓来,让重力均匀地传播它。
注:PDMS下降并不需要一直延伸到主的边缘。 - PDMS已经被倾倒在主后,对硅主的PDMS上应用投影胶片的第二片。小心地倒在PDMS /硅胶高手顶部滚动第二透明薄片,以避免产生气泡。不着急。 PDMS应均匀地散布现在Ø版本高手。
- 轻轻地放在透明胶片上的橡胶片,随后通过1/8“丙烯酸系片材。
- 在压克力板顶部添加3个10磅的重量。最初,权重将“浮动”。让他们进一步处理之前解决和稳定。
- 设置加热板的温度至70℃,固化的PDMS 4小时。允许干扰前冷却1小时的额外最低。
- 小心地从晶片剥离透明膜的顶片,并用钳子取出频道。
- 存放在无尘的菜,直到准备使用。
4. PDMS预学习的微通道使用
- 地方频道上新的,干净的透明胶片倒挂。清洁所有端 口( 图2b),使用打圈用锋利的钳子。删除PDMS中的任何片段。
- 清洁通道使用了一块打包带作为钉布。将胶带粘工作台表面(粘面朝上),然后设置通道0■首页。向下按压钳的圆端渠道,以确保良好的接触。删除,直到可见的碎屑被去除两侧重复。
- 转移清洗,坦然PDMS渠道到50毫升锥形用70%乙醇。在涡旋30秒的最大速度。丢弃EtOH中并用新鲜的70%乙醇取代。储存在70%乙醇中待用。
- 在组织培养罩,并使用无菌技术,传输PDMS渠道,一个洁净无菌盖玻璃或玻璃底菜。把通道侧和紫外线治疗,直到乙醇蒸发。
- 干燥后,翻转PDMS所以渠道都面临着向下延伸玻璃罩。按PDMS通道下放到玻璃板做一个良好的密封。添加无菌的PDMS覆盖的贴剂/关闭中心端口(端口B, 图2b)。允许继续之前彻底干燥。
- 预涂层用无菌水10微克/毫升的胶原蛋白的信道的内侧。大衣,放置一个100微升滴在陈荫罴顶部埃尔,并用真空抽吸通过。后在37℃1小时,填充有胶原涂层溶液的冰箱传输通道。冷藏约15 - 30分钟。
- 用吸气器或吸移管除去胶原涂布溶液,并开始胶原制备。
5.胶原使用准备在微通道
- 在冰上,中和胶原(1:1)用冰冷的100mM HEPES在2×PBS中,pH值7.4。彻底混合直到均匀(有关详细信息,请参见1.1节)。
- 稀释中和胶原蛋白的适当浓度与细胞介质(有关详细信息,请参见1.2节)。孵育在冰上15分钟。
- 同时,冷冻装在冰频道。
注意:我们的目标是对信道过程中的所有成分,在4℃或以下。胶原的成核温度和时间是到聚合过程中的关键参数,并且可以是用于进一步优化的起始点,如果需要的话。 - COUNT细胞与在此时间适当接种密度血球和重悬。为了便于计算,悬浮于1 - 3百万个细胞/毫升。 (更多详情,见第2.1节)。
- 一旦细胞已被计算在内,15分钟过去了,进行胶原蛋白涌出。
6.浇筑对齐和随机胶原蛋白微通道
- 通过渠道绘图胶原蛋白之前,调整和设定真空压力内嵌真空调节器。真空压力提供了诱导和控制胶原的流速,它决定对准程度的力。
- 随机或不对齐的矩阵,可以使用一个宽的通道(3毫米宽×200微米高)用10毫米汞柱或更低的真空压力。
- 对于排列矩阵,使用60毫米汞柱或更高的真空压力狭窄的通道(宽1mm×200微米高)。
- 从冰中取出安装通道和放置在层流H型清洁,消毒面洪水。
- 迅速开展工作,并装载120 - 150微升中和胶原蛋白的成A口( 图2b)。
- 通过将25毫升移液管连接到真空管线以上端c( 图2b)绘制通过通道胶原。通过在一个单一的,统一运动画胶原。重要信息:对于随机或对齐矩阵,得出胶原慢慢地穿过通道(约0.5 - 每秒1毫米),并停止一旦它到达终点。对于排列矩阵,得出整个胶原蛋白更快速,但是要注意避免产生气泡。
- 小心地从P200的Pipetman或吸气港口区域去除多余的胶原蛋白。
- 将无菌PDMS补丁在两个端口A和C.所有端口现在应该覆盖。
- 经过2 - 3分钟,取出中心PDMS补丁(B口),并添加2 - 3微升细胞(5 - - 10个细胞)进入中心端口。允许部分聚合(转不透明)在室温下再10 - 15分钟。
- 10后- 15分钟后,转移至37℃另外15 - 30分钟以完成聚合。除去PDMS盖和介质添加根据需要完全覆盖通道和培养的细胞。细胞可以通过除去一个毫升旧媒体的,并用一个毫升新媒体代替它送入。
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Representative Results
而三维测定可以胶原凝胶的相同的刚度中完成,改变凝胶硬度可以用来确定细胞将如何在它们的细胞微环境的机械变化。僵硬胶原凝胶被定义为凝胶,其中嵌入的细胞不能在本地收缩周边的胶原蛋白。不同细胞类型的固有收缩是唯一的,并且因此最好是开始用一个简单的收缩曲线建立将被感测为标准,僵硬的胶原浓度。
通过保持细胞数量恒定,增加胶原蛋白凝胶的浓度开始。凝胶的刚性将与浓度呈指数扩展,如前面10,20所示。一个收缩测定的代表性例子示于图1。在这里,5 4T1细胞嵌入eithe岭2毫克/毫升或5天3.5毫克/毫升的胶原凝胶。的4T1细胞系是高度收缩,转移性癌症线,但仅能够由大约10%至收缩高密度凝胶( 图1a中的C)。这种低收缩的水平是典型的刚性凝胶分类。可比低密度凝胶(2毫克/毫升, 图1b,c)的同一时间帧期间收缩57%(N = 4)。要注意的是增加胶原配体的量可影响细胞信号传导途径,因此第二装置来改变刚度保持胶原浓度恒定并通过被留下附着于底部比较被抑制凝胶(硬)是非常重要的菜或者是因为他们已经发布在细胞培养基中自由浮动收缩(标准)。这可以作为一个良好的控制,以确定在细胞信号的变化是否从增加的胶原配位体或基体的硬度的结果。
一旦三维基质内包埋细胞的掌握实现,测定可以进行修改,以改变该胶原纤维的组织和取向。这是通过使用PDMS微流体通道( 图2)实现的。对于本手稿的目的,两个类似的构象被使用,窄和宽通道,带3的开口或端口( 图2b)。在典型的实验,以确定相对于对准矩阵随机的细胞反应,未聚合的胶原是通过微流体通道绘制从端口A到端口C的与被添加到端口B细胞胶原取向的程度是通过胶原的速率调制流,使得较高的胶原蛋白的流速产生更好的调整。使用较窄的通道加上较高真空压力增强了胶原网络的取向,同时配合使用与低真空压力下更宽的通道产生随机矩阵。纤维状网络的组织可以通过二次谐波产生可视化,如图代表性图像( 图2c,d)所示 。在这些图像中,胶原纤维(由箭头表示,并且在紫色伪彩色)与在窄通道( 图2d)胶原流的轴线对齐更一致。在宽的信道的胶原纤维具有多种取向,并具有更多的随机分布( 图2c)。
宽和窄的通道之间的差异是可以辨认的人的眼睛,但也可以通过专门为纤维分析开发的软件进行分析。 CT-火灾,开源和免费的软件,采用了预处理其次是基于曲波算法纤维提取算法量化纤维角度,厚度,长度和直线21。对于每个条件,超过500张图像,随机从通道内的不同位置取样,提取并分析超过125000纤维经CT-FIRE。为狭窄的通道( 图2F)中产生的随后的纤维角度柱状图示出平行于流动的方向取向的纤维的清晰富集。与此相反,宽信道具有更多的等效纤维角度分布( 图2e),这是一个更随机矩阵一致。
重要的是,使用微流体装置的,作为一种技术,以控制组织和胶原纤维的取向,允许对改变的矩阵条件的各种细胞应答的评估。例如,宋等人 。确定人类乳腺fibrobasts的可行性取决于胶原纤维。15此外,最近从我们的实验室工作表明,乳腺癌细胞相比随机胶原基质更持久地迁移对齐的胶原纤维。3这些结果有助于更好地确定微环境的乳腺生物学和乳腺癌的范围内的作用。向前移动,以精确地控制在3D细胞微环境将允许许多不同的疾病状态的范围内的重要的细胞响应继续调查的能力。
图1. 3D胶原凝胶为细胞收缩和细胞反应测量到ECM刚度。在这两个接种4T1细胞 ( 一 )3.5毫克/毫升和 (b)第 2毫克/毫升胶原凝胶并使其生长5天。随着时间的推移,胶原凝胶(灰色区虚线内)将收缩,直径测量和量化(C,学生t检验,误差棒+/- SD)。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.产生随机和对准胶原基质使用的PDMS微通道。一个六英寸硅晶片( 一 )作为两个宽和窄的PDMS微通道(b)一种模板。相同胶原浓度通过这两种类型的信道的拉伸,和单个纤维(箭头,C,D)与流动方向对齐(箭头)中窄微通道 ( 四 )。微通道宽更产生随机矩阵。光纤ANGL相对于图象的底部,ES进行计数,(e)中和(f)示出。比例尺= 26微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
3D胶原凝胶是一种宝贵的除了我们的工具箱,了解细胞如何解释和自己的局部微环境作出反应。该原稿提供了一个非常基本的协议用于3D胶原基质中嵌入的细胞,并重复地生成具有随机的或排列的胶原纤维基质。两个协议工作作为适应的平台,其中不同的胶原蛋白同种型,交联剂,或其它基质蛋白可能在聚合时加入。这也很容易修改的平台,以评估基因表达和蛋白生产不同的时段和端点。成像,评估蛋白质和RNA水平,以及阅读代谢特征都与这些3D技术非常兼容。
如同所有的技术很重要,重要的是评估凝胶和测定的质量是很重要的。质量好的胶原凝胶的标志是一个可以处理手动操作。例如,一个1毫升的[1毫克/毫升]胶原凝胶倒入一个六孔板应该很容易拿起一个镊子和操纵。如果凝胶眼泪或片段,凝胶的质量是次优的,和步骤需要采取提高胶原聚合。温度和pH值是良好的纤维形成和凝胶化所需的最重要的参数。首先确保所有组件都保持在冰上直至准备发生胶凝故障排除过程。这也是非常重要的,以确保中和缓冲液和胶原原液被充分混合。接下来,验证中和缓冲液的pH为pH 7.4。一个HEPES缓冲建议的PBS,因为它是对组织培养非常相容,具有广泛的缓冲范围,而储备溶液倾向于在4℃非常稳定长时间。它也有产生更长,更弯曲纤维,更类似于生理状态15的额外的好处。氢氧化钠是另一种的commo唯一一句用过中和溶液,但需要更紧密地滴定。这似乎也具有产生更短,更厚的纤维15的效果。无论如何,中和胶原的pH应当在pH 7.4。如果正在满足所有这些条件,以及凝胶的完整性仍不理想,那么问题在于股票胶原溶液。虽然库存胶原溶液具有在4℃6个月上市的保质期,我们已经发现,这是用于3D凝胶时比商业来源如权利要求一般较短。摒弃旧的瓶子,并从一个新的订单很多。这是不寻常的胶原蛋白从制造商的质量显著有所不同批次。
除了确定质量胶原凝胶,它也很重要,以确定是用于PDMS微通道内产生良好对准的关键步骤。这种技术的基本原理是,COLL的速率阿让流过所述微通道随后诱导长丝取向。因此,在控制纤维取向的程度最关键的步骤是在真空压力的适当的调制。一种用于在微通道随机胶原对准,真空压力必须低,并且胶原必须慢慢流下的通道。如果胶原流经过快,纤维将开始对齐。更宽的通道,使这一主张更容易。相反,对于好的胶原对准,必须使用更高的真空压力和胶原溶液必须通过更迅速地被拉出。在对准矩阵的生成的第二关键步骤是温度。以确保所有组件和解决方案是在使用前冰冷却是很重要的。如果频道没有被使用之前冷却,在通道中的胶原蛋白会聚合太快,并会导致更薄,更小的纤维。如果中和胶原在4℃冷却,而不是在冰中,enhanc编成核会引起较大的纤维直径而更难以由流动对齐。同样重要的是,以冷却所述微通道本身。没有事先心寒,胶原蛋白的小体积会热情很快产生效果差。
胶原微通道是一个非常有用的技术,但也有一定的局限性。为一体,在一个流动引起的微通道中的取向是从不完美的,绝不等于一个应变诱导取向的技术。总会有一些垂直于流动的方向取向的纤维,但可再现性,适应性和易用性大于小变化在对准通道内。更重要的是,细胞已被证明能有效检测在对准的微小变化,并且在这些通道3,15更持久的迁移反应。该细胞也将提高信道的取向为它们的数量增加,并且他们开始迁移。如果更大对准我s ^需要,PDMS微通道可以很容易地修改,以更窄的尺寸或有小的收缩,以提高对齐。两者都被证明是有效的,但具有其它相关的权衡16。另一个限制到微通道技术是与PDMS通道具有小的渗透性药物或荧光染料。这意味着这些化合物需要扩散向下从端口,这是令人惊讶的缓慢的信道,并且可以构成在洗出处理的困难。
虽然有一定的限制,以这个微通道的平台,它确实提供优于现有技术的几个优点。它是更实验获得,因为它不需要笨重仪器3,13或细胞用于产生对准的小种群。它也不需要外生磁珠13,14这往往是自体荧光和可能人为地交联的胶原蛋白网络。胶原微通道也简单地更具成本效益和经济。除了当前的优点,它也有可能在将来的应用中利用许多好处。为一体,在胶原微通道可设计或在几乎任何配置或实验修改。先进的设计允许信道来创建中空胶原管或三维结构,以模仿简化器官或肿瘤22的体系结构。此外,该信道可以由比PDMS等材料。这种潜在可能传达不同的机械性能,以嵌入胶原网络或基质。最后,用于该测定的试剂的量小也可能使较小的高通量筛选吸引力和经济。
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Disclosures
作者什么都没有透露
Acknowledgments
笔者想感谢资助号UO1CA143069,R01CA142833,R01CA114462,RO1CA179556,T32-AG000213-24和T32-GM008692-18资助这项工作。我们也承认位点杰里米Bredfelt和玉明刘为发展和协助与CT-FIRE分析。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
High Concentration Rat Tail Collagen | Corning | 354249 | |
SylGard184 elastomer kit | Corning | NC9285739 | Elastomer for PDMS channels |
HEPES | Fisher | BP310 | For HEPES neutralization buffer |
KCl | Fisher | BP366 | For HEPES neutralization buffer |
KH2PO4 | Fisher | BP362 | For HEPES neutralization buffer |
Na2HPO4 | Fisher | S374 | For HEPES neutralization buffer |
NaCl | Fisher | BP358 | For HEPES neutralization buffer |
Levy Improved Neubauer Hemacytometer | Fisher | 15170-208 | cell counting |
6-well non-tissue culture plate | Corning | 351146 | |
50 mm glass bottom dish | MatTek | P50g-1.5-30-f | |
Bel-Art Plastic Vacuum Desiccator | Bel-Art | F4200-2021 | Degassing chamber for PDMS |
transparency film | 3M | pp2950 | Plastic film for pouring pdms channels |
ThermoScientific CimaRec | ThermoScientific | HP141925 | Hot plate for curing PDMS microchannels |
Vacuum regulator | Precision Medical | PM3100 | Vacuum regulator for collagen microchannels |
8" x 8" rubber sheet | Amazon - Rubber-Cal | Silicone - 60A | rubber sheet for pouring PDMS microchannel |
8" x 8" x 0.125" acrylic sheet | Amazon | Plexiglass sheets | for pouring PDMS microchannels |
10 lb weights | Amazon | CAP Barbell | for pouring PDMS microchannels |
15 ml Conical tubes | Fisher | 352097 | |
50 ml Conical tubes | Fisher | 352098 | |
Plastic pipets | Dot Scientific | 229202B, 229206B, and 667225B | 2 ml, 5 ml, and 25 ml |
70% EtOH | Fisher | NC9663244 |
References
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