Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הכנת ג'לי 3D קולגן microchannels לחקר אינטראקציות 3D Published: May 9, 2016 doi: 10.3791/53989
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 2,3,4, 1,2,5
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 4Morgridge Institute for Research, University of Wisconsin-Madison, 5Paul P. Carbone Comprehensive Cancer center, University of Wisconsin-Madison

Summary

קולגן הוא רכיב ליבה של ECM, ומספק רמזים חיוניים מספר תהליכים תאיים החל הגירת בידול ושגשוגם. הניתן כאן הוא פרוטוקול להטבעת תאים בתוך הידרוג קולגן 3D, טכניקה מתקדמת יותר ליצירת מטריצות קולגן אקראי או מיושר באמצעות microchannels PDMS.

Protocol

1. נטרול, דילול פלמור של פתרונות קולגן לחקירת 3D מבחני התכווצות סלולארית

  1. על הקרח ברדס רקמה סטרילית תרבות, לנטרל קולגן (1: 1) עם 100 HEPES מ"מ סטרילי, קר כקרח PBS 2x, pH 7.4, צינור חרוטי 15 מ"ל. מערבבים היטב עם פיפטה פלסטיק עד הפתרון הוא הומוגני מערבולות ערבוב אינן גלויות. היזהר לא להכניס בועות אוויר במהלך תהליך הערבוב. אחסן בקצרה על קרח.
  2. לדלל קולגן מנוטרל לריכוז המתאים עם התקשורת תא (כגון RPMI, DMEM, וכו ').
    1. כדי לחשב את כמות הקולגן לנטרל נדרש לפצות ריכוז הקולגן הרצוי, השתמש המשוואה N = (D * V) / (S / 2), כאשר N הוא כמות הקולגן לנטרל נדרש, D הוא ריכוז הקולגן הרצוי, V הוא הנפח הסופי של ריכוז הקולגן הרצוי, ו- S הוא tהוא החל ריכוז קולגן המניות.
    2. להעלות את כמות הקולגן לנטרל עד נפח על ידי התוספת של פתרון תקשורת תא ותא. מערבבים היטב ולאחסן על הקרח עד ומוכן להעברה.
      1. דוגמה: עבור ג'ל 2 מ"ג / מ"ל ​​בנפח ג'ל 1 מ"ל (נפח אופייני בגבס ג'ל בצלחת 6 היטב או 50 צלחת מ"מ זכוכית התחתונה), הראשון להכפיל את הריכוז הרצוי (2 מ"ג / מ"ל) על פי היקף הסופי הרצוי (1 מ"ל). קח את המספר הזה (2 מ"ג) ולחלק אותו בחצי של ריכוז המניות הרשומים על הבקבוק (9.49 מ"ג / מ"ל). במקרה זה, 0.42 מ"ל של קולגן לנטרל מדולל 0.58 מ"ל של תערובת מדיה / תא.
  3. Pipet קולגן / תא קר כקרח / מדיה התערובת לתוך או תרבות שאינם רקמות שטופלו 6-גם צלחת או צלחת תחתית זכוכית 50 מ"מ. השתמש טיפ pipet להתפזר הפתרון באופן שווה.
    הערה: חשוב להשתמש לתרבות הלא-רקמות שטופלו צלחת כדי למזער את הקובץ המצורף או צמיחה של תאים מחוץ collagen ג'ל.
  4. אפשר לפלמר בטמפרטורת החדר למשך כ 10 - 15 דקות. הג'לים צריכים לפנות אטומים על פילמור.
  5. אחרי זה הפך אטום, להעביר צלחת או צלחת ל -37 צלזיוס למשך נוספות 45 - דקות 60 כדי לסיים פילמור.
  6. אחרי 45 - 60 דקות, להוסיף 2 - 3 מ"ל של התקשורת ולשחרר ג'לים מן הצדדים של הבאר-ידי הפעלת טיפ p200 pipet סביב ההיקף של טוב או צלחת. צלחת מערבולת בעדינות כדי לשחרר את הג'ל. ג'ל קולגן צריך להיות צף בתקשורת.

2. המערבי סופג, תא המורפוגנזה וג'ל Gontractility Assay

  1. כדי להעריך את רמות החלבון, מורפולוגיה או התכווצות הסלולר ביחס ECM נוקשות, להתחיל לשפוך ג'ל קולגן, על פי ל -1.1 - 1.6, זורעים עם תאים עבור 7 - assay יום 10. לקבוע כל שיעור זריעת תאי קו בהתאם אמפירי על שיעור צמיחה ואת confluency. עבור assay 10 יום, צפיפות הזריעה יכולה לנוע בין 20,000 - 100,000 תאים / ג'ל.
  2. כדי למדודהתכווצות תא, למדוד את קוטר ג'ל באמצעות סרגל או מצלמה כל 24 שעות או על מרווח הזמן המתאים.
    הערה: בנוסף, תמונות מקבילות שנאספו מיקרוסקופ ניתן לבדוק עבור מאפיין תכונות מורפולוגיות של הקו הסלולרי זורע בתוך הג'ל, כגון מבני acini דמוי, tubules אפיתל, בליטות הסלולר, lameliapodia.
  3. כדי להעריך את רמות החלבון, lyse הג'לים ב Ripa חיץ תהליך לניתוח כתם המערבי של חלבונים בעלי עניין כמתואר ווזניאק et al. 17 ו גלאגר et al. 18.
    1. חשוב: השוואות של התכווצות בין שורות תאים, לנרמל contractility ל- DNA הכולל, אשר יכול להיות מופק הג'לים כפי שתואר על ידי לואי, et al 19, או לחלבון משתנה, משק בית (היסטונים, GAPDH, וכו ') על ידי המערב. ניתוח כתם, כמתואר ווזניאק et al. 17 ו גלאגר et al. 18. אם תאים לספור בתוך הג'ל באמצעות hemocytometer, לוודא לנרמל מספר הסלולרי לאזור ג'ל ליום הג'ל קבלנות יתרכז תאים.
  4. ג'לים Feed כל 3 - 4 ימים על ידי הסרת 1 מיליליטר של תקשורת והחלפתו 1 מיליליטר של תקשורת הטריה. הקפד להאכיל ג'לים אחרי המדידה נלקחת כמו תוספת של / סרום התקשורת טרי תגרום לעליה חדה במספר התכווצות.

דור 3. PDMS microchannels עבור יישור סיבי קולגן

הערה: כדי ליצור מטריצות קולגן מיושר, תבנית עבור microchannels PDMS (איור 2 א) דורש מאסטר סיליקון SU-8 עשה דרך-ליתוגרפיה רך 15.

  1. כדי להפוך ערוצי PDMS, לערבב PDMS ביסודיות בכוס חד פעמית עם מקל מלאכה. לקבלת מאסטר סיליקון 6 אינץ ', לערבב 20 גרם של בסיס אלסטומר עם 2 גרם של סוכן ריפוי.
  2. דה-גז התערובת PDMS על ידי הנחת כוס חד פעמי בתא ואקום בלחץ ואקום של550 מ"מ כספית. דה-גז 1 - 1.5 שעות.
  3. בעוד דה-בגז את PDMS, להכין את המאסטר סיליקון למילוי. הכן ידי הצבת סדין נקי של סרט שקיפות על פלטה חמה ואחריו אדון סיליקון. ודא כי עובש microchannel פונה כלפי מעלה.
    הערה: במהלך ליהוק PDMS וריפוי, המאסטר סיליקון יהיה דחוק בין שתי יריעות של סרט שקיפות.
  4. לאחר ה -1 - 1.5 שעות, להסיר את PDMS בגז דה מהאולם ואקום, ולאט לאט ויוצקים מעל את המאסטר סיליקון.
    חשוב: הימנע בועות אוויר. ממשיכים לזרום במרכז הורים, ולאפשר את כוח המשיכה כדי להפיץ אותו באופן שווה.
    הערה: ירידת PDMS לא צריכה להאריך את כל הדרך עד לקצה של המאסטר.
  5. לאחר PDMS כבר שפכו על המאסטר, להחיל גיליון שני של סרט שקיפות על גבי אדון סיליקון PDMS. בזהירות, לגלגל את גיליון שקיפות השני למטה על גבי האדון PDMS / סיליקון כדי למנוע בועות אוויר. אל תמהר. PDMS יש עכשיו להתפשט באופן שווה oמאסטר Ver.
  6. בעדינות להניח סדין גומי על גבי שקיפות, ואחריו גיליון 1/8 "אקריליק.
  7. מוסיפים שלוש 10 lb משקולות על גבי גיליון אקריליק. בתחילה, המשקולות תהיינה "לצוף". לאפשר להם להתיישב ולייצב לפני שתמשיך.
  8. גדר טמפרטורת פלטה חשמלית ל -70 PDMS C ו- מרפא 4 שעות. אפשר להתקרר במשך מינימום של 1 hr נוסף לפני מטריד.
  9. בזהירות לקלף גיליון העליון של שקף מן הרקיק, ולהסיר את הערוצים עם מלקחיים.
  10. חנות בצלחת ללא אבק עד מוכן לשימוש.

4. הכנות PDMS microchannels לשימוש

  1. ערוצי מקום במהופך על שקפים חדשים, נקיים. יציאות כל נקי (איור 2b) באמצעות תנועה מעגלית עם מלקחיים חדים. הסר את כל שברי PDMS.
  2. ערוצים נקיים באמצעות פיסת אריזת קלטת כמו מטלית טקטיקה. החל קלטת השטח של הספסל (הצד הדביק כלפי מעלה), ולאחר מכן להגדיר o ערוץהעליון n. לחץ כלפי מטה על ערוצים עם קצה מעוגל של מלקחיים כדי להבטיח מגע טוב. סור וחזור משני הצדדים עד פסולת גלויה מוסר.
  3. העברת ניקה, הכינו ערוצי PDMS לתוך חרוטי 50 מ"ל עם 70% EtOH. וורטקס במהירות מרבית למשך 30 שניות. בטל EtOH ולהחליף EtOH 70% טרי. חנות ב 70% EtOH עד מוכן לשימוש.
  4. במנדף בתרבית רקמה ושימוש בטכניקות ספטית, להעביר את ערוצי PDMS לכוס או מכסה זכוכית נקי וסטרילי מנות תחתית. שים את הפינוק מעלה UV צד בערוץ עד EtOH התאדה.
  5. לאחר יבש, להעיף את PDMS כך הערוצים הם פונים כלפי מטה לכיוון coverglass. לחץ על PDMS הערוץ כלפי מטה על הזכוכית כדי להפוך את חותם טוב. הוספת תיקון של PDMS סטרילי כדי לכסות / לסגור את הנמל למרכז (נמל B, איור 2b). ולאפשר לו להתייבש ביסודיות לפני שתמשיך.
  6. טרום המעיל הפנימי של הערוץ עם קולגן 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​מים סטריליים. כדי מעיל, למקם טיפה 100 μl על החלק העליון של channאל, ולצייר דרך עם ואקום. אחרי השעה 1 ב 37 C, ערוצי העברה מלאים פתרון ציפוי קולגן כדי מקרר. צ'יל למשך כ 15 - 30 דקות.
  7. הסר פתרון ציפוי קולגן עם aspirator או pipet, ולהתחיל הכנה קולגן.

5. הכנת קולגן לשימוש ב microchannels

  1. על קרח, לנטרל קולגן (1: 1) עם 100 קר כקרח HEPES מ"מ ב 2x PBS, pH 7.4. מערבבים היטב עד הומוגנית (לפרטים נוספים, ראה סעיף 1.1).
  2. לדלל קולגן מנוטרל על הריכוזים המתאימים עם תקשורת תא (לפרטים נוספים, ראה סעיף 1.2). דגירה במשך 15 דקות על קרח.
  3. במקביל, צמרמורת רכוב ערוצים על קרח.
    הערה: המטרה היא לקבל את כל הרכיבים הדרושים לתהליך ערוץ ב 4 C או מתחת. הטמפרטורה וזמן קולגן התגרענות כמה פרמטרים עיקריים לתהליך פילמור, ועלולה להיות נקודת ההתחלה עבור אופטימיזציה נוספת, במידת הצורך.
  4. counתאי T עם hemacytometer ו resuspend על צפיפות הזריעה המתאימה בשלב זה. על מנת להקל על חישובים, resuspend ל 3 - 1 מיליון תאים / מ"ל. (לפרטים נוספים, ראה גם סעיף 2.1).
  5. לאחר תאים נספרו ו -15 דקות עברו, המשך קולגן לשפוך.

6. לשפוך בציר microchannels אקראי קולגן

  1. לפני ציור קולגן בצינורות, להתאים ולהגדיר לחץ ואקום עם רגולטור ואקום מוטבע. לחץ אבק מספק כוח כדי לעודד ו לשלוט על קצב זרימת קולגן, אשר קובע את מידת יישור.
    1. עבור מטריצות אקראיות או unaligned, משתמש בערוץ רחב (x הרחב 3mm 200 מיקרומטר גבוה) עם לחץ ואקום של 10 מ"מימ כספיים או פחות.
    2. עבור מטריצות מיושרות, השתמש תעלה צר (1 מ"מ רחב x 200 מיקרומטר גבוה) עם לחץ ואקום של 60 מ"מ כספי או יותר.
  2. הסר ערוץ רכוב מקרח ומניחים על משטח נקי, מחוטא של h זרימה למינריתood.
  3. לעבוד במהירות לטעון 120 - 150 μl של קולגן לנטרל ליציאה (איור 2b).
  4. צייר קולגן דרך הערוץ על ידי הצבת 25 מ"ל pipet המצורפת קו ואקום מעל ג הנמל (איור 2b). צייר קולגן באמצעות בתנועה אחידה. חשוב: לקבלת מטריצות אקראיות או unaligned, לצייר קולגן לאט ברחבי הערוץ (כ 0.5 - 1 מ"מ לשנייה), ולהפסיק ברגע שהוא מגיע בסופו של דבר. עבור מטריצות מיושרות, לצייר את הקולגן ברחבי במהירות רבה יותר, אך היזהר כדי למנוע בועות אוויר.
  5. מוציאים בזהירות קולגן עודף מאזור הנמל עם pipetman או aspirator p200.
  6. מניח טלאי PDMS סטרילית על שני יציאות A ו- C. כל היציאות צריכות להיות מכוסות כעת.
  7. לאחר 2 - 3 דקות, להסיר תיקון מרכז PDMS (B port) ולהוסיף 3 - 2 μl של תאים (5 - 10 אלף תאים) ליציאת המרכז. אפשר לפלמר חלקית (להפוך אטום) בטמפרטורת החדר למשך עוד 10 - 15 דקות.
  8. אחרי 10- 15 דק ', העברה ל -37 צלזיוס למשך 15 נוספות - 30 דקות כדי לסיים פילמור. סר מכסה PDMS ולהוסיף תקשורת לכסות את תרבות תאי ערוץ לחלוטין לפי צורך. תאים יכולים להיות מוזן על ידי הסרת מ"ל של המדיה הישנה, ​​והחלפתו עם מ"ל של המדיה החדשה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעוד מבחני 3D ניתן לעשות זאת בתוך אותה הנוקשות של ג'ל קולגן, שינוי הקשיח ג'ל ניתן להשתמש כדי לקבוע כיצד התאים יגיבו לשינויים מכאניים microenvironment הסלולר שלהם. הידרוג קולגן נוקשה מוגדר כג'ל שבו התאים המוטבעים אינם מסוגלים מקומית להתכווץ קולגן שמסביב. ההתכווצות הפנימית של תאים מסוגים שונים היא ייחודית, ולכן עדיף להתחיל עם עקומת contractility פשוט להקים ריכוז הקולגן כי יהיה המורגש תואם ונוקשה.

בגין על ידי החזקת קבוע מספרי תאים להעלאת ריכוז ג'ל קולגן. הנוקשות של הג'ל יהיה בסדר גודל אקספוננציאלית עם ריכוז, כפי שהוצג קודם 10,20. דוגמה מייצגת של assay contractility מוצג באיור 1. הנה, 50,000 4T1 תאים המוטבעים eithe ra 2 מ"ג / מ"ל ​​או 3.5 מ"ג / מ"ל ​​ג'ל קולגן במשך 5 ימים. שורת תא 4T1 היא התכווצות מאוד, קו הסרטן גרורתי, אבל הוא רק מסוגל להתכווץ הג'ל הצפיפות הגבוה בכ -10% (איור 1 א, ג). רמה נמוכה זו של התכווצות אופיינית סיווג ג'ל נוקשה. ג'ל בצפיפות נמוכה להשוואה (2 מ"ג / מ"ל, 1b, ג) מכווצים 57% (n = 4) באותה מסגרת זמן. חשוב לציין כי הגדלת הכמות ליגנד קולגן יכולה להשפיע מסלולי תא איתות, ולכן אמצעי שני לגוון את הנוקשות הוא על ידי ההחזקה הקבועה קולגן הריכוז ולהשוות לים, כי הם מאופקים (נוקשים) שיניחוה מצורפת בתחתית המנה או תנועתיים (תואם) כי שוחררו הם לצוף בחופשיות המדיום הסלולרי. זה יכול לשמש כביקורת טובה כדי לקבוע האם שינויי איתות הסלולר לנבוע ליגנד קולגן המוגברת או את הנוקשות של מטריקס.

ether.within-page = "1"> בעוד מבחני התכווצות ג'ל קולגן הם פשוט, ישנם כמה פריטים כדי להיות מודע כאשר באמצעות סוגים אלה של מבחנים. ראשית, בתנאי צפיפות גבוהים חשוב לוודא כי אין פסד של כדאיויות תא. ראינו כי קיימת מגבלת תקרה עבור הנוקשות של microenvironment שתא יסבול, ו הבחנו אפופטוזיס מוגבר או מוות של תאים בחלק שורות תאים, אשר יכול לגרום לתוצאות לאחר להתפרש שלא כהלכה. לא צריך להיות שום הפסד ניכר של כדאיויות תא בין תנאים קשיחים גבוהים ונמוכים. זה יכול להיקבע על ידי המערבי סופג לפעילות caspase או כמה assay אחרים למדידת כדאיות התא. שנית, ג'ל קולגן יכול גם להיות מצומצם יותר מדי ובכך ליצור סביבה נוקשה, וצמצום ההבדלים בין תנאי קשיחות גבוה ונמוך. אנו ממליצים שלא נעלה על התכווצויות של 60 - 70%. כדי למקסם את השחזור, חשוב כדי לייעל את הזמןמסגרת של הניסוי, צפיפות זריעת תא הראשונית, ואת הנוקשות של מטריקס על ההתכווצות של סוג התא בשימוש.

לאחר שליטה של ​​הטבעת תאים בתוך מטריצות 3D מושגת, מבחנים יכולים להיות שונים כדי לשנות את הארגון ואת הכיוון של סיבי קולגן. זו מושגת על ידי שימוש בערוצים microfluidic PDMS (איור 2). לצורך כתב יד זה, שתי תצורות דומות שימשו, צר ערוץ רחב, עם 3 פתחים או יציאות (איור 2b). בניסוי טיפוסי לקבוע את תגובת התאים אקראי לעומת מטריצות מיושרות, קולגן unpolymerized מופנה דרך ערוץ microfluidic מנמל ל- C נמל עם תאים להתווסף ב יציאת מידת יישור קולגן הוא מווסת על ידי השיעור של קולגן לזרום כך ספיקות קולגן גבוה להניב התאמה טובה יותר. שימוש תעלות צרות יחד עם גבוהלחצי ואקום משפרים את היישור של רשת קולגן, בעוד ערוץ רחב יותר להשתמש בשילוב עם לחצי ואקום נמוכים ומייצר מטריצות אקראיות. הארגון של הרשת הסיבית ניתן דמיין ידי דור הרמוני שני, כפי שמוצג בתמונות נציג (איור 2 ג, ד). בדימויים האלה, סיבי קולגן (מסומן על ידי ראשי חץ pseudocolored בסגול) ליישר יותר עקבי עם ציר הזרימה קולגן באפיקים צר (איור 2). סיבי הקולגן בערוצים רחבים יש מגוון של אורינטציות, ויש להם (איור 2 ג) חלוקה אקראית יותר.

ההבדל בין ערוצים רחבים וצרים בוודאי ירגיש לעין האנושית, אבל יכול גם להיות מנותח באמצעות תוכנה שפותחה במיוחד עבור ניתוח סיבים. CT-FIRE, קוד פתוח ותוכנה חינמית, מנצל אלגוריתם מבוסס-curvelet לעיבוד מראש ואחריואלגוריתם חילוץ סיבים לכמת זווית סיבים, עובי, אורך, וישרות 21. עבור כל תנאי, יותר מ -500 תמונות נדגמו באופן אקראי ממקומות שונים בתוך הערוצים, ויותר מ 125,000 סיבי חולצו ונותחו על ידי CT-FIRE. ההיסטוגרמה זווית סיבים שנלוו עבור ערוצי צר (2f איור) מראה העשרה ברורה של סיבים אוריינטציה במקביל לכיוון הזרימה. לעומת זאת, ערוצים רחבים יש חלוקת זווית סיבים המקבילה יותר (איור 2E) אשר עולה בקנה אחד עם מטריצה ​​רנדומליים.

חשוב לציין כי השימוש במכשירי microfluidic, כטכניקה לשלוט בארגון והכיוון של סיבי קולגן, מאפשר הערכה של תגובות הסלולר שונות לתנאי מטריקס שינו. לדוגמה, סונג et al. נקבע כי הכדאיות של fibrobasts חלב האנושי תלויה סיבי קולגן.15 בנוסף, העבודה האחרונה של המעבדה שלנו מראה כי תאי סרטן השד לנדוד יותר בהתמדה על סיבי הקולגן מיושרים לעומת מטריצות קולגן אקראיות. 3 תוצאות אלה מסייעות להגדיר את התפקיד טוב יותר של המיקרו-הסביבה בהקשר של ביולוגית חלב וסרטן השד. במבט קדימה, את היכולת לשלוט על המיקרו-סביבת הסלולר 3D בדיוק יאפשר לחקירת המשך תגובות תאיות חשובות בהקשר של מצב מחלה שונה.

איור 1
איור 1. 3D קולגן ג'לי מדידת התכווצות תא ותגובות ניידות ECM הנוקשת. 4T1 תאים היו מצופים בשני (א) 3.5 מ"ג / מ"ל ו (ב) 2 מ"ג / מ"ל ג'ל קולגן ואיפשר לגדול במשך 5 ימים. במשך הזמן, ג'ל קולגן (אזור אפורבתוך קו מקווקו) יתכווץ ואת הקוטר נמדד לכמת (ג, מבחן t, ברי שגיאה +/- SD). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. יצירה אקראית ומיושר קולגן מטריצות שימוש PDMS microchannels. פרוסות סיליקון שש אינץ '(א) שמשו כתבנית היא microchannels PDMS הרחב והצר (ב). ריכוזי קולגן זהים נמשכו דרך שני סוגי הערוצים, סיבים בודדים (ראשי חץ, ג, ד) להתיישר עם כיוון הזרימה (חיצים) ב microchannels הצר (ד). microchannels Wide הניב מטריצות אקראיות יותר. angl סיביםes ביחס לחלק התחתון של התמונה נספרו שמוצג (ה) ו- (ו). סרגל קנה מידה = 26 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ג'ל קולגן 3D הם תוספת רבת ערך בארגז הכלים שלנו כדי להבין כיצד תאים לפרש ולהגיב microenvironment המקומית שלהם. כתב יד זה ספק פרוטוקול בסיסי מאוד להטבעת תאים בתוך מטריצת קולגן 3D, וכדי ליצור מטריצות reproducibly עם סיבי קולגן אקראיים או מיושרים. פרוטוקולי שניהם עובדים פלטפורמות וישימות היכן isoforms קולגן השונה, crosslinkers, או חלבונים מטריקס אחרים ניתן להוסיף פוטנציאלי בעת פילמור. זה גם קל לשנות את הפלטפורמות להעריך זמנים ונקודות קצה שונים עבור ביטוי גנים וייצור חלבון. הדמיה, חלבון בהערכת רמות RNA, ופרופילים מטבולית לקרוא כולם תואמים מאוד עם טכניקות 3D אלה.

כפי חשוב עם כל הטכניקות, חשוב להעריך את איכות הג'ל assay. שלט של ג'ל קולגן באיכות טוב הוא אחד שיכול להתמודד עם מניפולציה ידנית. לדוגמה, 1 מ"ל [1 מ"ג / מ"ל] ג'ל קולגן שפך לתוך צלחת שישה היטב צריך להיות נטל בקלות עם מלקחיים מניפולציות. אם הדמעות ג'ל או שברי, איכות הג'ל הוא הכי מוצלח, ועל צעדים יש לנקוט כדי לשפר את פילמור קולגן. טמפרטורה ו- pH הם הפרמטרים החשובים ביותר הנדרשים היווצרות gelation סיבים טובות. תוכלו להתחיל את תהליך פתרון הבעיות על ידי מוודא כל הרכיבים כל הזמן על הקרח עד מוכן gelation להתרחש. זה גם מאוד חשוב לוודא כי חיץ ניטרול פתרון מניות קולגן שמתבצעים מעורבים באופן יסודי. הבא, ודא כי ה- pH של למאגר נטרול הוא ב- pH 7.4. HEPES שנאגר PBS מומלץ כי זה מאוד תואם בתרבית רקמה, יש מגוון רחב חציצה, ופתרונות מניות נוטים להיות יציבים מאוד ב 4 צלזיוס למשך פרקי זמן ארוכים. כמו כן, יש ערך המוסף של הפקה יותר, סיבים מעוגלים יותר אשר דומים יותר את המצב הפיזיולוגי 15. NaOH הוא commo אחרnly השתמש נטרול פתרון, אבל צריך להיות titered יותר מקרוב. זה כנראה גם את ההשפעה של הפקה קצר, סיבים עבים 15. בכל מקרה, ה- pH של קולגן לנטרל צריך להיות ב- pH של 7.4. אם כל התנאים הללו נמצאים מרוצים, ואת היושרה של הג'לים עדיין אינה משביעת רצון, אזי הבעיה נעוצה פתרון קולגן המניות. למרות הפתרון קולגן המניות יש חיי מדף הרשום של 6 חודשים ב 4 C, מצאנו כי הוא קצר יותר מאשר בדרך כלל ממקורות מסחריים טוענים כאשר נעשה שימוש עבור ג'לים 3D. מחק את הבקבוק הישן, והסדר מהרבה חדש. אין זה יוצא דופן עבור איכות הקולגן מהיצרן להשתנות באופן משמעותי ממגרש למגרש.

בנוסף לזיהוי ג'ל קולגן איכות, חשוב גם כדי לזהות את השלבים כי הם קריטיים עבור הדור של יישור טוב בתוך microchannel PDMS. העיקרון העומד בבסיס של טכניקה זו הוא כי שיעור collAgen זרימה דרך microchannel ובהמשך גורם יישור נימה. לכן, השלב הקריטי ביותר בשליטה על מידת יישור סיבים הוא אפנון התקין של לחץ הוואקום. עבור יישור קולגן האקראי microchannel, לחץ הוואקום חייב להיות נמוך, ואת קולגן חייב לזרום לאט במורד הערוץ. אם קולגן זורם מהר מדי, הסיבים יתחילו ליישר. ערוץ רחב יותר הופך טענה זו קל יותר. לעומת זאת, עבור יישור קולגן טוב, לחצי ואקום גבוהים חייבים לשמש והפתרון קולגן חייב לסחוב אותן לאורך יותר מהר. שלב קריטי שני בדור של מטריצות מיושרות הוא הטמפרטורה. חשוב מאוד לוודא את כל הרכיבים והפתרונים קפואים על קרח לפני השימוש. אם הערוצים הם לא מקוררים לפני השימוש, הקולגן התעלה לפלמר מהר מדי, יגרום רזים, סיבים קטנים יותר. אם קולגן לנטרל הוא מקורר ב 4 C ולא על הקרח, העשרתהתגרענות ed תהיה להצמיח בקטרי סיבים גדולים שבו הם יותר קשים ליישר ידי זרימה. כמו כן, חשוב לצנן את microchannel עצמה. בלי לפני מצמרר, הנפח הקטן של קולגן יתחמם מאוד מניב תוצאות עלובות במהירות.

את microchannels קולגן הוא טכניקה שימושית מאוד, אבל יש מגבלות מסוימות. קודם כל, את היישור בתוך microchannel זרימה מושרה הוא לא מושלם, ולעולם לא שווה טכניקת יישור מושרה זן. תמיד יהיו כמה סיבים אוריינטציה בניצב לכיוון הזרימה, אך שחזור, הסתגלות, וקלות השימוש להכריע את וריאציות קטנות יישור בתוך הערוץ. יתרה מכך, הוכחו תאים לחוש שינויים קטנים ביעילות יישור, ולהגיב עם הגירה מתמשכת בערוצים אלה 3,15. התאים גם ישפרו את היישור של הערוץ ככל שמספרם להגדיל והם מתחילים לנדוד. אם אני יישור יותרשעות הנדרשות, microchannels PDMS ניתן לשנות בקלות לממדים צרים או להיות שמגבלות קטנות כדי לשפר את היישור. שניהם הוכחו כיעילים, אבל יש 16 הפשרות אחרים הקשורים. מגבלה נוספת לטכניקת microchannel היא שערוץ PDMS יש חדירות קצת לסמים או צבעי ניאון. משמעות הדבר היא כי תרכובות אלו צריכות לפזר את הערוץ מהנמלים, שהוא איטי להפליא, והוא יכול להוות קושי שטיפת טיפולים.

אמנם יש מגבלות מסוימות לפלטפורמת microchannel זו, הוא מציע מספר יתרונות על פני שיטות מקובלות. זה יותר ניסיוני נגיש כפי שהיא אינה דורשת מכשירים מגושמים 3,13 או אוכלוסיות קטנות של תאים ליצירת יישור. זה גם אינו מחייב חרוזים מגנטיים אקסוגניים 13,14 אשר נוטים להיות autofluorescent ויכול מלאכותי crosslink רשת קולגן. Microchannel קולגן הואגם פשוט יותר חסכוני וחסכוני. בנוסף ליתרונות הנוכחיים, יש לה גם יתרונות רבים כי ניתן יהיה למנף ביישומים עתידיים. קודם כל, את microchannel קולגן יכול להיות מתוכנן או שונה כמעט בכל תצורה או ניסוי. עיצובים מתקדמים מאפשרים הערוצים ליצור צינורות קולגן חלולים או מבני 3D לחקות את הארכיטקטורה של איברים פשוטים או גידולים 22. יתר על כן, הערוצים יכול להיות עשוי מחומרים אחרים מאשר PDMS. זה פוטנציאלי יכול להעביר תכונות מכניות שונות לרשתות קולגן מוטבע או מטריצות. לבסוף, הכמות הקטנה של חומרים כימיים המשמשת assay זה עלולה גם להפוך אותו אטרקטיבי וחסכוני עבור מסכי קצב העברת נתונים גבוהים יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לחשוף

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות UO1CA143069 מספרים מענק, R01CA142833, R01CA114462, RO1CA179556, T32-AG000213-24, ו T32-GM008692-18 למימון עבודה זו. אנחנו גם מכירים ג'רמי Bredfelt ו Yuming ליו של לוקוסים לפיתוח וסיוע בניתוח CT-FIRE.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High Concentration Rat Tail Collagen Corning 354249
SylGard184 elastomer kit Corning NC9285739 Elastomer for PDMS channels
HEPES Fisher BP310 For HEPES neutralization buffer
KCl  Fisher BP366 For HEPES neutralization buffer
KH2PO4 Fisher BP362 For HEPES neutralization buffer
Na2HPO4 Fisher S374 For HEPES neutralization buffer
NaCl Fisher BP358 For HEPES neutralization buffer
Levy Improved Neubauer Hemacytometer Fisher 15170-208 cell counting
6-well non-tissue culture plate  Corning 351146
50 mm glass bottom dish MatTek P50g-1.5-30-f
Bel-Art Plastic Vacuum Desiccator Bel-Art F4200-2021 Degassing chamber for PDMS
transparency film  3M pp2950 Plastic film for pouring pdms channels
ThermoScientific CimaRec ThermoScientific  HP141925 Hot plate for curing PDMS microchannels
Vacuum regulator Precision Medical PM3100 Vacuum regulator for collagen microchannels
8" x 8" rubber sheet Amazon - Rubber-Cal Silicone - 60A rubber sheet for pouring PDMS microchannel
8" x 8" x 0.125" acrylic sheet Amazon Plexiglass sheets for pouring PDMS microchannels
10 lb weights Amazon CAP Barbell for pouring PDMS microchannels
15 ml Conical tubes Fisher 352097
50 ml Conical tubes Fisher 352098
Plastic pipets Dot Scientific 229202B, 229206B, and 667225B 2 ml, 5 ml, and 25 ml
70% EtOH Fisher NC9663244

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. Am J Pathol. 178, 1221-1232 (2011).
  2. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, 38 (2006).
  3. Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophys J. 107, 2546-2558 (2014).
  4. Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Curr Opin Cell Biol. 17, 524-532 (2005).
  5. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188, 11-19 (2010).
  6. Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197, 439-455 (2012).
  7. Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).
  8. Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. J Cell Biol. 163, 583-595 (2003).
  9. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
  10. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
  11. Tlsty, T. D., Coussens, L. M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu Rev Pathol. 1, 119-150 (2006).
  12. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
  13. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys J. 95, 5374-5384 (2008).
  14. Guo, C., Kaufman, L. J. Flow and magnetic field induced collagen alignment. Biomaterials. 28, 1105-1114 (2007).
  15. Sung, K. E., et al. Control of 3-dimensional collagen matrix polymerization for reproducible human mammary fibroblast cell culture in microfluidic devices. Biomaterials. 30, 4833-4841 (2009).
  16. Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomed Microdevices. 8, 35-41 (2006).
  17. Wozniak, M. A., Keely, P. J. Use of three-dimensional collagen gels to study mechanotransduction in T47D breast epithelial cells. Biol Proced Online. 7, 144-161 (2005).
  18. Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 10, Unit 10 18 (2008).
  19. Liu, X., Harada, S. DNA isolation from mammalian samples. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 2, Unit 2 14 (2013).
  20. Roeder, B. A., Kokini, K., Sturgis, J. E., Robinson, J. P., Voytik-Harbin, S. L. Tensile mechanical properties of three-dimensional type I collagen extracellular matrices with varied microstructure. J Biomech Eng. 124, 214-222 (2002).
  21. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. J Biomed Opt. 19, 16007 (2014).
  22. Bischel, L. L., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microfluidic model of ductal carcinoma in situ with 3D, organotypic structure. BMC Cancer. 15, 12 (2015).

Tags

Bioengineering גיליון 111 קולגן ערוצי microfluidic מטריצות 3D ECM יישור קולגן microenvironment הגידול
הכנת ג&#39;לי 3D קולגן microchannels לחקר אינטראקציות 3D<em&gt; In vivo</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Burkel, B., Morris, B. A., Ponik, S. … More

Burkel, B., Morris, B. A., Ponik, S. M., Riching, K. M., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo. J. Vis. Exp. (111), e53989, doi:10.3791/53989 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter