Summary
Il collagene è una componente fondamentale della ECM, e fornisce spunti essenziali per molti processi cellulari che vanno dalla migrazione verso la differenziazione e la proliferazione. Qui fornito è un protocollo per l'incorporamento celle all'interno di idrogel di collagene 3D, e una tecnica più avanzata per la generazione di matrici di collagene randomizzati o allineati con microcanali PDMS.
Protocol
1. neutralizzazione, diluizione e la polimerizzazione del collagene soluzioni per il 3D investigazione e cellulari Contrazione saggi
- Il ghiaccio in cappa coltura tissutale sterili, neutralizzare collagene (1: 1) con una soluzione sterile, ghiacciata 100 mM HEPES in 2x PBS, pH 7,4, in un tubo da 15 ml. Mescolare accuratamente con pipetta di plastica fino a quando la soluzione è omogenea e turbinii di miscelazione non sono più visibili. Fare attenzione a non introdurre bolle d'aria durante il processo di miscelazione. Conservare brevemente su ghiaccio.
- Diluire collagene neutralizzato alla concentrazione appropriata con mezzi di cellule (ad esempio RPMI, DMEM, etc.).
- Per calcolare la quantità di collagene neutralizzato necessaria per compensare concentrazione collagene desiderato, utilizzare l'equazione N = (D * V) / (S / 2), dove N è quantità di collagene neutralizzato richiesto, D è la concentrazione di collagene desiderato, V è il volume finale della concentrazione collagene desiderato e S è tegli concentrazione iniziale magazzino collagene.
- Portare la quantità di collagene neutralizzato a volume con l'aggiunta di una soluzione cellulare e supporti delle cellule. Mescolare accuratamente e memorizzare sul ghiaccio fino al momento di lanciare.
- Esempio: Per un 2 mg / gel ml in un volume di gel 1 ml (volume tipico per un cast gel in 6 pozzetti o mm vetro 50 piatto inferiore), prima moltiplicare la concentrazione desiderata (2 mg / ml) per il volume finale desiderato (1 ml). Prendete questo numero (2 mg) e dividerlo per la metà della concentrazione di azioni quotate sulla bottiglia (9,49 mg / ml). In questo caso, 0,42 ml di collagene neutralizzato vengono diluiti con 0,58 ml di miscela di / cell media.
- Dispensare il collagene / miscela ghiacciata cellule / media in entrambi una cultura non-tessuto trattato 6 pozzetti o un bicchiere 50 millimetri piatto fondo. Utilizzare punta della pipetta per diffondere uniformemente la soluzione.
NOTA: È importante usare una coltura non-tessuti piastra trattata per minimizzare l'attacco o la crescita delle cellule al di fuori del collagen gel. - Lasciar polimerizzare a temperatura ambiente per circa 10 - 15 minuti. I gel devono girare opaco su di polimerizzazione.
- Dopo si è trasformato opaca, spostare piatto o un piatto a 37 ° C per ulteriori 45 - 60 minuti per completare la polimerizzazione.
- Dopo 45 - 60 minuti, aggiungere 2 - 3 ml di supporti e rilasciare i gel dalle pareti del pozzo eseguendo una punta p200 pipetta intorno al perimetro del bene o un piatto. piatto Swirl delicatamente per rilasciare il gel. Il gel di collagene deve essere galleggiare in media.
2. Western Blotting, cellulare morfogenesi e Gel Gontractility Assay
- Per valutare i livelli di proteina, la morfologia o la contrattilità cellulare in relazione alla ECM rigidità, iniziare versando gel di collagene, secondo 1,1-1,6, seminati con cellule di un 7 - saggio di 10 giorni. Determinare ogni tasso di semina linea cellulare empiricamente a seconda del tasso di crescita e confluenza. Per un dosaggio di 10 giorni, la densità di semina può variare da 20.000 - 100.000 cellule / gel.
- Misurarecontrattilità cellulare, misurare il diametro gel utilizzando un righello o una fotocamera ogni 24 ore o l'intervallo di tempo appropriato.
Nota: Inoltre, corrispondenti immagini raccolte da un microscopio possono essere esaminati per caratteristiche morfologiche caratteristica della linea di cellule seminate nel gel, come ad esempio strutture acini simili, tubuli epiteliali, sporgenze cellulari e lameliapodia. - Per valutare i livelli di proteina, la lisi dei gel in RIPA buffer e processo per l'analisi Western Blot di proteine di interesse, come descritto nel Wozniak et al. 17 e Gallagher et al. 18.
- IMPORTANTE: Nel confronto di contrattilità tra le linee cellulari, normalizzare la contrattilità di DNA totale, che può essere estratto dal gel, come delineato da Lui, et al 19, o per un immutabili, di proteine di pulizia (istoni, GAPDH, etc.) tramite Western. blot, come descritto in Wozniak et al. 17 e Gallagher et al. 18. Se le cellule conteggio all'interno del gel utilizzando un emocitometro, assicurarsi di normalizzare numero di cellulare per un'area totale di gel come il gel amministrazione si concentrerà cellule.
- gel feed ogni 3 - 4 giorni per la rimozione di 1 ml di mezzi di comunicazione e la sua sostituzione con 1 ml di mezzi freschi. Assicurati di alimentare gel dopo la misura viene effettuata come l'aggiunta di mezzi freschi / siero causerà un picco di contrattilità.
3. Generazione di PDMS microcanali per il collagene fibra Allineamento
Nota: Per generare matrici di collagene allineati, uno stampo per PDMS microcanali (Figura 2A) richiede un maestro SU-8 di silicio realizzato tramite soft-litografia 15.
- Per rendere i canali PDMS, PDMS mescolare accuratamente in una tazza a gettare con un bastone artigianale. Per un maestro silicone 6 pollici, mescolare 20 g di base di elastomero con 2 g di catalizzatore.
- De-gas miscela PDMS ponendo la tazza monouso in una camera a vuoto ad una pressione di vuoto550 millimetri Hg. De-gas per 1-1,5 ore.
- Mentre de-gassificazione la PDMS, preparare il maestro silicone per versare. Preparare mettendo un foglio di pellicola trasparente su una piastra seguita dal maestro silicone. Assicurarsi che lo stampo microcanali rivolto verso l'alto.
NOTA: Durante PDMS casting e stagionatura, il padrone di silicone viene inserito tra due fogli di pellicola trasparente. - Con 1 - 1,5 ore, rimuovere i PDMS degasificati dalla camera a vuoto, e lentamente versare sopra il master silicone.
IMPORTANTE: evitare bolle d'aria. Continuare a versare nel centro di maestro, e consentire la gravità di diffondersi in modo uniforme.
NOTA: La caduta di PDMS non deve estendersi fino al bordo della matrice. - Dopo PDMS è stato versato sul master, applicare un secondo foglio di pellicola trasparente sulla sommità del master silicone e PDMS. Attenzione, rotolare il secondo foglio trasparenza fino in cima master PDMS / silicone per evitare bolle d'aria. Non abbiate fretta. PDMS dovrebbero essere ora equamente distribuite omaestro ver.
- Delicatamente posizionare un foglio di gomma sulla parte superiore della trasparenza, seguito da un "foglio acrilico 1/8.
- Aggiungere tre 10 lb pesi sulla parte superiore del foglio acrilico. Inizialmente, i pesi si "galleggiare". Consentire loro di stabilirsi e stabilizzare prima di procedere ulteriormente.
- Impostare la temperatura di cottura a 70 C e cura PDMS per 4 ore. Lasciare raffreddare per almeno 1 ora aggiuntiva prima di disturbare.
- sbucciare accuratamente cima foglio di pellicola trasparente dal wafer, e rimuovere i canali con una pinza.
- Conservare in piatto privo di polvere fino al momento dell'uso.
4. preparando PDMS microcanali per l'uso
- Posizionare i canali a testa in giù sul nuovo, lucidi pulito. Pulire tutte le porte (Figura 2b) con movimento circolare con una pinza taglienti. Rimuovere eventuali frammenti di PDMS.
- canali Clean con un pezzo di nastro adesivo come un panno dell'aderenza. Applicare nastro adesivo sulla superficie del banco (lato adesivo verso l'alto), e quindi impostare il canale on top. Premere verso il basso i canali con estremità rotonda di pinze per assicurare un buon contatto. Rimuovere e ripetere su entrambi i lati fino a quando i detriti visibile viene rimosso.
- Trasferimento puliti, preparata canali PDMS in una conica da 50 ml con il 70% EtOH. Vortex alla massima velocità per 30 sec. Scartare EtOH e sostituirlo con fresco il 70% EtOH. Conservare in 70% EtOH fino al momento dell'uso.
- Nel cofano coltura tissutale e l'utilizzo di tecniche asettiche, trasferire i canali PDMS ad un vetro di copertura pulito e sterile o vetro piatti inferiori. Mettere il canale laterale e raggi UV trattare fino EtOH è evaporata.
- Una volta asciutto, capovolgere le PDMS in modo che i canali sono rivolti verso il basso verso coprioggetti. Premere il canale PDMS verso il basso sul vetro per fare una buona tenuta. Aggiungere un pezzo di PDMS sterili per coprire / chiudere la porta centrale (porta B, Figura 2b). Lasciare asciugare bene prima di procedere.
- Pre-rivestire l'interno del canale con 10 ug collagene / ml in acqua sterile. Per coat, posizionare una gocciolina 100 microlitri sulla sommità di un channEL, e disegnare attraverso con il vuoto. Dopo 1 ora a 37 ° C, i canali di trasferimento riempito con soluzione di rivestimento collagene ad un frigorifero. Mettere in frigorifero per circa il 15 - 30 min.
- Rimuovere soluzione di rivestimento di collagene con aspiratore o pipetta, e iniziare la preparazione del collagene.
5. Il collagene Preparativi per l'uso in microcanali
- Il ghiaccio, neutralizzare collagene (1: 1) con ghiacciata 100 mM HEPES in 2x PBS, pH 7,4. Mescolare accuratamente fino omogeneo (Per maggiori dettagli, vedere la sezione 1.1).
- Diluire collagene neutralizzato alle concentrazioni appropriate con i media cella (Per maggiori dettagli, vedere la sezione 1.2). Incubare per 15 minuti in ghiaccio.
- Allo stesso tempo, chill canali su ghiaccio montato.
NOTA: L'obiettivo è quello di avere tutti i componenti per il processo di canale a 4 ° C o al di sotto. Collagene temperatura e tempo nucleazione sono parametri fondamentali per il processo di polimerizzazione, e può essere il punto di partenza per ulteriore ottimizzazione, se necessario. - CounLe cellule T con un emocitometro e risospendere alla densità di semina appropriata in questo momento. Per facilità di calcoli, risospendere a 1 - 3 milioni di cellule / ml. (Per maggiori dettagli, vedere anche paragrafo 2.1).
- Una volta che le cellule sono state contate e 15 minuti sono passati, procedere al collagene versare.
6. Versare allineati e casuale collagene microcanali
- Prima di trarre il collagene attraverso i canali, regolare e impostare la pressione di vuoto con un regolatore di vuoto in linea. pressione di vuoto fornisce la forza di indurre e controllare la velocità del flusso di collagene, che determina il grado di allineamento.
- Per matrici casuali o non allineati, utilizzare un ampio canale (3mm di larghezza x 200 micron di altezza) con una pressione di vuoto di 10 mm Hg o meno.
- Per matrici allineate, usare il canale stretto (1 mm di larghezza x 200 micron di altezza) con una pressione di vuoto di 60 mm Hg o superiore.
- Rimuovere canale montato da ghiaccio e posto sulla superficie pulita, sterilizzata di flusso laminare hOOD.
- Lavorare velocemente e caricare 120 - 150 ml di collagene neutralizzato nella porta A (Figura 2b).
- Disegnare collagene attraverso il canale posizionando una pipetta 25 ml collegata alla linea del vuoto sulla porta c (Figura 2b). Disegnare il collagene attraverso in un unico, moto uniforme. IMPORTANTE: Per le matrici casuali o non allineati, disegnare lentamente collagene attraverso canale (circa 0,5-1 mm al secondo), e fermare una volta raggiunta la fine. Per matrici allineate, disegnare il collagene attraverso più rapidamente, ma fare attenzione ad evitare bolle d'aria.
- Rimuovere l'eccesso di collagene dalla regione porto con Pipetman P200 o aspiratore.
- Posizionare patch PDMS sterili su entrambe le porte A e C. Tutte le porte dovrebbero ora essere coperti.
- Dopo 2 - 3 minuti, togliere il centro delle patch PDMS (porta B) e aggiungere 2 - 3 ml di cellule (5 - 10 mila cellule) nella porta centrale. Lasciare polimerizzare parzialmente (girare opaco) a temperatura ambiente per altri 10 - 15 min.
- dopo 10- 15 min, il trasferimento a 37 ° C per altri 15 - 30 minuti per completare la polimerizzazione. Rimuovere i coperchi PDMS e aggiungere supporti per coprire completamente le cellule del canale e della cultura in base alle esigenze. Le cellule possono essere alimentati rimuovendo un ml di vecchi media, e la sua sostituzione con un ml di nuovi media.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mentre saggi 3D possono essere eseguite nella stessa rigidità del gel di collagene, variando la rigidità gel può essere usato per determinare come le cellule rispondono a modifiche meccaniche nel loro microambiente cellulare. Un idrogel collagene rigido è definito come un gel in cui le cellule incorporate potuto localmente contrarre il collagene circostante. La contrattilità intrinseca di tipi cellulari è unico, e quindi è meglio iniziare con una curva contrattilità semplice per stabilire la concentrazione di collagene che verrà percepito come conforme e rigido.
Iniziare tenendo costante il numero di cellule e aumentando la concentrazione del gel di collagene. La rigidità del gel si scala esponenzialmente con concentrazione, come illustrato in precedenza 10,20. Un esempio rappresentativo di un saggio contrattilità è mostrato in Figura 1. Qui, 50.000 4T1 celle sono incorporate in eithera 2 mg / ml o 3,5 mg / ml di gel di collagene per 5 giorni. La linea cellulare 4T1 è altamente contrattile linea cancro metastatico, ma è solo in grado di contrarre il gel ad alta densità di circa il 10% (Figura 1a, c). Questo basso livello di contrazione è tipico per una classificazione di gel rigido. Gel a bassa densità paragonabili (2 mg / ml, la Figura 1b, c) sono contratte 57% (n = 4) durante lo stesso periodo di tempo. È importante notare che aumentando la quantità di collagene ligando può influire percorsi di segnalazione cellulare, quindi un secondo mezzo per variare la rigidità è di tenere la concentrazione costante collagene e confronta gel che sono immobilizzati (rigide) essendo lasciata attaccata al fondo il piatto o contrattili (compliant) perché sono stati rilasciati a fluttuare liberamente nel mezzo delle cellule. Questo può servire come un buon controllo per determinare se i cambiamenti nella segnalazione cellulare derivano dalla maggiore ligando collagene o la rigidità della matrice.
Una volta padronanza incorporamento celle all'interno matrici 3D è raggiunto, saggi possono essere modificati per alterare l'organizzazione e l'orientamento delle fibre di collagene. Ciò si ottiene con l'uso di canali microfluidica PDMS (Figura 2). Ai fini di questo manoscritto, due conformazioni simili sono stati utilizzati, una stretta e un ampio canale, con 3 aperture o porte (Figura 2b). In un tipico esperimento per determinare la risposta cellulare casuale rispetto alle matrici allineate, collagene non polimerizzato viene aspirata attraverso il canale microfluidico dal canale A alla porta C con cellule viene aggiunto alla porta B. Il grado di allineamento collagene è modulata dal tasso di collagene fluiscono in modo tale che le portate più alto di collagene resa migliore allineamento. L'utilizzo di canali stretti accoppiato con maggiorepressioni di vuoto migliora l'allineamento della rete di collagene, mentre un canale ampia utilizzato in combinazione con basse pressioni di vuoto genera matrici random. L'organizzazione della rete fibrillare può essere visualizzato mediante generazione di seconda armonica, come mostrato nelle immagini rappresentative (figura 2c, d). In queste immagini, le fibre di collagene (indicate dalle frecce e pseudocolored in viola) allineare più coerente con l'asse di flusso collagene nei canali stretti (figura 2d). Le fibre di collagene in canali larghi avere una varietà di orientamenti, e hanno un più casuale distribuzione (figura 2c).
La differenza tra i canali larghi e stretti è percepibile per l'occhio umano, ma può anche essere analizzato tramite software sviluppato specificamente per l'analisi della fibra. CT-FIRE, un open source e il software liberamente disponibile, utilizza un algoritmo di curvelet-based per il pre-trattamento seguito daun algoritmo di estrazione della fibra di quantificare angolo di fibra, spessore, lunghezza, e rettilineità 21. Per ogni condizione, più di 500 immagini sono state campionate in modo casuale da diverse posizioni all'interno dei canali, e più di 125.000 fibre sono stati estratti e analizzati da CT-FIRE. La successiva istogramma angolo di fibra generato per i canali stretti (figura 2f) mostra una chiara arricchimento di fibre orientate parallelamente alla direzione di flusso. Al contrario, i canali larghi hanno un più equivalente distribuzione di angoli di fibre (figura 2e) che è coerente con una matrice più casuale.
È importante sottolineare che l'uso di dispositivi microfluidici, come tecnica per controllare l'organizzazione e l'orientamento delle fibre collagene, permette di valutare varie risposte cellulari condizioni matrice alterati. Ad esempio, Sung et al. stabilito che la redditività di fibrobasts mammarie umane dipende fibre collagene.15 Inoltre, un recente lavoro del nostro laboratorio dimostra che cellule di carcinoma mammario migrano più persistente sul fibre di collagene allineate rispetto alle matrici di collagene casuali. 3 Questi risultati aiutano a definire meglio il ruolo del microambiente nel contesto della biologia mammaria e del cancro al seno. Andando avanti, la capacità di controllare con precisione il microambiente cellulare 3D consentirà continua ricerca di importanti risposte cellulari nel contesto di molti diversi stati patologici.
Figura 1. 3D collagene Gel per la misurazione contrattilità delle cellule e risposte cellulari ECM rigidità. 4T1 cellule sono state seminate in entrambi (A) 3,5 mg / ml e (B) 2 mg / ml gel di collagene e lasciati crescere per 5 giorni. Nel tempo, il gel di collagene (area grigiaentro la linea tratteggiata) subirà una contrazione e il diametro è misurato e quantificato in (c, test t, barre di errore +/- SD). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Generazione casuale e Allineati collagene matrici utilizzando PDMS microcanali. Un wafer di silicio di sei pollici (a) è stato utilizzato come modello per PDMS sia larghi e stretti microcanali (B). Le concentrazioni di collagene identici sono stati elaborati attraverso entrambi i tipi di canali, e singole fibre (frecce, c, d) allinearsi con la direzione del flusso (frecce) in microcanali strette (D). Ampi microcanali ha prodotto matrici più casuali. fibra angles rispetto al fondo di immagine sono stati contati e mostrati in (e) e (f). Barra di scala = 26 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
gel di collagene 3D sono una preziosa aggiunta alla nostra cassetta degli attrezzi per capire come le cellule interpretano e rispondere alla loro microambiente locale. Questo manoscritto ha fornito un protocollo molto semplice per l'incorporamento celle all'interno di una matrice di collagene 3D, e generare riproducibile matrici con fibre collagene casuali o allineate. Entrambi i protocolli funzionano come piattaforme adattabili dove potrebbero potenzialmente essere aggiunte diverse isoforme collagene, reticolanti, o altre proteine della matrice al momento della polimerizzazione. E 'anche facile da modificare le piattaforme per valutare le diverse tempistiche e gli endpoint per l'espressione genica e la produzione di proteine. Imaging, valutando proteine e livelli di RNA e profili metabolici lettura sono molto compatibili con queste tecniche 3D.
Come è importante con tutte le tecniche, è importante per valutare la qualità del gel e dosaggio. Un segno di una buona qualità gel di collagene è uno che può gestire manipolazione manuale. Ad esempio, un 1 ml [1 mg / ml] Gel di collagene versato in un piatto ben sei dovrebbe essere facilmente raccolti con una pinza e manipolato. Se le lacrime gel o frammenti, la qualità del gel è subottimale e passaggi devono essere prese per migliorare la polimerizzazione collagene. Temperatura e pH sono i parametri più importanti necessari per la formazione della fibra bene e gelificazione. Iniziare il processo di risoluzione dei problemi facendo in modo che tutti i componenti sono tenuti in ghiaccio fino al momento gelificazione a verificarsi. E 'anche molto importante assicurarsi che il buffer di neutralizzazione e il collagene di soluzione vengono miscelati accuratamente. Successivamente, verificare che il pH del tampone di neutralizzazione è a pH 7.4. Un HEPES buffer PBS è raccomandato perché è molto compatibile per coltura tissutale, ha una ampia gamma buffering, e soluzioni madri tendono ad essere molto stabile a 4 ° C per lunghi periodi di tempo. Essa ha anche il vantaggio di produrre più lunghi, più fibre curve che sono più simile allo stato fisiologico 15. NaOH è un altro commoolo usato neutralizzare soluzione, ma deve essere titolato più da vicino. Sembra anche avere l'effetto di produrre più brevi, fibre spesse 15. Indipendentemente, il pH del collagene neutralizzato dovrebbe essere ad un pH di 7,4. Se tutte queste condizioni sono soddisfatte, e l'integrità dei gel non è ancora soddisfacente, allora il problema è con la soluzione di riserva di collagene. Anche se la soluzione di riserva di collagene ha una durata di 6 mesi quotata a 4 ° C, abbiamo trovato che è generalmente più breve di fonti commerciali sostengono quando viene utilizzato per gel 3D. Eliminare il vecchia bottiglia, e l'ordine da un nuovo lotto. Non è insolito per la qualità del collagene dal produttore al variare notevolmente da lotto a lotto.
Oltre a identificare gel di collagene qualità, è anche importante identificare i passi che sono critici per la generazione di un buon allineamento all'interno del microcanali PDMS. Il principio alla base di questa tecnica è che il tasso di Collflusso agen attraverso i microcanali induce poi l'allineamento del filamento. Pertanto, la fase più critica nel controllare il grado di allineamento delle fibre è corretta modulazione della pressione di vuoto. Per l'allineamento collagene casuale in un microcanale, la pressione del vuoto deve essere bassa, e il collagene deve fluire lentamente lungo il canale. Se il collagene scorre troppo rapidamente, le fibre cominceranno ad allinearsi. Un canale più ampio rende questa proposta più facile. Viceversa, per un buon allineamento collagene, depressioni superiori devono essere utilizzati e la soluzione di collagene devono essere tirati attraverso più rapidamente. Un secondo passo fondamentale nella generazione di matrici allineate è la temperatura. E 'molto importante assicurarsi che tutti i componenti e le soluzioni vengono raffreddate in ghiaccio prima dell'uso. Se i canali non sono raffreddati prima dell'uso, il collagene nei canali polimerizza troppo rapidamente, e si tradurrà in sottili fibre più piccole. Se il collagene neutralizzato viene raffreddato a 4 ° C e non su ghiaccio, il enhanced nucleazione darà luogo a diametri delle fibre più grandi che sono più difficili da allineare dal flusso. E 'anche importante per raffreddare il microcanali stesso. Senza preventiva agghiacciante, il piccolo volume di collagene si riscalda molto rapidamente ottenendo scarsi risultati.
I microcanali collagene sono una tecnica molto utile, ma ci sono alcune limitazioni. Per uno, l'allineamento in un microcanale flusso indotta è mai perfetta, e non sarà mai uguale a una tecnica di allineamento strain-indotta. Ci saranno sempre alcune fibre orientate perpendicolarmente alla direzione del flusso, ma la riproducibilità, l'adattabilità, e facilità di utilizzo superare le piccole variazioni in allineamento all'interno del canale. Ancora più importante, hanno dimostrato cellule per rilevare efficacemente piccole variazioni di allineamento e rispondere alla migrazione più persistente in questi canali 3,15. Le cellule saranno anche migliorare l'allineamento del canale come loro numeri aumentano e cominciano a migrare. Se più i allineamentos richiesta, i microcanali PDMS può essere facilmente modificato per dimensioni strette o avere piccoli costrizioni per migliorare l'allineamento. Entrambi hanno dimostrato di essere efficaci, ma hanno altri compromessi associati 16. Un'altra limitazione alla tecnica microcanali è che il canale PDMS ha poco permeabilità ai farmaci o coloranti fluorescenti. Ciò significa che questi composti devono diffondere lungo il canale dai porti, che è sorprendentemente lento, e possono comportare difficoltà nella lavando trattamenti.
Anche se ci sono alcune limitazioni a questa piattaforma microcanali, esso offre diversi vantaggi rispetto alle tecniche esistenti. È più sperimentalmente raggiungibile in quanto non richiede strumenti ingombranti 3,13 o di piccole popolazioni di cellule per generare l'allineamento. Inoltre non necessita di sfere magnetiche esogeni 13,14 che tendono ad essere autofluorescenti e potrebbe artificialmente reticolare della rete di collagene. Il collagene è microcanalianche semplicemente più conveniente ed economico. In aggiunta ai vantaggi attuali, ma ha anche numerosi vantaggi che possono essere sfruttate in applicazioni future. Per uno, il microcanali collagene può essere progettato o modificato in quasi qualsiasi configurazione o esperimento. Disegni avanzate consentono i canali di creare tubi di collagene cavi o strutture 3D per simulare l'architettura di organi o tumori 22 semplificate. Inoltre, i canali possono essere realizzati in materiali diversi PDMS. Questo potenzialmente potrebbe trasmettere diverse proprietà meccaniche alle reti collagene incorporate o matrici. Infine, la piccola quantità di reagenti utilizzati per questa analisi potrebbe anche rendere attraente ed economico per piccoli schermi ad alto rendimento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare
Acknowledgments
Gli autori vorrebbero riconoscere i numeri di sovvenzione UO1CA143069, R01CA142833, R01CA114462, RO1CA179556, T32-AG000213-24 e T32-GM008692-18 per finanziare questo lavoro. Riconosciamo anche Jeremy Bredfelt e Yuming Liu di loci per lo sviluppo e l'assistenza con l'analisi CT-FIRE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High Concentration Rat Tail Collagen | Corning | 354249 | |
| SylGard184 elastomer kit | Corning | NC9285739 | Elastomer for PDMS channels |
| HEPES | Fisher | BP310 | For HEPES neutralization buffer |
| KCl | Fisher | BP366 | For HEPES neutralization buffer |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | For HEPES neutralization buffer |
| Na2HPO4 | Fisher | S374 | For HEPES neutralization buffer |
| NaCl | Fisher | BP358 | For HEPES neutralization buffer |
| Levy Improved Neubauer Hemacytometer | Fisher | 15170-208 | cell counting |
| 6-well non-tissue culture plate | Corning | 351146 | |
| 50 mm glass bottom dish | MatTek | P50g-1.5-30-f | |
| Bel-Art Plastic Vacuum Desiccator | Bel-Art | F4200-2021 | Degassing chamber for PDMS |
| transparency film | 3M | pp2950 | Plastic film for pouring pdms channels |
| ThermoScientific CimaRec | ThermoScientific | HP141925 | Hot plate for curing PDMS microchannels |
| Vacuum regulator | Precision Medical | PM3100 | Vacuum regulator for collagen microchannels |
| 8" x 8" rubber sheet | Amazon - Rubber-Cal | Silicone - 60A | rubber sheet for pouring PDMS microchannel |
| 8" x 8" x 0.125" acrylic sheet | Amazon | Plexiglass sheets | for pouring PDMS microchannels |
| 10 lb weights | Amazon | CAP Barbell | for pouring PDMS microchannels |
| 15 ml Conical tubes | Fisher | 352097 | |
| 50 ml Conical tubes | Fisher | 352098 | |
| Plastic pipets | Dot Scientific | 229202B, 229206B, and 667225B | 2 ml, 5 ml, and 25 ml |
| 70% EtOH | Fisher | NC9663244 |
References
- Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. Am J Pathol. 178, 1221-1232 (2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, 38 (2006).
- Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophys J. 107, 2546-2558 (2014).
- Even-Ram, S., Yamada, K. M.
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188, 11-19 (2010).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197, 439-455 (2012).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).
- Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. J Cell Biol. 163, 583-595 (2003).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
- Tlsty, T. D., Coussens, L. M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu Rev Pathol. 1, 119-150 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys J. 95, 5374-5384 (2008).
- Guo, C., Kaufman, L. J. Flow and magnetic field induced collagen alignment. Biomaterials. 28, 1105-1114 (2007).
- Sung, K. E., et al. Control of 3-dimensional collagen matrix polymerization for reproducible human mammary fibroblast cell culture in microfluidic devices. Biomaterials. 30, 4833-4841 (2009).
- Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomed Microdevices. 8, 35-41 (2006).
- Wozniak, M. A., Keely, P. J. Use of three-dimensional collagen gels to study mechanotransduction in T47D breast epithelial cells. Biol Proced Online. 7, 144-161 (2005).
- Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 10, Unit 10 18 (2008).
- Liu, X., Harada, S. DNA isolation from mammalian samples. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 2, Unit 2 14 (2013).
- Roeder, B. A., Kokini, K., Sturgis, J. E., Robinson, J. P., Voytik-Harbin, S. L. Tensile mechanical properties of three-dimensional type I collagen extracellular matrices with varied microstructure. J Biomech Eng. 124, 214-222 (2002).
- Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. J Biomed Opt. 19, 16007 (2014).
- Bischel, L. L., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microfluidic model of ductal carcinoma in situ with 3D, organotypic structure. BMC Cancer. 15, 12 (2015).
