Summary
El colágeno es un componente central de la ECM, y proporciona indicaciones esenciales para varios procesos celulares que van desde la migración a la diferenciación y la proliferación. Aquí se incluye es un protocolo para la incorporación de las células dentro de los hidrogeles de colágeno en 3D, y una técnica más avanzada para la generación de matrices de colágeno aleatorios o alineados utilizando PDMS microcanales.
Protocol
1. Neutralización, dilución y polimerización de colágeno Soluciones para la Investigación en 3D y celulares de contracción Ensayos
- En el hielo en la campana de cultivo de tejido estéril, neutralizar colágeno (1: 1) con HEPES estéril, enfriada con hielo 100 mM en 2x PBS, pH 7,4, en un tubo cónico de 15 ml. Mezclar bien con la pipeta de plástico hasta que la solución es homogénea y remolinos de mezcla ya no son visibles. Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire durante el proceso de mezcla. Almacenar brevemente sobre hielo.
- Diluir colágeno neutralizado a la concentración adecuada con los medios de comunicación celular (tal como RPMI, DMEM, etc.).
- Para calcular la cantidad de colágeno neutralizado requerida para compensar la concentración de colágeno lo desea, utilice la ecuación N = (D * V) / (S / 2), donde N es la cantidad de colágeno neutralizado requerida, d es la concentración de colágeno deseada, V es el volumen final de la concentración de colágeno se desea, y S es tque a partir concentración de reserva de colágeno.
- Llevar hasta la cantidad de colágeno neutralizado al volumen mediante la adición de una solución de células y medio celular. Mezclar bien y guardar en hielo hasta que esté listo para lanzar.
- Ejemplo: Para un gel 2 mg / ml en un volumen de gel de 1 ml (volumen típica para un molde de gel en 6 placa de pocillos o mm de vidrio 50 plato inferior), se multiplica primero la concentración deseada (2 mg / ml) por el volumen final deseado (1 ml). Tome este número (2 mg) y se divide por la mitad de la concentración de reserva que aparece en la botella (9,49 mg / ml). En este caso, se diluyen 0,42 ml de colágeno se neutraliza con 0,58 ml de mezcla / célula medios de comunicación.
- Pipetear la mezcla enfriada con hielo de colágeno / célula / soporte en cualquiera de una cultura no-tejido tratado placa de 6 pocillos o un plato de cristal inferior a 50 mm. Utilice punta de la pipeta para repartir uniformemente la solución.
NOTA: Es importante usar una cultura no-tejido placa tratada para minimizar la unión o el crecimiento de las células fuera del collagen gel. - Permitir para polimerizar a temperatura ambiente durante aproximadamente 10-15 min. Los geles deben girar opaco en la polimerización.
- Después de que se ha vuelto opaco, mover plato o una bandeja a 37ºC durante otros 45 - 60 minutos para terminar la polimerización.
- Después de 45 - 60 minutos, añadir 2 - 3 ml de medio y suelte la gelatina de los lados del pozo mediante la ejecución de una punta de pipeta de p200 alrededor del perímetro del pozo o plato. plato girar suavemente para liberar el gel. El gel de colágeno debe estar flotando en los medios de comunicación.
2. Transferencia Western, la célula de la morfogénesis y Gel Gontractility Ensayo
- Para evaluar los niveles de proteína, la morfología o la contractilidad celular en relación con ECM rigidez, comenzar mediante el vertido de geles de colágeno, de acuerdo con 1.1 a 1.6, se sembró con células de un 7 - ensayo de 10 días. Determina cada dosis de siembra línea celular empíricamente en función de la tasa de crecimiento y la confluencia. Para un ensayo de 10 días, la densidad de siembra puede variar de 20.000 - 100.000 células / gel.
- Para medirla contractilidad celular, medir el diámetro gel mediante el uso de una regla o una cámara cada 24 horas o en el intervalo de tiempo apropiado.
Nota: Además, correspondientes imágenes recogidas a partir de un microscopio se pueden examinar para las características morfológicas características de la línea celular se sembró en el gel, tales como estructuras acinos-como, túbulos epiteliales, protuberancias celulares, y lameliapodia. - Para evaluar los niveles de proteína, la lisis de los geles en tampón RIPA y el proceso para el análisis de transferencia Western de proteínas de interés como se describe en Wozniak et al. 17 y Gallagher et al. 18.
- IMPORTANTE: En las comparaciones de la contractilidad entre las líneas celulares, normalizar la contractilidad de ADN total, que se puede extraer de los geles como se indica por Lui, et al 19, o para un inmutables, proteína de limpieza (histonas, GAPDH, etc.) a través de Western. El análisis de transferencia, como se describe en Wozniak et al. 17 y Gallagher et al. 18. Si las células contando dentro del gel utilizando un hemocitómetro, asegúrese de normalizar el número de células de la superficie total de gel como el gel de contratación se concentrará células.
- geles de alimentación cada 3 - 4 días mediante la eliminación de 1 ml de medio y reemplazándolo con 1 ml de medio fresco. Asegúrese de alimentar geles después de la medición se toma como la adición de medios / suero fresco causará un aumento en la contractilidad.
3. Generación de PDMS microcanales para la alineación de fibra de colágeno
Nota: Para generar matrices de colágeno alineadas, un molde de PDMS microcanales (Figura 2A) requiere un maestro de silicio SU-8 realizado a través de la litografía blanda-15.
- Para hacer que los canales de PDMS, la mezcla de PDMS a fondo en un vaso desechable con un palito de madera. Para un maestro de silicona 6 pulgadas, mezclar 20 g de base de elastómero con 2 g de agente de curado.
- De-gas la mezcla de PDMS colocando el vaso desechable en una cámara de vacío bajo una presión de vacío de550 mm Hg. De-gas por 1 - 1,5 horas.
- Mientras que la desgasificación del PDMS, preparar el maestro de silicona para el vertido. Preparar colocando una hoja de película de transparencia sobre una placa caliente seguido por el maestro de silicona. Asegúrese de que el molde de microcanales hacia arriba.
NOTA: durante la colada PDMS y curado, se intercala el maestro de silicona entre dos hojas de película de transparencia. - Después de 1 - 1,5 horas, retire el PDMS desgasificado de la cámara de vacío, y poco a poco se vierte sobre el maestro de silicona.
IMPORTANTE: Evitar las burbujas de aire. Siga vertiendo en el centro de la maestra, y permitir que la gravedad distribuirla uniformemente.
NOTA: La caída de PDMS no necesita extenderse todo el camino hasta el borde de la maestra. - Después de PDMS se ha vertido en el maestro, aplicar una segunda lámina de película de transparencia en la parte superior del maestro de silicona y PDMS. Con cuidado, gire la segunda hoja de transparencia hacia abajo en la parte superior del maestro PDMS / silicona para evitar burbujas de aire. No se apresure. PDMS deben ahora uniformemente distribuidas oamo ver.
- Con cuidado, coloque una hoja de goma en la parte superior de la transparencia, seguido de una "hoja de acrílico 1/8.
- Añadir tres 10 libras pesas en la parte superior de la hoja de acrílico. Inicialmente, los pesos se "flotar". Deje que se asientan y se estabilicen antes de seguir adelante.
- Establecer temperatura de la placa a 70 C y curado PDMS durante 4 horas. Deje que se enfríe por un mínimo de 1 hora adicional antes de molestar.
- Retire con cuidado la hoja superior de película de transparencia de la oblea, y quitar los canales con una pinza.
- Almacenar en el plato libre de polvo hasta que esté listo para su uso.
4. Preparar PDMS microcanales de uso
- Coloque los canales boca abajo sobre nueva, limpia película de transparencia. Limpiar todos los puertos (Figura 2b) usando un movimiento circular con unas pinzas cortantes. Retire cualquier fragmento de PDMS.
- canales limpios mediante el uso de un pedazo de cinta de embalaje como un trapo pegajoso. Aplique cinta a la superficie del banco (parte adhesiva hacia arriba), y luego ajuste el canal on superior. Presione hacia abajo en los canales con extremo redondo del fórceps para asegurar un buen contacto. Retire y repetir en ambos lados hasta que se elimina la suciedad visible.
- Transferencia de limpiado, preparada canales de PDMS en una cónica 50 ml con 70% EtOH. Vortex a velocidad máxima durante 30 segundos. Desechar EtOH y reemplazar con fresco EtOH al 70%. Almacenar en EtOH al 70% hasta que esté listo para su uso.
- En campana de cultivo de tejidos y el uso de técnicas asépticas, transferir los canales de PDMS a una cubierta de vidrio limpio y estéril o vidrio platos de fondo. Ponga el canal lateral y UV tratamiento hasta que se haya evaporado EtOH.
- Una vez seco, voltear el PDMS por lo que los canales estén mirando hacia abajo hacia el cubreobjetos. Pulse el canal de PDMS abajo en el cristal para hacer un buen sello. Añadir un parche de PDMS estériles para cubrir / cerrar el puerto central (puerto B, Figura 2b). Deje que se seque completamente antes de continuar.
- Pre-recubrir el interior de la canal con colágeno / ml 10 g de agua estéril. Para recubrir, colocar una gota de 100 l en la parte superior de un channel, y dibujar a través de vacío. Después de 1 hora a 37 ° C, los canales de transferencia llenos de solución de recubrimiento de colágeno a un refrigerador. Enfriar durante aproximadamente 15 - 30 min.
- Retire la solución de revestimiento de colágeno con un aspirador o una pipeta, y comenzar la preparación de colágeno.
5. Preparación de colágeno para uso en microcanales
- En el hielo, neutralizar colágeno (1: 1) con HEPES enfriada con hielo 100 mM en 2x PBS, pH 7,4. Mezclar bien hasta que sea homogénea (Para más detalles, véase la sección 1.1).
- Diluir colágeno neutralizado a las concentraciones apropiadas con los medios de comunicación celular (Para más detalles, véase la sección 1.2). Incubar durante 15 minutos en hielo.
- Al mismo tiempo, el enfriamiento canales en hielo montado.
NOTA: El objetivo es tener todos los componentes para el proceso de canal a 4 ° C o por debajo. El colágeno temperatura de nucleación y el tiempo son parámetros clave para el proceso de polimerización, y pueden ser el punto de partida para una mayor optimización, si es necesario. - Councélulas T con un hemacitómetro y resuspender en la densidad de siembra apropiada en este momento. Para facilidad de cálculos, resuspender a 1 - 3 millones de células / ml. (Para más detalles, véase también la sección 2.1).
- Una vez que las células han sido contados y 15 minutos han pasado, continúe con el colágeno vertido.
6. Verter alineados y microcanales aleatoria de colágeno
- Antes de elaborar colágeno a través de canales, ajustar y fijar la presión de vacío con un regulador de vacío en línea. La presión de vacío proporciona la fuerza para inducir y controlar la velocidad de flujo de colágeno, que determina el grado de alineación.
- Para matrices aleatorias o no alineados, utilizar una amplia canal (3 mm de ancho x 200 m de altura) con una presión de vacío de 10 mm Hg o menos.
- Para matrices alineadas, utilice estrecho canal (1 mm de ancho x 200 m de altura) con una presión de vacío de 60 mm Hg o mayor.
- Retire canal montada de hielo y colocar sobre la superficie limpia y desinfectada de flujo laminar hud.
- Trabajar de forma rápida y cargar 120 - 150 l de colágeno neutralizado en el puerto A (Figura 2b).
- Dibuje colágeno a través del canal mediante la colocación de una pipeta de 25 ml unido a la línea de vacío a través del puerto c (Figura 2b). Dibuje colágeno a través de un solo movimiento, uniforme. IMPORTANTE: Para matrices aleatorias o no alineados, dibujar colágeno lentamente a través del canal (aproximadamente 0,5 - 1 mm por segundo), y parar una vez que llegue al final. Para matrices alineados, dibujar el colágeno a través de más rápidamente, pero tenga cuidado para evitar burbujas de aire.
- Eliminar cuidadosamente el exceso de colágeno de la región con el puerto Pipetman p200 o aspirador.
- Colocar parches PDMS estériles sobre ambos puertos A y C. Todos los puertos ahora deben ser cubiertos.
- Después de 2 - 3 minutos, retirar de muestra central PDMS (puerto B) y añadir 2 - 3 l de células (5 - de 10 mil células) en el puerto central. Deje que se polimeriza parcialmente (a su vez opaco) a temperatura ambiente durante otros 10 - 15 min.
- después de 10- 15 min, la transferencia a 37 ° C durante otros 15 - 30 minutos para terminar la polimerización. Retire las cubiertas de PDMS y añadir medios para cubrir completamente las células de canal y de cultivo, según sea necesario. Las células pueden ser alimentados mediante la eliminación de un ml de los viejos medios, y su sustitución por un ml de los nuevos medios.
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Representative Results
Mientras que los ensayos en 3D se pueden hacer dentro de la misma rigidez del gel de colágeno, la variación de la rigidez del gel se puede utilizar para determinar cómo las células responden a los cambios mecánicos en su microambiente celular. Un hidrogel de colágeno rígido se define como un gel, donde las células embebidas no son capaces de contraerse localmente el colágeno circundante. La contractilidad intrínseca de diferentes tipos de células es único, y por lo tanto es mejor empezar con una curva de la contractilidad sencillo, para determinar la concentración de colágeno que se percibió como compatible y rígido es.
Comience manteniendo constante el número de células y el aumento de la concentración del gel de colágeno. La rigidez del gel se escala de manera exponencial con la concentración, como se indica anteriormente 10,20. Un ejemplo representativo de un ensayo de la contractilidad se muestra en la Figura 1. Aquí, 50.000 4T1 células están incrustadas en eithera 2 mg / ml o gel de colágeno 3,5 mg / ml durante 5 días. La línea celular 4T1 es una altamente contráctil, línea de cáncer metastásico, pero sólo es capaz de contraer el gel de alta densidad en aproximadamente un 10% (Figura 1a, c). Este bajo nivel de contracción es típico para una clasificación gel rígido. Geles de baja densidad comparables (2 mg / ml, la figura 1b, c) se contrajo 57% (n = 4) durante el mismo período de tiempo. Es importante tener en cuenta que el aumento de la cantidad de ligando de colágeno puede afectar vías de señalización celular, por lo tanto, un segundo medio para variar la rigidez es mantener la constante de la concentración de colágeno y comparar geles que son restringidos (rigidez) al ser la izquierda unida a la parte inferior de el plato o contráctil (compatible), ya que han sido puestos en libertad para flotar libremente en el medio celular. Esto puede servir como un buen control para determinar si los cambios en la señalización celular resultan del aumento de ligando de colágeno o la rigidez de la matriz.
Una vez que se logra el dominio de la incrustación de las células dentro de matrices en 3D, los ensayos pueden modificarse para alterar la organización y la orientación de las fibras de colágeno. Esto se logra mediante el uso de canales de microfluidos PDMS (Figura 2). Para el propósito de este manuscrito, se utilizaron dos conformaciones similares, un estrecho y un canal de ancho, con 3 aberturas o puertos (Figura 2b). En un experimento típico para determinar la respuesta celular al azar en comparación con matrices alineadas, el colágeno no polimerizada se extrae a través del canal microfluídico desde el puerto A al puerto C con células que se añaden al puerto B. El grado de alineación de colágeno está modulada por la tasa de colágeno fluyen de tal manera que las tasas de flujo más alta de colágeno producen una mejor alineación. El uso de canales más estrechos junto con mayorpresiones de vacío mejora la alineación de la red de colágeno, mientras que un canal más ancho se utiliza junto con bajas presiones de vacío genera matrices aleatorias. La organización de la red fibrilar puede ser visualizado por segunda generación de armónicos, como se muestra en imágenes representativas (figura 2c, d). En estas imágenes, las fibras de colágeno (indicados por las puntas de flecha y pseudocoloreada de color morado) se alinean de forma más consistente con el eje del flujo de colágeno en los canales estrechos (Figura 2d). Las fibras de colágeno en canales anchos tener una variedad de orientaciones, y tienen una distribución más al azar (Figura 2c).
La diferencia entre los canales anchos y estrechos es discernible por el ojo humano, pero también puede ser analizado a través de software desarrollado específicamente para el análisis de la fibra. CT-FIRE, un código abierto y el software libre disposición, utiliza un algoritmo basado en curvelet para el pre-procesamiento, seguido deun algoritmo de extracción de la fibra para cuantificar ángulo de la fibra, el grosor, la longitud y la rectitud 21. Para cada condición, más de 500 imágenes se tomaron muestras al azar de diferentes lugares dentro de los canales, y más de 125.000 fibras fueron extraídos y analizados por la TC-FIRE. La posterior histograma ángulo de fibra generada por los estrechos canales (Figura 2f) muestra una clara enriquecimiento de fibras orientadas paralelas a la dirección del flujo. En contraste, los canales de ancho tienen una distribución ángulo más fibra equivalente (Figura 2e) que es consistente con una matriz más al azar.
Es importante destacar que, el uso de dispositivos de microfluidos, como una técnica para controlar la organización y la orientación de las fibras de colágeno, permite la evaluación de diversas respuestas celulares a condiciones de la matriz alteradas. Por ejemplo, Sung et al. determinó que la viabilidad de fibrobasts mamarias humanas depende de la fibra de colágeno.15 Además, el trabajo reciente de nuestro laboratorio demuestra que las células de carcinoma de mama migran más persistente en fibras de colágeno alineados en comparación con las matrices de colágeno aleatorios. 3 Estos resultados ayudan a definir mejor el papel de la microambiente dentro del contexto de la biología mamaria y cáncer de mama. En el futuro, la capacidad de controlar con precisión el microambiente celular 3D permitirá la continuación de las investigaciones de las respuestas celulares importantes en el contexto de diversos estados de enfermedad.
Figura 1. Los geles de colágeno en 3D para la medición de la contractilidad celular y las respuestas celulares a ECM rigidez. 4T1 células se sembraron en tanto (A) 3,5 mg / ml y (B) 2 mg / ml geles de colágeno y se dejaron crecer durante 5 días. Con el tiempo, el gel de colágeno (área grisdentro de la línea de puntos) se contraerá y el diámetro es medido y cuantificado en (c, t de Student, barras de error +/- SD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Generación aleatoria y alineados colágeno Matrices Uso de PDMS microcanales. Una oblea de silicio de seis pulgadas (a) se utilizó como plantilla para PDMS tanto anchos y estrechos microcanales (B). Concentraciones de colágeno idénticos se elaboraron a través de ambos tipos de canales, y las fibras individuales (puntas de flecha, c, d) alinear con la dirección del flujo (flechas) en microcanales estrechas (D). microcanales ancho produjeron matrices más al azar. angl de fibraes con respecto a la parte inferior de la imagen se contaron y se muestran en (e) y (f). Barra de escala = 26 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
geles de colágeno en 3D son una valiosa adición a nuestra caja de herramientas para comprender cómo interpretan las células y responder a su microambiente local. Este manuscrito ha proporcionado un protocolo muy básico para incrustar las células dentro de una matriz de colágeno 3D, y para generar de forma reproducible matrices con las fibras de colágeno al azar o alineados. Ambos protocolos se plataformas como adaptables en diferentes isoformas de colágeno, agentes de reticulación, u otras proteínas de la matriz potencialmente se podrían añadir en el momento de la polimerización. También es fácil de modificar las plataformas para evaluar diferentes marcos de tiempo y los puntos finales para la expresión de genes y la producción de proteínas. Imaging, la evaluación de la proteína y los niveles de ARN, y la lectura de perfiles metabólicos son todos muy compatible con estas técnicas 3D.
Como es importante con todas las técnicas, es importante para evaluar la calidad del gel y ensayo. Una señal de un buen gel de colágeno de calidad es uno que puede manejar la manipulación manual. Por ejemplo, un 1 ml [1 mg / ml] Gel de colágeno se vierte en una placa de seis pocillos debe ser fácilmente recogido con una pinza y manipulado. Si se rompe el gel o fragmentos, la calidad del gel es subóptima, y los pasos deben tomarse para mejorar la polimerización del colágeno. La temperatura y pH son los parámetros más importantes que se requieren para la buena formación de la fibra y la gelificación. Iniciar el proceso de resolución de problemas, asegurándose de que todos los componentes se mantienen en hielo hasta que esté listo para que se produzca la gelificación. También es muy importante para asegurarse de que el tampón de neutralización y el colágeno solución madre se mezclan a fondo. A continuación, verificar que el pH del tampón de neutralización es a pH 7,4. A HEPES tamponada PBS se recomienda porque es muy compatible para cultivo de tejidos, tiene un amplio intervalo de tamponamiento, y las soluciones madre tienden a ser muy estable a 4 ° C durante largos períodos de tiempo. También tiene el beneficio añadido de producir fibras más largas, más curvadas que son más similar al estado fisiológico 15. NaOH es otro commoólo utilizó solución neutralizante, pero tiene que ser titularon más de cerca. También parece tener el efecto de producir más cortas, fibras más gruesas 15. Independientemente, el pH del colágeno neutralizado debe estar a un pH de 7,4. Si todas estas condiciones se satisfacen, y la integridad de los geles todavía no es satisfactoria, entonces el problema radica en la solución de colágeno. Aunque la solución de colágeno tiene una vida útil de cotización de 6 meses a 4 ° C, se ha encontrado que es generalmente más corto que fuentes comerciales afirman cuando se utiliza para geles 3D. Desechar la vieja botella, y la orden de un nuevo lote. No es raro que la calidad del colágeno por parte del fabricante de variar significativamente de un lote a otro.
Además de identificar los geles de colágeno calidad, también es importante identificar los pasos que son críticos para la generación de una buena alineación dentro del microcanal PDMS. El principio subyacente de esta técnica es que la tasa de collflujo a través de los agen microcanal posteriormente induce alineación filamento. Por lo tanto, el paso más crítico en el control del grado de alineación de la fibra es adecuada modulación de la presión de vacío. Para la alineación de colágeno al azar en un microcanal, la presión de vacío debe ser baja, y el colágeno debe fluir lentamente por el canal. Si el colágeno fluye a través de demasiado rápido, las fibras comienzan a alinear. Un canal más ancho hace que esta proposición más fácil. Por el contrario, para una buena alineación de colágeno, las presiones de vacío superior deben ser utilizadas y la solución de colágeno debe ser tirado a través de más rápidamente. Un segundo paso crítico en la generación de matrices alineadas es la temperatura. Es muy importante asegurarse de que todos los componentes y soluciones se enfriaron en hielo antes de su uso. Si los canales no se enfrían antes de su uso, el colágeno en los canales polimeriza demasiado rápidamente, y dará lugar a fibras más finas, más pequeñas. Si el colágeno neutralizado se enfría a 4 ° C y no en el hielo, la enhanced nucleación dará lugar a diámetros de las fibras más grandes que son más difíciles de alinear por el flujo. También es importante para enfriar el microcanal en sí. Sin previo enfriamiento, el pequeño volumen de colágeno se calentará muy rápidamente dando resultados pobres.
Los microcanales de colágeno son una técnica muy útil, pero hay ciertas limitaciones. Por un lado, la alineación en un microcanal inducida por el flujo nunca es perfecta, y nunca será igual a una técnica de alineación inducida por deformación. Siempre habrá algunos fibras orientadas perpendicularmente a la dirección del flujo, pero la reproducibilidad, la adaptabilidad y facilidad de uso superiores a las pequeñas variaciones en alineación dentro del canal. Más importante aún, se ha demostrado que las células para detectar eficazmente los pequeños cambios en la alineación, y responder a la migración más persistentes en estos canales 3,15. Las células se incrementará también la alineación de la canal como sus números aumentan y comienzan a migrar. Si es mayor i alineacións es necesario, los microcanales de PDMS se pueden modificar fácilmente a las dimensiones más estrechas o tener pequeñas constricciones para mejorar la alineación. Ambos se han demostrado ser eficaces, pero tienen otras compensaciones asociadas 16. Otra limitación de la técnica de microcanal es que el canal de PDMS tiene poca permeabilidad a las drogas o colorantes fluorescentes. Esto significa que estos compuestos tienen que difundirse por el canal de los puertos, lo que es sorprendentemente lenta, y pueden plantear dificultades para lavado de tratamientos.
Aunque existen ciertas limitaciones a esta plataforma de microcanales, sí ofrece varias ventajas sobre las técnicas existentes. Es más experimentalmente accesible, ya que no requiere instrumentos voluminosos 3,13 o pequeñas poblaciones de células para la generación de alineación. También no requiere perlas magnéticas exógenos 13,14 que tienden a ser autofluorescentes y podría reticular artificialmente la red de colágeno. El colágeno es microcanalTambién simplemente más rentable y económica. Además de las ventajas actuales, sino que también tiene numerosos beneficios que podrían ser aprovechadas en aplicaciones futuras. Por un lado, el microcanal colágeno puede ser diseñado o modificado en casi cualquier configuración o experimento. Los diseños avanzados permiten que los canales para crear tubos de colágeno huecos o estructuras 3D para imitar la arquitectura de órganos o tumores 22 simplificados. Por otra parte, los canales pueden estar hechos de materiales distintos de PDMS. Potencialmente, esto podría transmitir diferentes propiedades mecánicas de las redes o matrices de colágeno embebidos. Por último, la pequeña cantidad de reactivos utilizados para este ensayo también puede hacer que sea atractivo y económico para pantallas de alto rendimiento más pequeños.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar
Acknowledgments
Los autores desean reconocer los números de subvención UO1CA143069, R01CA142833, R01CA114462, RO1CA179556, T32-AG000213-24 y T32-GM008692-18 para financiar este trabajo. También reconocemos Jeremy Bredfelt y Liu Yuming de loci para el desarrollo y la asistencia con el análisis CT-FIRE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High Concentration Rat Tail Collagen | Corning | 354249 | |
| SylGard184 elastomer kit | Corning | NC9285739 | Elastomer for PDMS channels |
| HEPES | Fisher | BP310 | For HEPES neutralization buffer |
| KCl | Fisher | BP366 | For HEPES neutralization buffer |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | For HEPES neutralization buffer |
| Na2HPO4 | Fisher | S374 | For HEPES neutralization buffer |
| NaCl | Fisher | BP358 | For HEPES neutralization buffer |
| Levy Improved Neubauer Hemacytometer | Fisher | 15170-208 | cell counting |
| 6-well non-tissue culture plate | Corning | 351146 | |
| 50 mm glass bottom dish | MatTek | P50g-1.5-30-f | |
| Bel-Art Plastic Vacuum Desiccator | Bel-Art | F4200-2021 | Degassing chamber for PDMS |
| transparency film | 3M | pp2950 | Plastic film for pouring pdms channels |
| ThermoScientific CimaRec | ThermoScientific | HP141925 | Hot plate for curing PDMS microchannels |
| Vacuum regulator | Precision Medical | PM3100 | Vacuum regulator for collagen microchannels |
| 8" x 8" rubber sheet | Amazon - Rubber-Cal | Silicone - 60A | rubber sheet for pouring PDMS microchannel |
| 8" x 8" x 0.125" acrylic sheet | Amazon | Plexiglass sheets | for pouring PDMS microchannels |
| 10 lb weights | Amazon | CAP Barbell | for pouring PDMS microchannels |
| 15 ml Conical tubes | Fisher | 352097 | |
| 50 ml Conical tubes | Fisher | 352098 | |
| Plastic pipets | Dot Scientific | 229202B, 229206B, and 667225B | 2 ml, 5 ml, and 25 ml |
| 70% EtOH | Fisher | NC9663244 |
References
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