Summary
Kollagen är en central del av ECM, och ger viktiga ledtrådar för flera cellulära processer som sträcker sig från övergången till differentiering och proliferation. Förutsatt här är ett protokoll för att bädda in celler i 3D-kollagen hydrogeler, och en mer avancerad teknik för att generera randomiserade eller inriktade kollagenmatriser använder PDMS mikro.
Protocol
1. neutralisering Utspädning och Polymerisering av kollagenlösningar för 3D undersökning och Cellular Contraction analyser
- På is i steril vävnadsodling huva, neutralisera kollagen (1: 1) med steril, iskall 100 mM HEPES i 2x PBS, pH 7,4, i en 15 ml koniska rör. Blanda noga med plastpipett tills lösningen är homogen och blandnings virvlar runt är inte längre syns. Var noga med att inte införa luftbubblor under blandningsprocessen. Lagra kort på is.
- Späd neutraliserade kollagen till lämplig koncentration med cellmedium (såsom RPMI, DMEM, etc.).
- För att beräkna mängden neutraliserad kollagen som behövs för att göra upp önskad kollagenkoncentration, använd ekvationen N = (D * V) / (S / 2), där N är mängden neutraliserad kollagen krävs, är D den önskade kollagenkoncentration, är V den slutliga volymen av den önskade kollagenkoncentration, och S är tHan börjar lager kollagen koncentration.
- Ta upp den mängd neutraliserad kollagen till volym genom tillsats av en cell och cellmedielösning. Blanda väl och förvara på is tills redo att kasta.
- Exempel: För en 2 mg / ml gel i en 1 ml gelvolym (typisk volym för en gel gjuten i 6-brunnsplatta eller 50 mm glas nedre skålen), multiplicera först den önskade koncentrationen (2 mg / ml) med den önskade slutliga volymen (1 ml). Ta detta nummer (2 mg) och dividera den med hälften av beståndet koncentration anges på flaskan (9,49 mg / ml). I detta fall 0,42 ml av den neutraliserade kollagen späds med 0,58 ml / cellblandningen medier.
- Pipet den iskalla kollagen / cell / media blandningen i antingen en icke-vävnadskultur behandlas 6-brunnar eller en 50 mm glas nedre skålen. Använd pipettspets att jämnt sprida ut lösningen.
OBS: Det är viktigt att använda en icke-vävnadsodlingsbehandlade plattan för att minimera fastsättningen eller tillväxt av cellerna utanför collagsv gel. - Gör det möjligt att polymerisera vid rumstemperatur under ca 10 - 15 min. Gelerna ska vända ogenomskinliga vid polymerisation.
- Efter det har visat ogenomskinlig, flytta plattan eller skålen 37 ° C för ytterligare 45-60 minuter för att avsluta polymerisationen.
- Efter 45 - 60 minuter, tillsätt 2 - 3 ml media och släppa geler från sidorna av brunnen genom att köra en P200 pipettspets runt omkretsen av bra eller skålen. Swirl skålen försiktigt för att frigöra gelén. Kollagengelen bör vara flytande i media.
2. Western blotting, Cell Morphogenesis och Gel Gontractility analys
- För att bedöma proteinnivåer, morfologi eller cellulära kontraktilitet i förhållande till ECM styvhet, börja med att hälla kollagengeler, enligt 1,1-1,6, ympades med celler för en 7-10 dagars analys. Bestäm varje cellinje sådd hastighet empiriskt beroende på tillväxttakten och confluency. För en 10 dagars analys kan såddtäthet varierar från 20.000 - 100.000 celler / gel.
- Att mätacell kontraktilitet, mät gelén diameter med användning av en linjal eller en kamera varje 24 h eller vid lämpligt tidsintervall.
Obs: Dessutom kan undersökas motsvarande bilder som samlats in från ett mikroskop vara för morfologiska egenskaper karakteristiska för cellinje ympades i gelén, såsom acini liknande strukturer, epiteliala tubuli, cellulära utsprång och lameliapodia. - För att bedöma proteinnivåer, lysera geler i RIPA-buffert och processen för Western blot-analys av proteiner av intresse som beskrivs i et al. Wozniak 17 och Gallagher et al. 18.
- OBSERVERA: I jämförelser av kontraktilitet mellan cellinjer, normalisera kontraktilitet till totalt DNA, som kan extraheras från gelerna som den beskrivs av Lui et al 19, eller till ett oföränderligt, housekeeping protein (histoner, GAPDH, etc.) genom Western. blot-analys, såsom beskrivs i Wozniak et al. 17 och Gallagher et al. 18. Om räkna celler i under användning av en hemocytometer, se till att normalisera cellantalet till total gel område som den upphandlande gel kommer att koncentrera celler.
- Foder geler var 3 - 4 dagar genom att ta bort 1 ml av media och ersätta den med en ml färskt medium. Se till att mata geler efter mätningen tas som tillsats av färsk media / serum kommer att orsaka en stegring i kontraktilitet.
3. Framställning av PDMS mikro för kollagenfiber Alignment
OBS: För att generera inriktade kollagenmatriser, en form för PDMS mikro (Figur 2A) kräver en SU-8 kisel mästare görs via mjuk litografi 15.
- För att göra PDMS kanaler, blanda PDMS noggrant i en engångsbehållare med ett hantverk pinne. För en sex tums silikon herre, blanda 20 g av elastomerbasen med 2 g av härdare.
- De-gas PDMS blandningen genom att placera engångsskålen i en vakuumkammare under ett vakuumtryck av550 mm Hg. De-gas till 1 - 1,5 timmar.
- Medan de-gasning PDMS, förbereda silikon master för att hälla. Förbered genom att placera ett blankt OH-film på en värmeplatta, följt av silikon mästare. Se till att mikro formen är vänd uppåt.
OBS: Under PDMS gjutning och härdning, kommer silikon mästare placeras mellan två ark av OH-film. - Efter 1-1,5 h, avlägsna avgasad PDMS från vakuumkammaren, och långsamt häll över silikon mästare.
VIKTIGT: Undvik luftbubblor. Fortsätt att hälla i mitten av mästare, och låta gravitationen för att sprida det jämnt.
OBS: PDMS droppe behöver inte sträcka sig hela vägen till kanten av befälhavaren. - Efter PDMS har hällts på befälhavaren, tillämpa en andra ark av OH-film ovanpå silikon mästare och PDMS. Försiktigt, rulla andra öppenhet ark ner ovanpå PDMS / silikon befälhavaren att undvika luftbubblor. Stressa inte. PDMS bör nu jämnt over mästare.
- Placera försiktigt en gummiduk ovanpå insyn, följt av en "akrylskiva 1/8.
- Tillsätt tre 10 lb vikter ovanpå akryl blad. Inledningsvis vikterna kommer att "flyta". Låt dem lösa och stabilisera innan du går vidare.
- Inställd värmeplatta temperatur till 70 ° C och härdnings PDMS under 4 h. Låt svalna i minst ytterligare en timme innan störa.
- Dra försiktigt toppskiktet av OH-film från skivan, och ta bort kanaler med en pincett.
- Förvaras i dammfri skålen tills den ska användas.
4. förbereder PDMS mikro för användning
- Placera kanaler upp och ner på ny, ren OH-film. Rengör alla portar (figur 2b) med hjälp av cirkelrörelse med en vass pincett. Ta bort alla fragment av PDMS.
- Rena kanaler med hjälp av en bit av förpackningstejp som en putstrasa. Applicera tejp på ytan av bänken (klibbiga sidan uppåt), och sedan ställa in kanal on topp. Tryck ner kanaler med runda änden av tång för att säkerställa god kontakt. Ta bort och upprepa på båda sidor tills synliga skräp tas bort.
- Överföring rengöras, prepped PDMS kanaler in i en 50 ml konisk med 70% EtOH. Vortex vid maximal hastighet under 30 sek. Kasta EtOH och ersätta med färsk 70% EtOH. Förvaras i 70% EtOH tills den ska användas.
- I vävnadsodling huva och med aseptisk teknik, överföra PDMS kanaler till en ren och steril skyddsglas eller glas botten rätter. Sätt kanalsidan uppåt och UV behandla tills EtOH avdunstat.
- När torr, vända PDMS så kanalerna nedåt mot coverglass. Tryck på PDMS kanalen ner på glaset för att göra en bra tätning. Lägg en lapp av sterila PDMS att täcka / stänga mitt port (port B, figur 2b). Låt torka helt innan du fortsätter.
- Förbeläggning insidan av kanalen med 10 | ig / ml kollagen i sterilt vatten. Att belägga, placera en 100 pl droppe på toppen av en kanaliel, och dra igenom med vakuum. Efter 1 h vid 37 C och överför kanaler fyllda med kollagenbeläggningslösning till ett kylskåp. Kyla för cirka 15-30 minuter.
- Ta kollagenbeläggningslösning med aspirator eller pipett och börja kollagen beredning.
5. Kollagen Förberedelse för användning i mikro
- På is, neutraliserar kollagen (1: 1) med iskall 100 mM HEPES i 2x PBS, pH 7,4. Blanda väl tills homogen (För mer information, se avsnitt 1.1).
- Späd neutraliserade kollagen till lämpliga koncentrationer med cellmedium (För mer information, se avsnitt 1.2). Inkubera under 15 min på is.
- Samtidigt, monterad chill kanaler på is.
OBS: Målet är att ha alla komponenter för kanalprocessen vid 4 C eller lägre. Kollagen kärntemperatur och tid är viktiga parametrar till polymeriseringsprocessen, och kan vara utgångspunkten för ytterligare optimering, om det behövs. - CounT-celler med en hemacytometer och återsuspendera vid lämplig såddtäthet vid denna tidpunkt. För att underlätta beräkningarna, återsuspendera till 1 - 3 miljoner celler / ml. (För mer information, se även avsnitt 2.1).
- När celler har räknats och 15 minuter har gått, fortsätt till kollagen hälla.
6. Hälla inriktade och Random Collagen mikro
- Innan man drar kollagen genom kanaler, justera och ställa vakuumtryck med en inline vakuumregulator. Vakuumtryck ger kraften för att inducera och kontrollera hastigheten av kollagen flöde, som bestämmer graden av anpassning.
- För slumpmässiga eller ej anpassade matriser, använd en bred kanal (3 mm bred x 200 fim lång) med ett vakuumtryck av 10 mm Hg eller mindre.
- För inriktade matriser, använder smal kanal (1 mm bred x 200 fim lång) med ett vakuumtryck av 60 mm Hg eller högre.
- Ta monterade kanal från is och placera på ren, desinficerad yta av laminärt flöde hood.
- Arbeta snabbt och lasta 120 - 150 il neutraliserade kollagen i hamn A (Figur 2b).
- Dra kollagen genom kanalen genom att placera en 25 ml pipett fäst till vakuumledningen över port c (figur 2b). Dra kollagen genom en enda, enhetlig rörelse. VIKTIGT: För slumpmässiga eller ej anpassade matriser, dra kollagen långsamt över kanal (ca 0,5-1 mm per sekund), och stannar när den når slutet. För inriktade matriser, dra kollagen över snabbare, men vara noga med att undvika luftbubblor.
- Försiktigt bort överskott kollagen från öppningsområdet med p200 Pipetman eller aspirator.
- Placera sterila PDMS fläckar över båda portarna A och C. Alla portar bör nu täckas.
- Efter 2 - 3 minuter, ta bort center PDMS patch (port B) och tillsätt 2 - 3 pl celler (5 - 10 tusen celler) i mitten hamnen. Gör det möjligt att partiellt polymerisera (vrid ogenomskinlig) vid rumstemperatur under ytterligare 10 - 15 min.
- efter 10- 15 minuter, överföring till 37 ° C för ytterligare 15 - 30 minuter för att avsluta polymerisationen. Ta bort PDMS omslag och lägga till media för att helt täcka kanal och kulturceller som behövs. Celler kan matas genom att avlägsna en ml gamla medier, och ersätta den med en ml av nya medier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Även 3D analyser kan göras inom samma styvhet kollagengel, varierande gel styvhet kan användas för att bestämma hur cellerna reagerar på mekaniska förändringar i deras cellulära mikromiljö. En styv kollagen hydrogel definieras som en gel där de inbäddade cellerna inte kan lokalt dra ihop den omgivande kollagen. Den inneboende kontraktilitet av olika celltyper är unikt, och därför är det bäst att börja med en enkel kontraktilitet kurva för att fastställa kollagenkoncentration som kommer att avkännas som överensstämmande och stela.
Börja genom att hålla cellantal konstant och öka koncentrationen av kollagengelen. Styvheten hos gelén kommer att skala exponentiellt med koncentration, som visas tidigare 10,20. Ett representativt exempel på en kontraktiliteten assay visas i figur 1. Här används 50.000 4T1-celler inbäddade i eithera 2 mg / ml eller 3,5 mg / ml kollagen gel för 5 dagar. Den 4T1 cellinje är en mycket sammandragande, metastaserande cancer linje, men är bara att dra sig samman med hög densitet gel med cirka 10% (Figur 1a, c). Denna låga nivå av kontraktion är typiskt för en styv gel klassificering. Jämförbara låga geler densitet (2 mg / ml, Figur 1b, c) kontrakt 57% (n = 4) under samma tidsperiod. Det är viktigt att notera att en ökning av mängden kollagen ligand kan påverka cellsignalvägar, därför ett andra medel för att variera styvheten att hålla kollagenkoncentrationen konstant och jämföra geler som är fastspända (stela) genom att lämnas kvar på botten av skålen eller kontraktila (kompatibel) eftersom de har släppts flyta fritt i cellmediet. Detta kan tjäna som en god kontroll för att avgöra om förändringar i cellulär signalering resultera från ökad kollagen ligand eller styvheten hos matrisen.
När behärskning av bädda celler i 3D-matriser uppnås, kan analyser modifieras för att förändra organisationen och orienteringen av kollagenfibrer. Detta uppnås genom användning av PDMS mikroflödessystem kanaler (Figur 2). Vid tillämpning av detta manuskript, var två liknande konformationer som används, en smal och en bred kanal, med 3 öppningar eller portar (figur 2b). I ett typiskt experiment för att bestämma den cellulära responsen till slumpmässig jämfört med i linje liggande matriser, är opolymeriserad kollagen dras genom mikroflödeskanalen från port A till port C med celler läggs till port B. Den grad av kollagen uppriktning moduleras av den kollagen flöde så att högre kollagenflödeshastigheter ger bättre anpassning. Användningen av smalare kanaler i kombination med högrevakuumtryck förbättrar anpassningen av kollagen nätverket, medan en bredare kanal som används i samband med låga vakuumtryck genererar slumpmässiga matriser. Organisationen av fibrillära nätverk kan visualiseras genom andra harmoniska generationen, som visas i representativa bilder (figur 2c, d). I dessa bilder, de kollagenfibrer (indikeras av pilarna och pseudocolored i lila) rikta mer konsekvent med axeln av kollagen flödet i de smala kanaler (figur 2d). Kollagenfibrerna i breda kanaler har en mängd olika orienteringar, och har en mer slumpvis fördelning (figur 2c).
Skillnaden mellan breda och smala kanaler är urskiljbar för det mänskliga ögat, men kan också analyseras via mjukvara som utvecklats speciellt för fiberanalys. CT-FIRE, en öppen källkod och fritt tillgänglig programvara utnyttjar en curvelet baserad algoritm för förbehandling följt aven fiberutvinning algoritm för att kvantifiera fiber vinkel, tjocklek, längd och rakhet 21. För varje tillstånd, var mer än 500 bilder slumpvis prov från olika platser i kanalerna, och mer än 125.000 fibrer extraherades och analyserades med CT-FIRE. Den efterföljande fibervinkeln histogram genereras för de smala kanaler (figur 2f) visar en tydlig anrikning av fibrer orienterade parallellt med flödesriktningen. I kontrast, breda kanaler har en mer ekvivalent fibervinkelfördelningen (figur 2e) vilket överensstämmer med en mer slumpmässig matris.
Viktigt är att användningen av mikroflödessystem enheter, som en teknik för att styra organisationen och orienteringen av kollagenfibrer, möjliggör en bedömning av olika cellulära svar på förändrade matrisförhållanden. Till exempel, Sung et al. fastställt att lönsamheten för de mänskliga bröst fibrobasts är beroende av kollagenfibrer.15 Dessutom senaste arbete från vårt laboratorium visar att bröstkarcinomceller migrera mer ihärdigt på linje kollagenfibrer jämfört med slumpmässiga kollagenmatriser. 3 Dessa resultat bidrar till att bättre definiera den roll som mikro inom ramen för bröst biologi och bröstcancer. Framåt, förmågan att exakt styra 3D cellulära mikro kommer att möjliggöra fortsatt utredning av viktiga cellulära svar inom ramen för många olika sjukdomstillstånd.
Figur 1. 3D koUagengeler för mätcell Kontraktilitet och cellulära svaren till ECM styvhet. 4T1 celler ströks ut i både (A) 3,5 mg / ml och (B) 2 mg / ml kollagen geler och fick växa under 5 dagar. Med tiden kollagengelen (grått områdeinom streckad linje) kommer att krympa och diametern mäts och kvantifieras i (c, t-test, felstaplar +/- SD). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Generera Random och Aligned Collagen matriser med PDMS mikrokanaler. En sex tums kiselskiva (a) användes som en mall för både breda och smala PDMS mikrokanaler (b). Identiska kollagenkoncentrationer drogs genom båda typer av kanaler, och enskilda fibrer (pilspetsar, c, d) i linje med strömningsriktningen (pilar) i smala mikrokanaler (D). Breda mikro gav mer slumpmässiga matriser. fiber angles med avseende på botten av bilden räknades och visas i (e) och (f). Skala bar = 26 um. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D kollagengeler är ett värdefullt tillskott till vår verktygslåda för att förstå hur celler tolka och svara på deras lokala mikromiljö. Detta manuskript har gett en mycket grundläggande protokoll för att bädda in celler i en 3D kollagenmatris, och reproducerbart generera matriser med slumpmässiga eller riktade kollagenfibrer. Båda protokollen fungerar som anpassnings plattformar där olika kollagen isoformer, tvärbindningsmedel, eller andra matrixproteiner skulle kunna tillsättas vid tidpunkten för polymerisation. Det är också lätt att ändra plattformar för att utvärdera olika tidsramar och slutpunkter för genuttryck och proteinproduktion. Imaging, bedöma protein och RNA-nivåer, och läsa metaboliska profiler är alla mycket kompatibla med dessa 3D tekniker.
Som är viktigt med alla tekniker, är det viktigt att bedöma kvaliteten på gelén och analys. Ett tecken på en god kvalitet kollagengel är en som kan hantera manuell manipulation. Till exempel, en 1 ml [1 mg / ml] Kollagengel hälls i en sex brunnar bör vara lätt plockas upp med pincett och manipuleras. Om gel tårar eller fragment, är kvaliteten på gelén suboptimal, och åtgärder måste vidtas för att förbättra kollagen polymerisation. Temperatur och pH är de viktigaste parametrar som krävs för god fiberbildning och gelbildning. Börja felsökningsprocessen genom att se till att alla komponenter hålls på is tills redo för gelning att inträffa. Det är också mycket viktigt att vara säker på att neutraliseringsbuffert och kollagen stamlösningen är under blandas noggrant. Därefter kontrollera att pH neutralisering bufferten är vid pH 7,4. En HEPES-buffrad PBS rekommenderas eftersom det är mycket kompatibel med vävnadskultur, har ett brett buffertområde, och stamlösningar tenderar att vara mycket stabilt vid 4 C under långa tidsperioder. Det har också den ytterligare fördelen av att producera längre, mer böjda fibrer som är mer lik den fysiologiska tillstånd 15. NaOH är ett annat commoNLY används neutraliserande lösning, men måste titreras närmare. Det förefaller också att ha effekten att producera kortare, tjockare fibrer 15. Oavsett, bör pH hos den neutraliserade kollagen vara vid ett pH av 7,4. Om alla dessa villkor är att nöjda, och integritet gelerna är fortfarande inte tillfredsställande, då problemet ligger hos aktiekollagenlösningen. Även om beståndet kollagenlösningen har ett noterat hållbarhetstid på 6 månader vid 4 ° C, har vi funnit att det i allmänhet är kortare än kommersiella källor hävdar när den används för 3D-geler. Kasta det gamla flaskan, och order från en ny del. Det är inte ovanligt för kvaliteten av kollagen från tillverkaren att variera kraftigt från parti till parti.
Förutom att identifiera kvalitet kollagengeler, är det också viktigt att identifiera de åtgärder som är kritiska för generering av god anpassning inom PDMS mikro. Den underliggande principen för denna teknik är att graden av collagen flödet genom mikro därefter inducerar glöd inriktning. Därför är det mest kritiska steget i att kontrollera graden av fiberinriktningen korrekt modulering av vakuumtrycket. För slumpvis kollagen inriktning i en mikro måste vakuumtrycket vara lågt, och kollagen skall rinna långsamt ner i kanalen. Om kollagenet strömmar genom alltför snabbt, kommer fibrerna börja att anpassa. En bredare kanal gör detta förslag enklare. Omvänt, för god kollagen anpassning, högre vakuumtryck måste användas och kollagenlösningen måste dras genom snabbare. Ett andra kritiskt steg i genereringen av inriktade matriser är temperaturen. Det är mycket viktigt att se till att alla komponenter och lösningar kyldes på is före användning. Om kanalerna inte kyls före användning, kommer kollagen i kanalerna polymerisera alltför snabbt, och kommer att resultera i tunnare, mindre fibrer. Om den neutraliserade kollagen kyld vid 4 ° C och inte på is, den ljudtillbed kärn kommer att ge upphov till större fiberdiametrar som är svårare att anpassa efter flödet. Det är också viktigt att kyla mikrokanalen själv. Utan föregående kylning, kommer den lilla volymen av kollagen värmas mycket snabbt vilket gav dåliga resultat.
Kollagenmikro är en mycket användbar teknik, men det finns vissa begränsningar. För en, är inriktningen i en flödes inducerad mikro aldrig perfekt, och kommer aldrig att motsvara en spänningsinducerad inriktningsteknik. Det kommer alltid att finnas vissa fibrer orienterade vinkelrätt mot flödesriktningen, men reproducerbarheten, anpassningsförmåga, och användarvänlighet uppväger de små variationer i inriktning inuti kanalen. Ännu viktigare, har celler visat sig effektivt känna små förändringar i linje, och svara med mer ihållande migration i dessa kanaler 3,15. Cellerna kommer också att förbättra anpassningen av kanalen som deras antal ökar och de börjar migrera. Om större anpassning is behov kan PDMS mikro lätt modifieras till smalare dimensioner eller har små förträngningar att förbättra anpassningen. Båda har visat sig vara effektiva, men har andra associerade kompromisser 16. En annan begränsning till mikrokanalen teknik är att PDMS-kanalen har liten permeabilitet för läkemedel eller fluorescerande färgämnen. Detta innebär att dessa föreningar måste diffundera ner i kanalen från portarna, vilket är överraskande långsam och kan innebära svårigheter att tvätta ut behandlingar.
Även om det finns vissa begränsningar i denna mikro plattform, betyder erbjuder flera fördelar jämfört med existerande tekniker. Det är mer experimentellt tillgänglig som det inte kräver skrymmande instrument 3,13 eller små populationer av celler för generering av inriktning. Det kräver inte heller exogena magnetiska pärlor 13,14 som tenderar att vara autofluorescent och kunde artificiellt tvärbinda kollagennätet. Kollagenmikro ärockså helt enkelt mer kostnadseffektiv och ekonomisk. Utöver de nuvarande fördelar, har den också många fördelar som skulle kunna tränga in framtida tillämpningar. För en, kan kollagenmikro utformas eller modifieras på nästan alla konfiguration eller experiment. Avancerade konstruktioner tillåter kanalerna att skapa ihåliga kollagen rör eller 3D-strukturer för att efterlikna arkitektur förenklade organ eller tumörer 22. Dessutom kan kanalerna tillverkas av andra än PDMS material. Detta skulle kunna förmedla olika mekaniska egenskaper till de inbäddade kollagennätverk eller matriser. Slutligen kan den lilla mängden av reagens som används för denna analys också göra det attraktivt och ekonomiskt för mindre högkapacitetstestning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut
Acknowledgments
Författarna vill tacka för nummer bidrags UO1CA143069, R01CA142833, R01CA114462, RO1CA179556, T32-AG000213-24, och T32-GM008692-18 för att finansiera detta arbete. Vi erkänner också Jeremy Bredfelt och Yuming Liu loci för utveckling av och stöd till CT-FIRE analys.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High Concentration Rat Tail Collagen | Corning | 354249 | |
| SylGard184 elastomer kit | Corning | NC9285739 | Elastomer for PDMS channels |
| HEPES | Fisher | BP310 | For HEPES neutralization buffer |
| KCl | Fisher | BP366 | For HEPES neutralization buffer |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | For HEPES neutralization buffer |
| Na2HPO4 | Fisher | S374 | For HEPES neutralization buffer |
| NaCl | Fisher | BP358 | For HEPES neutralization buffer |
| Levy Improved Neubauer Hemacytometer | Fisher | 15170-208 | cell counting |
| 6-well non-tissue culture plate | Corning | 351146 | |
| 50 mm glass bottom dish | MatTek | P50g-1.5-30-f | |
| Bel-Art Plastic Vacuum Desiccator | Bel-Art | F4200-2021 | Degassing chamber for PDMS |
| transparency film | 3M | pp2950 | Plastic film for pouring pdms channels |
| ThermoScientific CimaRec | ThermoScientific | HP141925 | Hot plate for curing PDMS microchannels |
| Vacuum regulator | Precision Medical | PM3100 | Vacuum regulator for collagen microchannels |
| 8" x 8" rubber sheet | Amazon - Rubber-Cal | Silicone - 60A | rubber sheet for pouring PDMS microchannel |
| 8" x 8" x 0.125" acrylic sheet | Amazon | Plexiglass sheets | for pouring PDMS microchannels |
| 10 lb weights | Amazon | CAP Barbell | for pouring PDMS microchannels |
| 15 ml Conical tubes | Fisher | 352097 | |
| 50 ml Conical tubes | Fisher | 352098 | |
| Plastic pipets | Dot Scientific | 229202B, 229206B, and 667225B | 2 ml, 5 ml, and 25 ml |
| 70% EtOH | Fisher | NC9663244 |
References
- Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. Am J Pathol. 178, 1221-1232 (2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, 38 (2006).
- Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophys J. 107, 2546-2558 (2014).
- Even-Ram, S., Yamada, K. M.
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188, 11-19 (2010).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197, 439-455 (2012).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).
- Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. J Cell Biol. 163, 583-595 (2003).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
- Tlsty, T. D., Coussens, L. M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu Rev Pathol. 1, 119-150 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys J. 95, 5374-5384 (2008).
- Guo, C., Kaufman, L. J. Flow and magnetic field induced collagen alignment. Biomaterials. 28, 1105-1114 (2007).
- Sung, K. E., et al. Control of 3-dimensional collagen matrix polymerization for reproducible human mammary fibroblast cell culture in microfluidic devices. Biomaterials. 30, 4833-4841 (2009).
- Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomed Microdevices. 8, 35-41 (2006).
- Wozniak, M. A., Keely, P. J. Use of three-dimensional collagen gels to study mechanotransduction in T47D breast epithelial cells. Biol Proced Online. 7, 144-161 (2005).
- Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 10, Unit 10 18 (2008).
- Liu, X., Harada, S. DNA isolation from mammalian samples. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 2, Unit 2 14 (2013).
- Roeder, B. A., Kokini, K., Sturgis, J. E., Robinson, J. P., Voytik-Harbin, S. L. Tensile mechanical properties of three-dimensional type I collagen extracellular matrices with varied microstructure. J Biomech Eng. 124, 214-222 (2002).
- Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. J Biomed Opt. 19, 16007 (2014).
- Bischel, L. L., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microfluidic model of ductal carcinoma in situ with 3D, organotypic structure. BMC Cancer. 15, 12 (2015).
