Summary
O colágeno é um componente central da ECM, e fornece pistas essenciais para diversos processos celulares que vão desde a migração para diferenciação e proliferação. Fornecidas aqui é um protocolo para a incorporação de células dentro de hidrogéis de colágeno 3D, e uma técnica mais avançada para a geração de matrizes de colágeno randomizados ou alinhadas utilizando microcanais PDMS.
Protocol
1. A neutralização, diluição e Polimerização de colágeno Soluções de Investigação 3D e celulares contração Ensaios
- No gelo no exaustor de cultura de tecidos estéreis, neutralizar colagénio (1: 1) com estéril, 100 mM de HEPES arrefecido com gelo em 2X PBS, pH 7,4, num tubo de 15 ml. Misture bem com uma pipeta de plástico até que a solução é homogénea e redemoinhos de mistura não são mais visíveis. Tenha cuidado para não introduzir bolhas de ar durante o processo de mistura. Armazenar brevemente em gelo.
- Diluir colagénio neutralizado para a concentração adequada com meio celular (tal como meio RPMI, DMEM, etc).
- Para calcular a quantidade de colagénio neutralizado necessária para compensar a concentração de colagénio desejado, utilizar a equação N = (D * V) / (S / 2), em que N é quantidade de colagénio neutralizado necessário, D é a concentração de colagénio desejado, V seja o volume final da concentração de colagénio desejado, e S é tele a partir da concentração de colágeno estoque.
- Levar-se a quantidade de colagénio neutralizado para o volume através da adição de uma solução de meio celular de células e. Misture bem e guarde em gelo até estar pronto para lançar.
- Exemplo: Para a 2 mg / ml de gel num volume de gel de 1 ml (volume típico para um molde de gel em 6 de placa bem ou 50 milímetros prato de vidro de fundo), em primeiro lugar multiplicar a concentração desejada (2 mg / ml) pelo volume final desejado (1 ml). Tome este número (2 mg) e dividi-lo pela metade da concentração de ações listadas na garrafa (9,49 mg / ml). Neste caso, a 0,42 ml de colagénio neutralizado são diluídas com 0,58 ml de mistura / célula meios.
- Pipete o colagénio / célula / mistura meios gelada em qualquer uma cultura não-tecido tratado placa de 6 poços de 50 mm ou prato de vidro de fundo. Use ponta da pipeta para espalhar uniformemente a solução.
NOTA: É importante a utilização de uma cultura não-tecido placa tratada para minimizar a fixação ou o crescimento das células fora do collagen gel. - Deixa-se polimerizar à temperatura ambiente durante cerca de 10 - 15 min. Os géis deve virar opaco após polimerização.
- Depois ele se transformou opaco, mover prato ou prato para 37 ° C durante mais 45 - 60 min para terminar a polimerização.
- Após 45 - 60 min, adicionar 2 - 3 ml de meio e solte géis de paredes do poço, executando uma dica p200 pipeta em torno do perímetro de bem ou prato. prato redemoinho delicadamente para soltar o gel. O gel de colágeno deve estar flutuando na mídia.
2. Western Blot, Cell Morfogênese e Gel Gontractility Assay
- Para avaliar os níveis de proteína, morfologia ou contratilidade celular em relação ao ECM rigidez, começar por despejando géis de colagénio, de acordo com 1,1-1,6, semeado com células para a 7 - ensaio de 10 dias. Determine cada taxa de semeadura linha celular empiricamente dependendo da taxa de crescimento e de confluência. Para um ensaio de 10 dias, a densidade de sementeira pode variar de 20.000 - 100.000 células / gel.
- Medircontractilidade celular, medir o diâmetro gel usando uma régua ou de uma câmara a cada 24 h ou no intervalo de tempo apropriado.
Nota: Para além disso, as imagens correspondentes recolhidos a partir de um microscópio pode ser analisada para características morfológicas características da linha de células semeadas no gel, tal como estruturas do tipo acini, túbulos epiteliais, saliências celulares, e lameliapodia. - Para avaliar os níveis de proteína, lisar os géis em tampão RIPA, e processo para a análise Western blot de proteínas de interesse, como descrito em Wozniak et al. 17 e Gallagher et ai. 18.
- IMPORTANTE: Em comparações de contractilidade entre as linhas celulares, para normalizar a contractilidade do ADN total, o que pode ser extraída a partir dos géis, conforme descrito por Lui, et al, 19, ou para um imutáveis, proteínas (histonas arrumação, GAPDH, etc.) por Ocidental. análise de mancha, tal como descrito em Wozniak et al. 17 e Gallagher et ai. 18. Se a contagem de células dentro do gel usando um hemocitômetro, certifique-se para normalizar o número de células de área total gel como o gel de contratação vai se concentrar células.
- géis alimentar a cada 3 - 4 dias, removendo 1 ml de meio e substitui-lo com 1 ml de meio fresco. Certifique-se de alimentar géis após a medição é tida como a adição de nova media / soro vai causar um aumento da contratilidade.
3. Geração de PDMS microcanais para o alinhamento de fibra de colagénio
Nota: Para gerar matrizes de colagénio alinhados, um molde para PDMS microcanais (Figura 2A) requer um mestre de silício SU-8 feita através de litografia suave-15.
- Para tornar canais PDMS, misture PDMS completamente em um copo descartável com um palito de sorvete. Para um mestre de silicone 6 polegadas, misturar 20 g de base de elastómero com 2 g de agente de cura.
- De gás-se a mistura de PDMS, colocando o copo descartável numa câmara de vácuo sob uma pressão de vácuo de550 milímetros de Hg. De-gás para o 1 - 1,5 h.
- Enquanto de-gasificação do PDMS, prepare o mestre de silicone para derramar. Prepare colocando uma folha de filme de transparência sobre uma placa de aquecimento seguido pelo mestre silicone. Certifique-se de que o molde de microcanais voltado para cima.
NOTA: Durante a fundição PDMS e cura, o mestre de silicone será imprensado entre duas folhas de filme de transparência. - Após 1-1,5 horas, remover os PDMS desgaseificado a partir da câmara de vácuo, e, lentamente, despeje sobre o mestre silicone.
IMPORTANTE: Evite bolhas de ar. Continuam a despejar no centro de mestre, e permitir que a gravidade espalhe uniformemente.
NOTA: A queda de PDMS não precisa de estender-se até a borda do mestre. - Depois de PDMS foi vertida para o mestre, aplicar uma segunda folha de película de transparência no topo do mestre de silicone e PDMS. Cuidadosamente, rolar a segunda folha de transparência para baixo na parte superior do mestre PDMS / silicone para evitar bolhas de ar. Não se apresse. PDMS devem ser agora espalhar uniformemente omestre ver.
- Com cuidado, colocar uma folha de borracha no topo da transparência, seguido de uma "folha de acrílico 1/8.
- Adicionar três 10 lb pesos no topo da folha de acrílico. Inicialmente, os pesos serão "flutuar". Permita-lhes para resolver e estabilizar antes de prosseguir.
- Ajuste a temperatura placa de 70 C e cura PDMS durante 4 h. Deixe esfriar por mínimo de 1 hora adicional antes de perturbar.
- Retire cuidadosamente folha superior de filme de transparência do wafer, e remover os canais com uma pinça.
- Loja no prato livre de poeira até que esteja pronto para uso.
4. PDMS microcanais preparando para Uso
- Coloque canais de cabeça para baixo em filme de transparência novo, limpo. Limpe todas as portas (Figura 2b), utilizando movimentos circulares com uma pinça afiada. Remova todos os fragmentos de PDMS.
- canais limpo, usando um pedaço de fita adesiva como um pano de aderência. Aplique a fita para a superfície da bancada (lado adesivo para cima), e em seguida, definir o canaln superior. Pressione para baixo em canais com fim rodada de pinça para garantir um bom contacto. Retire e repetir em ambos os lados até que os restos visíveis é removido.
- Transferência limpo, preparado canais PDMS em uma cónico de 50 ml com 70% de EtOH. Vortex à velocidade máxima durante 30 segundos. Descarte EtOH e substituir com frescos EtOH 70%. Loja em 70% EtOH até estar pronto para usar.
- No tecido capa de cultura e usando técnicas assépticas, transferir os canais de PDMS para uma tampa de vidro limpo e estéril ou pratos com fundo de vidro. Coloque o canal lateral para cima e UV deleite até EtOH tenha evaporado.
- Depois de seco, vire as PDMS para que os canais estão virados para baixo em direção a lamela. Pressione o canal de PDMS para baixo no vidro para fazer uma boa vedação. Adicionar um pedaço de PDMS estéreis para cobrir / fechar a porta do Center (porta B, Figura 2b). Deixe secar completamente antes de prosseguir.
- Pré-revestimento no interior do canal com 10 ug de colagénio / ml em água esterilizada. Para revestimento, colocar uma gota 100 uL no topo de um eláel, e desenhar através de vácuo. Após 1 h a 37 ° C, encheram-se com os canais de transferência de solução de revestimento de colagénio a um frigorífico. Frio durante cerca de 15 - 30 min.
- Remover solução de revestimento de colágeno com aspirador ou pipeta, e começar a preparação de colágeno.
5. Preparação de colágeno para uso em microcanais
- Em gelo, neutralizar o colagénio (1: 1) com mM de HEPES arrefecido com gelo 100 em 2X PBS, pH 7,4. Misture bem até ficar homogénea (Para mais detalhes, consulte a secção 1.1).
- Diluir colágeno neutralizado com as concentrações adequadas com a mídia celular (Para mais detalhes, consulte a secção 1.2). Incubar durante 15 min em gelo.
- Ao mesmo tempo, frio canais em gelo montado.
NOTA: O objetivo é ter todos os componentes para o processo de canal a 4 ° C ou abaixo. O colagénio temperatura e tempo de nucleação são parâmetros importantes para o processo de polimerização, e pode ser o ponto de partida para a optimização adicional, se necessário. - CounAs células T com um hemacitómetro e ressuspender na densidade de sementeira adequado neste momento. Para facilidade de cálculo, ressuspender, 1 - 3 milhões de células / ml. (Para mais detalhes, veja também a secção 2.1).
- Uma vez que as células foram contadas e 15 min passaram, proceda ao colágeno vazamento.
6. Verter alinhados e aleatória de colágeno microcanais
- Antes de desenhar colágeno através de canais, ajustar e definir a pressão de vácuo com um regulador de vácuo em linha. A pressão de vácuo fornece a força para induzir e controlar a taxa de fluxo de colagénio, que determina o grau de alinhamento.
- Para matrizes aleatórias ou não alinhadas, usar um canal de largura (3 mm de largura x 200 um de altura) com uma pressão de vácuo de 10 mm Hg ou menos.
- Para matrizes alinhadas, utilizar o canal estreito (1 mm de largura x 200 um de altura) com uma pressão de vácuo de 60 mm Hg ou superior.
- Remover canal montado a partir de gelo e coloque em superfície limpa e higienizada de fluxo laminar hood.
- Trabalhe rapidamente e carregar 120 - 150 l de colágeno neutralizado na porta A (Figura 2b).
- Desenhar colagénio através do canal, colocando uma pipeta de 25 ml ligado à linha de vácuo através da porta c (Figura 2b). Desenhe colágeno através de um único movimento, uniforme. IMPORTANTE: Para matrizes aleatórias ou não alinhados, desenhar colágeno lentamente através do canal (cerca de 0,5-1 mm por segundo), e parar uma vez que atinge o fim. Para matrizes alinhados, desenhe o colágeno em mais rapidamente, mas tome cuidado para evitar bolhas de ar.
- Retirar cuidadosamente o excesso de colágeno da região do porto com Pipetman p200 ou aspirador.
- Coloque PDMS manchas estéreis sobre ambos os portos A e C. Todas as portas devem agora ser cobertas.
- Após 2 - 3 minutos, retire o centro remendo PDMS (porta B) e adicione 2 - 3 mL de células (5 - 10 mil células) na porta de centro. Permitir que a polimerizar parcialmente (girar opaco) à temperatura ambiente durante mais 10 - 15 min.
- após 10- 15 min, a transferência para 37 ° C durante mais 15 - 30 minutos para terminar a polimerização. Remover as tampas de PDMS e adicionar mídia para cobrir completamente as células de canal e de cultura, conforme necessário. As células podem ser alimentados através da remoção de um ml da velha mídia, e substituí-lo com um ml de novas mídias.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Embora ensaios 3D pode ser feito no interior da mesma rigidez do gel de colagénio, variando a rigidez de gel pode ser utilizado para determinar como as células respondem a alterações mecânicas no seu microambiente celular. Um hidrogel colagénio duro é definido como um gel em que as células são incapazes de embutidos localmente contrair o colagénio circundante. A contractilidade intrínseca de diferentes tipos de células é único, e portanto, é melhor começar com uma curva de contractilidade simples para determinar a concentração de colagénio, que será detectada como aderentes e rígida.
Comece segurando o número de células constante e o aumento da concentração do gel de colagénio. A rigidez do gel será dimensionado exponencialmente com a concentração, como mostrado anteriormente 10,20. Um exemplo representativo de um ensaio de contractilidade é mostrado na Figura 1. Aqui, 50.000 células 4T1 são incorporados em eithera de 2 mg / ml ou 3,5 mg de gel de colagénio / ml durante 5 dias. A linha celular 4T1 é altamente contráctil, linha de cancro metastático, mas só é capaz de contrair o gel de alta densidade por cerca de 10% (Figura 1-A, C). Este baixo nível de contração é típico para uma classificação gel dura. Géis de baixa densidade comparáveis (2 mg / ml, figura 1b, c) são contratados de 57% (n = 4), durante o mesmo período de tempo. É importante notar que o aumento da quantidade de ligando de colagénio pode ter impacto vias de sinalização celulares, por conseguinte, um segundo meio para variar a rigidez é para manter constante a concentração de colagénio e comparar géis que são restringidos (duras) por ser deixada ligada ao fundo de o prato ou contrátil (compatível), porque eles foram liberados para flutuar livremente no meio celular. Esta pode servir como um bom controlo para determinar se as alterações na sinalização celular resultar do aumento ligando colagénio ou a rigidez da matriz.
Uma vez que o domínio de incorporação de células dentro de matrizes 3D é alcançada, os ensaios podem ser modificados para alterar a organização e orientação das fibras de colagénio. Isto é conseguido através da utilização de canais de microfluidos PDMS (Figura 2). Para o propósito deste manuscrito, foram usadas duas conformações semelhantes, um estreito e um canal de largura, com 3 aberturas ou portas (Figura 2B). Numa experiência típica para determinar a resposta celular ao acaso em comparação com as matrizes alinhadas, colagénio não polimerizado é puxado através do canal microfluídico do canal A para a porta C, com as células a ser adicionado à porta B. O grau de alinhamento colagénio é modulada pela taxa de colagénio fluir de tal forma que as taxas de fluxo maior de colágeno produzir um melhor alinhamento. O uso de canais estreitos acoplado com maiorpressões de vácuo aumenta o alinhamento da rede de colagénio, enquanto um canal mais amplo usado em conjunto com baixas pressões de vácuo gera matrizes aleatórias. A organização da rede fibrilar pode ser visualizado pela segunda geração harmónica, tal como mostrado na Figura imagens representativas (2c, d). Nestas imagens, as fibras de colágeno (indicados pelas setas e pseudocolored em roxo) alinhar de forma mais consistente com o eixo do fluxo de colágeno nos canais estreitos (Figura 2d). As fibras de colagénio em canais largos têm uma variedade de orientações, e têm uma distribuição mais aleatória (Figura 2c).
A diferença entre os canais largos e estreitos é perceptível ao olho humano, mas também pode ser analisada através de um software desenvolvido especificamente para a análise de fibra. CT-FIRE, uma fonte aberta e software disponíveis gratuitamente, utiliza um algoritmo baseado em curvelet para pré-processamento seguido porum algoritmo de extracção de fibra para fibra quantificar ângulo, espessura, comprimento e 21 linearidade. Para cada condição, mais de 500 imagens foram amostrados aleatoriamente a partir de diferentes locais no interior dos canais, e mais de 125.000 fibras foram extraídos e analisados por CT-FOGO. A subsequente histograma gerado ângulo de fibra para os canais estreitos (Figura 2F) mostra um enriquecimento claro de fibras orientadas paralelamente à direcção do fluxo. Em contraste, os canais de distribuição de largura tem um ângulo de fibra mais equivalente (Figura 2E), o que é consistente com uma matriz mais aleatória.
Mais importante, o uso de dispositivos de microfluidos, como uma técnica para controlar a organização e orientação das fibras de colagénio, permite a avaliação de várias respostas celulares a condições matriz alterada. Por exemplo, Sung et ai. determinou que a viabilidade de fibrobasts mamárias humanas é dependente das fibras de colágeno.15 Além disso, trabalho recente do nosso laboratório demonstra que as células de carcinoma da mama migrar mais persistentemente em fibras de colagénio alinhados em comparação com as matrizes de colagénio aleatórios. 3 Estes resultados ajudam a definir melhor o papel do microambiente no contexto da biologia mamaria e do cancro da mama. Movendo-se para a frente, a capacidade para controlar com precisão o microambiente celular 3D irá permitir uma investigação continuada de respostas celulares importantes no contexto de muitos estados de doen diferentes.
Figura 1. 3D colágeno Gel para medição Contratilidade celular e respostas celulares a ECM rigidez. 4T1 células foram colocadas em ambos os (A) 3,5 mg / ml e (B) 2 mg / ml de colagénio géis e deixadas crescer durante 5 dias. Ao longo do tempo, o gel de colagénio (área cinzentadentro da linha pontilhada) irá contrair eo diâmetro é medido e quantificado em (c, t de Student, barras de erro +/- SD). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Geração aleatória e alinhado colagénio matrizes utilizando PDMS microcanais. Uma bolacha de silício de seis polegadas (a) foi usado como um modelo para ambas largas e estreitas PDMS microcanais (B). As concentrações de colagénio idênticas foram desenhados através de ambos os tipos de canais, e as fibras individuais (pontas de seta, c, d) alinhar com o sentido do fluxo (setas) em microcanais estreitas (D). microcanais largas produziu matrizes mais aleatórias. angl Fiberes com respeito à parte inferior da imagem foram contadas e mostrados em (e) e (f). Barra de escala = 26 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
géis de colágeno 3D são uma adição valiosa para a nossa caixa de ferramentas para compreender como as células interpretam e respondem ao seu microambiente local. Este manuscrito proporcionou um protocolo muito básico para a incorporação de células dentro de uma matriz de colagénio 3D, e reprodutível para gerar matrizes de fibras de colagénio aleatórios ou alinhadas. Ambos os protocolos funcionar como plataformas adaptáveis em que diferentes isoformas de colagénio, agentes de ligação cruzada, ou de outras proteínas de matriz poderia potencialmente ser adicionados no momento da polimerização. É também fácil de modificar as plataformas para avaliar diferentes intervalos de tempo e pontos de extremidade para a expressão de genes e produção da proteína. Imaging, avaliando proteína e níveis de RNA, e perfis metabólicos de leitura são todos muito compatíveis com estas técnicas 3D.
Como é importante em todas as técnicas, é importante para avaliar a qualidade do gel e ensaio. Um sinal de um bom gel de colágeno qualidade é aquele que pode lidar com a manipulação manual. Por exemplo, a 1 ml de [1 mg / ml] Gel de colagénio vertida para uma placa de seis deve ser facilmente apanhada com uma pinça e manipulado. Se as lágrimas de gel ou fragmentos, a qualidade do gel é sub-óptima, e os passos que devem ser tomadas para melhorar a polimerização do colagénio. A temperatura e o pH são os parâmetros mais importantes necessários para uma boa formação da fibra e de gelificação. Iniciar o processo de solução de problemas, certificando-se todos os componentes são mantidos em gelo até estar pronto para gelificação para ocorrer. É também muito importante para garantir que o tampão de neutralização e solução de colagénio estão a ser misturados completamente. Em seguida, verificar que o pH do tampão de neutralização é a pH 7,4. Um tampão HEPES PBS é recomendável, porque é muito compatível com cultura de tecidos, tem uma ampla gama de tamponamento, e soluções de reserva tendem a ser muito estável a 4 ° C por longos períodos de tempo. Ele também tem o benefício adicional de produção de fibras mais longas, mais curvos que são mais parecidos com o estado fisiológico de 15. NaOH é outro commoomente utilizar uma solução de neutralização, mas precisa ser titulado mais de perto. Ele também parece ter o efeito de produzir mais curtas fibras 15, mais grosso. Independentemente disso, o pH do colagénio neutralizado deve estar a um pH de 7,4. Se todas essas condições estão a ser satisfeitas, e a integridade dos géis ainda não é satisfatória, então o problema está com a solução de colágeno estoque. Embora a solução de colagénio estoque tem um prazo de validade apresentado na lista de 6 meses a 4 ° C, verificou-se que é geralmente mais curto do que as fontes comerciais reivindicação quando utilizado para géis 3D. Descarte o frasco velho, e ordem de um novo lote. Não é incomum para a qualidade do colágeno do fabricante para variar significativamente de lote para lote.
Além de identificar géis de colagénio de qualidade, é também importante para identificar os passos que são críticos para a geração de um bom alinhamento dentro do microcanal PDMS. O princípio subjacente a esta técnica é que a taxa de Collagen fluxo através dos microcanais posteriormente induz o alinhamento filamento. Por conseguinte, a etapa mais importante no controlo do grau de alinhamento das fibras é a modulação apropriada da pressão do vácuo. Para o alinhamento do colágeno aleatória em um microcanal, a pressão de vácuo deve ser baixo, e o colágeno deve fluir lentamente pelo canal. Se o colagénio flui através muito rapidamente, as fibras começarão a alinhar. Um canal mais amplo torna esta proposição mais fácil. Por outro lado, para um bom alinhamento colagénio, pressões mais elevadas de vácuo deve ser utilizado e a solução de colagénio deve ser puxado através mais rapidamente. Um segundo passo fundamental na geração de matrizes alinhadas é a temperatura. É muito importante certificar-se todos os componentes e soluções são refrigerados em gelo antes de usar. Se os canais não são refrigerados antes do uso, o colagénio nos canais irá polimerizar demasiado depressa, e vai resultar em mais finas, fibras menores. Se o colágeno neutralizado é refrigerado a 4 ° C e não em gelo, o enhancEd nucleação irá dar origem a um diâmetro de fibra maior que são mais difíceis de alinhar por fluxo. É também importante para relaxar o microcanal si. Sem refrigeração antes, o pequeno volume de colágeno vai aquecer muito rapidamente produzindo resultados pobres.
Os microcanais de colágeno são uma técnica muito útil, mas há certas limitações. Por um lado, o alinhamento em um microcanal induzida por fluxo nunca é perfeita, e nunca será igual a técnica de alinhamento induzida por deformação. Haverá sempre algumas fibras orientadas perpendicularmente à direcção de fluxo, mas a reprodutibilidade, adaptabilidade, e facilidade de utilização são superiores a pequenas variações no alinhamento dentro do canal. Mais importante ainda, as células foram mostrados para detectar eficazmente pequenas mudanças no alinhamento, e responder com migração mais persistente nestes canais 3,15. As células também irá aumentar o alinhamento do canal como os respectivos números de aumentar e começam a migrar. Se maior i alinhamentos exigido, os microcanais PDMS pode ser facilmente modificado para dimensões mais estreitos ou têm pequenos constrições para aumentar o alinhamento. Ambos têm sido mostrados para ser eficaz, mas tem outras vantagens e desvantagens associadas 16. Outra limitação à técnica de microcanais é que o canal de PDMS tem pouca permeabilidade a drogas ou corantes fluorescentes. Isto significa que estes compostos necessitam de se difundir para baixo o canal a partir das portas, o qual é surpreendentemente lenta, e podem representar dificuldades de lavagem tratamentos.
Embora existam algumas limitações a esta plataforma de microcanais, ele oferece várias vantagens sobre as técnicas existentes. É mais experimentalmente acessível, uma vez que não requer instrumentos volumosos 3,13 ou pequenas populações de células para a produção de alinhamento. Ele também não exige esferas magnéticas exógenos 13,14 que tendem a ser autofluorescente e poderia artificialmente reticular o rede de colágeno. O colagénio é de microcanaisTambém simplesmente mais rentável e econômico. Para além das vantagens actuais, que também tem inúmeras vantagens que podem ser aproveitados em futuras aplicações. Por um lado, o microcanal de colagénio podem ser concebidos ou modificados em quase qualquer configuração ou experiência. Projetos avançados permitem que os canais para criar tubos de colágeno ocas ou estruturas 3D para imitar a arquitetura de órgãos ou tumores 22 simplificadas. Além disso, os canais podem ser feitos de outros materiais de PDMS. Isso potencialmente poderia transmitir diferentes propriedades mecânicas às redes de colágeno incorporados ou matrizes. Por último, a pequena quantidade de reagentes utilizados para este ensaio também pode torná-lo atraente e econômica para pequenas telas de alto rendimento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para revelar
Acknowledgments
Os autores gostariam de reconhecer os números de concessão UO1CA143069, R01CA142833, R01CA114462, RO1CA179556, T32-AG000213-24 e T32-GM008692-18 pelo financiamento deste trabalho. Também reconhecemos Jeremy Bredfelt e Yuming Liu de loci para o desenvolvimento e assistência com a análise CT-fogo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High Concentration Rat Tail Collagen | Corning | 354249 | |
| SylGard184 elastomer kit | Corning | NC9285739 | Elastomer for PDMS channels |
| HEPES | Fisher | BP310 | For HEPES neutralization buffer |
| KCl | Fisher | BP366 | For HEPES neutralization buffer |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | For HEPES neutralization buffer |
| Na2HPO4 | Fisher | S374 | For HEPES neutralization buffer |
| NaCl | Fisher | BP358 | For HEPES neutralization buffer |
| Levy Improved Neubauer Hemacytometer | Fisher | 15170-208 | cell counting |
| 6-well non-tissue culture plate | Corning | 351146 | |
| 50 mm glass bottom dish | MatTek | P50g-1.5-30-f | |
| Bel-Art Plastic Vacuum Desiccator | Bel-Art | F4200-2021 | Degassing chamber for PDMS |
| transparency film | 3M | pp2950 | Plastic film for pouring pdms channels |
| ThermoScientific CimaRec | ThermoScientific | HP141925 | Hot plate for curing PDMS microchannels |
| Vacuum regulator | Precision Medical | PM3100 | Vacuum regulator for collagen microchannels |
| 8" x 8" rubber sheet | Amazon - Rubber-Cal | Silicone - 60A | rubber sheet for pouring PDMS microchannel |
| 8" x 8" x 0.125" acrylic sheet | Amazon | Plexiglass sheets | for pouring PDMS microchannels |
| 10 lb weights | Amazon | CAP Barbell | for pouring PDMS microchannels |
| 15 ml Conical tubes | Fisher | 352097 | |
| 50 ml Conical tubes | Fisher | 352098 | |
| Plastic pipets | Dot Scientific | 229202B, 229206B, and 667225B | 2 ml, 5 ml, and 25 ml |
| 70% EtOH | Fisher | NC9663244 |
References
- Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. Am J Pathol. 178, 1221-1232 (2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, 38 (2006).
- Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophys J. 107, 2546-2558 (2014).
- Even-Ram, S., Yamada, K. M.
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188, 11-19 (2010).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197, 439-455 (2012).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).
- Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. J Cell Biol. 163, 583-595 (2003).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
- Tlsty, T. D., Coussens, L. M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu Rev Pathol. 1, 119-150 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys J. 95, 5374-5384 (2008).
- Guo, C., Kaufman, L. J. Flow and magnetic field induced collagen alignment. Biomaterials. 28, 1105-1114 (2007).
- Sung, K. E., et al. Control of 3-dimensional collagen matrix polymerization for reproducible human mammary fibroblast cell culture in microfluidic devices. Biomaterials. 30, 4833-4841 (2009).
- Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomed Microdevices. 8, 35-41 (2006).
- Wozniak, M. A., Keely, P. J. Use of three-dimensional collagen gels to study mechanotransduction in T47D breast epithelial cells. Biol Proced Online. 7, 144-161 (2005).
- Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 10, Unit 10 18 (2008).
- Liu, X., Harada, S. DNA isolation from mammalian samples. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 2, Unit 2 14 (2013).
- Roeder, B. A., Kokini, K., Sturgis, J. E., Robinson, J. P., Voytik-Harbin, S. L. Tensile mechanical properties of three-dimensional type I collagen extracellular matrices with varied microstructure. J Biomech Eng. 124, 214-222 (2002).
- Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. J Biomed Opt. 19, 16007 (2014).
- Bischel, L. L., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microfluidic model of ductal carcinoma in situ with 3D, organotypic structure. BMC Cancer. 15, 12 (2015).
