Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Udarbejdelse af 3D Kollagen Gels og mikrokanalerne for Studiet af 3D Interactions Published: May 9, 2016 doi: 10.3791/53989
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 2,3,4, 1,2,5
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 4Morgridge Institute for Research, University of Wisconsin-Madison, 5Paul P. Carbone Comprehensive Cancer center, University of Wisconsin-Madison

Summary

Kollagen er et centralt element i ECM, og giver vigtige signaler til flere cellulære processer lige fra migration til differentiering og proliferation. Forudsat her er en protokol til indlejring celler i 3D-collagen hydrogeler, og en mere avanceret teknik til at generere randomiserede eller justeret collagen matricer hjælp PDMS mikrokanaler.

Protocol

1. Neutralisering, Fortynding og polymerisering af kollagen Løsninger til 3D Undersøgelse og Cellular Sammentrækning Analyser

  1. På is i steril vævskultur hætte, neutralisere kollagen (1: 1) med sterilt, iskold 100 mM HEPES i 2x PBS, pH 7,4, i et 15 ml konisk rør. Bland grundigt med plastik pipette indtil opløsningen er homogen og blande hvirvler ikke længere er synlige. Pas på ikke at indføre luftbobler under blandeprocessen. kortvarigt Opbevar på is.
  2. Fortynd neutraliseret collagen til den passende koncentration med celle medier (såsom RPMI, DMEM, etc.).
    1. For at beregne mængden af neutraliseret kollagen kræves for at gøre op ønskede kollagen koncentrationen anvendes ligningen N = (D * V) / (S / 2), hvor N er mængden af neutraliseret kollagen kræves, D er den ønskede kollagen koncentration, V er det endelige volumen af ​​den ønskede kollagen koncentration, og S er than starter stock kollagen koncentration.
    2. Åbn mængden af ​​neutraliseret collagen til volumen ved tilsætning af en celle og celle medier opløsning. Bland grundigt og opbevar på is, indtil klar til at kaste.
      1. Eksempel: For en 2 mg / ml gel i en 1 ml gel volumen (typisk volumen for en gel støbt i 6 brønds plade eller 50 mm glasbund skål), først multipliceres den ønskede koncentration (2 mg / ml) ved den ønskede slutvolumen (1 ml). Tag dette nummer (2 mg) og dividere det med halvdelen af ​​bestanden koncentration noteret på flaske (9,49 mg / ml). I dette tilfælde er 0,42 ml af den neutraliserede collagen fortyndet med 0,58 ml blanding media / celle.
  3. Pipetter den iskolde kollagen / celle / media blandingen i en ikke-vævskulturbehandlet 6-brønds plade eller en 50 mm glasbund skål. Brug pipettespids til jævnt fordelt løsningen.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at anvende et ikke-vævskulturbehandlet plade til at minimere fastgørelse eller vækst af cellerne uden for collagen gel.
  4. Tillad at polymerisere ved stuetemperatur i ca. 10 - 15 min. Gelerne skal dreje uigennemsigtig ved polymerisation.
  5. Efter at det er blevet uigennemsigtig, flytte plade eller skål til 37 ˚C for yderligere 45-60 minutter til at afslutte polymerisation.
  6. Efter 45 - 60 min, tilsættes 2 - 3 ml medier og frigivelse geler fra siderne af borehullet ved at køre en p200 pipettespids omkring omkredsen af ​​brønd eller skål. Swirl fad forsigtigt at frigøre gelen. Det kollagen gel bør være flydende i medierne.

2. Western blotting, Cell Morfogenese og Gel Gontractility Assay

  1. For at vurdere proteinniveauer, morfologi eller cellulær kontraktilitet i forhold til ECM stivhed, begynde ved at hælde kollagengeler, ifølge til 1,1 - 1,6, podes med celler til en 7 - 10 dage assay. Bestem hver cellelinie såning rate empirisk afhængig af væksthastighed og sammenflydning. For en 10 dages bestemmelse kan podningsdensitet ligge i området fra 20.000 - 100.000 celler / gel.
  2. At målecellesammentrækningsevne, måle gelen diameter ved hjælp af en lineal eller et kamera hver 24 timer eller på et passende tidsinterval.
    Bemærk: Derudover kan tilsvarende billeder indsamlet fra et mikroskop undersøges for morfologiske træk er karakteristiske for cellelinien podet i gelen, såsom acini-lignende strukturer, epitelceller tubuli, cellulære fremspring og lameliapodia.
  3. For at vurdere proteinniveauer, lysere geler i RIPA-buffer og fremgangsmåde til Western blot-analyse af proteiner af interesse som beskrevet i Wozniak et al. 17 og Gallagher et al. 18.
    1. Vigtigt: I sammenligninger af kontraktilitet mellem cellelinier, normalisere kontraktilitet til total DNA, som kan udvindes fra gelerne som skitseret af Lui et al 19, eller til en uforanderlig, housekeeping protein (histoner, GAPDH, etc.) ved hjælp af Western. blot-analyse, som beskrevet i Wozniak et al. 17 og Gallagher et al. 18. Hvis tælle celler i gelen ved hjælp af en hæmocytometer, så sørg for at normalisere celle nummer til den samlede gel område som den ordregivende gel vil koncentrere celler.
  4. Feed geler hver 3 - 4 dage ved at fjerne 1 ml medium og erstatte den med 1 ml frisk medier. Sørg for at fodre geler efter målingen tages som tilsætning af frisk medie / serum vil medføre en stigning i kontraktilitet.

3. Frembringelse af PDMS mikrokanaler for collagenfibre Alignment

Bemærk: For at generere linie collagen matricer, en form for PDMS mikrokanaler (figur 2A) kræver en SU-8 silicium mester foretages via soft-litografi 15.

  1. For at gøre PDMS kanaler, bland PDMS grundigt i et engangs kop med et håndværk stick. For en 6 tommer silikone mester, blandes 20 g elastomer base med 2 g hærder.
  2. De-gas PDMS blandingen ved at placere engangsbægeret i et vakuumkammer under et vakuum tryk på550 mm Hg. De-gas til 1 - 1,5 timer.
  3. Mens afgasning PDMS, forberede silikone master for at hælde. Forbered ved at placere en ren ark gennemsigtighed film på en kogeplade efterfulgt af silikone master. Sørg for, at mikrokanalplade skimmel vender opad.
    BEMÆRK: Under PDMS støbning og hærdning, vil silikone mester blive klemt mellem to plader af transparenter.
  4. Efter 1-1,5 time, fjerne afgasset PDMS fra vakuumkammer, og langsomt hæld silikone master.
    VIGTIGT: Undgå luftbobler. Fortsæt med at hælde i centrum af mester, og lad tyngdekraften til at sprede det jævnt.
    BEMÆRK: PDMS drop behøver ikke at strække sig hele vejen til kanten af ​​master.
  5. Efter PDMS er blevet hældes på master, anvende en anden ark transparenter på toppen af ​​silikone master og PDMS. Forsigtigt, rul den anden gennemsigtighed ark ned oven på PDMS / silikone mester for at undgå luftbobler. Tag det roligt. PDMS bør nu jævnt fordelt over master.
  6. Anbring forsigtigt en gummiark oven på gennemsigtighed, efterfulgt af en 1/8 "acrylplade.
  7. Tilføj tre 10 lb vægte oven på akryl plader. I første omgang vil vægtene "flyde". Lad dem bosætte sig og stabilisere før du går videre.
  8. Indstil kogeplade temperaturen til 70 ° C og helbredelse PDMS i 4 timer. Lad afkøle i mindst 1 yderligere hr før foruroligende.
  9. Træk forsigtigt øverste ark gennemsigtighed film fra wafer, og fjern kanalerne med en pincet.
  10. Opbevares i støvfrit fad indtil den er klar til brug.

4. prepping PDMS mikrokanaler for brug

  1. Place-kanaler op og ned på nye, rene transparenter. Rengør alle porte (figur 2b) ved hjælp af cirkulær bevægelse med en skarp pincet. Fjern eventuelle fragmenter af PDMS.
  2. Rene kanaler ved hjælp af et stykke emballage tape som en tack klud. Påfør tape til overfladen af ​​bænken (klæbende side op), og derefter indstille kanal on top. Tryk ned på kanaler med runde ende af pincet for at sikre god kontakt. Fjern og gentag på begge sider, indtil synlige rester er fjernet.
  3. Overførsel renset, prepped PDMS kanaler i en 50 ml konisk med 70% EtOH. Vortex ved maksimal hastighed i 30 sek. Kassér EtOH og erstatte med frisk 70% EtOH. Opbevares i 70% EtOH indtil den er klar til brug.
  4. I vævskultur hætte og anvendelse af aseptisk teknik, overføre PDMS kanaler til en ren og steril dækglas eller glasbund retter. Sætte kanalen opad og UV behandler indtil EtOH er fordampet.
  5. Når tør, vende PDMS så kanalerne vender ned mod dækglas. Tryk PDMS kanal ned på glaspladen for at gøre en god tætning. Tilføj et plaster af sterile PDMS at dække / lukke centret port (port B, figur 2b). Lad grundigt tørre, før du fortsætter.
  6. Pre-coat indersiden af ​​kanalen med 10 ug / ml collagen i sterilt vand. At belægge, anbringes en 100 pi lille dråbe på toppen af ​​en kanaliel, og trække igennem med vakuum. Efter 1 time ved 37 ° C, overføre kanaler fyldt med collagen overtræksopløsning til et køleskab. Chill i ca. 15 - 30 min.
  7. Fjern collagen coatingopløsning med aspirator eller pipette, og begynder kollagen forberedelse.

5. Collagen Klargøring til brug i mikrokanaler

  1. På is, neutraliseres kollagen (1: 1) med iskold 100 mM HEPES i 2x PBS, pH 7,4. Bland grundigt, indtil homogen (For yderligere oplysninger, se afsnit 1.1).
  2. Fortynd neutraliseret kollagen til de passende koncentrationer med celle medier (For yderligere oplysninger, se afsnit 1.2). Der inkuberes i 15 minutter på is.
  3. Samtidig, chill monterede kanaler på is.
    BEMÆRK: Målet er at have alle de komponenter til den kanal processen ved 4 C eller derunder. Collagen kernedannelse temperatur og tid er nøgleparametre til polymerisationsprocessen, og kan være udgangspunktet for yderligere optimering, hvis det er nødvendigt.
  4. CounT-celler med et hæmacytometer og resuspender på et passende udsåningstæthed på dette tidspunkt. For at lette beregninger, resuspenderes til 1 - 3 millioner celler / ml. (For flere detaljer, se også afsnit 2.1).
  5. Når celler er blevet talt og 15 minutter er gået, fortsæt til kollagen hælde.

6. hælde Aligned og Random Kollagen mikrokanaler

  1. Før tegning collagen gennem kanaler, justere og indstille vakuum tryk med en inline vakuum regulator. Vakuumtryk tilvejebringer kraft til at inducere og styre hastigheden af ​​kollagen flow, der bestemmer graden af ​​tilpasning.
    1. For tilfældige eller unaligned matricer, bruge en bred kanal (3 mm bred x 200 um høj) med et vakuum tryk på 10 mm Hg eller mindre.
    2. For justeret matricer, bruge smal kanal (1 mm bred x 200 um høj) med et vakuum tryk på 60 mm Hg eller derover.
  2. Fjern monteret kanal fra is og sted på ren, desinficeret overflade laminar flow hOOD.
  3. Arbejd hurtigt og indlæse 120 - 150 pi neutraliseret collagen i havn A (figur 2b).
  4. Tegn collagen gennem kanalen ved at placere en 25 ml pipette fastgjort til vakuumledningen over port c (figur 2b). Tegn collagen igennem i et enkelt, ensartet bevægelse. VIGTIGT: For tilfældige eller unaligned matricer, tegne kollagen langsomt over kanalen (ca. 0,5 - 1 mm per sekund), og stoppe, når den når enden. For justeret matricer, tegne kollagen tværs hurtigere, men sørge for at undgå luftbobler.
  5. Fjern forsigtigt overskydende collagen fra havnen region med P200 Pipetman eller emhætte.
  6. Placer sterile PDMS patches over begge porte A og C. Alle porte bør nu dækket.
  7. Efter 2 - 3 minutter, fjern center PDMS patch (port B) og tilsæt 2 - 3 pi celler (5 - 10 tusind celler) ind til centrum port. Tillad til delvist at polymerisere (drej uigennemsigtig) ved stuetemperatur i yderligere 10 - 15 min.
  8. efter 10- 15 min, overførsel til 37 ° C i yderligere 15 - 30 min for at afslutte polymerisationen. Fjern PDMS covers og tilføje medier til helt at dække den kanal og kultur celler efter behov. Celler kan fodres ved at fjerne en ml gamle medier, og erstatte den med en ml nye medier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mens 3D assays kan udføres under samme stivhed kollagengel, kan variere gelen stivhed anvendes til at bestemme, hvordan cellerne vil reagere på mekaniske ændringer i deres cellulære mikromiljø. En stiv collagen hydrogel defineres som en gel, hvor de indlejrede celler ikke er i stand til lokalt at sammentrække omgivende kollagen. Den iboende kontraktilitet af forskellige celletyper er unik, og det er derfor bedst at begynde med en simpel kontraktilitet kurve at fastslå kollagen koncentration, der vil blive affølt som eftergivende og stiv.

Begynd ved at holde celletal konstant og forøgelse af koncentrationen af ​​kollagengelen. Stivheden af gelen vil skalere eksponentielt med koncentration, som tidligere 10,20 vist. Et repræsentativt eksempel på en kontraktilitet assay er vist i figur 1. Her bliver 50.000 4T1-celler indlejret i eithera 2 mg / ml eller 3,5 mg / ml kollagen gel til 5 dage. The 4T1-cellelinien er en meget kontraktile, metastatisk cancer linje, men er kun i stand til at optage den store tæthed gel med ca. 10% (figur 1a, c). Denne lave sammentrækning er typisk for en stiv gel klassifikation. Sammenlignelige geler lav densitet (2 mg / ml, Figur 1b, c) er kontraheret 57% (n = 4) i den samme tidsramme. Det er vigtigt at bemærke, at øge mængden af ​​kollagen ligand kan påvirke celle signalveje, derfor et andet middel til at variere stivheden er at holde kollagen koncentrationen konstant og sammenlign geler, fastholdes (stive) ved at blive siddende på bunden af fadet eller kontraktile (kompatibel), fordi de er blevet frigivet til at flyde frit i cellen medium. Dette kan tjene som en god kontrol for at bestemme, om ændringer i cellulær signalering skyldes øget kollagen ligand eller stivheden af ​​matricen.

Når beherskelse af indlejring celler i 3D-matricer er opnået, kan assays modificeres til at ændre organisationen og orientering af kollagen fibre. Dette opnås ved anvendelse af PDMS mikrofluidkanaler (figur 2). Med henblik på dette manuskript blev to lignende konformationer anvendes, en smal og en bred kanal, med 3 åbninger eller porte (figur 2B). I et typisk eksperiment til bestemmelse af cellulære respons på tilfældig sammenlignet med flugtende matricer, er upolymeriseret collagen trækkes gennem mikrofluid kanal fra port A til port C med celler bliver tilføjet til port B. Graden af ​​kollagen alignment moduleres ved hastigheden af ​​kollagen flow således at højere kollagen flow giver bedre tilpasning. Anvendelsen af ​​snævrere kanaler kombineret med højerevakuumtryk forbedrer tilpasningen af ​​kollagen netværk, mens en bredere kanal anvendes i forbindelse med lave vakuumtryk genererer tilfældige matricer. Organiseringen af fibrillære netværk kan visualiseres ved anden harmoniske generation, som vist i repræsentative billeder (figur 2C, d). I disse billeder, de kollagen fibre (angivet med pilespidser og pseudocolored i lilla) tilpasse mere konsekvent med aksen af kollagen flow i de smalle kanaler (figur 2d). Collagenfibrene i brede kanaler har en række orienteringer, og har en mere tilfældig fordeling (figur 2C).

Forskellen mellem brede og smalle kanaler er mærkbar for det menneskelige øje, men kan også analyseres via software udviklet specielt til fiberproduktion analyse. CT-FIRE, et open source og frit tilgængelig software, anvender en curvelet-baserede algoritme til forbehandling efterfulgt afen fiber ekstraktion algoritme til at kvantificere fiber vinkel, tykkelse, længde og rethed 21. For hver tilstand blev mere end 500 billeder udtaget tilfældigt fra forskellige steder i kanalerne, og mere end 125.000 fibre blev ekstraheret og analyseret ved CT-FIRE. Den efterfølgende fiber vinkel histogram genereret for de smalle kanaler (figur 2f) viser en klar berigelse af fibre orienteret parallelt med strømningsretningen. I modsætning hertil brede kanaler har en mere tilsvarende fiber vinkel distribution (figur 2e), som er i overensstemmelse med en mere tilfældig matrix.

Vigtigt er, at brugen af ​​mikrofluidenheder, som en teknik til at styre organiseringen og orienteringen af ​​collagenfibre, giver mulighed for vurdering af forskellige cellulære reaktioner på ændrede matrix betingelser. For eksempel, Sung et al. fastslået, at levedygtigheden af ​​humane mammae fibrobasts er afhængig af kollagen fiber.15 Derudover seneste arbejde fra vores laboratorium viser, at brystkarcinomceller migrere mere ihærdigt på linie kollagen fibre i forhold til tilfældige kollagen matricer. 3 Disse resultater hjælper til bedre at definere den rolle af mikromiljø inden for rammerne af mamma biologi og brystkræft. Fremover evnen til præcist at styre 3D cellulære mikromiljø vil give mulighed for fortsat undersøgelse af vigtige cellulære responser i forbindelse med mange forskellige sygdomstilstande.

figur 1
Figur 1. 3D Collagen Gels til måling Cell Kontraktilitet og cellulære reaktioner på ECM Stivhed. 4T1 celler blev udsået i både (A) 3,5 mg / ml og (B) 2 mg / ml kollagen geler og lov til at vokse i 5 dage. Over tid, kollagengelen (gråt områdeindenfor stiplede linie) vil kontrakten og diameteren måles og kvantificeres (c, t-test, fejlsøjler +/- SD). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Generering Tilfældig og Aligned Collagen matricer vha PDMS mikrokanaler. En seks tommer siliciumskive (a) blev anvendt som en skabelon for både brede og smalle PDMS mikrokanaler (b). Identiske kollagen koncentrationer blev trukket gennem begge typer af kanaler, og individuelle fibre (pilespidser, c, d) tilpasning til strømningsretningen (pile) i smalle mikrokanaler (D). Brede mikrokanaler gav mere tilfældige matricer. Fiber angles i forhold til bunden af billedet blev talt og vist i (e) og (f). Scale bar = 26 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

3D kollagengeler er en værdifuld tilføjelse til vores værktøjskasse at forstå, hvordan celler fortolker og svare deres lokale mikromiljø. Dette håndskrift har givet en meget grundlæggende protokol for indlejring celler i en 3D-kollagen matrix, og reproducerbart generere matricer med tilfældige eller justeret kollagen fibre. Begge protokoller arbejder som fleksible platforme, hvor forskellige kollagen isoformer, tværbindere eller andre matrixproteiner potentielt kunne tilsættes på tidspunktet for polymerisation. Det er også let at ændre platforme til at vurdere forskellige tidsrammer og endepunkter for genekspression og protein produktion. Imaging, vurdere protein og RNA-niveauer, og læsning metaboliske profiler er alle meget kompatible med disse 3D teknikker.

Som det er vigtigt med alle teknikker er det vigtigt at vurdere kvaliteten af ​​gelen og assayet. Et tegn på en god kvalitet kollagengel er en, der kan håndtere manuel manipulation. For eksempel kan en 1 ml [1 mg / ml] Kollagengel hældt i en plade seks brønd bør let samles op med en pincet og manipuleres. Hvis gel tårer eller fragmenter, kvaliteten af ​​gelen er suboptimal, og skridt der skal tages for at forbedre kollagen polymerisering. Temperatur og pH er de vigtigste parametre, der kræves for god fiberdannelse og gelering. Begynd fejlfinding proces ved at sikre alle komponenter holdes på is indtil den er klar til gelering at forekomme. Det er også meget vigtigt at sikre, at neutraliseringen puffer og kollagen stamopløsning bliver blandet grundigt. Dernæst kontrollere, at pH i neutraliseringsbuffer er ved pH 7,4. En HEPES pufret PBS anbefales, da det er meget kompatibel med vævskultur, har en bred vifte buffering, og stamopløsninger tendens til at være meget stabil ved 4 ° C i længere tid. Det har også den fordel at producere længere, mere buede fibre, som er mere lig den fysiologiske tilstand 15. NaOH er en anden commoun brugte neutraliserende løsning, men skal titreres nærmere. Det ser også ud til at have den virkning at producere kortere, tykkere fibre 15. Uanset hvad, bør pH af den neutraliserede kollagen være ved en pH på 7,4. Hvis alle disse betingelser er blevet opfyldt, og integriteten af ​​de geler stadig ikke er tilfredsstillende, så problemet ligger hos bestanden kollagen løsning. Selvom bestanden collagen opløsning har en angivet holdbarhed på 6 måneder ved 4 ° C, har vi fundet, at det er generelt kortere end kommercielle kilder hævder, når de anvendes til 3D-geler. Kassér den gamle flaske og ordre fra en ny masse. Det er ikke usædvanligt for kvaliteten af ​​collagen fra producenten at variere betydeligt fra parti til parti.

Ud over at identificere kvalitet kollagengeler, er det også vigtigt at identificere de trin, der er afgørende for genereringen af ​​god tilpasning i PDMS mikrokanal. Det underliggende princip i denne teknik er, at antallet af collagen flow gennem mikrokanalplade efterfølgende inducerer justering glødetråd. Derfor er den mest kritiske trin ved styring af graden af ​​fiber justering er korrekt modulation af vakuumtrykket. For tilfældige kollagen tilpasning på en mikrokanal, skal vakuumtrykket være lav, og kollagen, skal flyde langsomt ned i kanalen. Hvis collagen strømmer gennem for hurtigt, vil fibrene begynder at tilpasse. En bredere kanal gør denne proposition lettere. Omvendt for god kollagen tilpasning, højere vakuumtryk skal anvendes, og kollagenopløsningen skal trækkes gennem hurtigere. Et andet kritisk trin i genereringen af ​​aligned matricer er temperaturen. Det er meget vigtigt at sikre, at alle komponenter og løsninger er afkølet på is før anvendelse. Hvis kanalerne ikke nedkøles før brug, vil collagen i kanalerne polymerisere for hurtigt, og vil resultere i tyndere, mindre fibre. Hvis den neutraliserede kollagen kølet ved 4 ˚C og ikke på is, det lydudstyred nukleering vil give anledning til større fiberdiametre, der er vanskeligere at tilpasse ved strømning. Det er også vigtigt at chill mikrokanalplade selv. Uden forudgående nedkøling, vil den lille volumen af ​​kollagen varme meget hurtigt giver dårlige resultater.

Collagen mikrokanaler er en meget nyttig teknik, men der er visse begrænsninger. For én, tilpasningen i en flow-induceret mikrokanalplade er aldrig perfekt, og vil aldrig lig en stamme-induceret tilpasning teknik. Der vil altid være nogle fibre orienteret vinkelret på strømningsretningen, men reproducerbarheden, tilpasningsevne, og brugervenlighed opvejer de små variationer på linie i kanalen. Mere vigtigt er celler vist sig effektivt at sanse små ændringer i justering og svare med mere persistente migration i disse kanaler 3,15. Cellerne vil også øge tilpasningen af ​​kanalen som deres numre stige, og de begynder at migrere. Hvis større tilpasning is påkrævet, kan PDMS mikrokanalerne let modificeres til smallere dimensioner eller at have små indsnævringer at forbedre tilpasningen. Begge har vist sig at være effektive, men har andre tilknyttede afvejninger 16. En anden begrænsning til mikrokanalplade teknik er, at PDMS kanal har lidt permeabilitet for lægemidler eller fluorescerende farvestoffer. Dette betyder, at disse forbindelser behøver at diffundere ned i kanalen fra havne, hvilket er overraskende langsom, og kan udgøre vanskeligheder med udvaskning behandlinger.

Selv om der er visse begrænsninger for denne mikrokanalplade platform, betyder det adskillige fordele i forhold til eksisterende teknikker. Det er mere eksperimentelt tilgængeligt, da det ikke kræver voluminøse instrumenter 3,13 eller små populationer af celler til generering tilpasning. Det kræver heller ikke exogene magnetiske perler 13,14 som har tendens til at være autofluorescerende og kunne kunstigt tværbinder collagen netværk. Kollagenet mikrokanal erogså simpelthen mere omkostningseffektiv og økonomisk. Ud over de nuværende fordele, den har også mange fordele, der kunne udnyttes i fremtidige ansøgninger. For én, kan kollagen mikrokanalplade konstrueret eller modificeret i næsten enhver konfiguration eller eksperiment. Avancerede designs tillader kanalerne til at skabe hule kollagen rør eller 3D strukturer til at efterligne arkitektur af forenklede organer eller tumorer 22. Desuden kan kanalerne være lavet af andre end PDMS materialer. Denne potentielt kunne formidle forskellige mekaniske egenskaber til de indlejrede kollagen netværk eller matricer. Endelig kan den lille mængde af reagenser anvendt til dette assay også gøre det attraktivt og økonomisk for mindre screeninger med højt gennemløb.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende tilskud numre UO1CA143069, R01CA142833, R01CA114462, RO1CA179556, T32-AG000213-24, og T32-GM008692-18 for finansiering dette arbejde. Vi anerkender også Jeremy Bredfelt og Yuming Liu loci for udviklingen af ​​og bistand med CT-FIRE-analyse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High Concentration Rat Tail Collagen Corning 354249
SylGard184 elastomer kit Corning NC9285739 Elastomer for PDMS channels
HEPES Fisher BP310 For HEPES neutralization buffer
KCl  Fisher BP366 For HEPES neutralization buffer
KH2PO4 Fisher BP362 For HEPES neutralization buffer
Na2HPO4 Fisher S374 For HEPES neutralization buffer
NaCl Fisher BP358 For HEPES neutralization buffer
Levy Improved Neubauer Hemacytometer Fisher 15170-208 cell counting
6-well non-tissue culture plate  Corning 351146
50 mm glass bottom dish MatTek P50g-1.5-30-f
Bel-Art Plastic Vacuum Desiccator Bel-Art F4200-2021 Degassing chamber for PDMS
transparency film  3M pp2950 Plastic film for pouring pdms channels
ThermoScientific CimaRec ThermoScientific  HP141925 Hot plate for curing PDMS microchannels
Vacuum regulator Precision Medical PM3100 Vacuum regulator for collagen microchannels
8" x 8" rubber sheet Amazon - Rubber-Cal Silicone - 60A rubber sheet for pouring PDMS microchannel
8" x 8" x 0.125" acrylic sheet Amazon Plexiglass sheets for pouring PDMS microchannels
10 lb weights Amazon CAP Barbell for pouring PDMS microchannels
15 ml Conical tubes Fisher 352097
50 ml Conical tubes Fisher 352098
Plastic pipets Dot Scientific 229202B, 229206B, and 667225B 2 ml, 5 ml, and 25 ml
70% EtOH Fisher NC9663244

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. Am J Pathol. 178, 1221-1232 (2011).
  2. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, 38 (2006).
  3. Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophys J. 107, 2546-2558 (2014).
  4. Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Curr Opin Cell Biol. 17, 524-532 (2005).
  5. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188, 11-19 (2010).
  6. Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197, 439-455 (2012).
  7. Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).
  8. Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. J Cell Biol. 163, 583-595 (2003).
  9. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
  10. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
  11. Tlsty, T. D., Coussens, L. M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu Rev Pathol. 1, 119-150 (2006).
  12. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
  13. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys J. 95, 5374-5384 (2008).
  14. Guo, C., Kaufman, L. J. Flow and magnetic field induced collagen alignment. Biomaterials. 28, 1105-1114 (2007).
  15. Sung, K. E., et al. Control of 3-dimensional collagen matrix polymerization for reproducible human mammary fibroblast cell culture in microfluidic devices. Biomaterials. 30, 4833-4841 (2009).
  16. Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomed Microdevices. 8, 35-41 (2006).
  17. Wozniak, M. A., Keely, P. J. Use of three-dimensional collagen gels to study mechanotransduction in T47D breast epithelial cells. Biol Proced Online. 7, 144-161 (2005).
  18. Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 10, Unit 10 18 (2008).
  19. Liu, X., Harada, S. DNA isolation from mammalian samples. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 2, Unit 2 14 (2013).
  20. Roeder, B. A., Kokini, K., Sturgis, J. E., Robinson, J. P., Voytik-Harbin, S. L. Tensile mechanical properties of three-dimensional type I collagen extracellular matrices with varied microstructure. J Biomech Eng. 124, 214-222 (2002).
  21. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. J Biomed Opt. 19, 16007 (2014).
  22. Bischel, L. L., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microfluidic model of ductal carcinoma in situ with 3D, organotypic structure. BMC Cancer. 15, 12 (2015).

Tags

Bioengineering Collagen mikrofluidkanaler 3D matricer ECM kollagen tilpasning tumor mikromiljø
Udarbejdelse af 3D Kollagen Gels og mikrokanalerne for Studiet af 3D Interactions<em&gt; In vivo</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Burkel, B., Morris, B. A., Ponik, S. … More

Burkel, B., Morris, B. A., Ponik, S. M., Riching, K. M., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo. J. Vis. Exp. (111), e53989, doi:10.3791/53989 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter