Abstract
Målet med denne protokol er at beskrive molekylære ændringer i humane diabetiske hornhinder og vise, hvordan de kan afhjælpes ved adenoviral genterapi i orgel-dyrkede hornhinder. Den diabetiske hornhinde sygdom er en komplikation af diabetes med hyppige abnormiteter i hornhinden nerver og epitelial sårheling. Vi har også dokumenteret væsentligt ændret udtryk for flere formodede epitelial stamcelle markører i menneskelige diabetiske hornhinder. For at afbøde disse ændringer blev adenoviral genterapi gennemføres med succes ved hjælp af opregulering af c-met-protoonkogen-ekspression og / eller nedregulering af proteinaser matrixmetalloproteinase-10 (MMP-10) og cathepsin F. Denne terapi accelereret sårheling i diabetiske hornhinder selv når kun det limbale knoglemarven blev transduceret. De bedste resultater blev opnået med kombineret behandling. For eventuel patient transplantation af normaliserede stamceller, er et eksempel også præsenteret af optimizatipå af gentransduktion i stamcelle-beriget kulturer under anvendelse polykationiske enhancere. Denne fremgangsmåde kan være nyttigt ikke blot for de udvalgte gener, men også for de andre mediatorer af hornhinde-epitel sårheling og stamcelle funktion.
Introduction
Den diabetiske hornhinde sygdom resulterer primært i degenerative epitelial (keratopati) og nerve (neuropati) ændringer. Det er ofte manifesterer sig ved de abnormaliteter af epitelial sårheling og hornhinde nerve reduktion 1-4. Det anslås 60-70% diabetikere har forskellige hornhinde problemer 1,3. Vores undersøgelser har identificeret flere markørproteiner med ændret ekspression i humane diabetiske hornhinder herunder nedregulering af c-met-protoonkogen (hepatocytvækstfaktor receptor) og opregulering af matrixmetalloproteinase-10 (MMP-10) og cathepsin F 5, 6. vi har også dokumenteret signifikant nedsat ekspression af flere formodede epitelial stamcellemarkører i de humane diabetiske hornhinder.
I de tidligere undersøgelser har vi udviklet en adenoviral-baseret genterapi til at normalisere niveauet af diabetes-ændrede markører under anvendelse af humant diabetisk hornhinde organ dyrkningssystem, der viser langsom sårheling, diabetiskmarkør ændringer, og stamceller markør udtryk reduktion svarende til ex vivo hornhinder 7,8. Denne vedvarende ændringer synes at være på grund af eksistensen af epigenetisk metaboliske hukommelse 9. Dette dyrkningssystem blev yderligere anvendes til genterapi. Målene for denne behandling blev valgt fra markører med enten reduceret ekspression i diabetiske hornhinder (c-met-protoonkogen), eller forøget ekspression (MMP-10 og cathepsin F).
Den adenovirale (AV) terapi blev anvendt i hele organ-dyrket hornhinder eller corneoscleral perifere limbal kun rum. Dette rum havne epitel stamceller, fornyer hornhindens epitel og deltager aktivt i sårheling 4,10-15. Her bliver protokoller fastsat normale og diabetisk human corneal organkultur, epitelial sårheling, isolering og karakterisering af stamcelle-beriget limbal cellekulturer, og adenoviral celle og hornhindens transduktion. VoresResultaterne viser gennemførligheden af denne terapi til normalisering markør ekspression og sårheling i diabetiske hornhinder til eventuel senere transplantation. De foreslår også, at kombinationen terapi er den mest effektive måde at genoprette normal markør mønster og epitelial heling i diabetisk hornhinden 16-18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
National Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA) leverede indvilliget post mortem sunde og diabetiske menneskelige øjne og hornhinder. NDRI menneskelige væv samling protokol godkendes af ledelsesmæssige udvalg og underlagt National Institutes of Health tilsyn. Denne forskning er blevet udført under det godkendte Cedars-Sinai Medical Center Institutional Review Board (IRB) fritaget protokol EX-1055. Samarbejde hornhinde kirurger, Drs. E. Maguen og Y. Rabinowitz, leveret udsmid corneoscleral fælge til isolering af stamcelle-beriget hornhindeepitelkulturer. Denne forskning er blevet udført under den godkendte IRB protokol Pro00019393.
1. Menneskelig Corneal Organ Culture
Bemærk: Normale og diabetiske hornhinder eller hele øjne modtages i afkølet hornhinde lagermedie (f.eks Optisol GS) inden 48 timer efter døden fra den nationale leverandør NDRI.
- Fjern hornhinder fra opbevaringsbeholder med pincet og vaske dem to gange in antibiotikummet-antimycotisk (ABAM) blanding. I tilfælde af hele øjne, klippe hornhinder ud fra glober med krum saks. Efterlad mindst 5 mm konjunktival fælg og også vaske hornhinder i ABAM.
- Forbered blandingen, der skal anbringes i hornhindens konkavitet. Den består af serum-frit minimalt essentielt medium (MEM) indeholdende ABAM, 1 mg / ml kalvehudkollagen (fremstillet ud fra en stamopløsning på 10 mg / ml i 0,1 N eddikesyre), 1% agar, og insulin-transferrin-selenit supplement 7.
- Mikrobølgeovn denne blanding til kogning i sterilisering og agar opløsning. Det kan tage op til 1 min for alt at opløse. Efterlad røret hætten delvis åben, fordi blandingen flyder let, når det koger. Derfor kan der være behov adskillige kogende cykler, hver til 10-15 sek. Afkøle blandingen til 37-39 ° C.
- Placer hornhinder epitelial nedad i sterile 60 mm retter. Fyld hornhindens konkavitet med ca. 0,5 ml af den i 1.2 blanding. DetBlandingen størkner ved hornhinderne inden for 2 min.
- Placer hornhinder agar nedad i sterile 60 mm skåle og tilføje de komplette medium indeholdende MEM med ABAM, og insulin-transferrin-selenit supplement 7 (37 ° C) for at holde niveauet tilnærmelsesvis limbus for luft-væske-grænsefladen kultur. Mediet volumen er 7-8 ml pr fad.
- Placer retter med hornhinderne i en 5% CO2-inkubator befugtet med en vand pan (denne måde luftfugtighed holdes på eller over 95%) ved 35 ° C (normal corneal temperatur). Tilsæt 100 pi medium (to dråber) dagligt på epitel at fugte hornhinder.
- Overvåg hornhindens morfologi og epitelcelle levedygtighed mikroskopisk under transmitteret lys under anvendelse af en standard mikroskop med et 4X objektiv. Gør det en gang om dagen.
- Skift medium hver tredje dag. Hornhinder kan dyrkes i mindst tre uger. For de genterapi eksperimenter, kultur hornhinder i 3-5 dage, så TRANSDe med gener af interesse (4.1-4.4), orlov i yderligere 3-5 dage afhængig af transgen og med forbehold af sårhelingen protokol (2,1-2,4).
2. Epiteliale Sårheling
Bemærk: I de diabetiske hornhinder, epitel debridering ved mekanisk skrabning er ikke mulig, fordi den skrøbelige epitelbasalmembran er afmonteret i processen, hvilket ikke sker i de normale hornhinder. Således, for at holde de normale og diabetiske hornhinder under lignende betingelser for sårheling, er kemisk fjernelse af epitel med n-heptanol anvendt 19. Denne procedure fjerner epithelet men efterlader et intakt basalmembran i både normale og diabetiske hornhinder.
- For at udføre central epitelial debridering 20, anbringes en 5 mm filterpapirskive gennemvædet med n-heptanol på den centrale hornhinde forreste overflade for 75 sek.
- Fjern filteret og vask hornhinderne fuldt medium. Fyld konkaviteten med 0,5 ml agar-collagenblandingen og kultur som i 1.4. Efter debridering, epitelceller normalt dø og skifte ham ud efterlod mikroskopisk intakt basalmembran 7.
- Brug 8,5 mm diske til at skabe større epitel sår i forsøgene med kun limbal genterapi. Dette vil sikre inddragelse af limbale stamceller i helingsprocessen.
- Overvåg hornhindens heling mikroskopisk. Lav billeder på 4X og 10X hver dag indtil den epiteldefekt er fuldstændig helet. Den helbredende proces kan tage fra 2 til 15 dage afhængigt af tilstanden (normal eller diabetisk) og sår størrelse.
Bemærk: Under helingsprocessen, er sorte spider-lignende celler observeret i toppen brændplanet. Disse celler er apoptotiske stromakeratocytter der døde efter epitel fjernelse 4. Helbredelsen er bestemt til at være komplet, når disse døde celler er overgroet af healing epitel og ikke længere er synlige (figur 2, indsat). - efter healingfærdiggørelse, skære hornhinder i halve, integrere dem i OCT-forbindelse og proces til indirekte immunofluorescens på cryostatsektioner eller til Western blots 16,21.
3. Isolering af limbal celler og vedligeholdelse af stamceller beriget Cultures
Bemærk: Forbered den primære limbal epitel stamcelle (LESC) beriget kulturer fra corneoscleral fælge. De fælge kommer fra raske donorer og kasseres efter hornhinde transplantationer er modtaget fra de samarbejdende kirurger i standard hornhinde lagermedium (f.eks Optisol). Ellers kan de LESC-berigede kulturer opnås fra fælge udskåret fra normale og diabetiske hele hornhinder eller kloder modtaget fra NDRI i hornhindens lagringsmediet.
- Hvis der anvendes hele hornhinder eller glober, først isolere de limbale områder. For at gøre dette, skal du placere hornhinden på en steril plastik skål med epitelial side op og fjern det centrale område med en 9-mm trepan (cirkulære hornhinde kniv).Kassér denne centrale del. Så udskære limbale zone ved hjælp af en 13 mm trepan og kassér den ydre konjunktival del. For at isolere celler bruger bagel-lignende limbal rand. Før celleisolering, fjerne endotelceller og vedhængende rester af iris fra indersiden af hornhinden modsat til overfladen epitel med en steril vatpind.
- Isoler limbale cellelag hjælp dispase behandling. Inkuber hver corneoscleral rand med 2,4 U / ml dispase II i 1,5 ml keratinocyt serum-frit medium (KSFM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i 2 timer 22.
- lethed forsigtigt limbale epitelcelle ark af fælgen under et dissekerende stereomikroskop med en pincet og dissociere cellerne i 1 ml 0,25% trypsin - 0,02% EDTA-opløsning i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Vask cellerne i 10 ml medium (f.eks Epilife) og pelletere dem ved 300 xg i en table-top centrifuge i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Gensuspendér the celler i dyrkningsmedium: medium med N2, B27 og humane keratinocyt væksttilskud, og 10 ng / ml epidermal vækstfaktor (EGF).
- Frø cellerne ved 3.000-5.000 celler / ml i kolber eller 60 mm skåle overtrukket med en blanding af humant basalmembranproteiner herunder fibronectin, type IV-collagen, og laminin (FCL), ved 0,5-1 ug / cm2, i KSFM medium.
- Dyrke cellerne i en fugtig (95% eller højere fugtighed) CO2-inkubator ved 37 ° C, indtil de danner fuldt sammenflydende monolag. Dette kan tage 1-2 uger.
Bemærk: Regelmæssigt bekræfte celle identitet ved positiv immuncytokemisk farvning for formodede LESC markører herunder Pax6, keratin (K) 14, K15, K17, og ΔNp63α. De farvning detaljer, herunder de primære antistoffer er blevet offentliggjort 8,16-18,22. - Til passage af de sammenflydende celler, behandle dem med 1 ml 0,05% trypsin-opløsning (1: 5 fortynding af 0,25% opløsning) i 10 minutter ved 37 ° C. Tilsæt 5 ml sojabønner trypsin inhibitor-opløsning (10 mg / ml) fortyndet 1: 4 i medium, og centrifuger cellerne som i 3.5.
- Vask cellepelleten i 3 ml fortyndet sojabønnetrypsininhibitor opløsning. Plate cellerne onto FCL-belagt (se 3.7) retter eller glas chamber slides på 2 x 10 4 celler / ml.
4. Adenoviral transduktion af Organ-dyrkede hornhinder
Bemærk: De rekombinante adenovira (AV) omfatter AV-vektor (ingen gen indsat), AV-cMet (med c-met-genet åben læseramme), AV-shM10 (med shRNA til MMP-10), og AV-shCF ( med shRNA at cathepsin F). De er E1 / E3-deleterede type 5 AV ekspression af gener under kontrol af den store umiddelbare tidlige cytomegalovirus-promotor. AV-cMet virus genereres ved hjælp af AV vektor pAd / CMV / V5-DEST 16. De AV-shRNA vira er custom genereres ved subkloning af shRNA sekvenser sammen med HH1 promotor og GFP tag-sekvens fra iLenti-EGFP vektor i en replikation-inkompetente (-E1 / -E3) human AV type 5-genomet under anvendelse af Adeno-4 ekspressionssystem 17.
- Transducere et organ dyrket hornhinde i hvert par med AV-vektor og en anden hornhinde, med et gen-ekspression-modulerende AV. Brug AV-cMet ved 0,8 til 1,25 x 10 8 plaquedannende enheder (pfu) pr hornhinden i dyrkningsmedium i 48 timer ved 37 ° C, idet hornhinderne på mellemlang overflade hver i en brønd af en 24-brønds skål. Brug AV-shRNA virus på 1-2 x 10 8 pfu pr hornhinden.
- Brug vira til transduktion i fuld medium suppleret med 75 ug / ml sildenafil citrat. Dette reagens aktiverer caveolin transport lette viral optagelse af epitelcellerne 21. På grund af korte halveringstid for sildenafil i vandige opløsninger, re-tilføje det samme beløb til mediet 4-5 timer senere. Standard behandling er i 48 timer.
- Overfør hornhinder til nye retter med en rund ende steril spatel og kultur i medium uden AV holde mediet niveau ved limbus. Efter tilføjelsentionelle 4-8 dage ved væske-luftgrænsefladen, proces AV-behandlede hornhinder til forskellige analyser eller test for epitel sårheling (se ovenfor). Rutinemæssigt fugte hornhinder under kultur ved tilsætning af 100 pi medium (to dråber) oven på hornhinden.
- For transduktionen af kun de limbale celler, inkuberes virus med hornhinderne på luft-væske-grænsefladen med medium niveau ved limbus, for at undgå transduktion af den centrale epitel.
5. Adenoviral Transduktion af dyrkede limbal Cells
- Opretholde LESC-berigede kulturer i medium med 10 ng / ml EGF (se 3.5) på plastskåle coatet med FCL blandingen ved 0,5 pg / cm2.
- Transducere dyrkede celler, der har nået 70-80% sammenflydning med AV huser grønt fluorescerende protein-gen (AV-GFP) eller AV-krypteret shRNA-GFP i en række infektionsmultiplicitet (MOI: 1-300 pfu / celle) på mellemlang med 2 ng / ml EGF. Udfør transduction i 4 timer ved 37 ° C i et minimalt volumen (0,2 ml) efterfulgt af 20 timer i 0,5 ml medium. Den caveolin transport aktivator sildenafil er ikke nødvendig for cellekulturen transduktion.
- Brug en af følgende reagenser, som letter AV binding til celleoverfladen at øge AV transduktionseffektiviteten: enten polykationer (1 ug / ml poly-L-lysin eller 5 ug / ml polybren), eller 6 pl / ml transduktion reagens ( fx ViraDuctin), eller 20 ul / ml transduktion enhancer (f.eks ibiBoost).
- Efter udskiftning af medium til en uden AV, inkuber dyrkede celler i 4 dage, i befugtet CO2-inkubator og vurdere GFP-ekspression niveau under anvendelse af et omvendt fluorescerende mikroskop.
- Brug scratch sårheling assay til at evaluere cellemigrering i AV-transducerede kulturer. Grow cellerne i flerbrøndspladens kammerskiver. Foretag sårene i et monolag ved at ridse celler i en lige lineær bevægelse med en 200 pi piPette tip. Efter sårede, ændre medium for en frisk til at fjerne de løsrevne celler.
- Fotografere sårene hver dag med et digitalt kamera fastgjort til et inverteret mikroskop ved 4X forstørrelse. Optage det tidspunkt, hvor helingen er komplet (sårkanterne kommer i kontakt langs hele sår).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidligere vist, at i hornhindens organkulturer, er forskellene i ekspressionen af diabetiske markører (f.eks basalmembranproteiner og integrin α3β1) og sårheling mellem de normale og diabetiske hornhinder bevaret. Dette dyrkningssystem blev underkastet genterapi til formål at normalisere niveauet af diabetes-ændrede markører, c-Met, MMP-10, og cathepsin F.
Når hele hornhindens epitel blev transduceret med AV-cMet, eller AV-shRNA til MMP-10 eller cathepsin F (separat eller i kombination), blev epitel sårheling afsluttet væsentligt hurtigere (P <0,03 ved parret Student t-test i forhold til AV-vektor) end i AV-vektor-transducerede kolleger hornhinder fra de samme donorer 16,17. AV-cMet reducerede den helbredende tid til det halve, hvilket ikke signifikant forskellig fra heling af de normale hornhinder (Figure 1). AV-shM10 og AV-shCF havde mindre effekt. Men en kombination af AV-cMet med AV-shM10 og AV-shCF (Combo) producerede den stærkeste effekt helt normalisere epiteliale helbredende gange (Figur 1). Denne reduktion i healing tid blev ledsaget af de normaliserede mønstre af diabetiske (basalmembran og integrin) og stamceller markører i de diabetiske hornhinder 8,16,17.
De epiteliale stamceller er den største sårhelende deltagere 4. Derfor har vi undersøgt, om limbal genterapi målrettet knoglemarven ville være gavnligt for de diabetiske hornhinder. Til dette formål blev kun de limbale dele af diabetiske hornhinder transduceres af AV-cMet eller Combo og store, blev 8,5 mm sår oprettet. AV-cMet transducerede hornhinder helede væsentligt hurtigere (P <0,001 ved parret Student t-test) end AV-vektoren transducerede kolleger hornhinder (Figure 2). Den Combo behandling resulterede i samme resultat 18. Genterapi øgede ekspression af diabetesrelaterede undertrykt markører, såsom integrin α3β1 og basalmembran komponent nidogen-1 (figur 3, venstre spalter, Combo). Vigtigt er, som i hele corneal transduktion 8,17, den limbale genterapi med enten AV-cMet eller Combo førte til en markant forøget ekspression af formodede LESC markører herunder K15 og ΔNp63α, sammenlignet med AV-vektor transducerede hornhinder (figur 3 , rigtige kolonner, både c-met og Combo). Disse data understøttede den rolle, stamcelle normalisering i den accelererede sårheling ved genterapi af diabetiske hornhinder og viser gennemførligheden af vores tilgang til behandling af diabetisk corneasygdom.
Vi næste begyndte at undersøge genterapi virkninger på dyrkede LESC beriget limbale epitelceller. kulturerneaf normale og diabetiske limbale epitelceller blev etableret og farvet for formodede LESC markører. Mange celler farvet positive (figur 4). Farvningsintensiteten i de diabetiske kulturer var konsekvent svagere end i de normale kulturer (K15 vist som et eksempel i figur 4), som var meget lig situationen i diabetiske vs. normal ex vivo hornhinder 8. Disse forsøg valideret de opnåede cellekulturer som egnede til genterapi.
Indledende forsøg med et telomerase-immortaliseret corneal epitelcellelinie (se 23) viste, at cellerne let blev transduceret af de tilgængelige AV konstruktioner (data ikke vist her). Men de primære limbale kulturer viste sig at være meget mere følsomme over for den virale belastning og / eller transduktion reagens, hvilket nødvendiggør optimering af transduktion protokol. Den dyrkede limbal celle transduktion vedAV-GFP (figur 5) afhang af infektionsmultiplicitet (MOI; interval 30-300 pfu / celle) resulterer i et relativt højt niveau af transduktion ved høj MOI (GFP-ekspression i> 80% celler). Men jo højere MOI var også giftige og fremkalder celledød eller svært nedsat cellevandring ind scratch sår efter 3-4 dages transduktion (figur 6). Ved den nedre MOI (10-30 pfu / celle), AV transduktion produceres mindre eller ingen cytotoksisk virkning, men resulterede i et nedsat antal GFP-udtrykkende celler (5-15%).
Dernæst forsøgte at øge transduktionseffektiviteten uden at kompromittere cellelevedygtighed ved hjælp transduktion-forstærkende reagenser, letter generelt AV binding til celleoverfladen. De viste forskellige effektivitetsforbedringer i limbal epitelcelle transduktion af AV på MOI 10-30. Begge polykationer, poly-L-lysin, og polybren, var ikke-toksiske og mest effektiveresulterer i 3-4 gange forøgelse i antallet af GFP-positive celler (figur 7, øverste række). ibiBoost var også effektivt, men mindre giftig, og ViraDuctin var ineffektiv og temmelig toksisk (figur 7, nederste række). Derfor polykationer tilbyde sikker og effektiv måde at øge gen af interesse udtryk på det AV transduktion og bør anvendes til genekspression og sårheling eksperimenter.
Figur 1: c-Met gentransduktion fører til signifikant nedsat hornhinde-epitel sårheling tid (middelværdi ± SEM). Desuden kombineret genterapi (Combo) med AV huser c-met gen og shRNAs til MMP-10 og cathepsin F-generne helt normaliserer epitel sårheling tid. Signifikans (p-værdier) blev etableret af parret Student t-test sammenlignet med respektiv e vektor behandlinger. Barer repræsenterer standardafvigelsen af middelværdien. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Heling af 8,5 mm epiteliale sår i et par diabetiske hornhinder. Øverste række, vektor-transducerede hornhinde; healing er færdig i 8 dage. Nederste række, AV-cMet transducerede fyr hornhinde; healing er komplet i 5 dage. Pile viser såret (W) kant. *, Ikke-helede del (også vist ved stor forstørrelse som indsat), med spider-formede apoptosed stromakeratocytter. De er synlige, indtil epitellaget vokser oven på dem. Bar = 50 um. Fase kontrast. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: immunfarvning af diabetiske hornhinde sektioner til forskellige markører efter limbal genterapi. Både AV-cMet og Combo behandlinger resulterer i markant øget limbal farvning for diabetiske markører (integrin α3β1 og nidogen-1) og formodede stamcelle markører (K15 og ΔNp63α). Pile på nidogen-1 paneler markerer corneal epitelbasalmembran. Bar = 30 um. e, epitel; s, stroma. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: immuncytokemisk farvning af primære limbale epiteliale kulturer til en formodet LESC markør K15. Øverste række, normal kultur; De fleste celler show stærk farvning for K15. Nederste række, diabetisk kultur; fleste celler viser kun svag farvning. De rigtige paneler er præsenteret med DAPI nukleare kontrastfarvning. Normale og diabetiske celler blev fotograferet med samme eksponeringstid. Bar = 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Niveauet af GFP-ekspression i transducerede limbale epitelceller afhænger MOI på AV-GFP: (a) 30 pfu / celle; (B) 120 pfu / celle; (C) 300 pfu / celle ved 3 dages transduktion. Fotografier af levende celler er vist. Bar = 300 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Cellemigration negativt påvirket af stigende koncentration af AV som afsløret ved bunden sår test: (a) kontrol; (B) 20 pfu / celle; (C) 80 pfu / celle; (D) 120 pfu / celle. Fotografier af levende celler er vist. Bar = 500 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: limbale epitelceller transduceret med AV-GFP ved 30 pfu / celle. (A) kontrol; (B) poly-L-lysin; (C, d) transduktion reagens; 5 dage af transduktion. Transduktion reagens caused en signifikant cytotoksisk virkning fører til celleafrunding og død (d, fasekontrast). Fotografier af levende celler er vist. Bar = 400 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hornhinden synes at være en ideel væv til genterapi på grund af sin overflade placering hvor genafgivelse, samt evaluering af effektivitet og bivirkninger, er let. Men en klinisk oversættelse af denne kraftfulde tilgang er stadig langsom på grund af knappe oplysninger om genetiske årsager til hornhinde sygdomme og de genterapi mål 24. Diabetiske komplikationer, herunder hornhinde ændringer kan være stort set epigenetisk i naturen, hvilket udmønter sig i metaboliske hukommelse 9. Af denne grund de diabetiske væv og celler bevarer deres abnormiteter ex vivo og kan studeres i organer og væv kultur. Også, diabetes forårsager specifikke ændringer i genekspressionsniveauer og mønstre, der kan rettes af genterapi. Vi har identificeret flere markører ændret i diabetiske hornhindeepitel herunder knoglemarven 5,6,8, og brugte de menneskelige hornhinde organkulturer 7,8 at normalisere medgenterapi markøren ekspression og epitelial sårheling kompromitteret i den diabetiske hornhinden.
Vi har valgt AV som genoverførselsmediet grund af sin stærke transgenekspression, dets ikke-integrerende natur og dets selektivitet for epitelceller, som er egenskaber bedre end dem af adeno-associeret virus (AAV) 25. AV transduktion af hornhindens organkulturer har flere kritiske trin. Hornhinder skal leveres til laboratoriet inden 48 timer postmortem, for at minimere tabet af epitel, der opstår under opbevaring. For at forøge viral optagelse, er det vigtigt at tilsætte caveolae transport boostere, såsom sildenafil, under transduktion 21. Når validering af transduktion effekt på proteinekspression, er anvendelsen af adskillige markører anbefalet (figur 3), som specifikke stamcellemarkører ikke endeligt identificeret. Når de foretager epiteliale sår, der er en nødvendighed for at bruge chemical debridement grund af skrøbelighed diabetisk epitelbasalmembranen resulterer i sin løsrivelse under manuel skrabning. En omhyggelig daglig overvågning af helingsprocessen er nødvendig med objektive kriterier for helbredelse, såsom forsvinden døde subepiteliale keratocytter væk når epitel regrows over dem (figur 2). Endelig skyldes nogle AV og / eller GFP toksicitet for de primære limbale celler, er det vigtigt at sænke den virale dosis, samtidig anvendelse af ikke-toksiske transduktion boostere, såsom polykationer, for at sikre effektiv og sikker transduktion (figur 5 - 7).
Genterapi systemet kan modificeres til at bruge dyreorgan-dyrket hornhinder. De er meget billigere end human, kan fås i mængder på regelmæssig basis, og kan være egnet til screening, fx af sårheling-modulerende stoffer. Men de humane hornhinder tilbyder potentielt bredere muligheder for,undersøgelsen på grund af den overflod af reagenser, især antistoffer. I tilfælde af lægemiddel-screening i ikke-diabetiske dyr hornhinder kan debridering ske maskinelt. Hvis et antistof for en bestemt markør ikke fungerer godt i nogle humane hornhinder, kan det være på grund af den individuelle variabilitet og / eller sygdom varighed eller omfang. I dette tilfælde undersøge andre markører kan anbefales. Evnen af n-heptanol at fjerne cellerne kan signifikant falde med tiden, muligvis på grund af oxidation under opbevaring. Hvis dette sker, kan en ny, tidligere uåbnet hætteglas skal bruges. Hvis du arbejder med de dyre menneskelige hornhinder, kan en anden runde af debridering forsøges. Sildenafil har en kort halveringstid i vandige opløsninger; derfor skal det fremstilles hver gang en hornhinde transduktion udføres. Succesen med dyrkning limbale celler kan afhænge af donorens alder; cellerne fra yngre donorer normalt vokser bedre. Et enkelt genterapi middel kan ikke fremkalde en betyicant effekt; i dette tilfælde kan en kombination af sådanne midler være optimal 17. Hvis de primære hornhinde celler viser tegn på toksicitet, er det vigtigt at sænke den virale og polykation (fx poly-L-lysin) doser for at minimere toksiske virkning samtidig bevare effektiv transduktion.
Selvom diabetiske organkulturer reproducere mange tegn på sygdommen og ændret genekspression, er de denerveres og mangler levering af immunceller, som kan påvirke sårheling og stamceller. I denne henseende kan dyremodeller tilbyde nogle fordele, selv om dyrene ikke reproducere det fulde spektrum af humane sygdomstilstande tegn. De andre genterapi mål findes der effektivt normalisere diabetiske hornhinder. Et eksempel på sådanne mål kan være microRNA, specifikt mir-146a eller mir-424 23. Kombinationerne af de anvendte target genmodifikationer med inhibering af specifik microRNA kan potentielt producere en mere potent fordelagtig virkning. anothER begrænsning omfatter nødvendigheden af relativt lang inkubation af hornhinden med topisk administreret AV (fx i form af øjendråber) for at sikre maksimal viral optagelse. Dette kan udgøre et problem i klinikken, selvom taping øjenlåg kunne hjælpe til at forlænge inkubationen. Anvendelsen af en lav koncentration af sildenafil i det virale løsning kunne accelerere AV-optagelse. AV transduktion effekten er forbigående, hvilket kan begrænse kurative potentiale AV-baserede genterapi. Selvom det varer længe nok til at rette den diabetiske sårheling afmatning, vedvarende normalisering af de epiteliale stamceller kan kræve en længerevarende virkning, såsom tilvejebragt af AAV-baserede genterapi 24. Det skal nævnes, at immunogenicitet var en alvorlig ulempe ved tidlige AV vektorer. Men den nye generation af rekombinant AV herunder "gutless" virus er stort set fri for denne bivirkning, øge deres udsigter til at være potent translatiOnal genterapi køretøjer 26.
Lavmolekylære modulatorer af forskellige veje, der kan være vigtige for sårheling 16,17,21, er 27-30 anvendes i de eksperimentelle modeller og klinikken. Men de er ikke rettet mod en bestemt celletype, kan have forskellige virkninger i forskellige celler, og kan kun handle på nogle aspekter af den diabetiske hornhinde sygdom 31,32. Genterapi giver en mulighed for at ændre genekspressionen i en ønsket retning i specifikke celler, som vi har opnået i dette arbejde transduktion epithelcellerne anvendelse af både gen overekspression (c-Met) og silencing (MMP-10 og cathepsin F). Denne tilgang gør det også muligt at modulere ekspression af specifikke sygdomme markørgener, en efter en eller i kombinationer 5,6. Vores eksperimenter viste, at selv i tilfælde af kombination af tre AVS huser forskellige genekspression modulatorer blev alle tre gener påvirkes som forventet, ogbehandling var mere effektiv end når hver AV blev anvendt alene 17.
Ved svær diabetisk keratopati med vedvarende epiteliale defekter eller ufuldstændige epitelial heling ved vitrektomi eller laser fotokoagulation, kan en udskiftning af dysfunktionelle limbale stamceller være et alternativ til genterapi. I disse tilfælde kan dyrkede og ekspanderede limbale epitelceller upon genterapi in vitro transplanteres på det syge hornhinder. Vores data viser, at dyrkede limbale celler fra de diabetiske hornhinder viser lignende forskelle i stamceller markør udtryk som ex vivo hornhinder gør dem gode mål for genterapi. Dog skal denne behandling, der skal optimeres, på grund af den høje følsomhed af sådanne celler til den virale belastning og transfektionsreagens anvendes. Vi var i stand til at vise, at de kationiske transfektionsreagenser sikret effektiv og sikker levering med høj ekspression af et gen af interesse i dyrkede diabetisk hornhindeepitel. Tisse resultater kan bane vejen for en vellykket genterapi af in vitro udvidet LESC for de fremtidige transplantation formål i tilfælde af alvorlig diabetisk keratopati. Fordi arvelig og erhvervet LESC mangel også er forbundet med reduktionen af hornhinde nerver ligner diabetes 33,34, kunne transplantation af raske LESC-berigede kulturer onto syge hornhinder potentielt lindre diabetiske corneal neuropati samt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| minimum essential medium | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Optisol-GS | Bausch & Lomb | 50006-OPT | |
| ABAM antibiotic-antimycotic mixture | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| calf skin collagen | Sigma-Aldrich | C9791 | |
| agar, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| n-heptanol | Sigma-Aldrich | 72954-5ML-F | |
| O.C.T. compound | VWR International | 25608-930 | |
| Dispase II | Roche Applied Science | 4942078001 | |
| keratinocyte serum-free medium (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005042 | |
| EpiLife medium with calcium | Thermo Fisher Scientific | MEPI500CA | |
| N2 medium supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| B27 medium supplement, 50x | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| human keratinocyte growth supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | S-001-5 | |
| trypsin 0.25% - EDTA 0.02% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| trypsin 0.25% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15050065 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| insulin-transferrin-selenite supplement (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| antibody to keratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
| antibody to keratin 15 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47697 | |
| antibody to keratin 17 | Santa Cruz Biotechnology | SC-58726 | |
| antibody to ΔNp63α | Santa Cruz Biotechnology | sc-8609 | |
| antibody to PAX6 | BioLegend | PRB-278P-100 | |
| antibody to nidogen-1 | R&D Systems | MAB2570 | |
| antibody to integrin α3β1 | EMD Millipore | MAB1992 | |
| human fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| human laminin | Sigma-Aldrich | L4445 | |
| human type IV collagen | Sigma-Aldrich | C6745-1ML | |
| adenovirus expressing MMP-10 shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing cathepsin F shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing scrambled shRNA and GFP | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing c-met | OriGene (plasmid) | SC323278 | |
| adenovirus expressing GFP | KeraFAST | FVQ002 | |
| sildenafil citrate, 25 mg | Pfizer | from pharmacy | |
| epidermal growth factor | Thermo Fisher Scientific | PHG0311 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| ViraDuctin | Cell Biolabs | AD-200 | |
| ibiBoost | ibidi, Germany | 50301 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Corning round end spatula | Dow Corning | 3005 | |
| 60 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 174888 | |
| Nunc Lab-Tek II multiwell chamber slides | Sigma-Aldrich | C6807 | |
| 200 μl pipet tips | Bioexpress | P-1233-200 | other suppliers available |
| inverted microscope | Nikon | Diaphot | other suppliers/models available |
| humidified CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370 (Steri-Cycle) | other suppliers/models available |
| fluorescent microscope | Olympus, Japan | BX-40 | other suppliers/models available |
| dissecting stereo microscope | Leica, Germany | S4 E | other suppliers/models available |
References
- Bikbova, G., Oshitari, T., Tawada, A., Yamamoto, S.
- Calvo-Maroto, A. M., Perez-Cambrodí, R. J., Albarán-Diego, C., Pons, A., Cerviño, A. Optical quality of the diabetic eye: a review. Eye (Lond). 28 (11), 1271-1280 (2014).
- Tripathy, K., Chawla, R., Sharma, Y. R., Venkatesh, P., Vohra, R.
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M.
- Saghizadeh, M., et al. Overexpression of matrix metalloproteinase-10 and matrix metalloproteinase-3 in human diabetic corneas: a possible mechanism of basement membrane and integrin alterations. Am J Pathol. 158 (2), 723-734 (2001).
- Saghizadeh, M., et al. Proteinase and growth factor alterations revealed by gene microarray analysis of human diabetic corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (10), 3604-3615 (2005).
- Kabosova, A., Kramerov, A. A., Aoki, A. M., Murphy, G., Zieske, J. D., Ljubimov, A. V. Human diabetic corneas preserve wound healing, basement membrane, integrin and MMP-10 differences from normal corneas in organ culture. Exp Eye Res. 77 (2), 211-217 (2003).
- Saghizadeh, M., et al. Alterations of epithelial stem cell marker patterns in human diabetic corneas and effects of c-met gene therapy. Mol Vis. 17, 2177-2190 (2011).
- Kowluru, R. A., Kowluru, A., Mishra, M., Kumar, B. Oxidative stress and epigenetic modifications in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 40-61 (2015).
- Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. J Cell Sci. 111 (Pt 19), 2867-2875 (1998).
- Lu, L., Reinach, P., Kao, W. W.
- Rama, P., et al. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. N Engl J Med. 363 (2), 147-155 (2010).
- Di Girolamo, N., et al. Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea. Stem Cells. 48 (1), 203-225 (2014).
- Amitai-Lange, A., et al. Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
- Di Girolamo, N. Moving epithelia: Tracking the fate of mammalian limbal epithelial stem cells. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 203-225 (2015).
- Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-met gene. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (4), 1970-1980 (2010).
- Saghizadeh, M., et al. Enhanced wound healing, kinase and stem cell marker expression in diabetic organ-cultured human corneas upon MMP-10 and cathepsin F gene silencing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8172-8180 (2013).
- Saghizadeh, M., Dib, C. M., Brunken, W. J., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and stem cell marker patterns in organ-cultured human diabetic corneas by gene therapy of limbal cells. Exp Eye Res. 129 (Dec), 66-73 (2014).
- Hatchell, D. L., et al. Damage to the epithelial basement membrane in the corneas of diabetic rabbits. Arch Ophthalmol. 101 (3), 469-471 (1983).
- Chung, J. H., Kim, W. K., Lee, J. S., Pae, Y. S., Kim, H. J. Effect of topical Na-hyaluronan on hemidesmosome formation in n-heptanol-induced corneal injury. Ophthalmic Res. 30 (2), 96-100 (1998).
- Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Res Bull. 81 (2-3), 262-272 (2010).
- Sareen, D., et al. Differentiation of human limbal-derived induced pluripotent stem cells into limbal-like epithelium. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1002-1012 (2014).
- Funari, V. A., et al. Differentially expressed wound healing-related microRNAs in the human diabetic cornea. PLoS One. 8 (12), e84425 (2013).
- Mohan, R. R., Rodier, J. T., Sharma, A. Corneal gene therapy: basic science and translational perspective. Ocul Surf. 11 (3), 150-164 (2013).
- Liu, J., et al. Different tropism of adenoviruses and adeno-associated viruses to corneal cells: implications for corneal gene therapy. Mol Vis. 14, 2087-2096 (2008).
- Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4 (5), 346-358 (2003).
- Sharma, G. D., He, J., Bazan, H. E. P38 and ERK1/2 coordinate cellular migration and proliferation in epithelial wound healing: evidence of cross-talk activation between MAP kinase cascades. J Biol Chem. 278 (24), 21989-21997 (2003).
- Saika, S., et al. Role of p38 MAP kinase in regulation of cell migration and proliferation in healing corneal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (1), 100-109 (2004).
- Xu, K. P., Li, Y., Ljubimov, A. V., Yu, F. S. High glucose suppresses epidermal growth factor receptor/phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway and attenuates corneal epithelial wound healing. Diabetes. 58 (5), 1077-1085 (2009).
- Xu, K., Yu, F. S. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3301-3308 (2011).
- Takamura, Y., et al. Aldose reductase inhibitor counteracts the enhanced expression of matrix metalloproteinase-10 and improves corneal wound healing in galactose-fed rats. Mol Vis. 19, 2477-2486 (2013).
- Byun, Y. S., Kang, B., Yoo, Y. S., Joo, C. K. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves corneal epithelial innervation and wound healing in diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1948-1955 (2015).
- Deng, S. X., et al. Characterization of limbal stem cell deficiency by in vivo laser scanning confocal microscopy: a microstructural approach. Arch Ophthalmol. 130 (4), 440-445 (2012).
- Lagali, N., et al. In vivo morphology of the limbal palisades of Vogt correlates with progressive stem cell deficiency in aniridia-related keratopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5333-5342 (2013).
