Abstract
Målet med detta protokoll är att beskriva molekylära förändringar i humana diabeteshornhinnor och visa hur de kan lindras genom adenoviral genterapi i organ odlade hornhinnor. Diabetiker hornhinnans sjukdom är en komplikation vid diabetes med täta avvikelser i hornhinnan nerver och epitel sårläkning. Vi har också dokumenterat signifikant uttrycket av flera förmodade epitel stamcellsmarkörer i humana diabeteshornhinnor. För att lindra dessa förändringar, var adenoviral genterapi genomföras framgångsrikt med hjälp av uppregleringen av c-met-proto-onkogen-expression och / eller nedreglering av proteinaser matrixmetalloproteinas-10 (MMP-10) och katepsin F. Denna terapi accelererad sårläkning i diabetiska hornhinnor även när endast limbal stamcells transducerades. De bästa resultaten erhölls med kombinationsbehandling. För eventuell patienten transplantation av normaliserade stamceller, är ett exempel presenteras också av optimizatipå av gentransduktion i stamcellsberikade kulturerna med polykatjoniska medel. Detta tillvägagångssätt kan vara användbart inte bara för de valda generna utan även för de andra mediatorer av hornhinneepitel sårläkning och stamcellsfunktion.
Introduction
Diabetiker hornhinnans sjukdom beror främst i degenerativ epitel (keratopati) och nerv (neuropati) förändringar. Det är ofta manifesteras av avvikelser i epitel sårläkning och hornhinnan nerv minskning 1-4. Uppskattningsvis 60-70% diabetiker har olika hornhinnan problem 1,3. Våra studier har identifierat flera markörproteiner med förändrade uttryck i humana diabeteshornhinnor inklusive nedreglering av c-met-proto-onkogen (hepatocyte growth factor receptor) och uppreglering av matrix metalloproteinas-10 (MMP-10) och cathepsin K 5, 6. vi har också dokumenterat avsevärt minskat uttryck av flera förmodade epitel stamcellsmarkörer i människans diabetes hornhinnor.
I tidigare studier har vi utvecklat en adenoviral-baserad genterapi för att normalisera nivåerna av diabetes-altered markörer med användning av humant diabetisk korneal organkultursystem, som visar långsam sårläkning, diabetiskmarkörförändringar, och stamcells markör uttryck minskning liknar hornhinnorna 7,8 ex vivo. Denna ihållande förändringar tycks bero på förekomsten av epigenetiska metabolisk minne 9. Detta odlingssystem var vidare användas för genterapi. Målen för denna behandling valdes från markörer med antingen minskad uttryck i diabeteshornhinnor (c-met-proto-onkogen) eller ökat uttryck (MMP-10 och cathepsin K).
Adenovirus (AV) terapi användes i hela organ odlade hornhinnor eller den corneoscleral perifera limbal endast fack. Detta fack hamnar epitelceller stamceller som förnyar hornhinnans epitel och aktivt delta i sårläknings 4,10-15. Här, är protokoll tillhandahålls för normal och diabetisk mänsklig korneal organkultur, epitelial sårläkning, isolering och karakterisering av stamceller berikad limbus cellkulturer, och adenoviral cell och korneal transduktion. VårResultaten visar genomförbarheten av denna behandling för att normalisera markör uttryck och sårläkning i diabetiska hornhinnor för eventuell framtida transplantation. De föreslår också att kombinationsbehandlingen är det mest effektiva sättet att återställa normal markörmönster och epitel läkning hos diabetiker hornhinnan 16-18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
National Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA) levereras godkänts obduktions friska och diabetiska mänskliga ögon och hornhinnor. NDRI mänskliga vävnadsuppsamlings protokoll godkänns av chefskommittén och i enlighet med National Institutes of Health tillsyn. Denna forskning har bedrivits inom ramen för den godkända Cedars-Sinai Medical Center Institutional Review Board (IRB) undantas protokoll EX-1055. Samarbeta hornhinnan kirurger, Drs. E. Maguen och Y. Rabinowitz, levereras Släng corneoscleral fälgar för isolering av stamceller berikade korneala epitelceller kulturer. Denna forskning har bedrivits inom ramen för godkända IRK-protokollet Pro00019393.
1. Human Corneal Organ Culture
Obs: Normala och diabetes hornhinnor eller hela ögon tas emot i kyld hornhinnan lagringsmedium (t.ex. Optisol GS) inom 48 timmar efter döden från den nationella leverantören NDRI.
- Ta bort hornhinnor från förvaringsbehållare med pincett och tvätta dem två gånger in antibiotika-antimykotika (Abam) blandning. Vid hela ögon, skära hornhinnor ut från klot med böjd sax. Lämna åtminstone en 5 mm konjunktival fälgen och även tvätta hornhinnor i Abam.
- Förbered blandningen ska placeras i hornhinnans konkavitet. Den består av serumfritt minimalt essentiellt medium (MEM) innehållande Abam, 1 mg / ml kalvskinnskollagen (som från en stamlösning av 10 mg / ml i 0,1 N ättiksyra), 1% agar, och insulin-transferrin-selenit komplettera 7.
- Microwave denna blandning till kokning för sterilisering och agar upplösning. Det kan ta upp till en minut för allt att lösa. Låt röret locket delvis öppna eftersom blandningen svämmar lätt när det kokar. Av denna anledning kan flera kokande cykler behövas, var och en för 10-15 sekunder. Kyl ner blandningen till 37-39 ° C.
- Placera hornhinnor epitel sidan nedåt i sterila 60 mm rätter. Fyll hornhinnans konkavitet med cirka 0,5 ml av blandningen som beskrivs i 1.2. DeBlandningen stelnar vid hornhinnorna inom 2 min.
- Placera hornhinnorna agar sidan nedåt i sterila 60-mm skålar och tillsätt den fullständiga medium innehållande MEM med Abam, och insulin-transferrin-selenit supplement 7 (37 ° C) för att hålla dess nivå ungefär vid limbus för luft-vätskegränsytan kultur. Mediet volymen är 7-8 ml per skål.
- Placera skålarna med hornhinnorna i en 5% CO2 inkubator fuktas med en vattenpannan (detta sätt fuktighetsnivån hålls vid eller över 95%) vid 35 ° C (normal korneal temperatur). Tillsätt 100 pl medium (två droppar) dagligen på epitelet att fukta hornhinnor.
- Övervaka hornhinnans morfologi och epitelceller livskraft mikroskopiskt genomfallande ljus med en vanlig mikroskop med en 4X mål. Gör så en gång om dagen.
- Ändra mediet var tredje dag. Hornhinnorna kan odlas under minst tre veckor. För genterapiexperiment, kultur hornhinnorna under 3-5 dagar, därefter transduce med gener av intresse (4,1-4,4), låt stå i ytterligare 3-5 dagar beroende på transgenen och föremål för sårläkning protokollet (2,1-2,4).
2. Epithelial sårläkning
Obs: I diabetiker hornhinnor, inte är möjligt epitelceller debridering genom mekanisk skrapning eftersom den bräckliga epiteliska basalmembranet är fristående i processen, vilket inte händer i normala hornhinnor. Således, för att hålla de normala och diabetiska hornhinnor under liknande villkor sårläkning, är kemiskt avlägsnande av epitel med n-heptanol används 19. Detta förfarande avlägsnar epitel men efterlämnar en intakt basalmembran i både normala och diabetiska hornhinnor.
- För att utföra central epitelceller debridering 20, placera en 5 mm filterpappersskiva indränkt i n-heptanol på den centrala hornhinnan främre yta för 75 sek.
- Ta bort filtret och tvätta hornhinnor i hela mediet. Fyll konkaviteten med 0,5 ml agar-kollagenblandningen och kultur som i 1,4. Efter debridering, epitelceller dör oftast och kasta bort lämnar efter mikroskopiskt intakt basalmembranet 7.
- Använd 8,5 mm skivor för att skapa större epiteliala sår i experimenten med endast limbus genterapi. Detta kommer att säkerställa deltagande från limbus stamceller i läkningsprocessen.
- Övervaka hornhinnans läkning mikroskopiskt. Gör fotografier på 4X och 10X varje dag tills epiteldefekt är helt läkt. Läkningsprocessen kan ta från 2 till 15 dagar beroende på läget (normal eller diabetes) och lindas storlek.
Obs: Under läkningsprocessen är svart spindel-liknande celler observerades vid toppen fokalplanet. Dessa celler är apoptotiska stromakeratocyter som dog efter epiteliala avlägsnande 4. Läkningen är fast besluten att vara fullständig när dessa döda celler är övervuxen av den helande epitel och är inte längre synlig (Figur 2, infälld). - efter läkningfullbordan skär hornhinnor i halv, bädda in dem i OCT-förening och ett förfarande för indirekt immunofluorescens på kryostatsnitt eller Western blotting 16,21.
3. Isolering av limbala celler och underhåll av stamcellsberikade kulturer
Obs: Förbered primära limbus epitelceller stamceller (LESC) berikad kulturer från corneoscleral fälgar. Fälgarna kommer från friska donatorer och kastas efter hornhinnan transplantationer tas emot från de samarbetande kirurger i standardhornhinnan lagringsmedium (t.ex. Optisol). Annars kan de LESC-berikade kulturer erhållas från fälgarna utskurna från normala och diabetiska hela hornhinnor eller glober emot från NDRI i hornhinnans lagringsmedium.
- Om hela hornhinnor eller klot används, först isolera limbala områden. För att göra detta genom att placera hornhinnan på en steril plastskål med epitelial uppåt och ta bort det centrala området med en 9 mm trephine (cirkulär hornhinnan kniv).Kassera denna centrala del. Sedan skära ut limbal zon med en 13 mm trephine och kassera den yttre konjunktival delen. Att isolera celler använder bagel liknande limbus kant. Före cellisolering, avlägsna de endotelceller och vidhäftande rester av iris från den inre sidan av hornhinnan som är motsatt ytan epitel med en steril bomullspinne.
- Isolera limbus cellskikt med hjälp av dispas behandling. Inkubera varje corneoscleral fälg med 2,4 U / ml dispas II i 1,5 ml keratinocyt serumfritt medium (KSFM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) vid 37 ° C under 2 h 22.
- lätta försiktigt limbal epiteliala cellarket från fälgen under ett dissekera stereomikroskop med en pincett och dissociera cellerna i 1 ml 0,25% trypsin - 0,02% EDTA-lösning under 30 min vid rumstemperatur.
- Tvätta cellerna i 10 ml medium (t.ex., EpiLife) och pelletera dem vid 300 xg i en bordsskiva centrifug under 5 min vid rumstemperatur.
- återsuspendera the-celler i odlingsmedium: medium med N2, B27 och mänskliga keratinocyt tillväxtsupplement, och 10 ng / ml epidermal tillväxtfaktor (EGF).
- Ympa cellerna vid 3000-5000 celler / ml i kolvar eller 60 mm skålar belagda med en blandning av human basalmembranproteiner inkluderande fibronektin, typ IV-kollagen, och laminin (FCL), vid 0,5-1 ^ ig / cm 2, i KSFM medium.
- Odla cellerna i en fuktad (95% eller högre fuktighet) CO2-inkubator vid 37 ° C tills de bildar helt sammanflytande monoskikt. Detta kan ta 1-2 veckor.
Obs: Regelbundet bekräfta cellidentiteten genom positiv immunocytokemisk färgning för förmodade LESC markörer inklusive Pax6, keratin (K) 14, K15, K17 och ΔNp63α. Färgningsuppgifter inklusive de primära antikropparna har publicerats 8,16-18,22. - Till passage de konfluenta cellerna, behandla dem med en ml 0,05% trypsin-lösning (1: 5 spädning av 0,25% lösning) under 10 min vid 37 ° C. Tillsätt 5 ml soja trlösning ypsin inhibitor (10 mg / ml) utspädd 1: 4 i medium, och centrifugera cellerna som i 3,5.
- Tvätta cellpelleten i 3 ml utspätt sojaböntrypsinhämmare lösning. Plate cellerna på FCL-belagd (se 3.7) rätter eller glaskammarobjektglas med 2 x 10 4 celler / ml.
4. adenovirala Transduktion av organ-odlade hornhinnor
Obs: De rekombinanta adenovirus (AV) omfattar AV-vektor (ingen genen insatt), AV-cmet (med c-met-genen öppen läsram), AV-shM10 (med shRNA till MMP-10), och AV-shCF ( med shRNA att cathepsin K). De är E1 / E3-delete typ 5 AV uttrycker gener under kontroll av de stora omedelbara tidiga cytomegalovirus-promotorn. AV-cmet virus genereras med hjälp av AV-vektor Pad / CMV / V5-DEST 16. AV-shRNA virus anpassade genereras genom subkloning av shRNA sekvenser tillsammans med HH1 promotorn och GFP tag sekvens från iLenti-EGFP vektor i en replikations inkompetent (-E1 / -E3) human AV typ 5 genomet med hjälp av Adeno-4 expressionssystem 17.
- Transducera en orgel odlade hornhinnan i varje par med AV-vektor och en annan hornhinnan, med en genuttryck modulerande AV. Använd AV-cmet vid 0,8 till 1,25 x 10 8 plackbildande enheter (pfu) per hornhinnan i odlingsmedium under 48 h vid 37 ° C hålla hornhinnorna under mediets yta vardera i en brunn på en 24-brunnsskål. Använd AV-shRNA virus vid 1-2 x 10 8 pfu per hornhinnan.
- Använd virus för transduktion i fullt medium kompletterat med 75 | ig / ml sildenafil citrate. Detta reagens aktiverar caveolin transport underlättar virus upptag av epitelceller 21. På grund av kort halveringstid av sildenafil i vattenlösningar, åter lägga till samma belopp till mediet 4-5 timmar senare. Standardbehandling är under 48 timmar.
- Överför hornhinnor till nya rätter med en rund ände steril spatel och kultur i medium utan AV hålla medelhög nivå vid limbus. När tilläggetnella 4-8 dagar vid vätskeluftgränssnittet, process AV-behandlade hornhinnor för olika analyser eller provnings för epitelial sårläkning (se ovan). Rutinmässigt fukta hornhinnorna under odling genom att tillsätta 100 | il medium (två droppar) ovanpå hornhinnan.
- För transduktion av endast de limbala cellerna, inkubera de virus med hornhinnorna vid luft-vätskegränsytan med medium nivå vid limbus, för att undvika transduktion av den centrala epitel.
5. adenovirala Transduktion av odlade limbala celler
- Bibehålla LESC-berikade kulturer i medium med 10 ng / ml EGF (se 3.5) på plastskålar belagda med FCL blandningen vid 0,5 ng / cm 2.
- Transducera odlade celler som har nått 70-80% konfluens med AV-härbärgerande grönfluorescerande proteingenen (AV-GFP) eller AV-oordning shRNA-GFP i ett intervall av multiplicitet av infektion (MOI: 1-300 pfu / cell) på medellång med 2 ng / ml EGF. Utför transduction under 4 h vid 37 ° C i en minimal volym (0,2 ml) följt av 20 h i 0,5 ml medium. behövs inte caveolin transport aktivator sildenafil för cellodlings transduktion.
- Använda en av följande reagenser som underlättar AV-bindning till cellytan för att öka AV-transduktionseffektiviteten: antingen polykatjoner (1 ^ g / ml poly-L-lysin eller 5 | j, g / ml polybren), eller 6 | il / ml transduktion reagens ( t.ex. ViraDuctin), eller 20 l / ml överföring förstärkare (t.ex. ibiBoost).
- Efter byte av mediet för en utan AV, inkubera odlade celler under 4 dagar, i befuktad CO2 inkubator och utvärdera GFP-expressionsnivån med användning av ett inverterat fluorescensmikroskop.
- Använd scratch sårläkning analys för att utvärdera cellmigration i AV-omvandlade kulturer. Odla cellerna i de flerbrunnskammarobjektglas. Göra såren i ett monoskikt genom att skrapa cellerna i en rak linjär rörelse med en 200 | j, l piPette spets. Efter skada, ändra mediet för en färsk en för att avlägsna de lösgjorda cellerna.
- Fotografera såren varje dag med en digitalkamera ansluten till en inverterad mikroskop vid 4X förstoring. Registrera den tid när läkningen är fullbordad (sårkanterna kommer i kontakt längs hela såret).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har visat tidigare att i de korneala organkulturer, är skillnaderna i uttrycket av diabetiska markörer (t.ex. basalmembranproteiner och grin α3β1) och sårläkning mellan de normala och diabetiska hornhinnor bevaras. Detta odlingssystem utsattes för genterapi i syfte att normalisera nivåerna av diabetes-altered markörer, c-met, MMP-10, och katepsin F.
När hela hornhinneepitelet transducerades med AV-cmet, eller AV-shRNA till MMP-10 eller katepsin F (separat eller i kombination), erhölls epiteliala sårläkning avslutad signifikant snabbare (P <0,03 genom parat Student t-test jämfört med aV-vektor) än i aV-vektor omvandlade andra hornhinnor från samma givare 16,17. AV-cmet minskade läkningstiden med hälften, vilket inte signifikant skiljer sig från läkning av de normala hornhinnor (Figure 1). AV-shM10 och AV-shCF hade mindre effekt. Dock en kombination av AV-cmet med AV-shM10 och AV-shCF (Combo) producerade den starkaste effekten helt normalisera epiteliala läkningstider (figur 1). Denna minskning av läkningstiden åtföljdes av de normaliserade mönster diabetiker (basalmembran och integrin) och stamcellsmarkörer i diabetes hornhinnor 8,16,17.
De epitelceller stamceller är den största sårläknings deltagare 4. Därför undersökte vi om limbus genterapi inriktning stamcells skulle vara fördelaktigt för diabetiker hornhinnor. För detta ändamål var det bara de limbala delar av diabetes hornhinnorna omvandlas av AV-cmet eller Combo och stor, var 8,5 mm sår skapas. AV-cmet transducerade hornhinnor läkte signifikant snabbare (P <0,001 genom parat Student t-test) än AV-vektorn transducerade andra hornhinnor (Figure 2). Combo behandling resulterade i samma resultat 18. Genterapi ökade uttrycket av diabetes undertryckta markörer, såsom integrin α3β1 och basalmembrankomponent nidogen-1 (Figur 3, vänstra kolumnen, Combo). Viktigare, som i hela hornhinnan transduktion 8,17, den limbal genterapi med antingen AV-cmet eller Combo ledde till en markant ökad expression av förmodade LESC markörer inklusive K15 och ΔNp63α, jämfört med de AV-vektorn transducerade hornhinnor (figur 3 räta kolonner, både c-met och Combo). Dessa data stödde roll stamcells normalisering i den accelererade sårläkning vid genterapi av diabetiska hornhinnor och visa genomförbarheten av vår strategi för behandling av diabetes hornhinnans sjukdom.
Vi började bredvid undersöka genterapi effekter på odlade LESC berikad limbus epitelceller. kulturernaav normala och diabetiska limbus epitelceller fastställdes och färgas för förmodade LESC markörer. Många celler färgade positivt (Figur 4). Färgningsintensiteten med diabetes kulturer var genomgående svagare än i de normala kulturer (K15 visas som ett exempel i figur 4), som var mycket lik situationen i diabetes jämfört med normala ex vivo hornhinnor 8. Dessa experiment validerade de erhållna cellkulturer som lämpliga för genterapi.
Preliminära experiment med telomeras-odödlig korneaepitelet cellinje (se 23) visade att cellerna lätt omvandlades av de tillgängliga AV konstruktioner (data visas inte här). De primära limbus kulturer visade sig vara mycket mer känsliga för virusmängd och / eller transduktion reagens, vilket nödvändiggör optimering av omvandlings protokollet. Den odlade limbus cellöverföring avAV-GFP (Figur 5) var beroende av den mångfald av infektion (MOI; intervall 30-300 pfu / cell) vilket resulterar i en ganska hög nivå av transduktion vid hög MOI (GFP-uttryck i> 80% av cellerna). Men ju högre MOI var också giftig, som orsakar celldöd eller kraftigt nedsatt cellmigration i skrap såren efter 3-4 dagar av överföring (Figur 6). Vid den lägre MOI (10-30 pfu / cell), AV-transduktion producerade mindre eller ingen cytotoxisk effekt, men resulterade i ett minskat antal GFP-uttryckande celler (5-15%).
Vi försökte intill öka transduktion effektivitet utan att kompromissa med cellviabiliteten med användning av transduktion höjande reagenser som i allmänhet underlättar AV-bindning till cellytan. De visade olika effektivitetsförbättringar i limbus epitelceller överföring av AV vid MOI 10-30. Båda polykatjoner, poly-L-lysin, och polybren, var giftfri och mest effektivavilket resulterade i 3-4-faldig ökning av antalet GFP-positiva celler (figur 7, övre raden). ibiBoost var också effektiv, men mindre giftiga, och ViraDuctin var ineffektivt och ganska giftiga (Figur 7, nedersta raden). Därför polykatjoner erbjuda säkra och effektiva sätt att öka genen av intresse uttryck på AV överföring och bör användas för genuttryck och sårläknings experiment.
Figur 1: c-Met gentransduktion leder till kraftigt minskade korneaepitelet sårläkningstiden (medelvärde ± SEM). Dessutom kombinerade genterapi (Combo) med AV hyser c-met-genen och shRNAs till MMP-10 och cathepsin F-generna normaliserar helt epitelial sårläkningstiden. Signifikans (p-värden) fastställdes genom parat Student t-test i jämförelse med respektiv e vektor behandlingar. Staplar representerar standardfelet av medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Läkning av 8,5 mm epiteliala sår i ett par av diabetic hornhinnor. Översta raden, vektor-transducerade hornhinnan; healing är komplett i 8 dagar. Nedre raden, AV-cmet omvandlade karl hornhinnan; healing är klar i 5 dagar. Pilar visar såret (W) kant. *, Som inte läkt delen (även visad i hög förstoring som infälld bild), med spindel-formade apoptosed stromakeratocyter. De är synliga tills epitelskiktet växer på dem. Bar = 50 | im. Faskontrast. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: immunfärgning av diabetiska hornhinnan sektioner för olika markörer efter limbus genterapi. Både AV-cmet och Combo behandlingar resulterar i markant ökad limbus färgning för diabetesmarkörer (integrin α3β1 och nidogen-1) och förmodade stamcellmarkörer (K15 och ΔNp63α). Pilar på nidogen-1 paneler markera korneaepitelet basalmembranet. Bar = 30 ^ m. e, epitel; s, stroma. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Immunocytokemisk färgning av primära limbus epitelceller kulturer för en förmodad LESC markör K15. Översta raden, normal kultur; de flesta celler show stark färgning för K15. Nedre raden, diabetisk kultur; de flesta celler visar bara svag färgning. De högra panelerna presenteras med DAPI nukleära motfärgning. Normala och diabetiska celler fotograferades med samma exponeringstid. Bar = 20 pm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Nivån av GFP-expression i transducerade limbus epitelceller beror på MOI av AV-GFP: (a) 30 pfu / cell; (B) 120 pfu / cell; (C) 300 pfu / cell vid 3 dagar av transduktion. Fotografier av levande celler visas. Bar = 300 pm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Cellmigration påverkas negativt av ökande koncentration av AV som avslöjas genom repa sår test: (a) kontroll; (B) 20 pfu / cell; (C) 80 pfu / cell; (D) 120 pfu / cell. Fotografier av levande celler visas. Bar = 500 nm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: limbus epitelceller transducerade med AV-GFP på 30 pfu / cell. (A) kontroll; (B) poly-L-lysin; (C, d) överföring reagens; 5 dagar efter transduktion. Transduktion reagens caused en signifikant cytotoxisk effekt som leder till cell avrundning och död (d, faskontrast). Fotografier av levande celler visas. Bar = 400 pm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hornhinnan synes vara en idealisk vävnad för genterapi på grund av dess yta plats där genen leverans, samt utvärdering av effekt och biverkningar, är lätta. Men det är en klinisk översättning av denna kraftfulla tillvägagångssätt fortfarande långsamt på grund av knappa uppgifter om genetiska orsaker till hornhinnan sjukdomar och genterapi mål 24. Diabeteskomplikationer, inklusive hornhinnan förändringar kan vara i stort sett epigenetisk i naturen, vilket leder till metabolisk minne 9. Av denna anledning, de diabetiska vävnader och celler bevara sina avvikelser ex vivo och kan studeras i organ- och vävnadskultur. Dessutom orsakar diabetes specifika förändringar i genuttryck nivåer och mönster som kan åtgärdas av genterapi. Vi har identifierat flera markörer förändrade i diabetiker hornhinnans epitel inklusive stamcells 5,6,8 och används hornhinnan organkulturer mänskliga 7,8 för att normalisera eftergenterapi markören uttryck och epitel sårläkning äventyras i diabetiker hornhinnan.
Vi har valt den AV som genöverföringsvehikel grund av dess starka transgenexpression, dess icke-integrerande natur och dess selektivitet för epitelceller, vilka är egenskaper som är överlägsna de hos adenoassocierat virus (AAV) 25. AV-transduktion av hornhinnan kulturer organ har flera viktiga steg. Hornhinnorna bör levereras till laboratoriet inom 48 h postmortem, för att minimera förlusten av epitel som inträffar under lagring. För att öka den virala upptag, är det viktigt att lägga caveolae transport boosters, såsom sildenafil, under transduktion 21. När validering transduktion effekt på proteinuttryck, är användningen av flera markörer rekommenderas (figur 3), som specifika markörer stamceller inte är säkert identifierad. Vid de epiteliala sår, det är en nödvändighet att använda chemiska debridering grund av bräcklighet diabetes epiteliska basalmembranet vilket resulterar i sin lossnar vid manuell skrapning. Det behövs en noggrann daglig övervakning av läkningsprocessen med objektiva kriterier av healing, såsom försvinnandet av döda subepitelial keratocyter ur sikte när epitel regrows över dem (Figur 2). Slutligen, på grund av vissa AV- och / eller GFP toxicitet för de primära limbala celler är det viktigt att sänka den virala dos, samtidigt med användning av icke-toxiska transduktion boosters, såsom polykatjoner, för att säkerställa effektiv och säker transduktion (fig 5 - 7).
Genterapi systemet kan modifieras för att använda organ odlade hornhinnor djur. De är mycket billigare än människa, kan erhållas i kvantiteter på en regelbunden bas, och kan vara lämpliga för screening, t ex, av sårläkning-modulerande läkemedel. Men den mänskliga hornhinnor erbjuder potentiellt bredare möjligheter förstudien på grund av överflödet av reagenser, i synnerhet antikroppar. I fallet med läkemedelsscreening i icke-diabetiska djur hornhinnor kan debridering göras mekaniskt. Om en antikropp för en viss markör inte fungerar bra i vissa mänskliga hornhinnor, kan det bero på att den enskilda variabilitet och / eller sjukdomsduration eller allvarlighetsgrad. I detta fall undersöker andra markörer kan rekommenderas. Förmågan hos n-heptanol för att avlägsna cellerna kan signifikant minska med tiden, möjligen på grund av oxidation under lagring. Om detta händer, kan en ny, tidigare oöppnad, flaska måste användas. Om man arbetar med de dyra mänskliga hornhinnor, kan en andra omgång av debridering prövas. Sildenafil har en kort halveringstid i vattenlösningar; Därför måste det beredas varje gång en hornhinnan överföring utförs. Framgången för odling limbala celler kan bero på givarens ålder; cellerna från yngre givare brukar växa bättre. En enda genterapimedel kan inte framkalla en Signifdande effekt; i detta fall kan en kombination av sådana medel vara optimal 17. Om de primära korneala celler visar tecken på toxicitet, är det viktigt att sänka den virala och polykatjon (t.ex. poly-L-lysin) doser för att minimera toxiska effekten samtidigt som effektiv transduktion.
Även diabetes organkulturer återge många tecken på sjukdomen och förändrad genexpression, de är denerverad och saknar utbudet av immunceller, som kan påverka sårläkning och stamceller. I detta avseende kan de djurmodeller erbjuda vissa fördelar, även om djuren inte återge hela spektrumet av tecken humana sjukdoms. De andra genterapi mål existerar som effektivt normalisera diabetes hornhinnor. Ett exempel på sådana mål kan vara mikro-RNA, specifikt, mir-146a eller mir-424 23. Kombinationerna av de använda mål förändringar av gener med inhibering av specifik microRNA kan potentiellt ge en mer potent gynnsam effekt. anothER begränsning inkluderar nödvändigheten av relativt lång inkubation av hornhinnan med den topiskt administrerad AV (t.ex. i form av ögondroppar) för att säkerställa maximal viral upptag. Detta kan innebära ett problem på kliniken, även tejpa ögonlocken kunde hjälpa till att förlänga inkubationstiden. Användningen av låg koncentration av sildenafil i virus lösning skulle kunna påskynda AV upptaget. AV-transduktion effekten är övergående, vilket kan begränsa den läkande potential AV-baserad genterapi. Även om det varar tillräckligt länge för att korrigera diabetiker sårläknings avmattning, ihållande normalisering av epitelceller stamceller kan kräva en mer långvarig effekt, såsom tillhandahålls av AAV-baserad genterapi 24. Det bör nämnas att immunogenicitet var en allvarlig nackdel med tidiga AV vektorer. Men den nya generationen rekombinanta AV inklusive "fega" virus är i stort sett fria från denna biverkning ökar deras möjligheter att vara potent translational genterapi fordon 26.
Småmolekylära modulatorer av olika vägar som kan vara viktiga för sårläkning 16,17,21, 27-30 används i experimentella modeller och kliniken. Men de är inte riktade till en viss celltyp, kan ha olika effekter i olika celler, och kan verka endast på vissa aspekter av diabetes hornhinnans sjukdom 31,32. Genterapin erbjuder en möjlighet att ändra genexpression i en önskad riktning i specifika celler, som vi åstadkommit i detta arbete transduktion epitelcellerna med användning av både genen överuttryck (c-met) och tystande (MMP-10 och katepsin F). Detta tillvägagångssätt gör det också möjligt att modulera uttrycket av specifika sjukdomsmarkörgener, en och en eller i kombinationer 5,6. Våra experiment visade att även i händelse av en kombination av tre AVs hyser olika genuttryck modulatorer, var alla tre gener påverkas som förväntat, ochbehandling var effektivare än när varje AV användes enbart 17.
Vid svår diabetes keratopati med ihållande epitelceller defekter eller ofullständig epitel läkning vid vitrektomi eller laser fotokoagulation kan en ersättning av dysfunktionella limbus stamceller vara ett alternativ till genterapi. I dessa fall kan odlas och expanderas limbus epitelceller vid genterapi in vitro transplanteras på de sjuka hornhinnor. Våra data visar att odlade limbus celler från diabetiska hornhinnor visar liknande skillnader i stamcells markör uttryck som ex vivo hornhinnor gör dem bra mål för genterapi. Emellertid behöver denna behandling som skall optimeras, beroende på den höga känsligheten hos sådana celler att virusbelastningen och transfektion använda reagenset. Vi kunde visa att de katjoniska transfektionsreagens garanteras effektiv och säker leverans med hög expression av en gen av intresse i odlade diabetiker hornhinnans epitel. Tessa resultat kan bana väg för en framgångsrik genterapi in vitro expanderade LESC för framtida transplantationsändamål i fall av allvarlig diabetisk keratopati. Eftersom ärftlig och förvärvad LESC brist är också förknippat med en minskning av hornhinnan nerver liknar diabetes 33,34, kan transplantation av friska LESC-berikade kulturer på de sjuka hornhinnor potentiellt lindra diabeteshornhinnan neuropati också.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| minimum essential medium | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Optisol-GS | Bausch & Lomb | 50006-OPT | |
| ABAM antibiotic-antimycotic mixture | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| calf skin collagen | Sigma-Aldrich | C9791 | |
| agar, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| n-heptanol | Sigma-Aldrich | 72954-5ML-F | |
| O.C.T. compound | VWR International | 25608-930 | |
| Dispase II | Roche Applied Science | 4942078001 | |
| keratinocyte serum-free medium (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005042 | |
| EpiLife medium with calcium | Thermo Fisher Scientific | MEPI500CA | |
| N2 medium supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| B27 medium supplement, 50x | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| human keratinocyte growth supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | S-001-5 | |
| trypsin 0.25% - EDTA 0.02% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| trypsin 0.25% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15050065 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| insulin-transferrin-selenite supplement (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| antibody to keratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
| antibody to keratin 15 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47697 | |
| antibody to keratin 17 | Santa Cruz Biotechnology | SC-58726 | |
| antibody to ΔNp63α | Santa Cruz Biotechnology | sc-8609 | |
| antibody to PAX6 | BioLegend | PRB-278P-100 | |
| antibody to nidogen-1 | R&D Systems | MAB2570 | |
| antibody to integrin α3β1 | EMD Millipore | MAB1992 | |
| human fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| human laminin | Sigma-Aldrich | L4445 | |
| human type IV collagen | Sigma-Aldrich | C6745-1ML | |
| adenovirus expressing MMP-10 shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing cathepsin F shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing scrambled shRNA and GFP | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing c-met | OriGene (plasmid) | SC323278 | |
| adenovirus expressing GFP | KeraFAST | FVQ002 | |
| sildenafil citrate, 25 mg | Pfizer | from pharmacy | |
| epidermal growth factor | Thermo Fisher Scientific | PHG0311 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| ViraDuctin | Cell Biolabs | AD-200 | |
| ibiBoost | ibidi, Germany | 50301 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Corning round end spatula | Dow Corning | 3005 | |
| 60 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 174888 | |
| Nunc Lab-Tek II multiwell chamber slides | Sigma-Aldrich | C6807 | |
| 200 μl pipet tips | Bioexpress | P-1233-200 | other suppliers available |
| inverted microscope | Nikon | Diaphot | other suppliers/models available |
| humidified CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370 (Steri-Cycle) | other suppliers/models available |
| fluorescent microscope | Olympus, Japan | BX-40 | other suppliers/models available |
| dissecting stereo microscope | Leica, Germany | S4 E | other suppliers/models available |
References
- Bikbova, G., Oshitari, T., Tawada, A., Yamamoto, S.
- Calvo-Maroto, A. M., Perez-Cambrodí, R. J., Albarán-Diego, C., Pons, A., Cerviño, A. Optical quality of the diabetic eye: a review. Eye (Lond). 28 (11), 1271-1280 (2014).
- Tripathy, K., Chawla, R., Sharma, Y. R., Venkatesh, P., Vohra, R.
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M.
- Saghizadeh, M., et al. Overexpression of matrix metalloproteinase-10 and matrix metalloproteinase-3 in human diabetic corneas: a possible mechanism of basement membrane and integrin alterations. Am J Pathol. 158 (2), 723-734 (2001).
- Saghizadeh, M., et al. Proteinase and growth factor alterations revealed by gene microarray analysis of human diabetic corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (10), 3604-3615 (2005).
- Kabosova, A., Kramerov, A. A., Aoki, A. M., Murphy, G., Zieske, J. D., Ljubimov, A. V. Human diabetic corneas preserve wound healing, basement membrane, integrin and MMP-10 differences from normal corneas in organ culture. Exp Eye Res. 77 (2), 211-217 (2003).
- Saghizadeh, M., et al. Alterations of epithelial stem cell marker patterns in human diabetic corneas and effects of c-met gene therapy. Mol Vis. 17, 2177-2190 (2011).
- Kowluru, R. A., Kowluru, A., Mishra, M., Kumar, B. Oxidative stress and epigenetic modifications in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 40-61 (2015).
- Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. J Cell Sci. 111 (Pt 19), 2867-2875 (1998).
- Lu, L., Reinach, P., Kao, W. W.
- Rama, P., et al. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. N Engl J Med. 363 (2), 147-155 (2010).
- Di Girolamo, N., et al. Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea. Stem Cells. 48 (1), 203-225 (2014).
- Amitai-Lange, A., et al. Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
- Di Girolamo, N. Moving epithelia: Tracking the fate of mammalian limbal epithelial stem cells. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 203-225 (2015).
- Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-met gene. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (4), 1970-1980 (2010).
- Saghizadeh, M., et al. Enhanced wound healing, kinase and stem cell marker expression in diabetic organ-cultured human corneas upon MMP-10 and cathepsin F gene silencing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8172-8180 (2013).
- Saghizadeh, M., Dib, C. M., Brunken, W. J., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and stem cell marker patterns in organ-cultured human diabetic corneas by gene therapy of limbal cells. Exp Eye Res. 129 (Dec), 66-73 (2014).
- Hatchell, D. L., et al. Damage to the epithelial basement membrane in the corneas of diabetic rabbits. Arch Ophthalmol. 101 (3), 469-471 (1983).
- Chung, J. H., Kim, W. K., Lee, J. S., Pae, Y. S., Kim, H. J. Effect of topical Na-hyaluronan on hemidesmosome formation in n-heptanol-induced corneal injury. Ophthalmic Res. 30 (2), 96-100 (1998).
- Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Res Bull. 81 (2-3), 262-272 (2010).
- Sareen, D., et al. Differentiation of human limbal-derived induced pluripotent stem cells into limbal-like epithelium. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1002-1012 (2014).
- Funari, V. A., et al. Differentially expressed wound healing-related microRNAs in the human diabetic cornea. PLoS One. 8 (12), e84425 (2013).
- Mohan, R. R., Rodier, J. T., Sharma, A. Corneal gene therapy: basic science and translational perspective. Ocul Surf. 11 (3), 150-164 (2013).
- Liu, J., et al. Different tropism of adenoviruses and adeno-associated viruses to corneal cells: implications for corneal gene therapy. Mol Vis. 14, 2087-2096 (2008).
- Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4 (5), 346-358 (2003).
- Sharma, G. D., He, J., Bazan, H. E. P38 and ERK1/2 coordinate cellular migration and proliferation in epithelial wound healing: evidence of cross-talk activation between MAP kinase cascades. J Biol Chem. 278 (24), 21989-21997 (2003).
- Saika, S., et al. Role of p38 MAP kinase in regulation of cell migration and proliferation in healing corneal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (1), 100-109 (2004).
- Xu, K. P., Li, Y., Ljubimov, A. V., Yu, F. S. High glucose suppresses epidermal growth factor receptor/phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway and attenuates corneal epithelial wound healing. Diabetes. 58 (5), 1077-1085 (2009).
- Xu, K., Yu, F. S. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3301-3308 (2011).
- Takamura, Y., et al. Aldose reductase inhibitor counteracts the enhanced expression of matrix metalloproteinase-10 and improves corneal wound healing in galactose-fed rats. Mol Vis. 19, 2477-2486 (2013).
- Byun, Y. S., Kang, B., Yoo, Y. S., Joo, C. K. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves corneal epithelial innervation and wound healing in diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1948-1955 (2015).
- Deng, S. X., et al. Characterization of limbal stem cell deficiency by in vivo laser scanning confocal microscopy: a microstructural approach. Arch Ophthalmol. 130 (4), 440-445 (2012).
- Lagali, N., et al. In vivo morphology of the limbal palisades of Vogt correlates with progressive stem cell deficiency in aniridia-related keratopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5333-5342 (2013).
