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Developmental Biology

당뇨병 각막에 대한 아데노 바이러스 유전자 치료 : 인간 장기 배양 각막 및 윤부 상피 세포에 상처 치유에 효과 및 세포 마커의 발현 줄기

Published: April 7, 2016 doi: 10.3791/54058
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Eye Program, Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Departments of Biomedical Sciences and Neurosurgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Abstract

이 프로토콜의 목적은 인간의 당뇨병 각막 분자 변화를 설명하고 그들이 장기 배양 각막의 아데노 바이러스 유전자 치료에 의해 완화 될 수있는 방법을 설명하는 것입니다. 당뇨병 각막 질환은 각막 신경 및 상피 창상 치유의 빈번한 이상과 당뇨병의 합병증이다. 우리는 또한 인간의 당뇨병 각막의 여러 추정 상피 줄기 세포 마커의 대폭 변경 식을 설명했다. 이러한 변화를 완화하기 위해, 아데노 바이러스 유전자 치료가 성공적 C-충족 원 종양 유전자 (proto-oncogene) 발현의 상향 조절 및 / 또는 단백질 분해 효소의 기질 금속-10 (MMP-10) 및 카 텝신 F.이 치료의 하향 조절을 사용하여 구현 된 당뇨병 각막 상처 치유를 가속화 만 윤부 줄기 세포 구획 형질 때에도. 가장 좋은 결과는 복합 치료를 얻었다. 정규화 된 줄기 세포의 이식 가능한 환자의 경우, 예를 들어도 optimizati의 제시폴리 양이온 강화제를 사용하여 줄기 세포 농축 문화 유전자 전달의에. 이 방법은 선택된 유전자뿐만 아니라, 각막 상피​​의 상처 치유의 다른 매개체를 위해 단지 유용한 세포 기능 줄기있다.

Introduction

당뇨병 각막 질환은 주로 퇴행성 상피 (각막)과 신경 (신경 병증) 변경을 초래한다. 그것은 종종 상피 상처 치유 및 각막 신경의 감소 1-4의 이상에 의해 명시된다. 추정 60-70%의 당뇨병 환자는 다양한 각막 문제 1,3- 있습니다. 우리의 연구는 변경된 C-충족 원 종양 유전자 (proto-oncogene) (간세포 성장 인자 수용체)의 하향 조절을 포함하여 인간 당뇨병 각막에서의 발현 및 매트릭스 메탈-10 (MMP-10) 및 카 텝신 F (5, 6)의 상향 조절 여러 마커 단백질을 확인 하였다. 또한 상당히 설명 인간 당뇨병 각막 여러 추정 상피 줄기 세포 마커의 발현이 감소하고있다.

이전의 연구에서는 당뇨병 느린 상처 치유를 보여준다 인간 당뇨병 각막 기관 배양 시스템을 사용하여, 당뇨병 변경 마커의 수준을 정상화 아데노 바이러스 계 유전자 치료제를 개발마커의 변화 및 생체 각막 -7,8- 유사한 세포 마커의 발현 감소 줄기. 변경이 지속성은 후생 유전 학적 대사 메모리 (9)의 존재로 인해 나타납니다. 이 문화 시스템은 유전자 치료에 대한 더 사용했다. 이 치료의 목표는 당뇨병 각막 (C-충족 프로토 종양 유전자) 또는 발현 증가 (MMP-10, 카 텝신 F)에서 감소 된 표현 중 하나와 마커에서 선택되었다.

아데노 바이러스 (AV) 치료는 전체 장기 배양 각막 또는 만 공막 윤부 주변 구획에 사용 하였다. 이 구획은 각막 상피를 갱신 적극적 4,10-15 상처 치유에 참여 상피 줄기 세포 항구. 여기에서, 프로토콜은 정상과 당뇨병 인간의 각막 기관 배양 상피 상처 치유, 분리 및 줄기 세포 농축 윤부 세포 배양의 특성, 및 아데노 바이러스 세포와 각막 전달 제공됩니다. 우리의결과는 향후 이식 당뇨 각막에 마커 표현과 상처 치유를 정규화이 치료의 가능성을 보여줍니다. 또한 병용 치료는 당뇨병, 각막 16-18 정상 마커 패턴 상피를 복원 할 수있는 가장 효과적인 방법임을 시사한다.

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Protocol

국립 질병 연구 교환 (NDRI, 필라델피아, PA는) 합의 된 사후 건강하고 당뇨병 인간의 눈과 각막을 공급했다. NDRI의 인체 조직 수집 프로토콜은 건강 감독의 국립 연구소에 경영위원회와 제목에 의해 승인된다. 이 연구는 승인 된 시더 - 시나이 의료 센터 임상 시험 심사위원회 (IRB) 면제 프로토콜 EX-1055에 따라 진행되고있다. , 박사를 각막 외과 공동. E. Maguen와 Y 라 비노 위츠는 줄기 세포가 풍부한 각막 상피​​ 문화의 분리를 위해 폐기 공막 바퀴를 공급했다. 이 연구는 승인 된 IRB 프로토콜 Pro00019393에서 진행되고있다.

1. 인간 각막 오르간 문화

참고 : 정상과 당뇨병 각막 또는 전부의 눈은 냉장 각막 저장 매체에 수신 (예를 들어, Optisol GS) 국가 공급 업체 NDRI 사망 후 48 시간 이내에.

  1. 집게와 저장 용기에서 각막을 제거하고 난 그들을 두 번 씻어n은 항생제 항진균제 (ABAM) 혼합물. 전체 눈의 경우, 곡선 가위로 글로브에서 각막을 잘라. 적어도 5mm 결막 림을두고도 ABAM의 각막을 씻는다.
  2. 각막 오목 부에 배치 할 수있는 혼합물을 제조한다. 이는 혈청의 최소 필수 배지 (MEM)를 포함 ABAM 1 밀리그램 / (0.1 N 아세트산 10 ㎎ / ㎖의 스톡 용액으로부터 제조) 용액 송아지 피부 콜라겐, 1 % 한천, 인슐린 - 트랜스페린 - 셀렌 이루어져 (7)을 보충합니다.
  3. 전자 레인지 살균과 한천 용해 비등이 혼합물. 모든 용해하는 것은 1 분까지 걸릴 수 있습니다. 끓을 때 혼합물이 쉽게 오버 플로우 때문에 부분적으로 개방 된 튜브의 캡을 둡니다. 이러한 이유로, 여러 사이클 비등 10-15 초 동안 각각 필요할 수있다. 37 ~ 39 ° C의 혼합물을 냉각.
  4. 멸균 60mm 요리에 각막을 아래로 상피면을 놓습니다. 1.2에 설명 된 혼합물의 약 0.5 ml의와 각막 오목를 입력합니다. 그만큼혼합물을 2 분 이내에 각막에 굳은.
  5. 아래로 멸균 60 mm 요리의 각막을 한천 측면을 놓고 ABAM와 MEM을 포함하는 전체 매체를 추가하고, 인슐린 트랜스페린 - 셀렌 보충 7 (37 ° C)는 공기 - 액체 인터페이스 문화에 대한 윤부에서 대략 그 수준을 유지. 중간 볼륨은 접시 당 7-8 ml 인 것을.
  6. 물 팬과 가습 5 % CO 2 배양기로 각막과 접시를 놓고 35 ° C (정상 각막 온도)에서 (이런 식으로, 습도 레벨 또는 95 % 이상으로 유지된다). 각막을 습하게하는 상피 세포에 매일 100 ㎕의 매체 (2 방울)를 추가합니다.
  7. 각막 형태 및 4X의 목적으로 표준 현미경을 사용하여 전송 된 빛 아래 현미경 상피 세포 생존을 모니터링합니다. 하루 그래서 한 번 수행합니다.
  8. 3 일 매체를 변경합니다. 각막는 적어도 3 주 동안 배양 될 수있다. 3~5일 유전자 치료 실험 배양 각막 다음 transduc관심 (4.1-4.4)의 유전자를 가진 전자는 상처 치유 프로토콜 (2.1-2.4)에 형질 전환 유전자 및 피사체에 따라 다른 3-5일 떠난다.

2. 상피 상처 치유

주 : 허약 상피 기저막이 정상 각막에서 발생하지 않는 프로세스에서 분리되기 때문에, 당뇨병 각막, 기계적 연삭에 의한 상피 조직 제거가 가능하지 않다. 따라서, 상처 치유와 유사한 조건 하에서 정상 및 당뇨병 각막을 유지하기 위해, N 헵탄과 상피의 화학적 제거는 19을 사용한다. 이 절차는 상피를 제거하지만 모두 정상 및 당뇨 각막에 손상 기저막 뒤에 떠난다.

  1. 중앙 상피 변연 절제술 (20)를 수행하려면, 75 초 동안 중심 각막 전방 표면에 n 형 헵탄에 적신 5mm 여과지 디스크를 넣습니다.
  2. 필터를 제거하고 전체 매체의 각막을 씻는다. 0.5 ml의 한천 - 콜라겐과 오목 채우기1.4에서와 같이 혼합물과 문화. 변연 절제술 후 상피 세포는 일반적으로 죽고 현미경 그대로 기저막 (7)를 뒤에 남겨 내놓고.
  3. 만 윤부 유전자 치료와 실험에 큰 상피 상처를 만들기 위해 8.5 mm 디스크를 사용합니다. 이는 치유 과정에서 윤부 줄기 세포의 참여를 확인한다.
  4. 현미경으로 각막 치유를 모니터링합니다. 상피 결함이 완전히 치유 될 때까지 매일 4 배 및 10 배에서 사진을 확인합니다. 치유 과정은 (정상 또는 당뇨병) 상태와 상처 크기에 따라 2 ~ 15 일 걸릴 수 있습니다.
    참고 치유 과정 동안 흑색 거미 유사 세포가 정상 초점면에서 관찰된다. 이 세포는 상피 제거 4 사망 사멸 간질 간질하다. 치유는 이러한 죽은 세포는 치유 상피 세포에 의해 자란 없습니다 더 이상 볼 (그림 2, 삽입) 때 완료된 것으로 결정된다.
  5. 치료 후완성은 반으로 각막을 잘라 저온 유지 장치 섹션에 간접 면역 형광 또는 웨스턴 블롯 16,21에 대한 간섭 단층 화합물 및 프로세스를 포함.

줄기 세포 농축 문화의 윤부 세포 및 유지 보수 3. 분리

참고 : 공막 림에서 기본 윤부 상피 줄기 세포 (LESC) 풍성 문화를 준비합니다. 각막 이식은 표준 각막 저장 매체 (예를 들어, Optisol)의 협력 외과 의사로부터받은 후 건강한 기증자에서 나오는 폐기 림. 그렇지 않으면, LESC 농후 배양 정상 및 당뇨병 전체 각막로부터 절단 테두리로부터 얻어 질 수 있거나 각막 기억 매체로부터 수신 NDRI 글로브.

  1. 전체 각막 또는 글로브가 사용되는 경우, 먼저 윤부 영역을 격리. 이렇게하려면, 상피면 멸균 플라스틱 접시에 각막을 배치하고 9 mm의 트레 (원형 각막 칼)와 중앙 영역을 제거합니다.이 중앙 부분을 폐기하십시오. 그런 다음 13mm의 트레를 사용하여 윤부 영역을 절제하고 외부 결막 부분을 폐기합니다. 분리하는 세포는 베이글과 같은 윤부 림을 사용합니다. 세포 분리 전에 멸균 면봉으로 표면 상피 반대 각막의 내측으로부터 내피 세포와 홍채 부착 잔재를 제거한다.
  2. 디스 파제 처리를 사용하여 각막 윤부 세포 시트를 분리합니다. 2 시간 22 37 ℃에서 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 1.5 ㎖의 각질 세포를 무 혈청 배지 (KSFM) 2.4 U / mL의 디스 파제 II와 함께 각 공막 림 부화.
  3. 부드럽게 집게 해부 스테레오 현미경 림 오프 윤부 상피 세포 시트를 용이하게하고, 0.25 % 트립신 1 ㎖로 세포를 해리 - 실온에서 30 분 동안 0.02 %의 EDTA 용액.
  4. 매체 (예 Epilife) 10ml에 세포를 세척하고 실온에서 5 분간 탁상용 원심 분리기 (300)에서 그들을 XG 펠렛.
  5. 재현 탁 일배양 배지에서 세포 E : N2, B27과 인간 각질 세포 성장 보충제, 10 ng / ml의 상피 세포 성장 인자 (EGF)와 매체.
  6. KSFM에서 0.5 μg의 / cm 2에서 피브로넥틴, 유형 IV 콜라겐, 라미닌 (FCL)을 포함한 인간 기저막 단백질의 혼합물로 코팅 된 플라스크 3,000-5,000 세포 / ml 또는 60mm 접시에서 세포를 종자 매질.
  7. 배양은 37 ℃에서 습윤 (95 % 이상의 습도) CO 2 인큐베이터에서 세포는 완전히 융합 단층을 형성 할 때까지. 이 1 ~ 2 주 정도 소요될 수 있습니다.
    참고 : 정기적으로 PAX6, 각질 (K) 14, K15, K17, 및 ΔNp63α를 포함하여 추정 LESC 마커에 대한 긍정적 인 면역 세포 화학 염색에 의한 세포의 신원을 확인합니다. 차 항체를 포함하는 염색 세부 사항은 8,16-18,22을 발표했다.
  8. 37 ° C에서 10 분 동안 (0.25 % 용액 5 희석 1) 세포 합류 통로, 1 ㎖의 0.05 % 트립신 용액을 처리한다. 5 ml의 대두 그럴 추가3.5과 매질 (4) 및 원심 셀 : ypsin 억제제 용액 (/ ㎖의 10 ㎎)을 1 희석.
  9. 희석 된 대두 트립신 억제제 용액 3 ml의 세포 펠렛을 세척 하였다. 2 × 104 세포 / ml에서 FCL 피복 상 세포 (3.7 참조) 또는 유리 접시 챔버 슬라이드 접시.

장기 배양 각막 4. 아데노 바이러스 형질 도입

참고 : 재조합 아데노 바이러스 (AV)는 AV-벡터 (어떤 유전자가 삽입되지 ()는 C-충족 유전자 오픈 리딩 프레임), AV-cmet (MMP-10의 shRNA)와 AV-shM10 및 AV-shCF 포함 ( shRNA를 포함) F를 카 텝신합니다. 그들은 큰 즉각적인 초기 사이토 메갈로 바이러스 프로모터의 조절하에 유전자를 발현 E1 / E3 결실 형 5 AV이다. 는 AV-cmet 바이러스는 AV 벡터 패드 / CMV / V5-DEST (16)를 사용하여 생성됩니다. 는 AV-shRNA를 바이러스는 사용자 정의 복제 - 무능한 (-E1 / -E3) 구호 물자로 iLenti-EGFP 벡터에서 H​​H1 프로모터 및 GFP 태그 시퀀스와 함께의 shRNA 서열의 서브 클로닝에 의해 생성되는n 개의 AV 형 아데노 4 발현 시스템 (17)을 사용하여 5 게놈.

  1. 유전자 발현 변조 AV와 AV-벡터와 다른 각막과 각 쌍 중 하나 장기 배양 각막을 형질 도입. 24 잘 접시의 잘의 매체면에서 각각 각막을 유지 37 ℃에서 48 시간 동안 배양 배지에서 각막 당 0.8 8 10 × 1.25 플라크 형성 단위 (PFU)에서 AV-cmet를 사용합니다. 각막 당 1-2 × 10 8 PFU에서 AV-shRNA를 바이러스를 사용합니다.
  2. 75 μg의 / ㎖ 실데나필 시트 레이트 보충 전체 매체에 전달에 대한 바이러스를 사용합니다. 이 시약은 상피 세포 (21)에 의해 바이러스의 흡수를 촉진 카베 올린 전송을 활성화합니다. 때문에 수용액에서 비아그라의 짧은 반감기로, 나중에 매체 4-5 시간에 동일한 금액을 다시 추가 할 수 있습니다. 표준 치료는 48 시간입니다.
  3. 윤부에서 중간 수준을 유지 AV 않고 중간에 둥근 끝 멸균 주걱과 문화와 새로운 요리에 각막을 전송합니다. 추가 후itional 액체 - 공기 계면에서 4~8일, 공정 상피 상처 치유에 대한 다양한 분석 또는 시험을위한 AV 처리 각막 (위 참조). 정기적으로 각막의 상단에 100 μl의 매체 (2 방울)를 추가하여 문화 동안 각막을 적시고.
  4. 만 윤부 세포의 형질 도입의 경우, 중앙 상피의 전달을 피하기 위해, 윤부에서 중간 수준의 공기 - 액체 계면에서의 각막과 바이러스를 배양한다.

배양 된 윤부 세포의 5 아데노 바이러스 형질 도입

  1. 0.5 μg의 / cm 2에서 FCL 혼합물로 코팅 된 플라스틱 접시에 10 NG / ㎖ EGF와 매체에 LESC 농후 배양 (3.5 참조)를 유지한다.
  2. 녹색 형광 단백질 유전자 (AV-GFP) 또는 AV 스크램블 감염 다중도의 범위에서 shRNA를-GFP를 (: 1-300 PFU / 세포 MOI)를 형질는 AV와 70-80%에 포화 상태에 도달 한 배양 세포를 형질 도입 2 NG / ㎖ EGF와 매체이다. transductio를 수행N, 0.5 mL의 배지에서 20 시간 뒤에 최소 부피 (0.2 ml) 중, 37 ℃에서 4 시간 동안. 카베 올린 반송 활성제 실데나필은 세포 배양 전달을 위해 필요하지 않다.
  3. 중 폴리 양이온 (1 μg의 / ㎖ 폴리 -L- 리신, 5 μg의 / ㎖ 폴리 브렌) 또는 6 μL / mL를 전달 시약 (다음 AV 전달 효율을 향상시키기 위해 세포 표면에 결합하는 AV 용이 다음의 시약을 사용하여 예 ViraDuctin) 20 μL / mL를 전달 증강제 (예 ibiBoost).
  4. 는 AV없이 하나 배지를 교체 한 후, 가습 된 CO2 인큐베이터에서 4 일 동안 배양 한 세포를 부화 및 반전 형광 현미경을 이용하여 GFP 발현 수준을 평가한다.
  5. 는 AV-형질 문화에서 세포 이동을 평가하기 위해 스크래치 상처 치유 분석을 사용합니다. 멀티 웰 챔버 슬라이드에 세포를 성장. 200 μL의 PI와 함께 선형 직선 운동으로 세포를 긁어서 단층의 상처 만들기pette 팁. 부상 후, 분리 된 세포를 제거하는 새로운 하나의 매체를 변경합니다.
  6. 4X 배율 거꾸로 현미경에 부착 된 디지털 카메라로 매일 상처 사진. 치료가 완료 될 때 시간을 기록 (상처 가장자리 전체 상처 따라 접촉).

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Representative Results

우리는 각막 기관 배양 물에서, 당뇨병 성 마커 (예, 기저막 단백질과 인테그린 α3β1) 정상 및 당뇨병 사이 각막 창상 치유의 발현의 차이가 유지되도록 미리 보여 주었다. 이 배양 시스템은 유전자 변형 당뇨병 마커, C-MET, MMP-10의 수준을 정상화 치료를 목적하고, 카 텝신 F.시켰다

전체 각막 상피​​는 MMP-10, 카 텝신 F (개별적으로 또는 조합)에 AV-cmet 또는 AV-shRNA를 형질 도입되었을 때, 상피 상처 치유 속도가 매우 빠르고 완료되었다 (P <짝 스튜던트 t 테스트로 0.03에 비해 같은 기증자 (16, 17)에서 AV-벡터 형질 동료 각막에 비해 AV-벡터). 는 AV-cmet 크게 정상적인 각막의 치료에서 차이가 없었다 절반에 의해 치유 시간 (Figu 감소1) 다시. 는 AV-shM10 및 AV-shCF 작은 영향을 미쳤다. 그러나, AV-shM10 및 AV-shCF (콤보)와 AV-cmet 조합 완전히 상피 시간 (도 1)를 정규화 강한 효과를 생성했다. 시간이 치유의 감소는 당뇨병 (기저막과 인테그린)의 정규화 된 패턴을 동반하고 당뇨 각막 8,16,17 세포 마커 줄기했다.

상피 줄기 세포는 참가자 4 치유 주요 권취. 따라서 줄기 세포 구획 타겟팅 윤부 유전자 치료는 당뇨병 각막 유익 할 것인지 조사 하였다. 이를 위해, 당뇨병의 각막 윤부 부품이 AV-cmet 콤보 대형 의해 형질 도입하고, 8.5 mm의 상처가 만들어졌다. 는 AV-cmet 형질 각막은 훨씬 빠르게 치유 (P <쌍을 이루는 학생 t 테스트 0.001)가 AV-벡터 동료 각막을 형질 도입보다 (그림URE 2). 콤보 처리는 동일한 결과 18 결과. 유전자 치료는 인테그린 α3β1과 기저막 성분 nidogen-1 (도 3, 왼쪽 칼럼 콤보) 당뇨병 억제 마커의 발현을 증가. 중요한 것은, 전체 각막 형질 8, 17에서와 같이, AV-cmet 콤보 하나와 윤부 유전자 치료는 AV 벡터 형질 도입 각막에 비해 K15 및 ΔNp63α 포함 추정 LESC 마커 현저하게 발현이 증가되었다 (도 3 오른쪽 열, 모두 C-만나 콤보). 이러한 데이터는 당뇨병 각막 유전자 치료시 가속 상처 치유의 줄기 세포 정규화의 역할을 지원하는 당뇨병, 각막 질환의 치료를위한 접근법의 타당성을 나타낸다.

우리는 다음 배양 LESC 농축 윤부 상피 세포에 대한 유전자 치료 효과를 조사하기 시작했다. 문화정상과 당뇨병 윤부 상피 세포의 설립되었다 및 추정 LESC 표시 문자에 대해 스테인드. 많은 세포 염색 플러스 (그림 4). 당뇨병 문화 염색 강도는 정상 생체 대 당뇨병 각막 8의 상황과 매우 유사 정상 배양 (K15은도 4에 예시)보다 일관되게 더 약했다. 이러한 실험은 유전자 치료에 적합한 같이 얻어진 세포 배양을 확인.

텔로 머라 - 불멸화 각막 상피 세포주 예비 실험 (23 참조) (데이터는 여기에 도시되지 않은) 셀을 용이하게 사용할 수있는 AV 제물로 형질 도입 된 것으로 나타났다. 그러나 기본 윤부 문화는 전달 프로토콜의 최적화를 필요로 훨씬 더 민감 바이러스 부하 및 / 또는 전달 시약을 입증. 에 의해 배양 된 각막 윤부 세포 전달높은 MOI (> 80 % 세포에서 GFP 발현)에 전달 상당히 높은 수준의 결과, 상기 AV-GFP (그림 5) 감염의 다수 (범위 30 ~ 300 PFU / 셀 MOI)에 의존. 그러나, 높은 MOI는 전달의 3~4일 (그림 6) 후 스크래치 상처에 세포 죽음 또는 심각한 손상 세포 이동의 원인도 독성했다. 낮은 MOI (10-30 PFU / 세포) 덜 생성 AV 전달 또는 전혀 독성 효과가 있지만, GFP 발현 세포 (5-15%)의 감소를 초래 번호.

우리는 일반적으로 다음의 세포 표면에 결합하는 AV 전달을 용이하게 향상 시약을 이용하여 세포의 생존력을 손상시키지 않고 전달 효율을 향상하기 위해 시도했다. 이들은 MOI (10-30)에 의해 AV 윤부 상피 세포의 형질 도입 효율이 다른 개선을 보였다. 두 폴리 양이온, 폴리 -L- 리신, 폴리 브렌과 비 독성이었고, 가장 효과적인GFP 양성 세포의 수가 3-4 배 증가의 결과 (도 7의 위쪽 행). ibiBoost도 효과적이지만 약간 독성, 그리고 ViraDuctin (그림 7, 하단 행) 효과가 오히려 독성이었다. 따라서, 폴리 양이온은 AV 전달에 관심 발현 유전자를 촉진하는 안전하고 효율적인 방법을 제공하고, 유전자 발현을 위해 사용되어야하고 치유 실험을 권취.

그림 1
그림 1 : C-메트로 유전자 전달이 크게 시간 (± SEM을 의미) 치유 각막 상피 상처를 감소하는 리드. 또한, MMP-10, 카 텝신 F 유전자 AV의 은닉의 C-충족 유전자와 shRNA를 함께 결합 된 유전자 치료 (콤보) 완전히 상피 상처 치유 시간을 정상화. 의미 (p 값) respectiv에 비해 쌍 학생 t 테스트에 의해 설립되었다 전자 벡터 처리. 바는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 당뇨병 각막의 한 쌍의 8.5 mm 상피 상처의 치유. 상위 행, 벡터 형질 각막; 치유 8 일 완료됩니다. 아래 행은, AV-cmet 동료 각막을 형질 도입; 치료 5 일에 완료됩니다. 화살표 상처 (W) 가장자리를 표시합니다. * 거미 모양의 apoptosed 간질 간질와 (또한 삽입의 높은 배율로 표시)이 아닌 치유 부분. 상피 층은 그 위에 성장 때까지 그들은 볼 수 있습니다. 바 = 50 μm의. 위상차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

ove_content "FO : 유지-together.within 페이지 ="1 "> 그림 3
그림 3 : 윤부 유전자 치료 후 다양한 마커 당뇨병 각막 섹션으로 면역 염색. AV-cmet 및 콤보 치료를 모두 당뇨병 마커 (인테그린 α3β1과 nidogen-1) 및 추정 줄기 세포 마커 (K15과 ΔNp63α)에 대해 현저하게 증가 윤부 염색을 초래. nidogen-1 패널의 화살표는 각막 상피​​ 기저막을 표시합니다. 바 = 30 μm의. 전자, 상피; 의, 기질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : 추정 LESC 마커 K15에 대한 기본 윤부 상피 문화의 면역 세포 화학 염색법. 상위 행, 일반 문화; 대부분의 세포 소K15에 대한 w 강한 염색. 아래 행, 당뇨병 문화; 대부분의 세포는 약한 얼룩을 보여줍니다. 오른쪽 패널은 DAPI 핵으로 대조되게됩니다. 정상 및 당뇨병 세포는 동일한 노출 시간으로 촬영 하였다. 바 = 20 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 : 형질 도입 윤부 상피 세포에서 GFP 표현의 수준은 AV-GFP의 MOI에 따라 (가) 30 PFU / 셀; (b) 120 PFU / 세포; 전달 3 일에 (C) 300 PFU / 셀. 살아있는 세포의 사진이 표시됩니다. 바 = 300 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


도 6 : 세포 이동 악영향 스크래치 상처 시험에 의해 계시 된 AV의 농도 증가에 의해 영향을 받는다 : (a) 관리; (b) 20 PFU / 세포; (c) 80 PFU / 세포; (d) 120 PFU / 세포. 살아있는 세포의 사진이 표시됩니다. 바 = 500 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
그림 7 : 30 PFU / 세포에 AV-GFP 형질 도입 윤부 상피 세포. (a) 관리; (b) 폴리 L 리신; (c, d) 전달 시약; 전달 5 일. 전달 시약 C세포 반올림과 죽음 (D, 위상차)로 이어지는 중요한 세포 독성 효과를 aused. 살아있는 세포의 사진이 표시됩니다. 바 = 400 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

각막 인해 유전자 전달뿐만 아니라 효과와 부작용의 평가가 쉽게 그 표면 위치를 유전자 요법을위한 이상적인 조직 것으로 보인다. 그러나,이 방법의 강력한 임상 번역으로 인해 유전 각막 질환의 원인 및 유전자 치료 대상 24 부족한 정보를 여전히 느리다. 각막 변경을 포함하는 당뇨병 합병증은 신진 대사 메모리 (9)로 번역 자연의 대부분 성적인 될 수있다. 그 때문에, 당뇨병 조직 및 세포는 생체 외에서 그 이상을 유지하고, 장기 및 조직 배양에서 연구 될 수있다. 또한, 당뇨병 환자는 유전자 치료에 의해 보정 될 수있는 유전자 발현 수준 및 패턴의 특정 변화를 야기한다. 우리가 정상화 각막 기관 배양 7,8 줄기 세포 구획 5,6,8 포함한 당뇨병 각막 상피에서 변경 여러 마커를 식별하고 사용했다유전자 치료 마커 발현과 당뇨 각막 상피​​ 손상된 상처 치유.

우리 때문에 강한 유전자 발현의 비 통합 사이트, 및 아데노 - 관련 바이러스 (AAV) (25)보다 우수한 특성이다 상피 세포에 대한 선택성의 유전자 전달 비히클로서 AV를 선택했다. 각막 기관 배양의 AV 전달 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 각막은 저장 중에 발생하는 상피 세포의 손실을 최소화하기 위해 48 시간의 사후 내에 실험실로 전달되어야한다. 바이러스 흡수를 증가시키기 위해, 이는 전달 (21) 중에 이러한 실데나필 같이 카베 올래 전송 부스터를 추가하는 것이 중요하다. 단백질 발현의 전달 효과를 검증 할 때 특정한 줄기 세포 마커가 명확하게 식별되지 않는 한, 몇 가지 마커의 사용은, (도 3)를 권장합니다. 상피의 상처를 만드는 경우, 체를 사용할 필요가있다수동 스크래핑 동안의 분리의 결과로 당뇨병 상피 기저막의 취약성으로 인해 mical의 변연 절제술. 상피 (그림 2) 그들을 regrows 때 치유 과정의주의 매일 모니터링 등의보기에서 죽은 피하 각막의 실종과 같은 치유의 객관적인 기준으로 필요하다. 기본 윤부 세포 일부 AV 및 / 또는 GFP 독성으로, 그러한 폴리 양이온과 같은 무독성 전달 부스터를 사용하는 동시에, 바이러스의 투여 량을 낮추는 것이 중요하다 때문에 마지막 효율적이고 안전한 전달을 보장하기 위해 (도 5 - 7).

유전자 치료 시스템은 동물의 장기 배양 각막을 사용하도록 수정 될 수있다. 그들은 정기적으로 기지에 수량을 얻을 수있다, 인간보다 훨씬 저렴하고, 상처 치유 변조 약물의 예를 들면, 검사에 적합 할 수있다. 그러나, 인간의 각막에 대한 잠재적 가능성을 제공 넓은시약, 특히 항체의 풍요 로움에 의한 연구. 비 당뇨병 동물 각막 약물 스크리닝의 경우, 괴사 기계적으로 수행 할 수있다. 특정 마커에 대한 항체가 몇몇 인간의 각막에 잘 작동하지 않는 경우, 각각의 가변성 및 / 또는 질병의 심각성 또는 시간에 기인 할 수있다. 이 경우, 다른 마커를 검사하는 것은 권장 할 수있다. 세포를 제거하기 위해 N 헵탄의 능력은 크게 저장 중에 아마도 의한 산화, 시간이 지남에 따라 감소 할 수있다. 이런 경우, 새로운 이전 개봉 바이알을 사용할 필요가있다. 고가의 인간 각막 작업하는 경우, 변연 절제술의 두 번째 라운드는 시도 할 수있다. 비아그라는 수용액에서의 짧은 반감기; 따라서, 신선한 각막 전달이 수행 될 때마다 준비한다. 기증자의 연령에 따라 달라질 수 있습니다 윤부 세포를 배양의 성공; 젊은 기증자의 세포는 일반적으로 더 성장한다. 단일 유전자 치료 에이전트는 signif을 유도하지 않을 수 있습니다icant 효과; 이 경우에, 이러한 제제의 조합이 최적의 17 일 수있다. 주 각막 세포 독성의 징후를 표시하면, 바이러스 및 폴리 양이온 (예를 들면, 폴리 -L- 리신)을 낮추는 것이 중요하다 효율적인 전달을 보존하면서 독성을 최소화 도스.

당뇨병 기관 배양 물은 질환 및 변화된 유전자 발현의 여러 징후를 재현하지만, 그들은 denervated하며 상처 치유에 영향을 줄기 세포를 면역 세포 수의 공급이 결여. 동물이 인간 질환 증상의 전체 스펙트럼을 재생하지 않지만 이러한 관점에서, 상기 동물 모델은 몇 가지 장점을 제공 할 수있다. 다른 유전자 치료 대상 효율적 당뇨병 각막을 정규화하는 것이 존재한다. 이러한 목표의 예는 특히 마이크로 RNA, 미르-146A 또는 미르-424 (23) 일 수있다. 특정 마이크로 RNA의 억제와 함께 사용되는 표적 유전자 변형의 조합은, 잠재적으로 더 강력 유익한 효과를 생성 할 수있다. AnothER 제한 바이러스 최대 흡수를 보장하기 위해 (점안제의 형태 예) 국소 투여 AV과 각막의 비교적 긴 배양의 필요성을 포함한다. 눈꺼풀을 테이핑하는 배양을 연장에 도움이 수 있지만 이것은 병원에서 문제를 제기 할 수있다. 바이러스 용액 실데나필 저농도의 사용은 AV 흡수를 촉진 할 수있다. 된 AV 전달 효과는 AV 계 유전자 요법의 치료 가능성을 제한 할 수있는, 일시적이다. 는 당뇨병 상처 치유 침체를 해결하기에 충분히 긴 지속 있지만, AAV 기반 유전자 치료 (24)에 의해 제공과 같은 더 긴 지속 효과가 필요할 수 있습니다 상피 줄기 세포의 정상화를 유지. 또한 면역 원성 초기 AV 벡터들의 심각한 단점이라고 언급한다. 그러나, "무기력"바이러스를 포함하는 새로운 세대 재조합 AV,이 부작용의 대부분 무료입니다 강력한 translati되는 자신의 가능성을 증가도 그러 유전자 ​​치료 차량 (26).

16,17,21 상처 치유에 중요 할 수있는 다양한 경로의 소분자 조절제, 27-30은 실험 모델 및 병원에서 사용된다. 그러나,이 특정 세포 유형에 타겟팅되지 않은 다른 셀들에서 서로 다른 영향을 미칠 수 있으며, 오직 당뇨 각막 질환 (31, 32)의 몇몇 양태들에 작용할 수있다. 유전자 치료는 우리 유전자 과발현 (c-MET)와 침묵 (MMP-10, 카 텝신 F)를 모두 사용하여 상피 세포를 형질 도입이 연구에서 달성 특정 셀에 원하는 방향으로 유전자 발현을 변경하는 가능성을 제공한다. 이 방법은 또한 하나 하나 또는 이들의 조합 5,6- 특정 질병 마커 유전자의 발현을 조절 수있다. 실험 예상 심지어 다른 유전자 발현의 조절을 은닉 세 AVS의 조합의 경우에, 모든 세 유전자가 영향을받은 것으로 나타났다 및처리는 각 AV 단독 (17)를 사용한 경우보다 더 효율적이었다.

지속적 상피 결함이나 유리체 절제술이나 레이저 광응고술시 불완전 상피 치유와 심한 당뇨 각막에 장애 윤부 줄기 세포의 대체 유전자 치료의 대안이 될 수있다. 이러한 경우에, 시험 관내에서 유전자 치료시 및 확대 배양 윤부 상피 세포는 각막 질환에 이식 될 수있다. 우리의 데이타는 당뇨병에서 배양 된 각막 윤부 세포는 유전자 치료를 위해 그들에게 좋은 표적을 생체 각막 등 줄기 세포 마커의 발현에 유사한 차이를 보여주는 것으로 나타났다. 그러나,이 처리에 의한 사용 된 바이러스로드 및 형질 감염 시약 그러한 세포의 감도를 최적화 할 필요가있다. 우리는 양이온 성 형질 전환 시약은 배양 당뇨 각막 상피​​에 대한 관심의 유전자의 높은 식으로 효율적이고 안전한 전달을 보장 것을 보여줄 수 있었다. 티HESE 결과는 심한 당뇨 각막의 경우 향후 이식을 위해 LESC 확장 체외에서의 성공적인 유전자 치료에 대한 방법을 포장 할 수있다. 유전 및 취득 LESC 결핍은 당뇨병 33,34 유사한 각막 신경의 감소와 연관되어 있기 때문에 환부 각막 상 건강 LESC 농후 배양 이식 잠재적 아니라 당뇨병 성 신경 병증, 각막을 완화 할 수있다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
minimum essential medium Thermo Fisher Scientific 11095-080
Optisol-GS  Bausch & Lomb 50006-OPT
ABAM antibiotic-antimycotic mixture Thermo Fisher Scientific 15240062
calf skin collagen  Sigma-Aldrich  C9791
agar, tissue culture grade Sigma-Aldrich  A1296
n-heptanol Sigma-Aldrich  72954-5ML-F
O.C.T. compound  VWR International 25608-930
Dispase II  Roche Applied Science 4942078001
keratinocyte serum-free medium (KSFM)  Thermo Fisher Scientific 17005042
EpiLife medium with calcium Thermo Fisher Scientific MEPI500CA
N2 medium supplement, 100x Thermo Fisher Scientific 17502-048
B27 medium supplement, 50x Thermo Fisher Scientific 17504-044
human keratinocyte growth supplement, 100x Thermo Fisher Scientific S-001-5
trypsin 0.25% - EDTA 0.02% with phenol red Thermo Fisher Scientific 25200056
trypsin 0.25% with phenol red Thermo Fisher Scientific 15050065
soybean trypsin inhibitor  Sigma-Aldrich  T6414
fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 26140079
insulin-transferrin-selenite supplement (ITS) Sigma-Aldrich  I3146-5ML
antibody to keratin 14 Santa Cruz Biotechnology sc-53253
antibody to keratin 15 Santa Cruz Biotechnology sc-47697
antibody to keratin 17 Santa Cruz Biotechnology SC-58726
antibody to ΔNp63α Santa Cruz Biotechnology sc-8609
antibody to PAX6 BioLegend PRB-278P-100
antibody to nidogen-1 R&D Systems MAB2570
antibody to integrin α3β1 EMD Millipore MAB1992
human fibronectin BD Biosciences 354008
human laminin Sigma-Aldrich  L4445
human type IV collagen Sigma-Aldrich  C6745-1ML
adenovirus expressing MMP-10 shRNA Capital BioSciences custom made
adenovirus expressing cathepsin F shRNA Capital BioSciences custom made
adenovirus expressing scrambled shRNA and GFP Capital BioSciences custom made
adenovirus expressing c-met OriGene (plasmid) SC323278
adenovirus expressing GFP KeraFAST FVQ002
sildenafil citrate, 25 mg Pfizer from pharmacy
epidermal growth factor  Thermo Fisher Scientific PHG0311
poly-L-lysine Sigma-Aldrich  P4707
polybrene Sigma-Aldrich  107689-10G
ViraDuctin Cell Biolabs AD-200
ibiBoost ibidi, Germany 50301
phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010049
Corning round end spatula  Dow Corning 3005
60 mm Petri dishes Thermo Fisher Scientific 174888
Nunc Lab-Tek II multiwell chamber slides  Sigma-Aldrich C6807
200 μl pipet tips Bioexpress P-1233-200 other suppliers available
inverted microscope  Nikon Diaphot other suppliers/models available
humidified CO2 incubator  Thermo Fisher Scientific 370 (Steri-Cycle) other suppliers/models available
fluorescent microscope Olympus, Japan BX-40 other suppliers/models available
dissecting stereo microscope Leica, Germany S4 E other suppliers/models available

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References

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발달 생물학 문제 (110) 당뇨 각막 유전자 치료 아데노 바이러스 MMP-10 카 텝신 F C-MET 윤부 줄기 세포 기관 배양 폴리 양이온 shRNA를 상처 치유 세포 배양
당뇨병 각막에 대한 아데노 바이러스 유전자 치료 : 인간 장기 배양 각막 및 윤부 상피 세포에 상처 치유에 효과 및 세포 마커의 발현 줄기
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