Abstract
Het doel van dit protocol is om moleculaire veranderingen te beschrijven in menselijke diabetische hoornvliezen en laten zien hoe ze kunnen worden ondervangen door adenovirale gentherapie in orgel-gekweekte hoornvliezen. De diabetische corneale ziekte een complicatie van diabetes met frequente afwijkingen hoornvlies zenuwen en epitheliale wondgenezing. We hebben ook gedocumenteerd significant veranderd uitdrukking van een aantal vermeende epitheliale stamcellen markers in menselijke diabetische hoornvliezen. Om deze veranderingen te verlichten, werd adenovirale gentherapie succes uitgevoerd volgens de opregulatie van c-met proto-oncogen expressie en / of neerwaartse regulatie van proteasen matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) en cathepsine F. Deze therapie versnelde wondgenezing bij diabetische hoornvliezen zelfs wanneer alleen de limbale stamcel compartiment werd getransduceerd. De beste resultaten werden verkregen met gecombineerde behandeling. Voor mogelijke patiënt transplantatie van stamcellen genormaliseerd, wordt ook een voorbeeld gegeven van de optimizatiop van gen transductie in stamcel-verrijkte culturen met behulp van polykationische enhancers. Deze benadering kan niet alleen nuttig zijn voor de geselecteerde genen maar ook voor de andere mediatoren van corneale epitheliale wondgenezing en stamcel functie.
Introduction
De diabetische hoornvlies ziekte resulteert voornamelijk in degeneratieve epitheliale (keratopathie) en zenuwen (neuropathie) verandert. Het wordt vaak tot uiting door de afwijkingen van epitheliale wondgenezing en het hoornvlies zenuwen reductie 1-4. Naar schatting 60-70% diabetici hebben verschillende hoornvlies problemen 1,3. Onze studies hebben verschillende merker eiwitten geïdentificeerd met veranderde expressie in humane diabetische cornea waaronder de neerwaartse regulatie van c-met proto-oncogen (hepatocyt groeifactor receptor) en opregulatie van matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) en cathepsine F 5, 6. we hebben ook aanzienlijk gedocumenteerd verminderde expressie van verscheidene mogelijke epitheliale stamcel markers in het menselijk hoornvlies diabetes.
In de eerdere studies hebben we een op adenovirale gentherapie om de niveaus van door diabetes veranderde merkers genormaliseerd met menselijke diabetische hoornvlies orgaancultuur, dat langzaam wondgenezing toont ontwikkeld diabetischemarker veranderingen, en stamcel marker expressie verlaging vergelijkbaar met de ex vivo hoornvliezen 7,8. Deze aanhoudende veranderingen blijkt door de aanwezigheid van epigenetische metabole geheugen 9 te zijn. Deze cultuur systeem werd verder gebruikt voor gentherapie. De doelstellingen van deze therapie zijn gekozen markers met hetzij verminderde expressie in diabetische cornea (c-met proto-oncogen), of verhoogde expressie (MMP-10 en cathepsine F).
De adenovirale (AV) therapie werd gebruikt in de hele orgaan- gekweekte cornea of corneoscleral perifere limbale enkel compartiment. Dit compartiment herbergt epitheliale stamcellen die het hoornvliesepitheel te vernieuwen en actief deelnemen aan de wondgenezing 4,10-15. Hier worden protocollen die voor het normaal en diabetische menselijk hoornvlies orgelcultuur, epitheliale wondgenezing, isolatie en karakterisering van stamcellen verrijkt limbale celculturen en adenovirale cel en hoornvlies transductie. Onzeresultaten laten de haalbaarheid van deze therapie voor het normaliseren markerexpressie en wondgenezing bij diabetische cornea voor mogelijke toekomstige transplantatie. Ze suggereren ook dat de combinatietherapie is de meest doeltreffende manier om normale merkerpatroon en epitheliale genezing herstellen bij diabetici cornea 16-18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
National Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA) geleverd goedgekeurde post-mortem gezonde en diabetische menselijke ogen en hoornvliezen. NDRI van menselijk weefsel collectie protocol wordt goedgekeurd door de bestuurlijke commissie en onder voorbehoud van de National Institutes of Health toezicht. Dit onderzoek is uitgevoerd in het kader van de goedgekeurde Cedars-Sinai Medical Center Institutional Review Board (IRB) vrijgestelde protocol EX-1055. Samenwerken hoornvlies chirurgen, Drs. E. Maguen en Y. Rabinowitz, geleverd teruggooi corneoscleral velgen voor de isolatie van stamcellen verrijkt cornea epitheliale culturen. Dit onderzoek is uitgevoerd in het kader van het goedgekeurde IRB protocol Pro00019393.
1. Human Cornea orgelcultuur
Opmerking: Normaal en diabetische hoornvliezen of hele ogen worden ontvangen in gekoelde cornea opslagmedium (bijv Optisol GS) binnen 48 uur na de dood van de nationale leverancier NDRI.
- Verwijder de hoornvliezen uit opslagcontainer met een pincet en was ze tweemaal in het antibioticum-antimycoticum (ABAM) mengsel. In het geval van de hele ogen, snijd de hoornvliezen uit de bollen met gebogen schaar. Laat minstens een 5 mm conjunctivale velg en ook de hoornvliezen wassen in ABAM.
- Bereid het mengsel in de cornea concaviteit te plaatsen. Het bestaat uit serumvrij minimaal essentieel medium (MEM) bevattende ABAM, 1 mg / ml kalfshuidcollageen (uit een voorraadoplossing van 10 mg / ml in 0,1 N azijnzuur), 1% agar, en insuline-transferrine-seleniet 7 vullen.
- Magnetron dit mengsel aan de kook voor sterilisatie en agar oplossing. Het kan tot 1 minuut voor alles op te lossen. Laat de buis kap gedeeltelijk open, omdat het mengsel overflows makkelijker als het kookt. Daarom kunnen verschillende kokend cycli nodig, elk voor 10-15 sec. Afkoelen van het mengsel tot 37-39 ° C.
- Plaats de hoornvliezen epitheliale kant naar beneden in steriele 60 mm gerechten. Vul het hoornvlies holte met ongeveer 0,5 ml van de in 1.2 beschreven mengsel. Demengsel stolt op het hoornvlies binnen 2 minuten.
- Plaats de cornea agar beneden in steriele 60-mm schaaltjes en voeg het volledige medium met MEM met ABAM en insuline-transferrine-seleniet supplement 7 (37 ° C) om het niveau bij benadering de limbus voor lucht-vloeistof-grensvlak kweek te houden. Het medium volume 7-8 ml per gerecht.
- De schaaltjes met de cornea in een 5% CO2 incubator bevochtigd met water pan (Aldus wordt vochtigheidsgraad gehouden op of boven 95%) bij 35 ° C (normale temperatuur cornea). Voeg 100 ul medium (twee druppels) per dag op het epitheel van het hoornvlies te bevochtigen.
- Bewaken van de cornea morfologie en de epitheliale cellen levensvatbaarheid microscopisch onder doorvallend licht met een standaard microscoop met een 4X doelstelling. Doe dit een keer per dag.
- Verander het medium elke drie dagen. De cornea kan worden gekweekt gedurende ten minste drie weken. Voor de gentherapie-experimenten, de cultuur van de hoornvliezen voor 3-5 dagen, dan omvormerse met genen van belang (4,1-4,4), laat nog eens 3-5 dagen, afhankelijk van de transgene en onder voorbehoud van de wondgenezing protocol (2,1-2,4).
2. epitheliale wondheling
Opmerking: In de diabetische hoornvlies, het epitheel debridement mechanisch schrapen niet toelaat de fragiele epitheliale basismembraan losgemaakt in het proces, dat gebeurt niet in de normale cornea. Dus om de normale en diabetische hoornvliezen onder vergelijkbare wondgenezing te houden, is chemisch verwijderen van het epitheel met n-heptanol 19 gebruikt. Deze procedure verwijdert de epitheel, maar laat achter een intact basaal membraan in zowel de normale en diabetische hoornvliezen.
- Naar het centrum van epitheliale debridement 20 uit te voeren, plaats een 5 mm filterpapier schijf gedrenkt in n-heptanol op het centrale hoornvlies voorste oppervlak voor 75 sec.
- Verwijder het filter en was de hoornvliezen volledig medium. Vul de holte met 0,5 ml agar-collageenmengsel en cultuur als in 1.4. Na debridement, de epitheelcellen meestal sterven en afwerpen met achterlating van microscopisch intact basaal membraan 7.
- Gebruik 8,5 mm schijven groter epitheliale wonden in de experimenten met enige limbale gentherapie creëren. Dit zal zorgen voor de betrokkenheid van limbale stamcellen in het genezingsproces.
- Bewaken van de cornea genezing microscopisch. Maak foto's op 4x en 10x per dag tot de epitheeldefect volledig genezen is. Het genezingsproces van 2 tot 15 dagen, afhankelijk van de stand (normale of diabetische) en wondgrootte.
Opmerking: Tijdens het genezingsproces, zijn zwarte spin-achtige cellen waargenomen bij de top focal plane. Deze cellen zijn apoptotisch stromale keratocyten dat stierf na de epitheliale verwijdering 4. De genezing volledig is beschouwd, wanneer deze dode cellen overwoekerd door de heling epitheel en niet meer zichtbaar (figuur 2, bijvoegsel). - na genezingvoltooiing, snijd de hoornvliezen in de helft, insluiten in OCT verbinding en proces voor indirecte immunofluorescentie op cryostaat secties of Western blots 16,21.
3. Isolatie van Limbale Cells en onderhoud van Stem Cell-verrijkte culturen
Let op: Bereid de primaire limbale epitheliale stamcellen (LESC) verrijkte culturen uit de corneoscleral velgen. De velgen afkomstig van gezonde donoren en weggegooid na het hoornvlies transplantaties worden ontvangen van de samenwerkende chirurgen in de standaard cornea opslagmedium (bijv Optisol). Anders kan de LESC verrijkte culturen worden verkregen bij de velgen uitgesneden uit normale en diabetische hele hoornvliezen of globes ontvangen van NDRI in de cornea opslagmedium.
- Als de hele hoornvliezen of bollen worden gebruikt, eerst de limbale gebieden te isoleren. Om dit te doen, plaatst u het hoornvlies op een steriele plastic schaaltje met epitheliale kant op en verwijder het centrale gebied met een 9-mm trephine (ronde hoornvlies mes).Gooi dit centrale deel. accijnzen dan de limbale zone met behulp van een 13 mm trephine en gooi de buitenste conjunctivale deel. Te isoleren cellen gebruiken de bagel-achtige limbale rand. Voordat celisolatie Verwijder de endotheelcellen en hechtende resten van de iris van de binnenzijde van het hoornvlies tegenover het oppervlak epitheel met een steriel wattenstaafje.
- Isoleer limbale cel vellen met behulp van dispase behandeling. Incubeer elk corneoscleral rand met 2,4 U / ml dispase II in 1,5 ml keratinocyt serumvrij medium (KSFM), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C gedurende 2 uur 22.
- Deze zachtjes limbale epitheliale cellaag van de velg onder een dissectie stereomicroscoop met een pincet en dissociëren de cellen in 1 ml van 0,25% trypsine - 0,02% EDTA gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de cellen in 10 ml medium (bv Epilife) en pellet ze bij 300 g in een tafelmodel centrifuge gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer the cellen in kweekmedium: medium met N2, B27 en menselijke keratinocytgroeifactor supplementen, en 10 ng / ml epidermale groeifactor (EGF).
- Zaad de cellen bij 3000-5000 cellen / ml in flessen en 60 mm schalen bekleed met een mengsel van menselijke basale membraan proteïnen zoals fibronectine, type IV collageen en laminine (FCL), bij 0,5-1 ug / cm 2, in de KSFM medium.
- De cellen te kweken in een bevochtigde (95% of hogere luchtvochtigheid) CO2 incubator bij 37 ° C tot ze volledig confluente monolagen. Dit kan 1-2 weken duren.
Let op: regelmatig de cel identiteit door positieve immunocytochemische kleuring voor vermeende LESC markers waaronder PAX6, keratine (K) 14, K15, K17 en ΔNp63α bevestigen. De kleuring gegevens evenals de primaire antilichamen gepubliceerd 8,16-18,22. - Om de passage confluente cellen te behandelen met 1 ml 0,05% trypsine-oplossing (1: 5 verdunning van de oplossing 0,25%) gedurende 10 min bij 37 ° C. Voeg 5 ml sojaboon trypsin remmeroplossing (10 mg / ml) verdund 1: 4 in medium en gecentrifugeerd cellen in 3,5.
- Was de celpellet in 3 ml verdund sojaboon trypsineremmer oplossing. Plaat de cellen op FCL-gecoate (zie 3.7) gerechten of glazen kamer dia's 2 x 10 4 cellen / ml.
4. adenovirale transductie van Organ-gekweekte Corneas
Opmerking: De recombinante adenovirussen (AV) bevatten AV-vector (geen geïnsereerd), AV-cMet (met c-met gen open leesraam), AV-shM10 (met shRNA tot MMP-10) en AV-shCF ( met shRNA cathepsine F). Ze zijn E1 / E3 gedeleteerde Type 5 AV expressie van genen onder de controle van de belangrijkste onmiddellijk vroege cytomegalovirus promoter. De AV-cMet virussen worden gegenereerd met behulp van AV vector Pad / CMV / V5-DEST 16. De AV-shRNA virussen zijn op maat gegenereerd door subklonering van shRNA sequenties samen met HH1 promotor en GFP-tag sequentie uit iLenti-EGFP vector in een replicatie-incompetente (-E1 / -E3) Human AV type 5 genoom met behulp van adeno-4 expressie systeem 17.
- Transduceren ene orgaan gekweekte cornea van elk paar met AV-vector en een hoornvlies, een genexpressie-modulerende AV. Gebruik de AV-cMet bij 0,8-1,25 x 10 8 plaquevormende eenheden (pfu) per cornea in kweekmedium gedurende 48 uur bij 37 ° C houden van de hoornvliezen onder het medium oppervlak elk in een putje van een 24-putjes. Gebruik de AV-shRNA virussen bij 1-2 x 10 8 pfu per hoornvlies.
- Gebruik de virussen voor transductie volledig medium, aangevuld met 75 ug / ml sildenafil citrate. Dit reagens activeert de caveolin transport te vergemakkelijken virale opname door de epitheelcellen 21. Vanwege de korte halfwaardetijd van sildenafil in waterige oplossingen, later opnieuw voeg dezelfde hoeveelheid aan middellange 4-5 uur. De standaardbehandeling voor 48 uur.
- Transfer hoornvliezen om nieuwe gerechten met een ronde uiteinde steriele spatel en cultuur in het medium zonder AV houden van het medium niveau van de limbus. Na de addnele 4-8 dagen aan het vloeistof-lucht, verwerkt de AV-behandelde hoornvliezen van verschillende analyses en testen van epitheliale wondgenezing (zie hierboven). Routinematig bevochtig de hoornvliezen tijdens cultuur door het toevoegen van 100 ul medium (twee druppels) op de top van het hoornvlies.
- Voor de transductie van alleen de limbale cellen, incubeer de virussen met de cornea van het lucht-vloeistof raakvlak met medium niveau de limbus, transductie van de centrale epitheel voorkomen.
5. adenovirale transductie van gekweekte Limbale Cells
- Handhaaf de LESC verrijkte kweken in het medium met 10 ng / ml EGF (zie 3.5) op plastic schaaltjes bekleed met het FCL mengsel bij 0,5 gg / cm 2.
- Transduceren gekweekte cellen 70-80% confluentie met de AV die het op groen fluorescent eiwitgen (AV-GFP) of AV-gecodeerde shRNA-GFP in verschillende multipliciteit van infectie (MOI: 1-300 pfu / cel) hebben bereikt , in het medium met 2 ng / ml EGF. Voer de transduction gedurende 4 uur bij 37 ° C in een minimaal volume (0,2 ml) gevolgd door 20 uur in 0,5 ml medium. De caveolin transport activator sildenafil is niet nodig voor de celkweek transductie.
- Een van de volgende reagentia die de AV binding aan het celoppervlak vergemakkelijken de AV transductie efficiëntie: of polykationen (1 ug / ml poly-L-lysine of 5 ug / ml polybreen) en 6 ul / ml transductie-reagens ( bijvoorbeeld ViraDuctin) of 20 ul / ml transductie versterker (bijv ibiBoost).
- Na het vervangen van het medium voor het zonder het AV incuberen gekweekte cellen gedurende 4 dagen in de bevochtigde CO2 incubator en beoordelen GFP-expressieniveau met een geïnverteerde fluorescentiemicroscoop.
- Gebruik de scratch wondgenezing assay om celmigratie te evalueren in de AV-getransduceerde culturen. Groeien de cellen in de multiwell kamer glijbanen. Maak de wonden in een monolaag door krassen cellen in een rechte lineaire beweging met een 200 pi piPette tip. Na verwonding, verandert het medium voor een frisse ene naar de vrijstaande cellen te verwijderen.
- Fotograferen de wonden elke dag met een digitale camera verbonden met een omgekeerde microscoop bij 4x vergroting. Noteer de tijd dat het genezingsproces voltooid is (de wondranden in contact over de gehele wond).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben eerder aangetoond dat de cornea orgaankweken de verschillen in de expressie van diabetische markers (bijv kelder membraaneiwitten en α3β1 integrine) en wondgenezing tussen de normale en diabetische hoornvliezen worden bewaard. Dit kweeksysteem werd onderworpen aan gentherapie gericht op het normaliseren van de niveaus van diabetes veranderd markers, c-Met, MMP-10 en cathepsine F.
Wanneer de gehele hoornvliesepitheel werd getransduceerd met de AV-cMet of AV-shRNA tot MMP-10 of cathepsine F (afzonderlijk of in combinatie), werd de epitheliale wondheling aanzienlijk sneller gedaan (P <0,03 gepaarde Student t-test vergeleken AV-vector) dan in de AV-vector getransduceerde collega cornea van dezelfde donor 16,17. De AV-cMet verminderde de genezing tijd met de helft, die niet significant afwijken van de genezing van de normale hoornvliezen (FiguAd 1). De AV-shM10 en AV-shCF hadden kleinere effect. Een combinatie van de AV-cMet de AV-shM10 en AV-shCF (Combo) die het sterkste effect volledig normaliseren van de epitheliale helingtijden (figuur 1). Deze vermindering van de genezingstijd ging gepaard met de genormaliseerde patronen van diabetische (basaal membraan en integrine) en stamcel markers bij diabetici cornea 8,16,17.
De epitheliale stamcellen zijn de belangrijkste wondgenezende deelnemers 4. Daarom onderzochten we of limbale gentherapie gericht op het stamcelcompartiment gunstig voor de diabetische cornea was. Hiervoor werden alleen de limbale delen van de diabetische cornea getransduceerd door de AV-cMet of Combo groot zijn 8,5 mm wonden gemaakt. De AV-cMet getransduceerde cornea significant sneller genezen (P <0,001 gepaarde Student t-test) dan de AV-vector getransduceerde collega cornea (Figure 2). De behandeling Combo resulteerde in gelijke uitkomst 18. Gentherapie verhoogde de expressie van diabetes onderdrukte markers, zoals integrine α3β1 en basaalmembraan component nidogen-1 (Figuur 3, links kolommen, Combo). Belangrijk, zoals in de gehele cornea transductie 8,17, de limbale gentherapie met ofwel de AV-cMet of Combo tot een sterk verhoogde expressie van vermeende LESC markers zoals K15 en ΔNp63α, vergeleken met de AV-vector getransduceerde cornea (Figuur 3 , rechterkolom, zowel c-met en Combo). Deze gegevens ondersteunden de rol van stamcellen normalisatie versnelde wondgenezing bij gentherapie van diabetische cornea en tonen de haalbaarheid van onze benadering van de behandeling van diabetische ziekte van het hoornvlies.
We vervolgens begonnen de gentherapie effecten op gekweekte LESC-verrijkte limbale epitheliale cellen onderzocht. de kwekenvan normale en diabetische limbale epitheliale cellen werden vastgesteld en gekleurd voor vermeende LESC markers. Vele positieve cellen gekleurd (Figuur 4). De kleuringsintensiteit bij diabetici kweken was altijd zwakker dan normaal kweken (K15 als voorbeeld weergegeven in figuur 4), die vergelijkbaar met de situatie bij diabetici vs. normale ex vivo cornea 8 was. Deze experimenten gevalideerd verkregen celculturen geschikt voor gentherapie.
Voorlopige experimenten met een telomerase onsterfelijk cornea epitheel cellijn (zie 23) toonden aan dat de cellen gemakkelijk werden getransduceerd door de beschikbare AV constructies (data hier niet getoond). De primaire kweken limbale bleken veel gevoeliger voor de virale lading en / of de transductie reagens, noodzakelijk optimalisering van de transductie protocol. De gekweekte limbale cel transductie doorde AV-GFP (Figuur 5) was afhankelijk van de multipliciteit van infectie (MOI; 30-300 pfu / cel) leidt tot een vrij hoge transductie bij hoge MOI (GFP expressie in> 80% van de cellen). De hogere MOI waren ook toxisch, waardoor celdood of sterk verminderde celmigratie in de kras wonden na 3-4 dagen na transductie (figuur 6). Bij de lagere MOI (10-30 pfu / cel), de AV transductie geproduceerd minder of geen cytotoxisch effect, maar resulteerde in een verminderd aantal GFP tot expressie brengende cellen (5-15%).
We vervolgens geprobeerd om de transductie-efficiëntie te verhogen zonder dat cellevensvatbaarheid door transductie verbetering reagentia die meestal de AV binding aan het celoppervlak te vergemakkelijken. Zij toonden verschillende efficiencyverbeteringen in limbale epitheliale cel transductie door de AV bij MOI 10-30. Beide polykationen, poly-L-lysine, en polybreen, waren niet-toxisch en doeltreffendstewat resulteert in 3-4 voudige toename van het aantal GFP-positieve cellen (figuur 7, bovenste rij). ibiBoost was ook effectief, maar in geringe mate giftig en ViraDuctin niet effectief was en nogal giftig (figuur 7, onderste rij). Daarom polykationen bieden een veilige en efficiënte manier om interessante gen expressie stimuleren van de AV transductie en moet worden gebruikt voor de genexpressie en wondgenezing experimenten.
Figuur 1: c-Met-gen transductie leidt tot significant afgenomen cornea epitheliale wondgenezing tijd (gemiddelde ± SEM). Bovendien, in combinatie gentherapie (Combo) met AV herbergen c-met-gen en shRNAs tot MMP-10 en cathepsine F-genen volledig normaliseert epitheliale wondgenezing tijd. Significantie (p-waarden) werd opgericht door gepaarde Student t-test in vergelijking met respectiv e vector behandelingen. Balken geven de standaardfout van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Genezing van 8,5 mm epitheliale wonden in een paar diabetische hoornvliezen. Bovenste rij, vector-getransduceerde hoornvlies; genezing is voltooid in 8 dagen. Onderste rij, AV-cMet getransduceerde fellow hoornvlies; genezing is voltooid in 5 dagen. Pijlen geven wond (W) edge. *, Non-genezen deel (ook getoond bij sterke vergroting als inzet), met de spin-vormige apoptosed stromale keratocyten. Ze staan totdat de epitheellaag groeit er bovenop. Bar = 50 urn. Fase contrast. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Immunokleuring van diabetische corneale gedeelten van verschillende merkers na limbale gentherapie. Zowel AV-cMet en Combo behandelingen leiden tot een aanzienlijke toename limbale aankleuring voor diabetische markers (α3β1 integrine en nidogen-1) en vermeende stamcel markers (K15 en ΔNp63α). Pijlen op nidogen-1 panelen markeren cornea epitheliale basismembraan. Bar = 30 urn. e, epitheel; s, stroma. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: immunocytochemische kleuring van primaire limbale epitheliale culturen voor een vermeende LESC marker K15. Bovenste rij, normaal cultuur; de meeste cellen show sterke kleuring voor K15. Onderste rij, diabetische cultuur; de meeste cellen tonen slechts zwakke kleuring. De rechter panelen worden met DAPI nucleaire tegenkleuring. Normale en diabetische cellen werden gefotografeerd met dezelfde belichtingstijd. Bar = 20 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Het niveau van GFP-expressie in getransduceerde limbale epitheliale cellen afhankelijk MOI van AV-GFP: (a) 30 pfu / cel; (B) 120 pfu / cel; (C) 300 pfu / cel 3 dagen van de transductie. Foto's van levende cellen worden getoond. Bar = 300 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Cel migratie wordt negatief beïnvloed door de toenemende concentratie van AV zoals blijkt uit scratch wond-test: (a) controle; (B) 20 pfu / cel; (C) 80 pfu / cel; (D) 120 pfu / cel. Foto's van levende cellen worden getoond. Bar = 500 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Limbale epitheelcellen getransduceerd met AV-GFP bij 30 pfu / cel. (A) controle; (B) poly-L-lysine; (C, d), transductie reagens; 5 dagen na transductie. Transductie reagens caused een significant cytotoxisch effect dat leidt tot celronding en dood (d, fasecontrast). Foto's van levende cellen worden getoond. Bar = 400 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De cornea lijkt een ideale weefsel voor gentherapie vanwege zijn oppervlak plaats waar de genafgifte, alsmede de evaluatie van de werkzaamheid en bijwerkingen, zijn eenvoudig. Echter, een klinische vertaling van deze krachtige aanpak is nog steeds traag vanwege de schaarse informatie over de genetische oorzaken van het hoornvlies ziekten en de gentherapie targets 24. Diabetische complicaties met inbegrip van de cornea veranderingen kunnen grotendeels epigenetische in de natuur, wat zich vertaalt in metabole geheugen 9 zijn. Daarom is de diabetische weefsels en cellen behouden hun afwijkingen ex vivo en kunnen worden bestudeerd in de orgaan- en weefselkweek. Ook diabetes veroorzaakt specifieke veranderingen in de genexpressie en patronen die kunnen worden gecorrigeerd door de gentherapie. We hebben verschillende markers gewijzigd bij diabetici hoornvliesepitheel waaronder stamcelcompartiment 5,6,8 geïdentificeerd en gebruikt het menselijk hoornvlies orgaankweken 7,8 normaliseren doorgentherapie de marker expressie en epitheliale wondgenezing aangetast in de diabetische hoornvlies.
Wij hebben gekozen voor de AV als genoverdrachtsvehikel vanwege de sterke transgenexpressie, de niet-integrerende aard en de selectiviteit voor epitheelcellen, welke eigenschappen beter zijn dan die van het adeno-geassocieerde virus (AAV) 25 zijn. De AV-transductie van het hoornvlies orgel culturen heeft een aantal kritische stappen. De cornea's worden afgeleverd aan het laboratorium binnen 48 uur post mortem, het verlies van epitheel die optreedt tijdens opslag te minimaliseren. Om het virale opname verhogen, is het belangrijk om caveolae transport boosters, zoals sildenafil, voeg gedurende 21 transductie. Bij de validatie van de transductie effect op eiwitexpressie is het gebruik van meerdere merkers aanbevolen (figuur 3), specifieke stamcel markers niet definitief vastgesteld. Bij het maken van de epitheliale wonden, is er een noodzaak om het gebruik chemical debridement vanwege de kwetsbaarheid van de diabetische epitheliale basismembraan waardoor het losraken tijdens handmatig afschrapen. Een zorgvuldige dagelijkse controle van het genezingsproces noodzakelijk is objectieve criteria van genezing, zoals het verdwijnen van de dode subepitheliaal keratocyten uit het zicht wanneer het epitheel regrows over hen (figuur 2). Tenslotte vanwege enkele AV en / of GFP toxiciteit voor de primaire limbale cellen, is het belangrijk om het virale dosis verlagen, tegelijkertijd met niet giftige transductie boosters, zoals polykationen, efficiënte en veilige transductie verzekeren (figuren 5 - 7).
Gentherapie systeem kan worden aangepast om het dierlijk orgaan gekweekt cornea gebruiken. Ze zijn veel goedkoper dan de mens, kunnen de hoeveelheden worden verkregen op een regelmatige basis, en kan geschikt zijn voor screening, bijvoorbeeld van wondgenezing modulerende geneesmiddelen. De menselijke hoornvliezen in potentie bredere mogelijkhedende studie vanwege de overvloed aan reagentia, vooral antilichamen. Bij het screenen van geneesmiddelen in niet-diabetische dieren cornea, kan de debridement mechanische bewerking. Indien een antilichaam voor een bepaalde merker niet goed in sommige menselijke hoornvliezen, mogelijk te wijten aan de variabiliteit en / of duur van de ziekte of ernst. In dit geval op de andere markers worden aanbevolen. Het vermogen van n-heptanol aan de cellen te verwijderen aanzienlijk tijd afnemen, mogelijk als gevolg van de oxidatie tijdens opslag. Als dit gebeurt, kan het nodig zijn een nieuw, eerder ongeopend, flacon worden gebruikt. Als het werken met de dure menselijke cornea, kan een tweede debridement worden geprobeerd. Sildenafil heeft een korte halfwaardetijd in waterige oplossingen; Daarom moet vers worden bereid telkens een corneale transductie uitgevoerd. Het succes van het kweken limbale cellen afhangen leeftijd van de donor; de cellen van jongere donoren meestal beter groeien. Eén gentherapiemiddel kan teweegbrengt een signifcante effect; in dit geval kan een combinatie van dergelijke middelen optimaal 17 zijn. Als de primaire hoornvliescellen tekenen van toxiciteit, is het belangrijk om de virale en polykation (bijvoorbeeld poly-L-lysine) lagere doses toxische effect minimaliseren behoud efficiënte transductie.
Hoewel diabetische orgaankweken reproduceren veel tekenen van de ziekte en veranderde genexpressie, ze gedenerveerde en niet de levering van immuuncellen die de wondheling kunnen beïnvloeden en stamcellen. In dit opzicht kan de diermodellen enige voordelen bieden, hoewel de dieren niet het volledige spectrum van menselijke ziekten tekens reproduceren. De andere gentherapie verden dat diabetische hoornvlies efficiënt normaliseren. Een voorbeeld van dergelijke doelstellingen kunnen microRNA specifiek mir-146a of mir-424 23. De combinaties van de gebruikte doelgen wijzigingen met de remming van specifieke microRNA mogelijk kunnen produceren krachtiger gunstig effect. another opsomming behoort de noodzaak relatief lange incubatie van het hoornvlies met de AV topisch (bijvoorbeeld in de vorm van oogdruppels) om maximale virale opname zorgen. Dit kan een probleem vormen in de kliniek, maar taping de oogleden kunnen helpen bij het verlengen van de incubatie. Het gebruik van lage concentraties van sildenafil in de virale oplossing zou de AV opname versnellen. De AV transductie effect is van voorbijgaande aard, die de genezende potentieel van de AV-gebaseerde gentherapie kunnen beperken. Hoewel het duurt lang genoeg om de diabetische wondgenezing vertraging te corrigeren, aanhoudende normalisatie van de epitheliale stamcellen kan een langduriger effect vereisen, zoals door de AAV-gentherapie 24. Opgemerkt zij dat immunogeniciteit een ernstig nadeel vroege AV vectoren. Echter, de nieuwe generatie recombinant AV waaronder "laf" virussen zijn grotendeels vrij van deze bijwerking, hun vooruitzichten van het zijn krachtige vertalin toenemendeonal gentherapievehikels 26.
Kleinmoleculige modulatoren van diverse routes die belangrijk zijn voor wondheling kunnen 16,17,21, 27-30 worden gebruikt in de experimentele modellen en de kliniek. Zij zijn echter niet gericht op een specifiek celtype, kunnen verschillende effecten in verschillende cellen, en kunnen optreden slechts bepaalde aspecten van de diabetische ziekte van het hoornvlies 31,32. De gentherapie biedt de mogelijkheid om de genexpressie in een gewenste richting in specifieke cellen, die we bereikt in dit werk transduceren de epitheelcellen met beide genoverexpressie (c-met) en silencing (MMP-10 en cathepsine F). Deze aanpak maakt het ook moduleren van de expressie van specifieke ziekte merkergenen, een voor een of in combinaties 5,6. Onze experimenten toonden dat zelfs bij combinatie van drie verschillende AVS herbergen genexpressie modulatoren werden alle drie genen beïnvloed zoals verwacht, en debehandeling efficiënter was dan wanneer elk AV alleen 17 gebruikt.
In ernstige diabetische keratopathie met aanhoudende epitheliale defecten of onvolledige epitheliale genezing bij vitrectomie of laser fotocoagulatie, kan een vervanging van disfunctionele limbale stamcellen alternatief voor gentherapie. In deze gevallen worden gekweekt en uitgebreid limbale epitheliale cellen na gentherapie in vitro worden getransplanteerd op de zieke hoornvlies. Onze gegevens tonen aan dat gekweekte limbale cellen uit de diabetische hoornvliezen vertonen vergelijkbare verschillen in de stamcel marker uitdrukking als ex vivo cornea waardoor ze goede doelen voor de gentherapie. Echter, deze behandeling moet worden geoptimaliseerd, vanwege de hoge gevoeligheid van deze cellen aan de virale lading en transfectie reagens. We konden aantonen dat de kationische transfectie reagentia gewaarborgd efficiënte en veilige levering met hoge expressie van een gen van interesse in de gekweekte diabetische hoornvliesepitheel. THese resultaten kan de weg voor een succesvolle gentherapie van in vitro uitgebreid LESC voor de toekomst transplantatiedoeleinden in gevallen van ernstige diabetische keratopathie effenen. Omdat erfelijke en verworven deficiëntie LESC ook geassocieerd met geringere hoornvlies zenuwen Soortgelijke diabetes 33,34 kan de transplantatie van gezonde LESC verrijkte kweken naar het aangetaste hoornvlies mogelijk verlichten van de cornea diabetische neuropathie ook.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| minimum essential medium | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Optisol-GS | Bausch & Lomb | 50006-OPT | |
| ABAM antibiotic-antimycotic mixture | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| calf skin collagen | Sigma-Aldrich | C9791 | |
| agar, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| n-heptanol | Sigma-Aldrich | 72954-5ML-F | |
| O.C.T. compound | VWR International | 25608-930 | |
| Dispase II | Roche Applied Science | 4942078001 | |
| keratinocyte serum-free medium (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005042 | |
| EpiLife medium with calcium | Thermo Fisher Scientific | MEPI500CA | |
| N2 medium supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| B27 medium supplement, 50x | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| human keratinocyte growth supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | S-001-5 | |
| trypsin 0.25% - EDTA 0.02% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| trypsin 0.25% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15050065 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| insulin-transferrin-selenite supplement (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| antibody to keratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
| antibody to keratin 15 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47697 | |
| antibody to keratin 17 | Santa Cruz Biotechnology | SC-58726 | |
| antibody to ΔNp63α | Santa Cruz Biotechnology | sc-8609 | |
| antibody to PAX6 | BioLegend | PRB-278P-100 | |
| antibody to nidogen-1 | R&D Systems | MAB2570 | |
| antibody to integrin α3β1 | EMD Millipore | MAB1992 | |
| human fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| human laminin | Sigma-Aldrich | L4445 | |
| human type IV collagen | Sigma-Aldrich | C6745-1ML | |
| adenovirus expressing MMP-10 shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing cathepsin F shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing scrambled shRNA and GFP | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing c-met | OriGene (plasmid) | SC323278 | |
| adenovirus expressing GFP | KeraFAST | FVQ002 | |
| sildenafil citrate, 25 mg | Pfizer | from pharmacy | |
| epidermal growth factor | Thermo Fisher Scientific | PHG0311 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| ViraDuctin | Cell Biolabs | AD-200 | |
| ibiBoost | ibidi, Germany | 50301 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Corning round end spatula | Dow Corning | 3005 | |
| 60 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 174888 | |
| Nunc Lab-Tek II multiwell chamber slides | Sigma-Aldrich | C6807 | |
| 200 μl pipet tips | Bioexpress | P-1233-200 | other suppliers available |
| inverted microscope | Nikon | Diaphot | other suppliers/models available |
| humidified CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370 (Steri-Cycle) | other suppliers/models available |
| fluorescent microscope | Olympus, Japan | BX-40 | other suppliers/models available |
| dissecting stereo microscope | Leica, Germany | S4 E | other suppliers/models available |
References
- Bikbova, G., Oshitari, T., Tawada, A., Yamamoto, S.
- Calvo-Maroto, A. M., Perez-Cambrodí, R. J., Albarán-Diego, C., Pons, A., Cerviño, A. Optical quality of the diabetic eye: a review. Eye (Lond). 28 (11), 1271-1280 (2014).
- Tripathy, K., Chawla, R., Sharma, Y. R., Venkatesh, P., Vohra, R.
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M.
- Saghizadeh, M., et al. Overexpression of matrix metalloproteinase-10 and matrix metalloproteinase-3 in human diabetic corneas: a possible mechanism of basement membrane and integrin alterations. Am J Pathol. 158 (2), 723-734 (2001).
- Saghizadeh, M., et al. Proteinase and growth factor alterations revealed by gene microarray analysis of human diabetic corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (10), 3604-3615 (2005).
- Kabosova, A., Kramerov, A. A., Aoki, A. M., Murphy, G., Zieske, J. D., Ljubimov, A. V. Human diabetic corneas preserve wound healing, basement membrane, integrin and MMP-10 differences from normal corneas in organ culture. Exp Eye Res. 77 (2), 211-217 (2003).
- Saghizadeh, M., et al. Alterations of epithelial stem cell marker patterns in human diabetic corneas and effects of c-met gene therapy. Mol Vis. 17, 2177-2190 (2011).
- Kowluru, R. A., Kowluru, A., Mishra, M., Kumar, B. Oxidative stress and epigenetic modifications in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 40-61 (2015).
- Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. J Cell Sci. 111 (Pt 19), 2867-2875 (1998).
- Lu, L., Reinach, P., Kao, W. W.
- Rama, P., et al. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. N Engl J Med. 363 (2), 147-155 (2010).
- Di Girolamo, N., et al. Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea. Stem Cells. 48 (1), 203-225 (2014).
- Amitai-Lange, A., et al. Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
- Di Girolamo, N. Moving epithelia: Tracking the fate of mammalian limbal epithelial stem cells. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 203-225 (2015).
- Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-met gene. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (4), 1970-1980 (2010).
- Saghizadeh, M., et al. Enhanced wound healing, kinase and stem cell marker expression in diabetic organ-cultured human corneas upon MMP-10 and cathepsin F gene silencing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8172-8180 (2013).
- Saghizadeh, M., Dib, C. M., Brunken, W. J., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and stem cell marker patterns in organ-cultured human diabetic corneas by gene therapy of limbal cells. Exp Eye Res. 129 (Dec), 66-73 (2014).
- Hatchell, D. L., et al. Damage to the epithelial basement membrane in the corneas of diabetic rabbits. Arch Ophthalmol. 101 (3), 469-471 (1983).
- Chung, J. H., Kim, W. K., Lee, J. S., Pae, Y. S., Kim, H. J. Effect of topical Na-hyaluronan on hemidesmosome formation in n-heptanol-induced corneal injury. Ophthalmic Res. 30 (2), 96-100 (1998).
- Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Res Bull. 81 (2-3), 262-272 (2010).
- Sareen, D., et al. Differentiation of human limbal-derived induced pluripotent stem cells into limbal-like epithelium. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1002-1012 (2014).
- Funari, V. A., et al. Differentially expressed wound healing-related microRNAs in the human diabetic cornea. PLoS One. 8 (12), e84425 (2013).
- Mohan, R. R., Rodier, J. T., Sharma, A. Corneal gene therapy: basic science and translational perspective. Ocul Surf. 11 (3), 150-164 (2013).
- Liu, J., et al. Different tropism of adenoviruses and adeno-associated viruses to corneal cells: implications for corneal gene therapy. Mol Vis. 14, 2087-2096 (2008).
- Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4 (5), 346-358 (2003).
- Sharma, G. D., He, J., Bazan, H. E. P38 and ERK1/2 coordinate cellular migration and proliferation in epithelial wound healing: evidence of cross-talk activation between MAP kinase cascades. J Biol Chem. 278 (24), 21989-21997 (2003).
- Saika, S., et al. Role of p38 MAP kinase in regulation of cell migration and proliferation in healing corneal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (1), 100-109 (2004).
- Xu, K. P., Li, Y., Ljubimov, A. V., Yu, F. S. High glucose suppresses epidermal growth factor receptor/phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway and attenuates corneal epithelial wound healing. Diabetes. 58 (5), 1077-1085 (2009).
- Xu, K., Yu, F. S. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3301-3308 (2011).
- Takamura, Y., et al. Aldose reductase inhibitor counteracts the enhanced expression of matrix metalloproteinase-10 and improves corneal wound healing in galactose-fed rats. Mol Vis. 19, 2477-2486 (2013).
- Byun, Y. S., Kang, B., Yoo, Y. S., Joo, C. K. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves corneal epithelial innervation and wound healing in diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1948-1955 (2015).
- Deng, S. X., et al. Characterization of limbal stem cell deficiency by in vivo laser scanning confocal microscopy: a microstructural approach. Arch Ophthalmol. 130 (4), 440-445 (2012).
- Lagali, N., et al. In vivo morphology of the limbal palisades of Vogt correlates with progressive stem cell deficiency in aniridia-related keratopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5333-5342 (2013).
