Abstract
Bu protokolün amacı, insan diyabetik kornealar moleküler değişiklikleri tanımlamak ve organ kültürlü kornealar adenoviral gen tedavisi ile kontrol altına alınabilir nasıl göstermektir. Diyabetik kornea hastalığı kornea sinir ve epitel yara iyileşmesi sık anormallikler diyabet komplikasyonudur. Biz de insan diyabetik kornealar birçok olası epitel kök hücre belirteçleri önemli ölçüde değişmiş ifadesini belgelenmiştir. Bu değişiklikleri hafifletmek için adenoviral gen terapisi başarıyla c-met proto-onkogen ifade düzenlenmesi ve / ya da proteinazlar, matris metaloproteinaz-10 (MMP-10) ve katepsin F. Bu tedavinin down-regüle kullanılarak uygulanan diyabetli kornea yara iyileşmesi hızlandırılmış sadece limbal kök hücre bölmesi transduse zaman bile. En iyi sonuçlar, kombine terapi ile elde edilmiştir. normalize kök hücrelerin mümkün olan hastaya nakli, bir örnek, optimizati arasında sunulmuşturpolikatyonik güçlendiricileri kök hücre ile zenginleştirilmiş kültürlerde gen transdüksiyonu on. Bu yaklaşım, seçilen genler için değil, aynı zamanda kornea epitel yara iyileşmesinin diğer arabulucular için sadece yararlı olabilir ve hücre fonksiyonu kaynaklanıyor olabilir.
Introduction
Diyabetik kornea hastalığı çoğunlukla dejeneratif epitel (keratopatisi) ve sinir (nöropati) değişikliklere neden olur. Genellikle epitel yara iyileşmesi ve kornea sinir azaltma 1-4 anormallikler ortaya çıkar. Tahminen% 60-70 diyabet çeşitli kornea problemleri 1,3 var. Çalışmalarımız değiştirilmiş Cı-met proto-onkogen (hepatosit büyüme faktörü reseptörü) ile aşağı doğru düzenleme dahil olmak üzere insan diyabet kornea ekspresyon ve matris metaloproteinaz-10 (MMP-10) ve katepsin F 5, 6, yukarı doğru düzenleme ile birkaç işaretçi proteinleri tanımlanmıştır. Biz de önemli ölçüde belgelenmiş insan diyabetik kornealar birçok olası epitel kök hücre belirteçleri ifadesini azalmıştır.
Daha önceki çalışmalarda diyabetik, yavaş yara iyileşme gösterir Diyabet kornea organ kültür sistemi kullanılarak şeker-değiştirilmiş belirteçlerin seviyelerini normalize etmek üzere bir adenoviral esaslı gen terapisi geliştirdikişaretleyici değişiklikler ve ex vivo kornealar 7,8 benzer hücre belirteci ifade azaltma kaynaklanıyor. Değişikliklerin Bu sebat epigenetik metabolik belleğin 9 varlığından dolayı görünmektedir. Bu kültür sistemi gen terapisi için daha kullanılmıştır. Bu tedavi için hedef diyabetik kornealar (c-met proto-onkogen) veya artmış ekspresyonu (MMP-10 ve katepsin K) azaltılmış ekspresyonu ile ya belirteçleri seçilmiştir.
adenoviral (AV) tedavisi tüm organ kültür kornealar veya sadece korneoskleral periferik limbal bölmeye kullanılmıştır. Bu bölme kornea epitel yenilemek ve aktif 4,10-15 yara iyileşmesi katılmak epitel kök hücreleri barındırır. Burada, protokoller, normal sağlıklı insan kornea organ kültürü, epitelyal yara iyileşmesi, izolasyon ve kök hücre zenginleştirilmiş limbal hücre kültürlerinin karakterizasyonu ve adenoviral hücre ve kornea transdüksiyon için verilmiştir. BizimSonuçlar gelecekteki olası transplantasyon için diyabetik kornea işaretleyici ifade ve yara iyileşmesi normalleştirilmesi için bu tedavinin uygulanabilirliğini göstermektedir. Onlar da kombinasyon tedavisi, diyabetik kornea 16-18 normal işaretleyici desen ve epitel iyileşmesini geri en etkili yol olduğunu göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ulusal Hastalık Araştırma Değişim (Ndri, Philadelphia, PA) rıza gösterilen postmortem sağlıklı ve diyabetik insan gözleri ve korneaları verilir. Ndri insan doku toplama protokolü Sağlık gözetimi National Institutes yönetim komitesi ve konuya tarafından onaylanmıştır. Bu araştırma onaylı Cedars-Sinai Tıp Merkezi Kurumsal Değerlendirme Kurulu (KİK) muaf protokol EX-1055 kapsamında yapılmıştır. , Dr kornea cerrahları İşbirliği. E. Maguen ve Y. Rabinowitz, kök hücre ile zenginleştirilmiş kornea epitel kültürlerin izolasyonu için ıskarta korneoskleral jantlar verilir. Bu araştırma onaylı IRB protokolü Pro00019393 altında yapılmıştır.
1. İnsan Kornea Organ Culture
Not: Normal ve diabetik korneaları veya bütün gözler soğutulmuş kornea depolama ortamına alınır (örneğin, Optisol GS) Ulusal satıcı Ndri gelen ölümünden sonra 48 saat içinde.
- forseps ile depolama kabından kornealar çıkarın ve ben onları iki kez yıkayınN antibiyotik antimikotik (ABAM) karışımı ile gerçekleştirilmektedir. Bütün gözlerin durumunda, kavisli makas ile küreler gelen kornea kesip. en az 5 mm konjonktiva jant bırakın ve aynı zamanda ABAM de korneaları yıkayın.
- kornea konkavlık yerleştirilmesi için bir karışım hazırlayın. Serum içermeyen minimum temel ortam (MEM) içeren ABAM, 1 mg / l (0.1 N asetik asit içerisinde 10 mg / ml'lik bir stok çözeltisinden elde edilen) mi dana derinin kollajen,% 1 agar ve insülin transferin-selenit oluşmaktadır 7 tamamlar.
- Mikrodalga sterilizasyon ve agar çözülme için kaynayan bu karışım. Her şey erimesi için ne 1 dakika kadar sürebilir. Kaynadıktan zaman karışım kolayca aşıyor çünkü kısmen açık tüp kapağını bırakın. Bu nedenle, çok sayıda kaynama çevrimleri 10-15 sn için, her biri gerekli olabilir. 37-39 ° C'ye kadar karışım soğutun.
- Steril 60 mm yemekleri kornealar aşağı epitel tarafı yerleştirin. 1.2 anlatılan karışımın yaklaşık 0,5 ml kornea konkavlık doldurun.Karışım 2 dakika içinde kornealar üzerinde katılaşır.
- Aşağı steril 60 mm yemekleri kornealar agar tarafını yerleştirin ve ABAM ile MEM içeren tam orta ekleyin ve insülin transferin-selenit ek 7 (37 ° C) hava-sıvı arayüz kültürü için limbusta yaklaşık seviyesini korumak için. orta hacimli çanak başına 7-8 ml.
- Bir su tavası ile nemlendirilmiş bir% 5 CO 2 kuvöz içine kornealar yemekleri ile koyun 35 ° C (normal kornea sıcaklığı) (Bu şekilde, nem düzeyinde veya% 95 üzerinde tutulur). kornealar nemlendirmek için epiteli günlük 100 ul orta (iki damla) ekleyin.
- kornea morfolojisi ve 4X amacı ile standart bir mikroskop kullanılarak iletilen ışık altında mikroskopik epitel hücre canlılığı izleyin. Bir gün çok kez yapın.
- her üç günde bir orta değiştirin. kornea en az üç hafta boyunca kültürlenebilir. 3-5 gün boyunca gen terapisi deneyleri için, kültür kornealar sonra detfaiz (4,1-4,4) genleri ile e yara iyileşmesi protokolü (2,1-2,4) için transgen ve konuya bağlı olarak başka bir 3-5 gün bekletin.
2. Epitel Yara İyileşmesi
Not: kırılgan epitel bazal membran, normal kornealar olmaz süreçte, müstakil olduğu için diyabetik kornealar ise, mekanik kazıma ile epitel debridman mümkün değildir. Bu nedenle, yara iyileşmesinin benzer şartlar altında, normal ve diyabetik kornealar tutmak için, N-heptanol epitelin kimyasal çıkarılması 19 kullanılır. Bu prosedür epitel kaldırır ama hem normal hem de diabetik kornealar sağlam bir bazal membranın geride bırakır.
- Merkezi epitel debridmanı 20 gerçekleştirmek için, 75 saniye boyunca santral kornea ön yüzeyinde n-heptanol batırılmış 5 mm filtre kağıdı diski yerleştirin.
- filtreyi kaldırmak ve tam orta korneaları yıkayın. 0.5 mi agar-kollajen ile konkavite doldurmak1.4 gibi karışım ve kültür. Debridmandan sonra, epitel hücreleri genellikle ölür ve mikroskopik bozulmamış bazal membran 7 geride bırakarak batağından.
- Sadece limbal gen terapisi ile yapılan deneylerde geniş epitel yaraları oluşturmak için 8.5 mm diskleri kullanın. Bu iyileşme sürecinde limbal kök hücrelerin katılımını sağlayacaktır.
- mikroskobik kornea iyileşmesini izleyin. epitel defekti tamamen iyileşene kadar her gün 4X ve 10X fotoğraflarını olun. İyileşme süreci (normal veya diyabetik) devlet ve yara büyüklüğüne bağlı olarak 2 ile 15 gün arasında sürebilir.
Not: iyileşme sürecinde, siyah örümcek benzeri hücreler üst odak düzlemi gözlenir. Bu hücreler epitel çıkarıldıktan 4 sonra ölen apoptotik stromal keratositler vardır. Şifa bu ölü hücreler şifa epitel ile büyümüş ve artık görünür (Şekil 2, ek) zaman tam olarak tespit edilir. - şifa sonratamamlama, yarım kornealar kesilmiş kriyostat kesitleri üzerinde dolaylı immünofloresan veya Western lekeleri 16,21 için Ekim bileşik ve bu süreç içinde onları gömmek.
Kök Hücre zenginleştirilmiş Kültürlerin Limbal Hücreler ve Bakım 3. İzolasyon
Not: korneoskleral jantlar primer limbal epitel kök hücre (LESC) bakımından zenginleştirilmiş kültürleri hazırlayın. Kornea nakilleri standart kornea depolama ortamına (örneğin, Optisol) içinde işbirliği cerrahlar alınan sonra sağlıklı donörlerden gelen ve atılan jantlar. Aksi takdirde, LESC zenginleştirilmiş kültür normal ve diyabetik bütün kornea eksize jantlar elde edilebilir veya korneal depolama ortamında Ndri alınan küreler.
- Bütün korneaları veya küreler kullanılması halinde, ilk limbal alanları izole. Bunu yapmak için, epitel tarafı ile steril plastik tabak üzerine kornea yukarı yerleştirin ve bir 9 mm trepan (dairesel kornea bıçak) ile merkezi alanı kaldırmak.bu merkezi kısmını atın. Sonra 13 mm trefin kullanarak limbal bölgeyi tüketim ve dış konjonktiva kısmını atın. izole etmek için hücreler, simit gibi limbal kenar kullanımı. hücre izolasyonu önce, steril pamuklu çubukla yüzey epiteli ters korneanın iç tarafında endotel hücreleri ve iris yapışan kalıntıları çıkarmak.
- dispase tedavi ile limbal hücre yaprak izole edin. 2 saat 22 süreyle 37 ° C'de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 1.5 mi keratinosit serumsuz ortam (KSFM) 'de 2.4 U / ml dispase II, her korneoskleral kenar inkübe edin.
- Yavaşça forseps bir kesme stereo bir mikroskop altında ağız dışı limbal epitel hücre tabakasını kolaylaştırmak ve% 0.25 tripsin 1 ml hücreleri ayırmak - oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 0.02 EDTA çözeltisi.
- Ortam (ör Epilife) 10 ml hücre yıkayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca masa üstü santrifüjü içinde 300 xg'de bunları pelet.
- süspanse inciKültür ortamı içinde, hücrelerin: N2, B27 ve keratinosit büyüme takviyeleri, ve 10 ng / ml, epidermal büyüme faktörü (EGF) ile orta.
- KSFM olarak, 0.5-1 mg / cm2 de, fibronektin, tip IV kolajen, laminin ve (FCL) dahil olmak üzere insan bazal membran proteinlerinin bir karışımı ile kaplanmış şişelerinde 3.000-5.000 hücre / ml ya da 60 mm tabaklar hücreleri Tohum orta.
- Kültür, 37 ° C'de, nemlendirilmiş (% 95 ya da daha yüksek nem) CO2 inkübatör hücreler tam konfluent tek tabaka oluşturmayan kadar. Bu 1-2 hafta sürebilir.
Not: Düzenli Pax6, keratin (K) 14, K15, K17, ve ΔNp63α dahil varsayılan LESC belirteçler pozitif immünositokimyasal boyama ile hücre kimliğini onaylamak. Birincil antikorlar dahil olmak üzere boyama bilgilerini 8,16-18,22 yayınlanmıştır. - 37 ° C'de 10 dakika süre ile (% 0.25 solüsyon 5 dilüsyon 1) konfluent hücreler kanalı için, 1 ml% 0.05 tripsin solüsyonu ile muamele. 5 ml soya fasulyesi tr ekleme3.5 gibi bir ortam içinde 4 ve santrifüj hücreleri: ypsin inhibitör çözeltisi (ug / ml, 10 mg), 1 seyreltilmiştir.
- seyreltilmiş soya fasulyesi tripsin önleyicisi çözeltisi 3 ml hücre pelletini yıkayın. 2 x 10 4 hücre / ml FCL-kaplı üzerine hücreleri (3.7 bakınız) yemekleri veya cam haznesi slaytlar Plate.
Organ-kültürlü kornealar 4. adenoviral İletimi
Not: Rekombinant adenovirüsleri (AV), AV-vektörü (Resim geninin dahil) (c-met geninin açık okuma çerçevesi ile), AV-met, (MMP-10 shRNA) ile AV shM10 ve AV-shCF içerir ( shRNA ile) F katepsin için. Bunlar ana ani erken sitomegalovirüs promoterinin kontrolü altında genlerin E1 / E3-silinmiş tip 5 AV vardır. AV-c-met virüsler AV vektör Pad / CMV / V5-dest 16 kullanılarak üretilir. AV-shRNA virüsleri özel bir replikasyon-yetersiz (-E1 / -E3) huma içine iLenti EGFP vektörü gelen HH1 promotör ve GFP etiketi dizisi ile birlikte shRNA dizilerinin alt klonlanması tarafından oluşturulann AV tipi Adeno-4 ifade sistemi 17 ile 5 genom.
- Bir gen ifadesi-modülasyon AV, AV-vektörü ve başka kornea ile her çiftin bir organ kültürlü kornea transduce. 24 oyuklu kabına orta yüzeyinin altındaki her kornealar tutarak, 37 ° C'de 48 saat süre ile kültür ortamı içinde kornea başına 0,8 8 ila 10 x 1.25 plak oluşturucu birim (pfu) AV-met kullanın. Kornea başına 1-2 x 10 8 pfu AV-shRNA virüs kullanın.
- 75 ug / ml sildenafil sitrat ile eklenmiş tam ortam içinde transdüksiyonu için virüs kullanın. Bu reaktif epitel hücreleri 21 viral alımını kolaylaştırmak kaveolin taşıma aktive eder. Nedeniyle sulu çözeltilerde sildenafilin kısa yarılanma ömrü, daha sonra orta 4-5 saat için aynı miktarda yeniden ekleyin. Standart işleme 48 saat için.
- limbusta orta düzeyde tutarak AV olmadan ortamda yuvarlak uç steril spatula ve kültürü ile yeni yemekler korneaları aktarın. add sonraitional sıvı-hava arayüzü de 4-8 gün, süreç epitel yara iyileşmesi için çeşitli analizler veya test için AV-tedavi kornealar (yukarıya bakınız). Rutin olarak korneanın üzerine, 100 ul ortam (iki damla) ilave edilerek kültür sırasında kornealar ıslatın.
- Sadece limbal hücrelerin iletimi için merkezi epitel iletimini önlemek için, limbusta orta seviyede hava-sıvı arayüzü de kornealar ile virüsleri kuluçkaya yatmaktadır.
Kültürlenmiş Limbal Hücreleri 5. adenoviral İletimi
- 0.5 ug / cm2'de FCL karışımı ile kaplanmış plastik tabaklar 10 ng / ml EGF ile ortam içinde LESC zenginleştirilmiş kültürleri (3.5) muhafaza.
- Yeşil floresan proteini geni (AV-GFP) veya AV karıştırılmış enfeksiyon çokluğu aralığında shRNA-GFP (: 1-300 PFU / hücre MOI) barındıran AV% 70-80 konfluent ulaşmış kültürlenmiş hücreleri nakletmek 2 ng / ml EGF ile üretilebilir. transductio gerçekleştirinN, 0.5 mi ortamında 20 saat ve ardından en az bir hacim (0.2 mi) içerisinde 37 ° C'de 4 saat karıştırıldı. kaveolin nakil etkinleştiricisi sildenafil hücre kültürü transdüksiyonu için gerekli değildir.
- ya da polikatyonlar (1 ug / ml poli-L-lisin ya da 5 ug / ml polybrene), ya da 6 ul / ml transdüksiyon reaktifi (: AV iletim verimliliğini artırmak için hücre yüzeyine bağlanma AV kolaylaştıran aşağıdaki reaktiflerin birini kullanarak ör ViraDuctin) ya da 20 ul / ml transdüksiyon arttırıcı (ör ibiBoost).
- AV olmadan biri için orta değiştirdikten sonra, nemlendirilmiş CO2 kuluçka makinesinde, 4 gün süre ile kültüre hücreleri inkübe ve ters flüoresan mikroskop kullanılarak GFP tanımı seviyesini değerlendirmek.
- AV-transduced kültürlerde hücre göçü değerlendirmek için karalama yara iyileşmesi tahlil kullanın. multiwell oda slaytlar hücreleri büyümek. 200 ul pi düz bir doğrusal hareket hücreleri kazıyarak bir tek tabaka yaraları yapmakPette ucu. yaralama sonra, müstakil hücreleri çıkarmak için taze bir orta değiştirmek.
- 4X büyütme ters bir mikroskop bağlı bir dijital kamera ile her gün yaraları fotoğraf. şifa tamamlandığında zaman kaydetmek (yara kenarları tüm yara boyunca temas).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu kornea organ kültürlerinde, diyabetik belirteçleri (örneğin, bazal membran proteinleri ve integrin α3β1), normal ve diyabetik kornea ile yara iyileşmesi ifadesindeki farklar korunmuş olduğu daha önce gösterilmiştir. Bu kültür sistemi gen diyabet değiştirilmiş belirteçler, c-Met, MMP-10 seviyelerini normale döndürme amaçlı tedavisi ve katepsin F tabi tutuldu
Bütün kornea epitel MMP-10 veya katepsin F (ayrı ayrı veya birlikte) AV-met, ya da AV-shRNA ile transduced edildiğinde, epitel yara iyileşmesi çok daha hızlı tamamlandı (p <eşleştirilmiş Student t testi ile 0.03 ile karşılaştırıldığında aynı vericilerden 16,17 AV-vektör transduced adam kornealar daha AV-vektör). AV-c-met ölçüde normal kornealardakinden iyileşmesi farklı değildi yarısı tarafından şifa zaman (figu azaltılmış) 1 yeniden. AV-shM10 ve AV-shCF küçük bir etkisi vardı. Ancak, AV-shM10 ve AV-shCF (Combo) AV-met bir arada tamamen epitel şifa kez (Şekil 1) normalleştirme güçlü etkisi yarattı. Iyileşme süresi bu azalma diyabetik (bazal membran ve integrin) normalize desenleri eşliğinde ve diyabetik kornealar 8,16,17 hücre belirteçleri kök edildi.
Epitel kök hücreler katılımcıları 4 şifa büyük yara vardır. Bu nedenle, biz kök hücre bölmesini hedefleyen limbal gen tedavisi, diyabetik kornealar için yararlı olacağını inceledik. Bu amaçla, diyabetik kornealar sadece limbal parçaları AV-met veya Combo ve büyük ile kalıt, 8.5 mm yaralar oluşturuldu. AV-c-met transduced korneanın önemli ölçüde daha hızlı iyileşti (p <eşleştirilmiş Student t testi ile 0.001) AV-vektör adam kornealar transduse daha (Şekure 2). Birleşik tedavi aynı sonuç 18 ile sonuçlanmıştır. Gen terapisi, bir integrin α3β1 ve taban membran bileşeni, nidojen 1 (Şekil 3, sol kolon, Birleşik) halinde diyabet bastırılan belirteçleri ekspresyonunu artırmıştır. Önemlisi, bütün kornea iletimi 8,17 gibi, AV-met veya Combo ile ya limbal gen terapisi AV-vektör transduced kornealar ile karşılaştırıldığında, 15 K ve ΔNp63α dahil varsayılan LESC belirteçleri belirgin artış ifade açtı (Şekil 3 , sağ sütunlar, hem c-met ve Combo). Bu veriler diyabetik kornealar gen terapisi üzerine hızlandırılmış yara iyileşmesi kök hücre normalleşme rolünü desteklenen ve diyabetik kornea hastalıklarının tedavisinde bizim yaklaşımın uygulanabilirliğini göstermektedir.
Önümüzdeki kültürlü LESC zenginleştirilmiş limbal epitel hücreleri üzerinde gen terapisi etkisini incelemek başladı. kültürlerNormal ve diabetik limbal epitel hücrelerinin kurulmuş ve varsayılan LESC belirteçleri için boyandı. Birçok hücre lekeli pozitif (Şekil 4). Diyabetik kültürlerde boyama yoğunluğu ex vivo, normal vs diyabetik kornealar 8 duruma çok benzer, normal kültürlerde (K15 Şekil 4'te örnek olarak gösterilir), daha tutarlı zayıftı. Bu deneyler, bir gen tedavisi için uygun olarak elde hücre kültürleri doğrulandı.
Telomeraz ölümsüzleştirilmiş korneal epitelyal hücre hattı ile hazırlık deneyleri (23) (veriler burada gösterilmemiştir) hücreleri kolayca kullanılabilir AV yapılan tarafından aktarılacak olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, birincil limbal kültürleri transdüksiyon protokolünün optimizasyonuna gerektiren çok daha hassas bir viral yük ve / veya nakil reaktifi kanıtladı. tarafından kültüre limbal hücre iletimiYüksek MOI (>% 80 hücrelerinde GFP) de transdüksiyon, oldukça yüksek bir seviyesi ile sonuçlanan, AV-GFP (Şekil 5) enfeksiyon çokluğu (aralık 30-300 PFU / hücre MOI) bağlıydı. Ancak, daha yüksek İçişleri Bakanlığı iletimi 3-4 gün (Şekil 6) sonra çizik yaralarına hücre ölümü ya da ağır engelli hücre göçü neden de zehirli idi. Alt MOI (10-30 PFU / hücre), daha az üretilen AV transdüksiyonu ya da sitotoksik etkisi ancak GFP ifade eden hücrelerin (% 5-15) bir azalma ile sonuçlandığı da.
Biz bundan sonra, genellikle hücre yüzeyine bağlanma AV kolaylaştıran transdüksiyon arttırıcı reaktifler kullanılarak hücre canlılığı ödün vermeden transdüksiyon verimliliği artırmak için çalışmıştır. Onlar İçişleri Bakanlığı 10-30 de AV limbal epitel hücre iletiminde farklı etkinlik gelişmeler göstermiştir. Her iki polikatyonlar, poli-L-lizin ve polibren, toksik-olmayan ve etkiliGFP-pozitif hücrelerin sayısı 3-4 kat artış ile sonuçlanan (Şekil 7, üst satır). ibiBoost de etkili ama biraz toksiktir ve ViraDuctin (Şekil 7, alt sıra) etkisiz ve oldukça zehirli oldu. Bu nedenle, polikatyonlar AV iletimi üzerine faiz ifade geni artırmak için güvenli ve verimli bir şekilde sunmak ve gen ifadesi için kullanılması gereken ve şifa deneyleri yara.
Şekil 1: c-Met geni, transdüksiyon süresini önemli ölçüde (ortalama ± SEM) iyileşme korneal epitelyal yara düşmesine yol açar. Ayrıca, MMP-10 ve katepsin F genlerine AV Barınma c-met gen ve shRNAs ile birlikte gen terapisi (Combo) tamamen epitel yara iyileşme süresini normalleştirir. Önem (p değerleri) respectiv ile karşılaştırıldığında eşleştirilmiş Student t testi ile kurulan e vektör tedaviler. Barlar ortalamanın standart hatasını temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Diyabetik kornealar bir çift 8.5 mm epitel yaraların iyileşmesi. Üst satır, vektör transduced kornea; iyileşmesi 8 gün içinde tamamlanır. Alt sıra, AV-c-met adam kornea transduse; iyileşmesi 5 gün içinde tamamlanır. Oklar yara (W) kenar gösterir. *, Örümcek şeklindeki apoptosed stromal keratositlerde ile (aynı zamanda içerlek gibi yüksek büyütme gösterilen) olmayan iyileşmiş parçası. epitel tabakası bunların üzerine büyür kadar onlar görebilir. Çubuk = 50 um. Faz kontrast. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: limbal gen tedavisi sonra çeşitli belirteçler için diyabetik kornea kesitlerinin immunosteyn. AV-c-met ve açılan tedavileri iki diabetik markörler (integrin α3β1 ve nidojen-1) ve varsayımsal kök hücre belirteçleri (K15 ve ΔNp63α) bariz bir şekilde artmış limbal boyama ile sonuçlanır. nidojen 1 panellerde Oklar kornea epitel bazal membran işaretleyin. Çubuk = 30 um. E, epitelyum; s, stroma. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Bir varsayımsal LESC markör 15 K için birincil limbal epitel kültürlerin immünositokimyasal leke. Üst satır, normal kültür; En hücreler shoK15 W güçlü bir boyama. Alt sıra, diyabetik kültür; Birçok hücre zayıf leke bırakmazlar. Doğru paneller DAPI nükleer counterstaining ile sunulmaktadır. Normal ve diyabetik hücreler aynı pozlama süresi ile fotoğrafları çekildi. Bar = 20 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: transdüksiyona limbal epitel hücrelerinde GFP ekspresyon seviyesi, AV-GFP MOI bağlıdır: (a) 30 PFU / hücre; (B) 120 pfu / hücre; Transdüksiyon 3 günlük (c) 300 PFU / hücre. Canlı hücrelerin fotoğrafları gösterilmektedir. Bar = 300 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6: Hücre göçü olumsuz sıfırdan yara testi ile ortaya çıktığı gibi AV konsantrasyonunun arttırılması etkilenir: (a) kontrolü; (B) 20 PFU / hücre; (C) 80 PFU / hücre; (D) 120 PFU / hücre. Canlı hücrelerin fotoğrafları gösterilmektedir. Bar = 500 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 7: 30 pfu / hücre AV-GFP ile dönüştürülmüş Limbal epitel hücreleri. (A) kontrolü; (B) poli-L-lisin; (C, d) transdüksiyon reaktifi; iletimi 5 gün. İletimi reaktif cHücre yuvarlama ve ölüm (d, faz kontrast) giden önemli bir sitotoksik etki aused. Canlı hücrelerin fotoğrafları gösterilmektedir. Bar = 400 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kornea bağlı gen verici, hem de etkinliği ve yan etkilerin değerlendirilmesi kolay yüzey konumuna gen terapisi için ideal bir doku gibi görünmektedir. Ancak, bu güçlü bir yaklaşım klinik çevirisi genetik kornea hastalıklarının nedenleri ve gen tedavisi hedefleri 24 kıt bilgilere hala yavaş. Korneal değişiklikler de dahil olmak üzere Diyabetik komplikasyonlar metabolik belleğe 9 çevirir doğada, büyük ölçüde epigenetik olabilir. Bu nedenle, diyabet dokular ve hücreler, ex vivo olarak kendi anormallikleri korunması ve organ ve doku kültüründe incelenebilir. Ayrıca, şeker hastalığı gen tedavisi ile düzeltilebilir gen ekspresyon düzeyleri ve desen belirli değişikliklere neden olur. Biz tarafından normalleştirmek için insan kornea organı kültürleri 7,8 kök hücre bölmesi 5,6,8 dahil diyabetik kornea epitelinde değişmiş birçok belirteç tespit ve kullanmışGen terapisi işaretleyici ifade ve diyabetik kornea tehlikeye epitel yara iyileşmesi.
Nedeniyle güçlü transgen ekspresyonu, non-entegre doğa ve adeno-ilişkili virüs (AAV) 25 daha üstün nitelikleri epitel hücreleri için olan seçicilik gen verici vasıta olarak AV etti. Kornea organ kültürleri AV iletimi birçok kritik adımlar vardır. korneaları depolama sırasında meydana epitel kaybını en aza indirmek için, 48 saat postmortem içinde laboratuvara teslim edilmelidir. Viral alımını artırmak için, transdüksiyon 21 boyunca sildenafil gibi kaveolanın taşıma takviye, eklenmesi önemlidir. Protein ifadesi üzerindeki transdüksiyon etkisi doğrularken özgü kök hücre belirteçleri kesin tespit edilmemiş gibi birçok belirteçlerin kullanımı (Şekil 3) önerilir. epitel yaralar yaparken, che kullanmak için bir zorunluluk olduğunumanuel kazıma sırasında dekolmanı ile sonuçlanan diyabetik epitel bazal membran kırılganlık nedeniyle mical debridman. Epitel (Şekil 2) üzerlerinde regrows zaman iyileşme sürecinin dikkatli bir günlük izleme gibi görünümünden ölü subepitelyal keratositlerin kaybolması olarak şifa objektif kriterler ile ihtiyaç vardır. Birincil limbal hücrelere bir AV ve / veya GFP toksisite için, örneğin polikatyonlar gibi toksik olmayan transdüksiyon takviye kullanılarak, aynı zamanda, viral dozunu önemli nedeni, son olarak, etkili ve güvenli bir transdüksiyonunu sağlamak için (Şekil 5 - 7).
Gen terapi sistemi, hayvan organ kültür kornealar kullanılacak şekilde kolaylıkla modifiye edilebilir. Bunlar düzenli aralıklarla miktarlarda elde edilebilir, insan çok daha ucuzdur ve yara iyileşmesi-modüle edici ilaçlar, örneğin, tarama için uygun olabilir. Ancak, insan korneası için potansiyel daha geniş olanaklar sunmaktadırreaktifler, özellikle antikorların bolluğu nedeniyle çalışma. diabetik olmayan hayvan kornea ilaç taraması durumunda, debridman mekanik yapılabilir. Belirli bir işaretleyici için bir antikor bazı insan kornealar iyi işe yaramazsa, bireysel değişkenlik ve / veya hastalık süresi veya şiddeti nedeniyle olabilir. Bu durumda, diğer işaretleyiciler incelenmesi tavsiye edilebilir. Hücreleri çıkarmak için, n-heptanol kabiliyeti önemli ölçüde depolama sırasında muhtemelen oksidasyon, zamanla azalabilir. Bu durumda, yeni, daha önce açılmamış, şişe kullanılması gerekebilir. Pahalı insan kornealar ile çalışıyorsanız, debridman ikinci tur denenebilir. Sildenafil, sulu çözeltiler içinde kısa bir yarı-ömrü vardır; Bu nedenle, taze bir kornea transdüksiyon gerçekleştirilir her hazırlanmalıdır. vericinin yaşı bağlı olabilir limbal hücrelerin kültürlenmesi başarısı; genç vericilerden hücreler genellikle daha iyi büyür. Tek bir gen terapi maddesi, bir anlaml ortaya olmayabilirIcanT etkisi; Bu durumda, bu tür maddelerin bir kombinasyonu 17 uygun olabilir. Birincil kornea hücreler toksisite belirtileri varsa, viral ve polikatyon (örneğin, poli-L-lizin) alt önemlidir etkin iletimi korurken toksik etkisini en aza indirmek için dozlar.
Diyabetik organ kültürleri hastalık ve değişmiş gen ifadesinin birçok işaret yeniden rağmen, Denerve ve yara iyileşmesini etkileyen ve kök hücreler olabilir bağışıklık hücrelerinin kaynağı yoksundur. hayvanların insan hastalık belirtileri tam spektrum çoğaltmak olmamasına rağmen bu bağlamda, hayvan modelleri, bazı avantajlar sunabilir. Diğer gen tedavisi hedef etkin diyabet korneası normalize olduğu bulunmaktadır. Bu tür hedeflerin bir örneği özellikle mikroRNA, mir-146a veya mir-424 23 olabilir. Belirli microRNA inhibisyonu ile birlikte kullanıldığında, hedef geni modifikasyonları kombinasyonları ve potansiyel olarak daha kuvvetli bir faydalı bir etki yaratabilir. AnothER sınırlama fazla virüs alımını sağlamak için (göz damlası şeklinde, örneğin, maddenin) topik olarak tatbik AV korneanın nispeten uzun kuluçka gerekliliğini içerir. Göz kapaklarını kurdele inkübasyon uzatılmasında yardımcı olabilir ancak bu, klinikte bir sorun teşkil edebilir. Viral çözeltide sildenafilin düşük konsantrasyonda kullanılması AV alımını hızlandırabilir. AV dönüşüm-AV-bazlı gen terapisinin tedavi edici potansiyelini sınırlamaktadır olabilir, geçicidir. Diyabetik yara iyileşme yavaşlama düzeltmek için yeterince uzun sürer, ancak AAV esaslı gen terapisi 24 tarafından sağlanan gibi, daha uzun süreli bir etkiye gerektirebilir epitel kök hücrelerin normalleşme sürdürmüştür. Immünojenite erken AV vektörleri ciddi bir dezavantajı olduğu belirtilmelidir. Ancak, "yüreksiz" virüsler dahil olmak üzere yeni nesil rekombinant AV, bu yan etkinin büyük ölçüde ücretsiz güçlü Alan Çevirisi olma umutlarını artırarakonal gen tedavisi araçları 26.
16,17,21 yara iyileşmesi için önemli olabilir, çeşitli yollar küçük molekül modülatörleri, 27-30 deneysel modellerde ve klinikte kullanılmaktadır. Ancak, belirli bir hücre tipi hedefleyen değil, farklı hücrelerde farklı etkilere sahip olabilir ve sadece diyabetik kornea hastalığının 31,32 bazı yönleri üzerinde hareket edebilir. Gen terapisi gen aşırı ifadesi (Cı-met) ve susturma (MMP-10 ve katepsin K) her ikisini de kullanarak epitel hücrelerini transduse Bu çalışma gerçekleştirilebilir spesifik hücreler, istenen bir doğrultuda, gen ekspresyonunu değiştirmek için bir olasılık sunar. Bu yaklaşım, aynı zamanda, bir tek ya da bir arada, 5,6 özel hastalık markeri olan genlerin ekspresyonunu modüle sağlar. Deneylerimiz beklendiği gibi daha farklı gen sentezleme modülatörlerinin barındıran üç AVS kombinasyon halinde, üç gen etkili olduğu gösterilmiştir, veTedavi her AV tek başına 17 kullanıldığı zaman daha etkili oldu.
inatçı epitel defekti veya vitrektomi veya lazer fotokoagülasyon üzerine eksik epitel iyileşmesi ile şiddetli diyabetik keratopatili olarak, işlevsiz limbal kök hücre yedek gen terapisi için bir alternatif olabilir. Bu gibi durumlarda, in vitro olarak gen tedavisi üzerine kültürlenmiş ve genişletilmiş limbal epitel hücreleri, hastalıklı kornea transplante edilebilir. Bizim verilerimiz diyabetik kornealar kültürlerinde limbal hücrelerin gen tedavisi için onlara iyi hedefler yapma ex vivo kornealar olarak kök hücre işaretleyici ifadesinde benzer farklılıklar göstermektedir olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, bu tedavi, kullanılan virüs yükü ve transfeksiyon reaktifi bu hücrelerin yüksek hassasiyet için, optimize edilmesi gerekmektedir. Biz katyonik transfeksiyon ayıraçları kültürlü diyabetik kornea epitel ilgi bir genin yüksek ifadesi ile verimli ve güvenli teslimat sağladığını göstermek başardık. These sonuçlar şiddetli diyabetik keratopatinin durumlarda gelecekteki nakil amaçlarıyla LESC genişletilmiş in vitro başarılı gen tedavisi için önünü açabilir. Kalıtsal ve edinsel LESC eksikliği de diyabet 33,34 benzer kornea sinirlerin azalma ile ilişkili olduğundan, hastalıklı kornealar üzerine sağlıklı LESC zenginleştirilmiş kültürlerin nakli potansiyel olarak diyabetik kornea nöropati hafifletebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| minimum essential medium | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Optisol-GS | Bausch & Lomb | 50006-OPT | |
| ABAM antibiotic-antimycotic mixture | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| calf skin collagen | Sigma-Aldrich | C9791 | |
| agar, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| n-heptanol | Sigma-Aldrich | 72954-5ML-F | |
| O.C.T. compound | VWR International | 25608-930 | |
| Dispase II | Roche Applied Science | 4942078001 | |
| keratinocyte serum-free medium (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005042 | |
| EpiLife medium with calcium | Thermo Fisher Scientific | MEPI500CA | |
| N2 medium supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| B27 medium supplement, 50x | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| human keratinocyte growth supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | S-001-5 | |
| trypsin 0.25% - EDTA 0.02% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| trypsin 0.25% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15050065 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| insulin-transferrin-selenite supplement (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| antibody to keratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
| antibody to keratin 15 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47697 | |
| antibody to keratin 17 | Santa Cruz Biotechnology | SC-58726 | |
| antibody to ΔNp63α | Santa Cruz Biotechnology | sc-8609 | |
| antibody to PAX6 | BioLegend | PRB-278P-100 | |
| antibody to nidogen-1 | R&D Systems | MAB2570 | |
| antibody to integrin α3β1 | EMD Millipore | MAB1992 | |
| human fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| human laminin | Sigma-Aldrich | L4445 | |
| human type IV collagen | Sigma-Aldrich | C6745-1ML | |
| adenovirus expressing MMP-10 shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing cathepsin F shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing scrambled shRNA and GFP | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing c-met | OriGene (plasmid) | SC323278 | |
| adenovirus expressing GFP | KeraFAST | FVQ002 | |
| sildenafil citrate, 25 mg | Pfizer | from pharmacy | |
| epidermal growth factor | Thermo Fisher Scientific | PHG0311 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| ViraDuctin | Cell Biolabs | AD-200 | |
| ibiBoost | ibidi, Germany | 50301 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Corning round end spatula | Dow Corning | 3005 | |
| 60 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 174888 | |
| Nunc Lab-Tek II multiwell chamber slides | Sigma-Aldrich | C6807 | |
| 200 μl pipet tips | Bioexpress | P-1233-200 | other suppliers available |
| inverted microscope | Nikon | Diaphot | other suppliers/models available |
| humidified CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370 (Steri-Cycle) | other suppliers/models available |
| fluorescent microscope | Olympus, Japan | BX-40 | other suppliers/models available |
| dissecting stereo microscope | Leica, Germany | S4 E | other suppliers/models available |
References
- Bikbova, G., Oshitari, T., Tawada, A., Yamamoto, S.
- Calvo-Maroto, A. M., Perez-Cambrodí, R. J., Albarán-Diego, C., Pons, A., Cerviño, A. Optical quality of the diabetic eye: a review. Eye (Lond). 28 (11), 1271-1280 (2014).
- Tripathy, K., Chawla, R., Sharma, Y. R., Venkatesh, P., Vohra, R.
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M.
- Saghizadeh, M., et al. Overexpression of matrix metalloproteinase-10 and matrix metalloproteinase-3 in human diabetic corneas: a possible mechanism of basement membrane and integrin alterations. Am J Pathol. 158 (2), 723-734 (2001).
- Saghizadeh, M., et al. Proteinase and growth factor alterations revealed by gene microarray analysis of human diabetic corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (10), 3604-3615 (2005).
- Kabosova, A., Kramerov, A. A., Aoki, A. M., Murphy, G., Zieske, J. D., Ljubimov, A. V. Human diabetic corneas preserve wound healing, basement membrane, integrin and MMP-10 differences from normal corneas in organ culture. Exp Eye Res. 77 (2), 211-217 (2003).
- Saghizadeh, M., et al. Alterations of epithelial stem cell marker patterns in human diabetic corneas and effects of c-met gene therapy. Mol Vis. 17, 2177-2190 (2011).
- Kowluru, R. A., Kowluru, A., Mishra, M., Kumar, B. Oxidative stress and epigenetic modifications in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 40-61 (2015).
- Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. J Cell Sci. 111 (Pt 19), 2867-2875 (1998).
- Lu, L., Reinach, P., Kao, W. W.
- Rama, P., et al. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. N Engl J Med. 363 (2), 147-155 (2010).
- Di Girolamo, N., et al. Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea. Stem Cells. 48 (1), 203-225 (2014).
- Amitai-Lange, A., et al. Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
- Di Girolamo, N. Moving epithelia: Tracking the fate of mammalian limbal epithelial stem cells. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 203-225 (2015).
- Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-met gene. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (4), 1970-1980 (2010).
- Saghizadeh, M., et al. Enhanced wound healing, kinase and stem cell marker expression in diabetic organ-cultured human corneas upon MMP-10 and cathepsin F gene silencing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8172-8180 (2013).
- Saghizadeh, M., Dib, C. M., Brunken, W. J., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and stem cell marker patterns in organ-cultured human diabetic corneas by gene therapy of limbal cells. Exp Eye Res. 129 (Dec), 66-73 (2014).
- Hatchell, D. L., et al. Damage to the epithelial basement membrane in the corneas of diabetic rabbits. Arch Ophthalmol. 101 (3), 469-471 (1983).
- Chung, J. H., Kim, W. K., Lee, J. S., Pae, Y. S., Kim, H. J. Effect of topical Na-hyaluronan on hemidesmosome formation in n-heptanol-induced corneal injury. Ophthalmic Res. 30 (2), 96-100 (1998).
- Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Res Bull. 81 (2-3), 262-272 (2010).
- Sareen, D., et al. Differentiation of human limbal-derived induced pluripotent stem cells into limbal-like epithelium. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1002-1012 (2014).
- Funari, V. A., et al. Differentially expressed wound healing-related microRNAs in the human diabetic cornea. PLoS One. 8 (12), e84425 (2013).
- Mohan, R. R., Rodier, J. T., Sharma, A. Corneal gene therapy: basic science and translational perspective. Ocul Surf. 11 (3), 150-164 (2013).
- Liu, J., et al. Different tropism of adenoviruses and adeno-associated viruses to corneal cells: implications for corneal gene therapy. Mol Vis. 14, 2087-2096 (2008).
- Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4 (5), 346-358 (2003).
- Sharma, G. D., He, J., Bazan, H. E. P38 and ERK1/2 coordinate cellular migration and proliferation in epithelial wound healing: evidence of cross-talk activation between MAP kinase cascades. J Biol Chem. 278 (24), 21989-21997 (2003).
- Saika, S., et al. Role of p38 MAP kinase in regulation of cell migration and proliferation in healing corneal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (1), 100-109 (2004).
- Xu, K. P., Li, Y., Ljubimov, A. V., Yu, F. S. High glucose suppresses epidermal growth factor receptor/phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway and attenuates corneal epithelial wound healing. Diabetes. 58 (5), 1077-1085 (2009).
- Xu, K., Yu, F. S. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3301-3308 (2011).
- Takamura, Y., et al. Aldose reductase inhibitor counteracts the enhanced expression of matrix metalloproteinase-10 and improves corneal wound healing in galactose-fed rats. Mol Vis. 19, 2477-2486 (2013).
- Byun, Y. S., Kang, B., Yoo, Y. S., Joo, C. K. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves corneal epithelial innervation and wound healing in diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1948-1955 (2015).
- Deng, S. X., et al. Characterization of limbal stem cell deficiency by in vivo laser scanning confocal microscopy: a microstructural approach. Arch Ophthalmol. 130 (4), 440-445 (2012).
- Lagali, N., et al. In vivo morphology of the limbal palisades of Vogt correlates with progressive stem cell deficiency in aniridia-related keratopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5333-5342 (2013).
