Abstract
O objetivo deste protocolo é descrever as alterações moleculares em córneas diabéticos humanos e demonstrar como eles podem ser aliviados pela terapia de gene adenoviral em córneas de órgãos-cultivadas. A doença da córnea do diabético é uma complicação da diabetes com alterações frequentes de nervos da córnea e cicatrização epitelial. Nós também documentaram expressão significativamente alterada de vários marcadores de células-tronco epiteliais putativos em córneas diabéticos humanos. Para atenuar estas alterações, a terapia de gene adenoviral foi implementado com sucesso utilizando a regulação positiva da expressão do proto-oncogene c-met e / ou a regulação negativa da matriz proteinases metaloproteinase-10 (MMP-10) e catepsina F. Esta terapia acelerou a cicatrização em córneas diabéticos mesmo quando apenas o compartimento de células-tronco do limbo foi transduzida. Os melhores resultados foram obtidos com o tratamento combinado. Para possível transplante de paciente de células-tronco normalizados, um exemplo também é apresentada do optimizatina transdução de gene nas culturas enriquecidas com células-tronco usando potenciadores policati�icos. Esta abordagem pode ser útil não só para os genes seleccionados, mas também para os outros mediadores de cicatrização do epitélio da córnea e a função das células-tronco.
Introduction
A doença da córnea diabética resulta principalmente no epitélio degenerativa (Ceratopatia) e nervosas mudanças (neuropatia). Ele é muitas vezes manifestada pelas anormalidades de cicatrização de feridas epiteliais e redução dos nervos da córnea 1-4. Estima-se que 60-70% diabéticos têm vários problemas de córnea 1,3. Os nossos estudos identificaram várias proteínas marcadoras com expressão alterada em córneas diabéticos humanos, incluindo a regulação negativa de (receptor do factor de crescimento de hepatócitos) c-met proto-oncogene e a regulação positiva de metaloproteinase de matriz-10 (MMP-10) e a catepsina F 5, 6. também têm documentado diminuição da expressão de vários marcadores de células estaminais epiteliais córneas putativos nos diabéticos humanos significativamente.
Nos estudos anteriores, nós desenvolvemos uma terapia de gene adenoviral à base para normalizar os níveis de marcadores alterou-diabetes usando sistema de cultura de órgãos humanos diabéticos da córnea, que mostra cicatrização lenta, diabéticaalterações marcador, e a redução da expressão do marcador de células semelhantes às ex vivo córneas 7,8 haste. Esta persistência de alterações parece ser devida à existência de memória metabólica epigenética 9. Este sistema de cultura foi ainda utilizado para a terapia genética. Os alvos para a presente terapia foram escolhidos a partir de marcadores, quer com uma expressão reduzida em córneas diabéticos (c-met proto-oncogene), ou o aumento da expressão (MMP-10 e a catepsina F).
A terapia adenoviral (AV) foi usada em todo o córneas de órgãos-cultivadas ou apenas o compartimento de limbo periférica córneo. Este compartimento abriga células-tronco epiteliais que renovar o epitélio corneano e participar activamente na cicatrização de feridas 4,10-15. Aqui, os protocolos são fornecidos para a cultura normal e diabética humana córnea órgão, cicatrização de feridas epiteliais, o isolamento e caracterização das culturas de células do limbo enriquecida em células estaminais e células adenoviral e transdução da córnea. Nossoresultados mostram a viabilidade desta terapia para normalizar a expressão do marcador e cicatrização de feridas em diabéticos córneas para transplante possível futuro. Eles também sugerem que a terapia de combinação é a maneira mais eficaz para restaurar o padrão de marcadores normal e cicatrização do epitélio da córnea diabética 16-18.
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Protocol
Doença National Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA) fornecido consentidos post mortem saudáveis e diabéticos olhos humanos e córneas. protocolo de recolha de tecido humano do NDRI é aprovado pela comissão de gestão e sujeitas a Institutos Nacionais de Saúde supervisão. Esta pesquisa foi conduzida sob o Cedars-Sinai Medical Center Institutional Review Board aprovado (IRB) protocolo isenta EX-1055. Colaborando cirurgiões da córnea, Drs. E. Maguen e Y. Rabinowitz, fornecido jantes córneo de descarte para o isolamento de culturas epiteliais da córnea enriquecida com células-tronco. Esta pesquisa foi conduzida no âmbito do protocolo IRB aprovado Pro00019393.
1. Cultura de Órgãos de córnea humana
Nota: córneas normais e diabéticos ou olhos inteiros são recebidos em meio de armazenamento corneal refrigerados (por exemplo, Optisol GS) no prazo de 48 horas após a morte do fornecedor nacional NDRI.
- Retire as córneas de recipiente de armazenamento com uma pinça e lavá-los duas vezes in a (ABAM) mistura de antibiótico-antimicótico. Em caso de olhos inteiros, cortar as córneas para fora dos globos com tesoura curva. Deixe pelo menos um aro conjuntival 5 mm e também lavar as córneas em ABAM.
- Preparar a mistura a ser colocado na concavidade da córnea. Consiste em meio isento de soro mínimo essencial (MEM) contendo ABAM, 1 mg / ml de vitelo pele colagénio (feita a partir de uma solução estoque de 10 mg / ml em ácido 0,1 N acético), 1% de ágar, e insulina-transferrina-selenite complementar 7.
- Microondas esta mistura até à ebulição durante a esterilização e de dissolução do agar. Pode demorar até 1 minuto para que tudo se dissolver. Deixe a tampa do tubo parcialmente aberto porque a mistura transborda facilmente quando ferve. Por esta razão, vários ciclos de ebulição pode ser necessária, para cada 10-15 seg. Arrefecer a mistura a 37-39 ° C.
- Coloque as córneas lado epitelial para baixo em 60 mm pratos estéreis. Encher a concavidade da córnea com cerca de 0,5 ml da mistura descrita no ponto 1.2. omistura solidifica sobre as córneas dentro de 2 min.
- Coloque as córneas lado de agar para baixo em pratos estéreis de 60 mm e adicionar o meio completo contendo MEM com ABAM, e insulina-transferrina-selenite suplemento 7 (37 ° C) para manter o seu nível de aproximadamente no limbo para a cultura de interface ar-líquido. O volume médio é de 7-8 ml por placa.
- Colocar as cápsulas com as córneas em uma incubadora de CO 2 a 5% humidificada com uma panela de água (desta forma, o nível de humidade é mantida a ou acima de 95%) a 35 ° C (temperatura normal da córnea). Adicionar 100 � de meio (duas gotas) por dia no epitélio para umedecer as córneas.
- Monitorar a morfologia da córnea e da viabilidade das células epiteliais microscopicamente sob luz transmitida através de um microscópio padrão com um objetivo 4X. Faça isso uma vez por dia.
- Mudar o meio de três em três dias. As córneas podem ser cultivadas por pelo menos três semanas. Para as experiências de terapia genética, as córneas de cultura durante 3-5 dias, em seguida, transduce com genes de interesse (4,1-4,4), deixe por mais 3-5 dias, dependendo do transgene e sujeito ao protocolo de cicatrização de feridas (2,1-2,4).
2. cicatrização do epitélio da ferida
Nota: nas córneas diabéticos, o desbridamento epitelial por raspagem mecânica não é viável porque a membrana basal epitelial frágil é separado no processo, o que não acontece nas córneas normais. Assim, para manter as córneas normais e diabéticos em condições semelhantes de cicatrização de feridas, a remoção química do epitélio com n-heptanol 19 é usado. Este procedimento remove o epitélio mas deixa para trás uma membrana basal intacto em ambos os córneas normais e diabéticos.
- Para executar o desbridamento epitelial central 20, colocar um disco de papel de filtro de 5 milímetros embebidos em n-heptanol na superfície anterior da córnea central para 75 seg.
- Remover o filtro e lava-se as córneas em meio completo. Preencher a concavidade com 0,5 ml de agar-colágenomistura e da cultura como em 1.4. Após desbridamento, as células epiteliais geralmente morrem e descamam deixando para trás membrana basal microscopicamente intacta 7.
- Use 8,5 mm discos para criar feridas epiteliais maiores nos experimentos apenas com terapia genética limbo. Isso irá garantir o envolvimento de células-tronco do limbo no processo de cura.
- Monitorar a cicatrização da córnea microscopicamente. Fazer fotografias em 4x e 10x todos os dias até que o defeito epitelial é completamente curado. O processo de cura pode tomar a partir de 2 a 15 dias, dependendo do estado (normal ou diabética) e o tamanho da ferida.
Nota: Durante o processo de cura, as células de aranha preto são observados no plano focal superior. Estas células são apoptóticas ceratócitos de estroma que morreram após a remoção do epitélio 4. A cura é considerado completo quando essas células mortas são cobertas pelo epitélio cura e não são mais visíveis (Figura 2, inserção). - após a curaconclusão, cortar as córneas no meio, incorporá-los em composto OCT e processo para imunofluorescência indireta em seções criostato ou Western blot 16,21.
3. Isolamento de células do limbo e manutenção de tronco culturas enriqueceram-Cell
Nota: Preparar a célula primária limbo epitelial haste (LESC) culturas enriquecido a partir das bordas córneo. As jantes provenientes de doadores saudáveis e descartados após transplantes de córnea são recebidas dos cirurgiões que colaboram no meio de armazenamento corneal padrão (por exemplo, Optisol). Caso contrário, as culturas enriquecidas com Lesc Website pode ser obtido a partir das bordas de córneas excisadas inteiros normais e diabéticos ou globos recebido de NDRI no meio de armazenamento corneal.
- Se forem utilizadas as córneas inteiros ou globos, em primeiro lugar isolar as áreas límbicas. Para fazer isso, colocar a córnea em um prato de plástico estéril, com o lado epitelial para cima e remover a área central com uma trépano de 9 mm (faca circular da córnea).Descarte essa parte central. Então extirpar a zona de limbo usando uma trefina 13 mm e descartar a parte conjuntival exterior. células para isolar usar a borda do limbo do bagel-like. Antes de isolamento de células, remover as células endoteliais e aderentes remanescentes da íris a partir do lado interior da córnea de frente para o epitélio de superfície com uma mecha de algodão estéril.
- Isolar folhas de células do limbo usando tratamento dispase. Incubar cada halos com 2,4 U / ml de dispase II em 1,5 de meio isento de soro ml de queratinócitos (KSFM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) a 37 ° C durante 2 h 22.
- Suavemente aliviar a camada de células epiteliais do limbo fora do aro sob um microscópio de dissecação com uma pinça de estéreo e dissociar as células em 1 ml de tripsina a 0,25% - solução de EDTA 0,02% durante 30 min à temperatura ambiente.
- Lavam-se as células em 10 ml de meio (por exemplo, Epilife) e sedimentar-los a 300 xg numa centrifugadora de bancada durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- th Ressuspendae células em meio de cultura: meio com N2, B27 e suplementos de crescimento de queratinócitos humanos, e factor de 10 ng / mL de crescimento epidérmico (EGF).
- Semear as células a 3.000-5.000 células / ml em frascos ou placas de 60 mm revestidas com uma mistura de proteínas de membrana basal humana, incluindo f ibronectina, colagénio tipo IV, laminina e (FCL), a 0,5-1 ug / cm 2, na KSFM médio.
- Cultura das células numa atmosfera humidificada (95% ou mais de humidade) incubador de CO2 a 37 ° C até formarem monocamadas confluentes totalmente. Isso pode demorar 1-2 semanas.
Nota: Regularmente confirmar a identidade da célula por coloração imunocitoquímica positiva para os marcadores Lesc Website putativos incluindo PAX6, queratina (K) 14, K15, K17, e ΔNp63α. Os detalhes de coloração, incluindo os anticorpos primários foram publicados 8,16-18,22. - Para passagem, as células confluentes, tratá-los com uma solução de 1 ml de 0,05% de tripsina (1: diluição da solução a 0,25% 5) durante 10 min a 37 ° C. Adicionar 5 ml tr sojasolução de inibidor ypsin (10 mg / ml) diluído a 1: 4 em meio, e centrifuga-se as células como em 3.5.
- Lava-se a pelete de células em 3 ml de solução de inibidor de tripsina de soja diluída. Placa as células nas FCL-revestido (ver 3.7) pratos ou lâminas de câmara de vidro em 2 x 10 4 células / ml.
4. Transdução adenoviral de córneas Órgão-cultura
Nota: Os adenovírus recombinantes (AV) incluem AV-vector (sem gene inserido), AV-c-met (com o gene de leitura aberta de c-met), AV-shM10 (com shRNA para MMP-10) e AV-SHCF ( com shRNA para catepsina F). Eles são E1 / E3 suprimida-tipo 5 AV expressar genes sob o controle do principal promotor precoce imediato de citomegalovírus. Os vírus AV-c-met são gerados usando vector AV pad / CMV / V5-DEST 16. Os vírus AV-shRNA são personalizados gerada por subclonagem de sequências shRNA junto com o promotor HH1 e sequência tag GFP a partir iLenti-EGFP vetor em uma huma replicação-incompetentes (-E1 / -E3)n Tipo AV 5 genoma usando adeno-4 sistema de expressão 17.
- Transdução de uma córnea de órgãos-cultura de cada par com AV-vector e outra córnea, com um AV expressão gênica-modulação. Utilizar a AV-cMet em 0,8 a 1,25 x 10 8 unidades formadoras de placas (pfu) por córnea em meio de cultura durante 48 horas a 37 ° C mantendo as córneas sob a superfície do meio em cada poço de um prato de 24 poços. Use os vírus AV-shRNA a 1-2 x 10 8 pfu por córnea.
- Use os vírus para a transdução em meio completo suplementado com 75 ug / ml de citrato de sildenafil. Este reagente ativa o transporte caveolin facilitando a absorção viral pelas células epiteliais 21. Devido à curta meia-vida de sildenafil em soluções aquosas, re-adiciona a mesma quantidade ao meio de 4-5 horas mais tarde. O tratamento padrão é de 48 horas.
- Transferir córneas para novos pratos com uma extremidade espátula estéril redonda e cultura no meio sem AV mantendo o nível médio no limbo. Após o suplementoitional 4-8 dias na interface ar-líquido, processo as córneas tratadas com AV para diversas análises e testes para a cicatrização de feridas epiteliais (ver acima). Rotineiramente humedecer as córneas durante a cultura por meio de adição de 100 ul (duas gotas) em cima da córnea.
- Para a transdução de apenas as células do limbo, incubar os vírus com as córneas na interface ar-líquido com um nível médio no limbo, para evitar a transdução do epitélio central.
5. Transdução adenoviral de células cultivadas de limbo
- Manter as culturas LESC enriquecidos em meio contendo 10 ng / ml de EGF (ver 3.5) em placas de plástico revestidas com a mistura de FCL a 0,5 ug / cm2.
- Transduzir células cultivadas que atingiram 70-80% de confluência com o AV albergando o gene da proteína fluorescente verde (GFP-AV) ou shRNA-GFP em uma gama de multiplicidade de infecção mexidos-AV (MOI: 1-300 ufp / célula) , na forma com 2 ng / ml de EGF. Executar a transductioN, durante 4 h a 37 ° C num volume mínimo (0,2 ml) seguido por 20 h em 0,5 ml de meio. O sildenafil activador transporte caveolin não é necessária para a transdução de cultura de células.
- Utilizar um dos seguintes reagentes que facilitam a ligação à superfície da célula AV para melhorar a eficácia de transdução AV: ou policatiões (1 ug / ml de poli-L-lisina ou 5 ug / ml de polibreno), ou 6 ul / ml de reagente de transdução ( por exemplo, ViraDuctin), ou 20 ul / ml de intensificador de transdução (por exemplo, ibiBoost).
- Após substituição do meio por um sem o AV, incubar as células cultivadas durante 4 dias, na humidificada incubadora de CO 2 e avaliar o nível de expressão da GFP utilizando um microscópio de fluorescência invertido.
- Utilizar o ensaio de cicatrização da ferida zero para avaliar a migração celular nas culturas transduzidas-AV. Crescer as células nas lâminas de câmara de múltiplos poços. Faça as feridas em uma monocamada de células riscar em um movimento linear em linha reta com um pi 200 ulponta pette. Após o ferimento, mudar o meio para uma fresca para remover as células destacadas.
- Fotografar as feridas a cada dia com uma câmera digital ligada a um microscópio invertido em uma ampliação de 4X. Gravar o momento em que a cura é completa (os bordos da ferida entre em contacto ao longo de toda a ferida).
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Representative Results
Nós mostramos anteriormente que nas culturas de órgãos da córnea, as diferenças na expressão de marcadores diabéticos (por exemplo, proteínas de membrana de base e α3β1 integrina) e cicatrização de feridas entre as córneas normais e diabéticos são preservadas. Este sistema de cultura foi submetido à terapia genética destinada a normalizar os níveis de marcadores alterou-diabetes, c-Met, MMP-10, e catepsina F.
Quando todo o epitélio da córnea foi transduzida com o AV-cMet, ou AV-shRNA para MMP-10 ou a catepsina F (separadamente ou em combinação), o epitélio a cicatrização de feridas foi completada significativamente mais rápido (P <0,03 pelo teste t pareado comparação com AV-vector) do que nos outros córneas AV transduzidas por vectores dos mesmos doadores 16,17. O AV-cMet reduziu o tempo de cura pela metade, que não diferiu significativamente da cura das córneas normais (Figure 1). O AV-shM10 e AV-SHCF teve efeito menor. No entanto, uma combinação de AV-cMet com o AV-shM10 e AV-SHCF (Combo) produziu o efeito mais forte normalizar completamente os tempos de cicatrização do epitélio (Figura 1). Esta redução no tempo de cicatrização foi acompanhado dos padrões normalizados de diabético (membrana basal e integrinas) e marcadores de células estaminais nas córneas diabéticos 8,16,17.
As células-tronco epiteliais são a principal ferida participantes 4 de cura. Portanto, nós examinamos se a terapia genética limbo segmentação compartimento da célula a haste seria benéfico para as córneas diabéticos. Para esse efeito, apenas as partes do limbo das córneas diabéticos foram transduzidas pelo AV-cMet ou combinação e grande, 8,5 mm feridas foram criados. O AV-CMET córneas transduzidas curado significativamente mais rápido (P <0,001 por pareado t de Student) do que o AV-vector transduzidas companheiros de córneas (Figure 2). O tratamento de combinação resultou em o mesmo resultado 18. A terapia genética aumentou a expressão de marcadores de supressão de diabetes, tais como α3β1 integrina e o componente da membrana basal nidog�io-1 (Figura 3, colunas restantes, de combinação). É importante notar, como em toda a transdução da córnea 8,17, a terapia genética de limbo com quer o AV-cMet ou combinação conduziu a um aumento da expressão marcadamente de marcadores Lesc Website putativos incluindo K15 e ΔNp63α, comparado com as córneas de AV-vector transduzidas (Figura 3 , colunas da direita, tanto-c-met e Combo). Estes dados suportado a função de normalização de células estaminais na cicatrização de feridas acelerada mediante a terapia genética de córneas diabéticos e mostram a viabilidade da nossa abordagem para o tratamento de doenças da córnea diabética.
A seguir, começou a examinar os efeitos de terapia gênica em células epiteliais do limbo enriquecido com Lesc Website cultivadas. as culturasde células epiteliais do limbo normais e diabéticos foram estabelecidos e corados para marcadores Lesc Website putativos. Muitas células coradas positiva (Figura 4). A intensidade da coloração nas culturas diabéticos foi consistentemente mais fraca do que nas culturas normais (K15 mostrados como exemplo na Figura 4), o que era muito semelhante à situação na diabéticos vs. normais ex vivo córneas 8. Estas experiências validadas as culturas de células obtidos como adequados para a terapia génica.
Experiências preliminares com uma linha celular epitelial da córnea imortalizada-telomerase (ver 23) mostrou que as células foram facilmente transduzidas pelas construções AV disponíveis (dados não apresentados aqui). No entanto, as culturas primárias do limbo provou ser muito mais sensível à carga viral e / ou o reagente de transdução, necessitando de optimização do protocolo de transdução. A transdução de células do limbo cultivadas pelaAV-GFP (Figura 5) dependia da multiplicidade de infecção (MOI; gama de 30-300 pfu / célula), resultando em um nível bastante elevado de transdução de alto MOI (expressão da GFP em células de> 80%). No entanto, a maior MOI foram também tóxico, causando a morte celular ou migração celular severamente prejudicada nas feridas de raspar após 3-4 dias de transdução (Figura 6). No MOI inferior (10-30 pfu / célula), a transdução AV produziu menos ou nenhum efeito citotóxico, mas resultou numa diminuição do número de células que expressam GFP (5-15%).
Nós próxima tentativa para aumentar a eficácia de transdução sem comprometer a viabilidade das células por utilização de reagentes que aumentam a transdução que permitem, geralmente, a ligação à superfície da célula AV. Eles mostraram diferentes melhorias de eficiência na transdução de células epiteliais do limbo pela AV na MOI 10-30. Ambos os policatiões, poli-L-lisina, e polibreno, eram não-tóxicos e os mais eficazesresultando em aumento de 3-4 vezes no número de células positivas para GFP (Figura 7, linha superior). ibiBoost também era eficaz, mas ligeiramente tóxico, e ViraDuctin foi ineficaz e bastante tóxicas (Figura 7, linha inferior). Portanto, oferecem policatiões maneira segura e eficaz para aumentar a expressão do gene de interesse sobre a transdução de AV e deve ser usado para a expressão do gene e de feridas experiências de cura.
Figura 1: transdução do gene c-Met leva à diminuição da ferida significativamente epitelial da córnea tempo (média ± SEM) de cura. Além disso, a terapia genética combinada (Combo) com o gene AV abrigar c-met e shRNAs de genes de MMP-10 e catepsina F normaliza completamente o tempo epitelial cicatrização de feridas. Significância (valores de p) foi estabelecido pelo emparelhado teste t de Student na comparação com respectiv tratamentos vetor e. As barras representam o erro padrão da média. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A cicatrização de feridas epiteliais 8,5 mm em um par de córneas diabéticos. Top de linha, córnea transduzidas por vetores; a cura é completa em 8 dias. linha de fundo, AV-cMet transduzidas companheiro córnea; a cura está completa em 5 dias. As setas mostram ferida (W) borda. *, Parte não curado (também mostrado em grandes ampliações como inserção), com as ceratócitos de estroma apoptosed em forma de aranha. Eles são visíveis até que a camada epitelial cresce em cima deles. Barra = 50 uM. Contraste de fase. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: imunocoloração das secções da córnea diabéticos para vários marcadores após a terapia genética limbo. Ambos AV-c-met e tratamentos Combo resultar num aumento pronunciado coloração do limbo para os marcadores diabéticos (α3β1 integrina e nidog�io-1) e marcadores de células estaminais putativas (K15 e ΔNp63α). Setas nos painéis nidog�io-1 marcar membrana basal epitelial da córnea. Barra = 30 um. e, epitélio; s, estroma. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: coloração imunocitoquímica de culturas epiteliais do limbo primários para um putativo marcador K15 LESC. Top de linha, a cultura normal; a maioria dos sho célulasforte coloração w para K15. linha de fundo, a cultura diabética; a maioria das células mostrar apenas coloração fraca. Os painéis direitos são apresentados com contracoloração nuclear DAPI. As células normais e diabéticos foram fotografadas com o mesmo tempo de exposição. Bar = 20 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: O nível de GFP-expressão em células epiteliais do limbo transduzidas depende MOI de AV-GFP: (a) de 30 pfu / célula; (B) de 120 PFU / célula; (C) a 300 PFU / célula em 3 dias de transdução. Fotografias de células vivas são mostrados. Bar = 300 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: A migração celular é negativamente afectada pelo aumento da concentração de AV como revelado pelo teste do zero ferida: (a) controle; (B) 20 ufp / célula; (C) de 80 pfu / célula; (D) de 120 PFU / célula. Fotografias de células vivas são mostrados. Bar = 500 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: células epiteliais do limbo transduzidas com AV-GFP em 30 pfu / célula. (A) controle; (B) poli-L-lisina; (C, d) de transdução de reagente; 5 dias após a transdução. Transdução de reagente caused um efeito citotóxico significativo levando a arredondamento celular e morte (d, contraste de fase). Fotografias de células vivas são mostrados. Bar = 400 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A córnea parece ser um tecido ideal para terapia génica devido à sua localização em que a superfície de entrega de genes, bem como a avaliação de eficácia e efeitos secundários, são fáceis. No entanto, uma tradução clínica desta abordagem poderosa ainda é lenta devido à escassa informação sobre as causas genéticas das doenças da córnea e os alvos de terapia genética 24. Complicações diabéticas, incluindo alterações da córnea pode ser em grande parte epigenética na natureza, o que se traduz na memória metabólica 9. Por esta razão, os tecidos e células diabéticos preservar as suas anormalidades ex vivo e pode ser estudado em cultura de órgãos e tecidos. Além disso, a diabetes provoca alterações específicas nos níveis de expressão de genes e padrões que podem ser corrigidos por terapia de genes. Nós identificamos vários marcadores alterados no epitélio corneano do diabético incluindo o 5,6,8 compartimento de células-tronco, e usou as culturas de órgãos da córnea humana 7,8 para normalizar pelaterapia do gene do marcador de expressão e a cicatrização de feridas comprometida epiteliais na córnea diabética.
Nós escolhemos o AV como o veículo de entrega de genes por causa da sua forte expressão do transgene, a sua natureza não-integração, e a sua selectividade para as células epiteliais, que são qualidades superiores àqueles do vírus adeno-associado (AAV) 25. A transdução AV das culturas de órgãos da córnea tem vários passos críticos. As córneas deve ser entregue ao laboratório dentro de 48 horas post-mortem, para minimizar a perda de epitélio que ocorre durante o armazenamento. Para aumentar a absorção virai, é importante adicionar impulsionadores de transporte caveolae, tais como sildenafil, durante 21 transdução. Ao validar o efeito sobre a expressão da proteína de transdução, a utilização de vários marcadores é recomendada (Figura 3), como marcadores de células estaminais específicas não são definitivamente identificada. Ao fazer as feridas epiteliais, existe uma necessidade de usar o chedesbridamento mical devido à fragilidade da membrana basal epitelial diabética resultando em seu afastamento durante a raspagem manual. A monitorização diária cuidadosa do processo de cura é necessária com critérios objectivos de cura, como o desaparecimento de queratinócitos subepiteliais mortas da vista quando o epitélio regrows sobre eles (Figura 2). Finalmente, devido a algum AV e / ou toxicidade GFP para as células do limbo primárias, é importante para reduzir a dose virai, ao mesmo tempo, utilizando impulsionadores de transdução não-tóxicos, tais como policatiões, para assegurar a transdução eficiente e segura (Figuras 5 - 7).
O sistema de terapia de gene pode ser modificado para utilizar os órgãos córneas-cultivadas animais. Eles são muito mais baratos do que humana, pode ser obtido em quantidades numa base regular, e podem ser adequados para o rastreio, por exemplo, de fármacos moduladores da cicatrização de feridas. No entanto, as córneas humanas oferecem possibilidades mais amplas para potencialmenteo estudo devido à abundância de reagentes, especialmente anticorpos. No caso de o rastreio de drogas em córneas de animais não diabéticos, o desbridamento pode ser feito mecanicamente. Se um anticorpo para um determinado marcador não funciona bem em algumas córneas humanas, que pode ser devido à variabilidade individual e / ou a duração da doença ou da gravidade. Neste caso, a examinar outros marcadores podem ser recomendado. A capacidade de n-heptanol para remover as células podem diminuir significativamente com o tempo, possivelmente devido à oxidação durante o armazenamento. Se isto acontecer, um novo, previamente fechada, frasco pode necessitar de ser usado. Se trabalhar com as córneas humanas caros, uma segunda rodada de desbridamento pode ser tentada. Sildenafil tem uma meia-vida curta em soluções aquosas; Por isso, deve ser preparada de fresco cada vez que uma transdução da córnea é realizada. O sucesso da cultura de células do limbo pode depender da idade do dador; as células de doadores mais jovens normalmente crescem melhor. Um único agente de terapia de genes podem não provocar uma signifefeito icant; Neste caso, uma combinação de tais agentes podem ser óptima 17. Se as células da córnea primárias apresentam sinais de toxicidade, é importante para reduzir o (por exemplo, poli-L-lisina) viral e policatião doses para minimizar o efeito tóxico, preservando a transdução eficiente.
Apesar de culturas de órgãos diabéticos reproduzir muitos sinais da doença e a expressão do gene alterado, eles são desnervado e falta de fornecimento de células do sistema imunológico, o que pode afetar a cicatrização de feridas e células-tronco. A este respeito, os modelos animais podem oferecer algumas vantagens, embora os animais não reproduzir toda a gama de sinais de doença humana. Os existem outros alvos de terapia génica que eficientemente normalizar córneas diabéticos. Um exemplo de tais objectivos podem ser microRNA, especificamente, mir-146a ou mir-424 23. As combinações das modificações de genes alvo utilizados com a inibição de microARN específica pode potencialmente produzir um efeito benéfico mais potente. another limitação inclui a necessidade de incubação relativamente longo da córnea com o AV administrado topicamente (por exemplo, sob a forma de gotas para os olhos), a fim de garantir a absorção virai máxima. Isso pode representar um problema na clínica, embora gravando as pálpebras pode ajudar a prolongar a incubação. A utilização de baixa concentração de sildenafil na solução viral poderia acelerar a absorção AV. O efeito transdução AV é transitória, o que pode limitar o potencial curativo da terapia genética baseada em AV. Embora dura o tempo suficiente para corrigir a cicatrização de feridas abrandamento diabética, sustentada normalização das células estaminais epiteliais pode exigir um efeito mais duradouro, tal como fornecido pela terapia de genes à base de AAV 24. Deve ser mencionado que a imunogenicidade foi uma séria desvantagem de vectores iniciais AV. No entanto, o AV recombinante de nova geração, incluindo vírus "covardes" são em grande parte livre desse efeito colateral, aumentando as suas perspectivas de ser potente translativeículos de terapia génica onal 26.
Moduladores de molécula pequena de várias vias que podem ser importantes para a cicatrização de feridas 16,17,21, 27-30 são utilizados nos modelos experimentais e a clínica. No entanto, eles não são direcionados para um tipo específico de célula, pode ter efeitos diferentes em diferentes células, e pode agir apenas em alguns aspectos da doença da córnea diabética 31,32. A terapia génica oferece a possibilidade de alterar a expressão do gene numa direcção desejada em células específicas, que realizamos neste trabalho transduzir as células epiteliais utilizando tanto sobre-expressão do gene (c-Met) e silenciamento (MMP-10 e a catepsina F). Esta abordagem também permite a modulação da expressão de genes específicos do marcador da doença, uma por uma ou em combinações 5,6. As nossas experiências mostraram que, mesmo em caso de combinação de três AVs que albergam diferentes moduladores de expressão de genes, todos os três genes foram afectados conforme esperado, e otratamento foi mais eficiente do que quando cada um foi usado sozinho AV 17.
Em queratopatia diabética grave com defeitos epiteliais persistentes ou cicatrização do epitélio incompleta após vitrectomia ou fotocoagulação com laser, uma substituição de células estaminais do limbo disfuncionais pode ser uma alternativa à terapia genética. Nestes casos, as células epiteliais do limbo cultivadas e expandidas terapia génica in vitro podem ser transplantadas sobre as córneas doentes. Os nossos dados mostram que as células do limbo cultivadas a partir das córneas diabéticos apresentam diferenças similares na expressão do marcador de células estaminais tal como ex vivo córneas tornando-os bons alvos para a terapia genética. No entanto, este tratamento tem de ser optimizado, devido à alta sensibilidade de tais células para o reagente de carga e transfecção virai utilizada. Fomos capazes de demonstrar que os reagentes de transfecção catiónicos assegurada a entrega eficiente e segura, com elevada expressão de um gene de interesse no epitélio de córnea cultivadas diabética. Tresultados stas pode abrir o caminho para a terapia genética bem sucedida de in vitro expandido LESC para as futuras fins de transplante em casos de ceratopatia diabética grave. Como a deficiência hereditária e adquirida LESC também está associada com a redução dos nervos da córnea semelhantes a diabetes 33,34, o transplante de culturas enriquecidas LESC saudáveis sobre as córneas doentes poderia potencialmente reduzir a neuropatia diabética córnea bem.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| minimum essential medium | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Optisol-GS | Bausch & Lomb | 50006-OPT | |
| ABAM antibiotic-antimycotic mixture | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| calf skin collagen | Sigma-Aldrich | C9791 | |
| agar, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| n-heptanol | Sigma-Aldrich | 72954-5ML-F | |
| O.C.T. compound | VWR International | 25608-930 | |
| Dispase II | Roche Applied Science | 4942078001 | |
| keratinocyte serum-free medium (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005042 | |
| EpiLife medium with calcium | Thermo Fisher Scientific | MEPI500CA | |
| N2 medium supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| B27 medium supplement, 50x | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| human keratinocyte growth supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | S-001-5 | |
| trypsin 0.25% - EDTA 0.02% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| trypsin 0.25% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15050065 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| insulin-transferrin-selenite supplement (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| antibody to keratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
| antibody to keratin 15 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47697 | |
| antibody to keratin 17 | Santa Cruz Biotechnology | SC-58726 | |
| antibody to ΔNp63α | Santa Cruz Biotechnology | sc-8609 | |
| antibody to PAX6 | BioLegend | PRB-278P-100 | |
| antibody to nidogen-1 | R&D Systems | MAB2570 | |
| antibody to integrin α3β1 | EMD Millipore | MAB1992 | |
| human fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| human laminin | Sigma-Aldrich | L4445 | |
| human type IV collagen | Sigma-Aldrich | C6745-1ML | |
| adenovirus expressing MMP-10 shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing cathepsin F shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing scrambled shRNA and GFP | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing c-met | OriGene (plasmid) | SC323278 | |
| adenovirus expressing GFP | KeraFAST | FVQ002 | |
| sildenafil citrate, 25 mg | Pfizer | from pharmacy | |
| epidermal growth factor | Thermo Fisher Scientific | PHG0311 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| ViraDuctin | Cell Biolabs | AD-200 | |
| ibiBoost | ibidi, Germany | 50301 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Corning round end spatula | Dow Corning | 3005 | |
| 60 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 174888 | |
| Nunc Lab-Tek II multiwell chamber slides | Sigma-Aldrich | C6807 | |
| 200 μl pipet tips | Bioexpress | P-1233-200 | other suppliers available |
| inverted microscope | Nikon | Diaphot | other suppliers/models available |
| humidified CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370 (Steri-Cycle) | other suppliers/models available |
| fluorescent microscope | Olympus, Japan | BX-40 | other suppliers/models available |
| dissecting stereo microscope | Leica, Germany | S4 E | other suppliers/models available |
References
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