Abstract
El objetivo de este protocolo es describir las alteraciones moleculares en las córneas diabéticos humanos y demostrar cómo pueden ser aliviados mediante terapia génica adenoviral en córneas cultivadas de órganos. La enfermedad de la córnea diabética es una complicación de la diabetes con anomalías frecuentes de los nervios corneales y la curación de heridas epiteliales. También hemos documentado la expresión alterada de manera significativa de varios marcadores de células madre epiteliales putativos en córneas humanas diabéticos. Para aliviar estos cambios, la terapia génica adenoviral se aplicó con éxito el uso de la regulación al alza de la expresión de proto-oncogén c-met y / o la regulación a la baja de la matriz metaloproteinasa-proteinasas 10 (MMP-10) y la catepsina F. Esta terapia acelerado la cicatrización de heridas en diabéticos córneas incluso cuando fue transducida sólo el compartimento de células madre del limbo. Los mejores resultados se obtuvieron con el tratamiento combinado. Para el trasplante posible paciente de las células madre normalizadas, un ejemplo se presenta también de la optimizatien la transducción de genes en cultivos enriquecidos con células madre utilizando potenciadores policatiónicos. Este enfoque puede ser útil no sólo para los genes seleccionados, sino también para los otros mediadores de la cicatrización de la herida corneal epitelial y la función de células madre.
Introduction
La enfermedad de la córnea diabética se debe principalmente en el epitelio degenerativa (queratopatía) y cambios nerviosas (neuropatía). A menudo se manifiesta por las alteraciones de la cicatrización de heridas del epitelio y la reducción de nervio corneal 1-4. Se estima que 60-70% diabéticos tienen diversos problemas corneales 1,3. Nuestros estudios han identificado varias proteínas marcadoras con expresión alterada en las córneas diabéticos humanos, incluida la regulación a la baja de los proto-oncogén (receptor del factor de crecimiento de hepatocitos) c-met y la regulación al alza de la metaloproteinasa de matriz 10 (MMP-10) y la catepsina F 5, 6. también hemos documentado de manera significativa disminución de la expresión de varios marcadores de células madre epiteliales putativos en las córneas diabéticos humanos.
En los estudios anteriores hemos desarrollado una terapia génica basada en adenoviral para normalizar los niveles de marcadores de la diabetes alterado utilizando el sistema de la córnea diabética humana de cultivo de órganos, que muestra lenta la cicatrización de heridas, diabéticocambios de marcador, y la reducción de la expresión de marcadores de células similares a las córneas ex vivo 7,8 tallo. Esta persistencia de los cambios parece ser debido a la existencia de memoria metabólica epigenética 9. Este sistema de cultivo era más utilizados para la terapia génica. Los objetivos para esta terapia se eligieron a partir de marcadores, ya sea con una expresión reducida en córneas diabéticos (c-met proto-oncogén), o aumento de la expresión (MMP-10 y la catepsina F).
La terapia adenoviral (AV) se utilizó en todo el córneas de órganos-cultivadas o sólo la corneoscleral compartimento limbal periférica. Este compartimiento alberga las células madre epiteliales que renuevan el epitelio corneal y participan activamente en la curación de heridas 4,10-15. Aquí, se proporcionan protocolos para el cultivo normal y diabética humana corneal de órganos, la cicatrización de heridas del epitelio, el aislamiento y la caracterización de los cultivos celulares limbal enriquecida de células madre, y células adenoviral y la transducción de la córnea. Nuestraresultados demuestran la factibilidad de este tratamiento para la normalización de la expresión del marcador y la cicatrización de heridas en diabéticos córneas para trasplante posible futuro. También sugieren que la terapia de combinación es la forma más eficaz para restaurar patrón marcador normal y la curación epitelial en la córnea diabética 16-18.
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Protocol
Investigación de Enfermedades Intercambio Nacional (ISRND, Filadelfia, PA) suministra post mortem ojos humanos sanos y diabéticos con autorización y córneas. protocolo de recogida de tejido humano de ISRND es aprobado por el comité directivo y sujetos a los Institutos Nacionales de Salud de supervisión. Esta investigación se ha llevado a cabo bajo la Junta aprobó el Cedars-Sinai Medical Center de Revisión Institucional (IRB) de protocolo exentos EX-1055. Colaborador de los cirujanos de córnea, los Dres. E. Maguen e Y. Rabinowitz, suministran llantas corneoesclerales de descarte para el aislamiento de cultivos epiteliales de la córnea enriquecida de células madre. Esta investigación se ha realizado con arreglo al protocolo aprobado por el IRB Pro00019393.
1. Human Corneal cultivo de órganos
Nota: Las córneas normales y diabéticos o los ojos enteros se reciben en el medio de almacenamiento refrigerado de la córnea (por ejemplo, Optisol GS) en un plazo de 48 horas después de la muerte del proveedor nacional ISRND.
- Retire las córneas de recipiente de almacenamiento con pinzas y se lavo dos veces in el (ABAM) mezcla de antibiótico-antimicótico. En el caso de los ojos enteros, cortar las córneas hacia fuera de los globos con tijeras curvas. Deje por lo menos un borde conjuntival 5 mm y también lavar las córneas en ABAM.
- Preparar la mezcla para ser colocado en la concavidad corneal. Consiste en medio libre de suero mínimo esencial (MEM) que contiene ABAM, 1 mg / ml de ternero piel de colágeno (hechos a partir de una solución madre de 10 mg / ml en ácido 0,1 N acético), 1% de agar, y la insulina-transferrina-selenito complementar 7.
- Microondas esta mezcla a ebullición durante la esterilización y la disolución de agar. Se puede tomar hasta 1 minuto para que todo se disuelva. Deje la tapa del tubo parcialmente abierta, porque la mezcla se desborda con facilidad cuando hierva. Por esta razón, pueden ser necesarios varios ciclos de ebullición, cada uno por 10-15 seg. Enfriar la mezcla a 37-39 ° C.
- Coloque las córneas lado epitelial hacia abajo en placas de 60 mm estériles. Llene la concavidad corneal con aproximadamente 0,5 ml de la mezcla descrita en 1.2. losmezcla se solidifica en las córneas dentro de 2 min.
- Coloque las córneas con el agar en placas estériles de 60 mm y añadir el medio completo que contiene MEM con ABAM, y la insulina-transferrina-selenita de suplemento de 7 (37 ° C) para mantener su nivel aproximadamente en el limbo de la cultura interfase aire-líquido. El volumen medio es de 7-8 ml por plato.
- Colocar los recipientes con las córneas en un incubador de CO2 5% humidificado con una bandeja de agua (de esta manera, el nivel de humedad se mantiene en o por encima de 95%) a 35 ° C (temperatura de la córnea normal). Añadir 100 l de medio (dos gotas) al día en el epitelio para humedecer las córneas.
- Monitorear la morfología de la córnea y la viabilidad de las células epiteliales al microscopio con luz transmitida utilizando un microscopio estándar con un objetivo 4X. Hacerlo una vez al día.
- Cambiar el medio cada tres días. Las córneas pueden ser cultivadas durante al menos tres semanas. Para los experimentos de terapia génica, la cultura de las córneas durante 3-5 días, luego transduce con genes de interés (4.1-4.4), dejar durante otros 3-5 días, dependiendo del transgén y sujeto al protocolo de cicatrización de la herida (2.1-2.4).
2. La curación de la herida epitelial
Nota: En las córneas diabéticos, el desbridamiento epitelial por raspado mecánico no es factible debido a la membrana basal del epitelio frágil se separa en el proceso, lo que no ocurre en las córneas normales. Por lo tanto, para mantener las córneas normales y diabéticos bajo condiciones similares de la cicatrización de heridas, la eliminación química del epitelio con n-heptanol se utiliza 19. Este procedimiento elimina el epitelio, pero deja detrás de una membrana basal intacta tanto en las córneas normales y diabéticos.
- Para llevar a cabo el centro de desbridamiento epitelial 20, coloque un disco de papel de filtro de 5 mm empapado en n-heptanol en la superficie anterior de la córnea central para 75 seg.
- Retire el filtro y se lavan las córneas en un medio completo. Llene la concavidad con 0,5 ml de agar-colágenola mezcla y la cultura como en 1.4. Tras el desbridamiento, las células epiteliales por lo general mueren y se desprenden dejando atrás la membrana basal intacta microscópicamente 7.
- Use 8,5 mm discos para crear grandes heridas epiteliales en los experimentos con solamente la terapia génica limbal. Esto asegurará la participación de las células madre del limbo en el proceso de curación.
- Monitorear la cicatrización de la córnea microscópicamente. Hacer fotografías en 4X y 10X todos los días hasta que el defecto epitelial esté completamente curada. El proceso de curación puede durar de 2 a 15 días dependiendo del estado (normal o diabética) y el tamaño de la herida.
Nota: Durante el proceso de curación, se observan células en forma de araña negro en el plano focal superior. Estas células son queratocitos estromales apoptóticos que murieron después de la extracción epitelial 4. La curación se determina que es completa cuando estas células muertas se hacen salvajes por el epitelio de la curación y ya no son visibles (Figura 2, recuadro). - después de la curaciónfinalización, cortar las córneas a la mitad, incrustarlos en el compuesto y el proceso de PTU para su inmunofluorescencia indirecta en secciones de criostato o por transferencias de Western 16,21.
3. Aislamiento de células limbares y mantenimiento de Stem Cell Cultures enriquecida
Nota: Preparar la célula epitelial primaria del limbo vástago (LESC) enriquecida culturas de las llantas corneoesclerales. Las llantas procedentes de donantes sanos y desechados después de los trasplantes de córnea se reciben de los cirujanos que colaboran en el medio de almacenamiento de la córnea estándar (por ejemplo, Optisol). De lo contrario, los cultivos LESC enriquecido se pueden obtener de las llantas extirpados de córneas enteros normales y diabéticos o globos recibidos de NDRI en el medio de almacenamiento corneal.
- Si se utilizan las córneas enteras o globos, en primer lugar aislar las áreas límbicas. Para ello, coloque la córnea en un plato de plástico estéril con el lado epitelial hacia arriba y retire la zona central con un trépano de 9 mm (cuchillo corneal circular).Descartar esta parte central. Entonces extirpar la zona del limbo utilizando un trépano de 13 mm y deseche la parte externa de la conjuntiva. Para aislar las células utilizan el borde del limbo panecillo parecido. Antes de aislamiento de células, eliminar las células endoteliales y que se adhieren restos de los iris desde el lado interior de la córnea opuesta a la superficie del epitelio con un bastoncillo de algodón estéril.
- Aislar láminas de células limbares mediante tratamiento dispasa. Incubar cada borde corneoscleral con 2,4 U / ml de dispasa II en 1,5 medio libre de suero ml de queratinocitos (KSFM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) a 37 ° C durante 2 hr 22.
- aliviar suavemente la capa celular epitelial limbal de la llanta bajo un microscopio estéreo de disección con un fórceps y disociar las células en 1 ml de 0,25% de tripsina - EDTA 0,02% durante 30 min a temperatura ambiente.
- Se lavan las células en 10 ml de medio (por ejemplo, Epilife) y sedimentar ellos a 300 xg en una centrífuga de sobremesa durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- º Resuspendercélulas e en medio de cultivo: medio con N2, B27 y suplementos de crecimiento de queratinocitos humanos, y 10 factor de ng / ml de crecimiento epidérmico (EGF).
- Semillas de las células a 3.000-5.000 células / ml en matraces o placas de 60 mm recubiertas con una mezcla de proteínas de la membrana basal humana, incluyendo la fibronectina, el colágeno de tipo IV, y laminina (FCL), en 0,5 a 1 g / cm 2, en el KSFM medio.
- Cultivar las células en un incubador de CO2 humidificado (95% o mayor humedad) a 37 ° C hasta que forman monocapas confluentes totalmente. Esto puede tomar de 1-2 semanas.
Nota: Regularmente confirmar la identidad de la célula mediante tinción inmunohistoquímica positiva para los marcadores putativos LESC incluyendo PAX6, queratina (K) 14, K15, K17, y ΔNp63α. Los detalles de tinción incluyendo los anticuerpos primarios se han publicado 8,16-18,22. - Para el paso de las células confluentes, los tratan con una solución de 1 ml 0,05% de tripsina (dilución 1: 5 de la solución de 0,25%) durante 10 min a 37 ° C. Añadir 5 ml de soja trsolución de inhibidor ypsin (10 mg / ml) diluido 1: 4 en el medio, y centrifugar las células como en 3.5.
- Lavar el sedimento de células en 3 ml de solución de inhibidor de tripsina de soja diluida. La placa de las células sobre FCL-revestido (véase 3.7) o platos de la cámara de diapositivas de vidrio a 2 x 10 4 células / ml.
4. Transducción adenoviral de córneas de órganos cultivados
Nota: Los adenovirus recombinantes (AV) incluyen AV-vector (sin gen insertado), AV-CMET (con el marco de lectura abierta del gen c-MET), AV-shM10 (con shRNA de MMP-10), y AV-SHCF ( con shRNA de catepsina F). Son eliminados E1-E3 / tipo 5 AV expresar genes bajo el control de la principal promotor temprano inmediato de citomegalovirus. Los virus de AV-CMET se generan utilizando el vector AV PAD / CMV / V5-DEST 16. Los virus AV-shRNA se generan a medida por subclonación de secuencias shRNA junto con el promotor HH1 secuencia de marca y GFP de iLenti-EGFP vector en una huma incompetente para la replicación (-E1 / -E3)n tipo AV 5 genoma utilizando adeno-4 sistema de expresión 17.
- Transducir una córnea órgano-cultivadas de cada par con AV-vector y la otra córnea, con una expresión de genes AV-moduladora. Utilice la AV-CMET en 0.8 a 1.25 x 10 8 unidades formadoras de placa (pfu) por córnea en medio de cultivo durante 48 horas a 37 ° C manteniendo las córneas bajo la superficie del medio cada una en un pocillo de una placa de 24 pocillos. Usa los virus AV-shRNA a 1-2 x 10 8 pfu por córnea.
- Utilice los virus de la transducción en medio completo suplementado con 75 mg citrato de sildenafil / ml. Este reactivo se activa el transporte caveolina facilitar la absorción viral por las células epiteliales 21. Debido a la corta vida media de sildenafilo en soluciones acuosas, volver a agregar la misma cantidad al medio de 4-5 horas más tarde. El tratamiento estándar es de 48 horas.
- Transferir las córneas a nuevos platos con una espátula estéril extremo redondo y cultura en el medio y sin AV manteniendo el nivel medio en el limbo. Después de la adiciónitional 4-8 días en la interfase aire-líquido, el proceso de las córneas tratadas AV-para diversos análisis o prueba para la curación de heridas epiteliales (véase más arriba). Rutinariamente humedecer las córneas durante el cultivo mediante la adición de 100 l de medio (dos gotas) en la parte superior de la córnea.
- Para la transducción de sólo las células limbares, incubar los virus con las córneas en la interfase aire-líquido con el nivel medio en el limbo, para evitar la transducción del epitelio central.
5. Transducción adenoviral de células cultivadas limbares
- Mantener los cultivos enriquecidos-LESC en el medio con 10 ng / ml de EGF (véase 3.5) en placas de plástico recubiertas con la mezcla FCL a 0,5 g / cm2.
- Transducir células cultivadas que han alcanzado el 70-80% de confluencia con el AV que alberga el gen de proteína fluorescente verde (AV-GFP) o el shRNA-GFP en una gama de multiplicidad de infección revueltos AV-(MOI: 1 a 300 pfu / célula) , en el medio con 2 ng / ml de EGF. Realice la transduction durante 4 horas a 37 ° C en un volumen mínimo (0,2 ml) seguido de 20 horas en 0,5 ml de medio. El sildenafil activador transporte caveolina no es necesario para la transducción de cultivo celular.
- Utilice uno de los siguientes reactivos que facilitan la unión a la superficie celular AV para mejorar la eficacia de transducción AV: o policationes (1 mg / ml de poli-L-lisina o 5 mg / ml de polibreno), o 6 l / reactivo transducción ml ( por ejemplo, ViraDuctin), o 20 l / ml potenciador de la transducción (por ejemplo, ibiBoost).
- Después de reemplazar el medio por el que no tiene el AV, se incuban las células en cultivo durante 4 días, en el incubador de CO2 humidificado y evaluar el nivel de expresión de GFP usando un microscopio de fluorescencia invertida.
- Utilice el ensayo de cicatrización de la herida cero para evaluar la migración celular en los cultivos transducidos AV. Cultivar las células en los portaobjetos de cámara de múltiples pocillos. Hacer las heridas en una monocapa de células por el rascado en un movimiento lineal recta con una pi 200 lpette punta. Después de la herida, cambiar el medio para uno nuevo para eliminar las células separadas.
- Fotografiar las heridas todos los días con una cámara digital conectada a un microscopio invertido con un aumento de 4X. Grabar el momento en que la curación es completa (los bordes de la herida se ponen en contacto a lo largo de toda la herida).
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Representative Results
Hemos demostrado previamente que en los cultivos de órganos de la córnea, las diferencias en la expresión de marcadores de la diabetes (por ejemplo, proteínas de la membrana basal y α3β1 integrina) y la cicatrización de heridas entre las córneas normales y diabéticos se conservan. Este sistema de cultivo se sometió a la terapia génica dirigida a la normalización de los niveles de marcadores de la diabetes alterado, c-Met, MMP-10, y catepsina F.
Cuando todo el epitelio corneal se transducidas con el AV-CMET, o AV-shRNA a MMP-10 o la catepsina F (por separado o en combinación), la cicatrización de la herida epitelial se completó significativamente más rápido (P <0,03 por la prueba t de Student pareada en comparación con AV-vector) que en los compañeros de córneas AV-vector-transduced de los mismos donantes 16,17. El AV-CMET redujo el tiempo de curación a la mitad, lo que no difiere significativamente de la curación de las córneas normales (Figure 1). El AV-shM10 y AV-SHCF tuvieron efecto menor. Sin embargo, una combinación de la AV-CMET con la AV-shM10 y AV-SHCF (Combo) produce el efecto más fuerte normalizar completamente los tiempos de curación epiteliales (Figura 1). Esta reducción en el tiempo de curación fue acompañado por los patrones normalizados de diabética (membrana basal y las integrinas) y marcadores de células córneas en los diabéticos 8,16,17 vástago.
Las células madre epiteliales son la principal herida participantes 4 curación. Por lo tanto, se examinó si la terapia génica del limbo dirigida al compartimento de células madre sería beneficioso para los diabéticos córneas. Con este fin, sólo las partes del limbo de las córneas diabéticos fueron transducidas por la AV-CMET o Combo y grande, se crearon heridas de 8,5 mm. El AV-CMET córneas transducidas curados significativamente más rápido (P <0,001 por pares de t de Student) que el AV-vector transduced compañeros de córneas (Figure 2). El tratamiento combinado dio como resultado el mismo resultado 18. La terapia génica aumentó la expresión de los marcadores de la diabetes suprimida, tales como α3β1 integrina y el componente de la membrana basal nidogen-1 (Figura 3, columnas de la izquierda, Combo). Es importante destacar que, como en toda la transducción de la córnea 8,17, la terapia génica limbal, ya sea con la AV-CMET o Combo condujo a un marcado incremento en la expresión de marcadores de LESC putativo incluyendo K15 y ΔNp63α, en comparación con las córneas AV-vector transducidas (Figura 3 , columnas de la derecha, ambos c-se reunieron y Combo). Estos datos apoyaron el papel de la normalización de células madre en la cicatrización de la herida acelerado en la terapia génica de las córneas diabéticos y muestran la viabilidad de nuestro enfoque para el tratamiento de la enfermedad de la córnea diabética.
A continuación empezamos a examinar los efectos de la terapia génica en células límbicas LESC enriquecidas cultivadas. los cultivosde las células epiteliales del limbo normales y diabéticos fueron establecidos y teñidas de marcadores LESC putativos. Muchas células teñidas positivo (Figura 4). La intensidad de la tinción en las culturas diabéticos fue consistentemente más débil que en los cultivos normales (K15 muestra como un ejemplo en la Figura 4), que era muy similar a la situación en el diabético vs. normales ex vivo córneas 8. Estos experimentos validaron los cultivos celulares obtenidos como adecuados para la terapia génica.
Los experimentos preliminares con una línea celular epitelial corneal telomerasa inmortalizadas (véase 23) mostraron que las células se transducen fácilmente por las construcciones de AV disponibles (datos no mostrados aquí). Sin embargo, los cultivos primarios limbares resultaron ser mucho más sensibles a la carga viral y / o el reactivo de transducción, que requiere la optimización del protocolo de transducción. La transducción de células limbares cultivadas porla AV-GFP (Figura 5) dependía de la multiplicidad de infección (MOI; rango de 30 a 300 pfu / célula) que resulta en un nivel bastante alto de transducción a alta MOI (expresión de GFP en células> 80%). Sin embargo, la mayor MOI también eran tóxicos, causando la muerte celular o deteriorado gravemente la migración de células en las heridas de arañazos después de 3-4 días de la transducción (Figura 6). Al MOI baja (10-30 UFP / célula), la transducción de AV producido menos o ningún efecto citotóxico, pero dado lugar a una disminución del número de células que expresan GFP (5-15%).
A continuación intentamos aumentar la eficacia de transducción, sin comprometer la viabilidad celular mediante el uso de reactivos de transducción de mejora que generalmente facilitan la unión a la superficie celular AV. Ellos mostraron diferentes mejoras de la eficiencia en la transducción de las células epiteliales del limbo en el AV a MOI 10-30. Ambos policationes, poli-L-lisina, y polibreno, eran no tóxicos y los más eficaceslo que resulta en incremento de 3-4 veces en el número de células positivas para GFP (Figura 7, fila superior). ibiBoost también fue eficaz pero ligeramente tóxico, y ViraDuctin fue ineficaz y bastante tóxico (Figura 7, fila inferior). Por lo tanto, policationes ofrecen de forma segura y eficaz para impulsar gen de expresión de interés en la transducción de AV y deben ser utilizados para la expresión de genes y la herida experimentos de curación.
Figura 1: c-Met transducción génica conduce a una disminución significativa de la córnea heridas epiteliales tiempo (media ± SEM) de curación. Por otra parte, la terapia génica combinada (Combo) con el gen MET-c albergar AV y shRNAs a los genes de MMP-10 y la catepsina F normaliza por completo de curación de heridas epiteliales tiempo. Significación (valores p) fue establecido por pares de t de Student en comparación con respectiv tratamientos vector e. Las barras representan el error estándar de la media. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La curación de heridas epiteliales 8,5 mm en un par de córneas diabéticos. Fila superior, la córnea del vector transducidas; la curación es completa en 8 días. Fila inferior, AV-CMET transducidas compañero de córnea; la curación es completa dentro de 5 días. Las flechas muestran la herida borde (W). *, Parte no curado (también se muestra en la alta ampliación como recuadro), con los queratocitos estromales apoptosed forma de araña. Son visibles hasta que la capa epitelial crece en la parte superior de ellos. Bar = 50 micras. El contraste de fases. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La inmunotinción de secciones de córnea diabéticos para diversos marcadores después de la terapia génica del limbo. Tanto AV-CMET y tratamientos combinados dan como resultado notablemente aumento de la tinción para los marcadores limbal diabéticos (α3β1 integrina y nidogen-1) y marcadores de células madre putativas (K15 y ΔNp63α). Las flechas en paneles-1 Nidogen marcan membrana basal epitelial corneal. Bar = 30 micras. e, epitelio; s, estroma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La tinción inmunocitoquímica de las culturas epiteliales del limbo primarios para un putativo K15 marcador LESC. Fila superior, de cultivo normal; mayoría de las células show fuerte tinción para K15. Fila inferior, la cultura diabética; la mayoría de las células sólo muestran tinción débil. Los paneles de la derecha se presentan con DAPI contratinción nuclear. Las células normales y diabéticos se fotografiaron con el mismo tiempo de exposición. Bar = 20 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: El nivel de expresión de GFP en las células epiteliales del limbo transducidas depende del Ministerio del Interior de AV-GFP: (a) 30 pfu / célula; (B) 120 pfu / célula; (C) 300 pfu / célula a los 3 días de la transducción. Se muestran fotografías de las células vivas. Barra = 300 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: La migración celular se ve afectada negativamente por el aumento de la concentración de AV según lo revelado por prueba de marcar la herida: (a) el control; (B) 20 pfu / célula; (C) 80 pfu / célula; (D) 120 pfu / célula. Se muestran fotografías de las células vivas. Barra = 500 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: células límbicas transducidas con AV-GFP a 30 pfu / célula. (A) el control; (B) de poli-L-lisina; (C, d) la transducción de reactivo; 5 días de la transducción. Transducción reactivo caused un efecto citotóxico significativo que conduce al redondeo celular y la muerte (d, contraste de fase). Se muestran fotografías de las células vivas. Barra = 400 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La córnea parece ser un tejido ideal para la terapia génica debido a su ubicación superficie en la que la entrega de genes, así como la evaluación de la eficacia y efectos secundarios, son fáciles. Sin embargo, una traducción clínica de este enfoque poderoso sigue siendo lento debido a la escasa información sobre las causas genéticas de las enfermedades de la córnea y los objetivos de terapia génica 24. Complicaciones diabéticas, incluyendo alteraciones de la córnea pueden ser en gran parte epigenética en la naturaleza, lo que se traduce en la memoria metabólica 9. Por esta razón, los tejidos y las células diabéticos conservan sus anomalías ex vivo y pueden ser estudiados en el cultivo de órganos y tejidos. Además, la diabetes causa cambios específicos en los niveles de expresión génica y patrones que pueden ser corregidos por el la terapia génica. Hemos identificado varios marcadores alterados en el epitelio corneal diabética incluyendo el 5,6,8 compartimento de células madre, y se utilizan los cultivos de órganos de la córnea humana para normalizar 7,8 porla terapia génica del marcador de expresión y la curación de la herida epitelial comprometida en la córnea diabética.
Hemos elegido el AV como el vehículo de suministro de genes debido a su fuerte expresión de los transgenes, su naturaleza no la integración, y su selectividad para las células epiteliales, que son cualidades superiores a las del virus adeno-asociado (AAV) 25. La transducción de AV de los cultivos de órganos de la córnea tiene varios pasos críticos. Las córneas se deben enviar al laboratorio dentro de 48 hr después de la muerte, para reducir al mínimo la pérdida de epitelio que se produce durante el almacenamiento. Para aumentar la absorción viral, es importante añadir potenciadores de transporte caveolae, tales como sildenafil, durante la transducción 21. Al validar el efecto de transducción de expresión de la proteína, el uso de varios marcadores se recomienda (Figura 3), como marcadores de células madre específicas no están identificados de manera definitiva. Al hacer las heridas epiteliales, hay una necesidad de utilizar el chemical desbridamiento debido a la fragilidad de la membrana basal epitelial diabética que resulta en su desprendimiento durante el raspado manual. Se necesita un cuidadoso seguimiento diario del proceso de curación con criterios objetivos de curación, como la desaparición de los queratocitos subepiteliales muertos a la vista cuando el epitelio vuelve a crecer por encima de ellos (Figura 2). Por último, debido a algún AV y / o toxicidad GFP a las células limbares primarios, es importante reducir la dosis viral, al mismo tiempo el uso de refuerzos de transducción no tóxicos, tales como policationes, para asegurar la transducción eficiente y seguro (Figuras 5 - 7).
El sistema de terapia de gen puede ser modificado para utilizar las córneas de órganos-cultivadas de animales. Son mucho más baratos que humano, se pueden obtener en cantidades sobre una base regular, y pueden ser adecuados para la detección, por ejemplo, de medicamentos de la modulación de la cicatrización de heridas. Sin embargo, las córneas humanas ofrecen posibilidades más amplias parael estudio debido a la abundancia de los reactivos, especialmente los anticuerpos. En el caso de la detección de drogas en las córneas de los animales no diabéticos, el desbridamiento puede hacerse mecánicamente. Si un anticuerpo para un determinado marcador no funciona bien en algunos córneas humanas, puede ser debido a la variabilidad individual y / o duración de la enfermedad o la gravedad. En este caso, el examen de otros marcadores puede ser recomendada. La capacidad de n-heptanol para eliminar las células puede disminuir significativamente con el tiempo, posiblemente debido a la oxidación durante el almacenamiento. Si esto ocurre, puede ser necesario utilizar una nueva, no abierto anteriormente, vial. Si se trabaja con las caras córneas humanas, una segunda ronda de desbridamiento se puede intentar. Sildenafil tiene una vida media corta en soluciones acuosas; Por lo tanto, debe estar recién preparado cada vez que se realiza una transducción de la córnea. El éxito del cultivo de células límbicas pueden depender de la edad del donante; las células de donantes más jóvenes por lo general crecen mejor. Un agente de la terapia génica sola no puede provocar una signifiicant efecto; en este caso, una combinación de tales agentes puede ser óptimo 17. Si las células corneales primarias muestran signos de toxicidad, es importante para reducir el (por ejemplo, poli-L-lisina) viral y policatión dosis para minimizar efecto tóxico preservando al mismo tiempo la transducción eficiente.
Aunque cultivos de órganos diabéticos reproducen muchos signos de la enfermedad y la expresión génica alterada, son denervado y carecen de la oferta de las células inmunes, lo que puede afectar a la cicatrización de heridas y células madre. En este sentido, los modelos animales pueden ofrecer algunas ventajas, aunque los animales no reproducen el espectro completo de los signos de enfermedad humana. Existen los otros objetivos de terapia génica que se normalizan de manera eficiente córneas diabéticos. Un ejemplo de estos objetivos puede ser microARN, específicamente, MIR-146a o miR-424 23. Las combinaciones de las modificaciones de genes diana utilizados con la inhibición de microARN específicos pueden producir potencialmente un efecto beneficioso más potente. Another limitación incluye la necesidad de incubación relativamente largo de la córnea con el AV administra por vía tópica (por ejemplo, en forma de gotas para los ojos) a fin de asegurar la absorción viral máxima. Esto puede plantear un problema en la clínica, aunque la grabación de los párpados podría ayudar en la prolongación de la incubación. El uso de una baja concentración de sildenafilo en la solución viral podría acelerar la adopción de AV. El efecto de transducción de AV es transitoria, que puede limitar el potencial curativo de la terapia génica basada en AV. A pesar de que dura lo suficiente para corregir la cicatrización de la herida desaceleración diabética, sostenida normalización de las células madre epiteliales podría requerir un efecto más duradero, tal como el proporcionado por la terapia génica basada en AAV 24. Se debe mencionar que la inmunogenicidad era un serio inconveniente de los vectores AV temprana. Sin embargo, la nueva generación de AV recombinante que incluye los virus "cobardes" son en gran parte libre de este efecto secundario, lo que aumenta sus posibilidades de ser potente translativehículos de terapia génica onal 26.
Moduladores de molécula pequeña de las diversas vías que pueden ser importantes para la curación de la herida 16,17,21, 27 a 30 se utilizan en los modelos experimentales y la clínica. Sin embargo, no están dirigidos a un tipo específico de célula, puede tener diferentes efectos en diferentes células, y puede actuar sólo sobre algunos aspectos de la enfermedad de la córnea diabética 31,32. La terapia génica ofrece una posibilidad de cambiar la expresión de genes en una dirección deseada en células específicas, que hemos logrado en este trabajo la transducción de las células epiteliales utilizando tanto la sobreexpresión de genes (c-met) y el silenciamiento (MMP-10 y la catepsina F). Este enfoque también permite la modulación de la expresión de genes marcadores de enfermedad específicos, uno por uno o en combinaciones 5,6. Nuestros experimentos mostraron que incluso en caso de combinación de tres AVs que albergan diferentes moduladores de la expresión génica, los tres genes fueron afectadas como se esperaba, y eltratamiento fue más eficaz que cuando se utilizó cada AV solo 17.
En queratopatía diabética severa con defectos epiteliales persistentes o la curación epitelial incompleta sobre vitrectomía o la fotocoagulación con láser, un reemplazo de las células madre limbares disfuncionales puede ser una alternativa a la terapia génica. En estos casos, las células epiteliales cultivadas del limbo y ampliado la terapia génica in vitro se pueden trasplantar en las córneas enfermas. Nuestros datos muestran que las células limbares cultivadas de las córneas diabéticos muestran diferencias similares en la expresión de marcadores de células madre como ex córneas in vivo que los hacen buenos objetivos para la terapia génica. Sin embargo, este tratamiento tiene que ser optimizado, debido a la alta sensibilidad de dichas células al reactivo de carga y la transfección viral usado. Hemos sido capaces de demostrar que los reactivos de transfección catiónicos garantizarse la entrega eficiente y segura con una alta expresión de un gen de interés en el epitelio corneal diabética cultivadas. Tstos resultados pueden allanar el camino para el éxito de la terapia génica in vitro ampliado LESC para los futuros trasplantes en casos de queratopatía diabética severa. Debido a la deficiencia hereditaria y adquirida LESC también se asocia con la reducción de los nervios de la córnea similar a la diabetes 33,34, el trasplante de sanos cultivos enriquecidos-LESC en las córneas enfermas potencialmente podría aliviar la neuropatía diabética corneal también.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| minimum essential medium | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Optisol-GS | Bausch & Lomb | 50006-OPT | |
| ABAM antibiotic-antimycotic mixture | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| calf skin collagen | Sigma-Aldrich | C9791 | |
| agar, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| n-heptanol | Sigma-Aldrich | 72954-5ML-F | |
| O.C.T. compound | VWR International | 25608-930 | |
| Dispase II | Roche Applied Science | 4942078001 | |
| keratinocyte serum-free medium (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005042 | |
| EpiLife medium with calcium | Thermo Fisher Scientific | MEPI500CA | |
| N2 medium supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| B27 medium supplement, 50x | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| human keratinocyte growth supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | S-001-5 | |
| trypsin 0.25% - EDTA 0.02% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| trypsin 0.25% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15050065 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| insulin-transferrin-selenite supplement (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| antibody to keratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
| antibody to keratin 15 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47697 | |
| antibody to keratin 17 | Santa Cruz Biotechnology | SC-58726 | |
| antibody to ΔNp63α | Santa Cruz Biotechnology | sc-8609 | |
| antibody to PAX6 | BioLegend | PRB-278P-100 | |
| antibody to nidogen-1 | R&D Systems | MAB2570 | |
| antibody to integrin α3β1 | EMD Millipore | MAB1992 | |
| human fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| human laminin | Sigma-Aldrich | L4445 | |
| human type IV collagen | Sigma-Aldrich | C6745-1ML | |
| adenovirus expressing MMP-10 shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing cathepsin F shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing scrambled shRNA and GFP | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing c-met | OriGene (plasmid) | SC323278 | |
| adenovirus expressing GFP | KeraFAST | FVQ002 | |
| sildenafil citrate, 25 mg | Pfizer | from pharmacy | |
| epidermal growth factor | Thermo Fisher Scientific | PHG0311 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| ViraDuctin | Cell Biolabs | AD-200 | |
| ibiBoost | ibidi, Germany | 50301 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Corning round end spatula | Dow Corning | 3005 | |
| 60 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 174888 | |
| Nunc Lab-Tek II multiwell chamber slides | Sigma-Aldrich | C6807 | |
| 200 μl pipet tips | Bioexpress | P-1233-200 | other suppliers available |
| inverted microscope | Nikon | Diaphot | other suppliers/models available |
| humidified CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370 (Steri-Cycle) | other suppliers/models available |
| fluorescent microscope | Olympus, Japan | BX-40 | other suppliers/models available |
| dissecting stereo microscope | Leica, Germany | S4 E | other suppliers/models available |
References
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