Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

תרפיה adenoviral ג'ין עבור סוכרתית keratopathy: השפעות על ריפוי פצע גזע ביטוי נייד מרקר ב קרניות אדם איברים בתרבית תאים לימבלית אפיתל

Published: April 7, 2016 doi: 10.3791/54058
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Eye Program, Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Departments of Biomedical Sciences and Neurosurgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Abstract

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר שינויים מולקולריים קרני סוכרת אדם להדגים כיצד הם ניתן להקל על ידי ריפוי גנטי adenoviral ב קרניות איבר תרבותי. המחלה בקרנית הסוכרתית היא סיבוך של מחלת סוכרת עם מומים תכופים של עצבים קרניים וריפוי פצע אפיתל. גם תעדנו ביטוי ישתנה באופן משמעותי של סמני תא גזע כמה משוערים אפיתל קרניות סוכרת אדם. כדי להקל את השינויים האלה, ריפוי גנטי adenoviral יושם בהצלחה באמצעות גברת ביטוי ביטוי פרוטו-אונקוגן-נפגש ג ו / או downregulation של מטלו-10 מטריקס proteinases (MMP-10) ו cathepsin צלזיוס זה טיפול מואץ ריפוי פצע ב קרניות סוכרת גם כאשר רק תא תאי גזע limbal היה transduced. את התוצאות הטובות ביותר התקבלו עם טיפול משולב. להשתלה לחולה אפשרית של תאי גזע מנורמלים, מוצגת דוגמא גם של optimizatiעל של תמרת גן בתרביות תאים מועשרות גזע באמצעות משפרי polycationic. גישה זו עשויה להיות שימושי לא רק הגנים שנבחרו אלא גם עבור מתווכים אחרים של ריפוי הפצע אפיתל הקרנית גזע תפקוד התא.

Introduction

המחלה בקרנית הסוכרת בעיקר תוצאת אפיתל ניוונית (keratopathy) ואת העצב (נוירופתיה) שינויים. הוא לעתים קרובות לידי ביטוי על ידי הליקויים של ריפוי פצע אפיתל והפחתת עצב קרני 1-4. סוכרת 60-70% העריכו יש 1,3 בעיות קרניות שונות. המחקרים שלנו זיהו מספר חלבונים סמן עם ביטוי שונה ב קרניות סוכרת האדם כולל downregulation של (הקולטן לגורם הצמיחה hepatocyte) פרוטו-אונקוגן-נפגשו ג ואת הגברת הביטוי של מטלו-10 מטריקס (MMP-10) ו cathepsin F 5, 6. גם תעדנו ירד באופן משמעותי ביטוי מספר סמני תא גזע המשוערת אפיתל קרניות סוכרת האדם.

במחקרים הקודמים פתחנו ריפוי גנטי adenoviral המבוסס לנרמל את רמות הסמנים שינה סוכרת באמצעות מערכת התרבות איבר קרנית סוכרת אדם, אשר מציגה ריפוי פצע איטי, סוכרתשינויי סמן, גזע הפחתת התא סמן ביטוי דומה קרניות vivo לשעבר 7,8. התמדה זו של שינויים שנראה בשל קיומו של זיכרון מטבולי אפיגנטיים 9. מערכת תרבות זה הייתה מעבר למה משומש עבור ריפוי גנטי. היעדים עבור טיפול זה נבחרו מתוך סמנים גם עם ביטוי מופחת ב קרניות סוכרתיות (נפגש-ג פרוטו-אונקוגן), או ביטוי מוגבר (MMP-10 ו F cathepsin).

טיפול adenoviral (AV) שמש ב קרניות האיבר תרבותי השלמות או בתא לימבלית ההיקפי corneoscleral בלבד. תא זה מטפח בתאי גזע אפיתל שמתחדשים האפיתל של הקרנית ולהשתתף באופן פעיל ריפוי הפצע 4,10-15. הנה, פרוטוקולים מסופקים תרבות איבר קרנית אנושית בריאה סוכרתית, ריפוי פצעים אפיתל, בידוד ואפיון של תרביות תאים לימבלית מועשרות בתאי גזע, ותא adenoviral תמרה קרנית. שֶׁלָנוּתוצאות מראות את הכדאיות של טיפול זה לנרמול ביטוי סמן ואת ריפוי פצעים קרני סוכרת להשתלה עתידית אפשרית. הם גם מראים כי הטיפול המשולב הוא הדרך היעילה ביותר כדי לשחזר דפוס סמן נורמלי ולריפוי אפיתל הקרני סוכרת 16-18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

המחלף הלאומי למחקר מחלות (NDRI, פילדלפיה, פנסילבניה) ספק עיניים קרניות אדם בריאים סוכרת שלאחר מוות הסכימו. פרוטוקול אוסף אדם רקמות של NDRI יאושר על ידי הוועדה הניהולית ובכפוף National Institutes of Health הפיקוח. מחקר זה נערך תחת דירקטוריון הסקירה המוסדי במרכז הרפואי Cedars-Sinai אשר (IRB) פרוטוקול פטור EX-1055. שיתוף פעולת מנתחים קרניים, בני זוג. א Maguen וי רבינוביץ, סיפק חישוקי corneoscleral שנזרקו לבידוד תרמי של תרבויות אפיתל הקרנית גזע מועשר התא. מחקר זה נערך תחת פרוטוקול IRB אשר Pro00019393.

1. תרבות איברי אדם קרנית

הערה: קרניות רגילות סוכרת או עיניים כולו מתקבלות במדיום אחסון קרני מצונן (למשל, Optisol GS) תוך 48 שעות לאחר מותו מהספק הלאומי NDRI.

  1. הסר את קרניות ממכל אחסון עם מלקחיים ולשטוף אותם פעמיים in את התערובת אנטיביוטיקה antimycotic (ABAM). במקרה של עיניים שלמות, לחתוך את הקרניות מתוך גלובס במספריים מעוגלים. השאר לפחות שפת 5 מ"מ הלחמית וגם לשטוף את הקרניות ב ABAM.
  2. מכינים את תערובת להציב קעירות הקרנית. הוא מורכב מדיום חיוני מינימום סרום ללא (MEM) ABAM המכיל, 1 מ"ג / מ"ל ​​עגל העור קולגן (עשוי פתרון המניות של 10 מ"ג / מ"ל ​​בחומצה 0.1 N אצטית), 1% אגר, ו-סלניט אינסולין-transferrin להשלים 7.
  3. מיקרוגל תערובת זו רותחת לעיקור והתפרקות אגרה. זה עלול לקחת עד 1 דקות לכל דבר לפזר. השאר את כובע הצינור פתוח מעט בגלל התערובת גולש בקלות כשזה שחין. מסיבה זו, מספר מחזורים רותחים עשויים להידרש, כל 10-15 שניות. לצנן את התערובת 37-39 מעלות צלזיוס.
  4. מניחים את קרניות הצד אפיתל למטה ב -60 סטרילי מ"מ צלחות. מלא את הקעירות הקרנית עם כ 0.5 מיליליטר של התערובת מתוארת 1.2. התערובת מבצר על הקרניות בתוך 2 דקות.
  5. מניח את הקרניות צד אגר למטה במנות 60 מ"מ סטרילי ולהוסיף המדיום המלא המכיל ממ עם ABAM, והאינסולין-transferrin-סלניט תוספת 7 (37 ° C) כדי לשמור על הרמה שלה כ בבית לימבוס לתרבות ממשק נוזל אוויר. היקף המדיום הוא 7-8 מ"ל לכל צלחת.
  6. מניח את הכלים עם הקרניות לתוך חממת 5% CO 2 humidified עם מחבת מים (בדרך זו, רמת לחות נשמרת בבית או מעל 95%) ב 35 ° C (טמפרטורת קרנית נורמלית). הוספת 100 בינוני μl (שתי טיפות) יומי על האפיתל כדי ללחלח את הקרניות.
  7. לפקח על המורפולוגיה הקרנית ואת כדאיות תא אפיתל מיקרוסקופית תחת אור עובר באמצעות מיקרוסקופ רגיל עם מטרת 4X. לעשות זאת פעם אחת ביום.
  8. שנה את בינונית כל שלושה ימים. הקרניות יכולות להיות מתורבתות במשך שלושה שבועות לפחות. עבור ניסויי הריפוי הגנטי, התרבות הקרנית למשך 3-5 ימים, ולאחר מכן, אנקודריםדואר עם גנים של עניין (4.1-4.4), להשאיר למשך 3-5 ימים נוספים תלוי transgene ובכפוף פרוטוקול ריפוי הפצע (2.1-2.4).

ריפוי 2. אפיתל הפצע

הערה: הקרניות הסוכרות, את הטריה אפיתל על ידי גירוד מכאני הוא לא ריאלית מכיוון הקרום במרתף אפיתל שברירי מנותק בתהליך, מה שלא קורה ב הקרניות הנורמליות. לכן, כדי לשמור על הקרניות הנורמליות סוכרת בתנאים דומים של ריפוי פצעים, הסרה כימית של האפיתל עם n-heptanol משמשת 19. הליך זה מסיר את האפיתל אך מותיר אחריו קרום במרתף ללא פגע בשתי הקרניות הנורמליות סוכרתיות.

  1. כדי לבצע טרי אפיתל מרכזי 20, למקם דיסק נייר סינון 5 מ"מ טבול n-heptanol על פני השטח הקדמי של הקרנית המרכזי עבור 75 שניות.
  2. הסר את המסנן ולשטוף את הקרניות במדיום מלא. מלאו את קעירות עם 0.5 מ"ל קולגן אגרתערובת ותרבות כמו 1.4. לאחר טרי, לתאי האפיתל בדרך כלל מתים ו להשיל והותירו אחריו קרום במרתף ללא פגע מיקרוסקופי 7.
  3. השתמש 8.5 מ"מ דיסקים ליצור פצעים אפיתל גדולים בניסויים עם הריפוי הגנטי לימבלית בלבד. פעולה זו תבטיח את מעורבותם של תאי גזע limbal בתהליך הריפוי.
  4. לפקח על הריפוי הקרני מיקרוסקופי. הפוך צילומים בבית 4X ו 10X כל יום עד הפגם אפיתל נרפא לחלוטין. תהליך ההחלמה יכול להימשך בין 2 עד 15 ימים, בהתאם למדינה (רגיל או סוכרת) וגודל פצע.
    הערה: במהלך תהליך הריפוי, תאי עכביש דמוי שחורים הם נצפו על מישור המוקד העליון. תאים אלה הם keratocytes סטרומה אפופטוטיים מת לאחר הסרת האפיתל 4. הריפוי הוא נחוש בדעתו להיות שלם כאשר תאים המתים אלה הם מגודלים על ידי האפיתל הריפוי אינם גלוי (איור 2, הבלעה).
  5. לאחר ריפויהשלמתי, לחתוך את הקרניות לשתיים, להטביע אותם במתחם אוקטובר ותהליכים, immunofluorescence עקיפה על סעיפי cryostat או כתמים מערביים 16,21.

3. בידוד של תאים לימבלית ותחזוקה של תרבויות גזע מועשר ניידות

הערה: הכן את תאי הגזע אפיתל limbal העיקרי (LESC) תרבויות -enriched מן המכון corneoscleral. החישוקים מגיעים מתורמים בריאים מושלכים לאחר השתלות קרניות מתקבלות המנתחים הפעולה במדיום האחסון קרני הסטנדרטי (למשל, Optisol). אחרת, התרבויות מועשרות LESC ניתן לקבל חישוקי הניכרת מן הקרניות כולו נורמליות סוכרות או גלובס שהתקבלו NDRI במדיום האחסון הקרני.

  1. אם הקרניות או הגלובוסים השלמים משמשות, בתחילה מבודד באזורים לימבלית. לשם כך, למקם את הקרנית על צלחת פלסטיק סטרילי עם צד אפיתל עד ולהסיר באזור המרכז עם מקדחת 9 מ"מ (סכין קרני מעגלי).מחק חלק מרכזי זה. אז שתחתוך את האזור לימבלית באמצעות מקדחת 13 מ"מימ וזורקים את חלק הלחמית החיצוני. כדי לבודד תאים להשתמש השפה לימבלית דמוית בייגל. לפני בידוד תא, להסיר את תאי האנדותל ושאריות דבקות של הקשתית מהצד הפנימי של הקרנית הפוכה האפיתל משטח עם מקלון צמר גפן סטרילי.
  2. לבודד גליונות תא לימבלית באמצעות טיפול dispase. דגירה כל שפת corneoscleral עם dispase 2.4 U / ml II ב 1.5 מ"ל keratinocyte סרום ללא בינוני (KSFM) בתוספת 10% עוברי בסרום שור (FBS) ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות 22.
  3. הזז בעדינות את גיליון תא אפיתל limbal מעבר לשפת תחת מיקרוסקופ סטריאו לנתח עם מלקחיים לנתק את התאים ב 1 מ"ל של טריפסין 0.25% - פתרון EDTA 0.02% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. שוטפים את התאים ב 10 מ"ל של מדיום (למשל, Epilife) ו גלולה אותם XG ב 300 בצנטריפוגה בטבלה העליונה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. ה resuspendתאי דואר במדיום תרבות: בינוני עם N2, B27 ותוספי צמיחה keratinocyte אדם, ו -10 גורם הגדילה באפידרמיס ng / ml (EGF).
  6. זרעים התאים ב 3,000-5,000 תאים / מ"ל צלוחיות או 60 מנות מ"מ מצופה בתערובת של חלבונים בממברנה במרתף האדם כולל פיברונקטין, קולגן מסוג IV, ו laminin (FCL), ב 0.5-1 מיקרוגרם / 2 ס"מ, ב KSFM בֵּינוֹנִי.
  7. התרבות התאים בתוך (% 95 או לחות גבוהה) humidified CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עד שהם יוצרים monolayers ומחוברות במלואו. פעולה זו עשויה להימשך 1-2 שבועות.
    הערה: באופן קבוע לאשר את זהות התא על ידי מכתים immunocytochemical חיובית עבור סמנים המשוערת LESC כולל Pax6, קרטין (K) 14, K15, K17, ו ΔNp63α. הפרטים המכתימים כולל הנוגדנים הראשוניים פורסמו 8,16-18,22.
  8. למעבר התאים והמחוברים, להתייחס אליהם עם 1 מיליליטר של 0.05% פתרון טריפסין (1: 5 דילול של פתרון 0.25%) במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הוסף 5 מ"ל סויה trפתרון ypsin מעכב (10 מ"ג / מ"ל) מדולל 1: 4 במדיום, צנטריפוגות התאים כמו 3.5.
  9. שטוף את התא הגלול ב 3 מיליליטר של תמיסת מעכב טריפסין סויה מדוללת. פלייט תאים על-מצופה FCL (ראה 3.7) מנות או שקופיות קאמרית זכוכית ב 2 x 10 4 תאים / מ"ל.

4. תמרת adenoviral של קרניות איברים-תרבותיים

הערה: adenoviruses רקומביננטי (AV) כוללים AV-וקטור (לא הגן הוכנס), AV-cmet (עם מסגרת קריאה פתוחה גן-נפגשו ג), AV-shM10 (עם shRNA כדי MMP-10), ו AV-shCF ( עם shRNA כדי cathepsin F). הם E1 / E3-deleted סוג 5 AV לבטא גנים תחת השליטה של ​​אמרגן ציטומגלווירוס מוקדם המיידי הגדול. וירוסי AV-cmet נוצרים באמצעות כרית וקטור AV / CMV / V5-DEST 16. הוירוסים AV-shRNA נוצרות מותאם אישית על ידי subcloning של רצפי shRNA יחד עם האמרגן HH1 ורצף תג ה- GFP מן וקטור iLenti-EGFP לתוך שכפול-יוצלח (-E1 / -E3) הומאn AV סוג 5 הגנום באמצעות Adeno-4 ביטוי במערכת 17.

  1. Transduce קרני איבר תרבותי אחד מכל זוג עם וקטור AV ועוד קרני, עם AV ויסות-ביטוי גנים. השתמש-cmet AV 0.8 כדי 1.25 x 10 8 יחידות להרכיב פלאק (pfu) לכל קרנית במדיום התרבות במשך 48 שעות ב 37 ° C שמירת הקרניות מתחת לפני השטח הבינוני כל אחד טוב של צלחת 24 באר. השתמש וירוסי AV-shRNA ב 1-2 x 10 8 pfu לכל קרנית.
  2. השתמש וירוסים עבור התמרה במדיום מלא בתוספת 75 מיקרוגרם / מ"ל ​​סילדנאפיל. מגיב זה מפעיל את תחבורת caveolin הקלה ספיגה ויראלי ידי לתאי האפיתל 21. בשל מחצית חיים קצרים של sildenafil בתמיסות מימיות, מחדש להוסיף את אותה הכמות של 4-5 שעות הבינוניות מאוחר יותר. הטיפול הסטנדרטי הוא למשך 48 שעות.
  3. עבר קרניות כדי מנות חדשות עם מרית תרבות סטרילי סוף סיבוב במדיום ללא AV שמירה על הרמה הבינונית בבית לימבוס. לאחר ההרחבהitional 4-8 ימים בממשק הנוזל-האוויר, תהליך קרני שטופל AV עבור ניתוחים או בדיקה שונים לריפוי פצע אפיתל (ראה לעיל). באופן שגרתי ללחלח את הקרניות במהלך התרבות על ידי הוספת 100 בינוני μl (שתי טיפות) על גבי הקרנית.
  4. עבור התמרה של תאים לימבלית בלבד, דגירת הווירוסים עם הקרניות על הממשק הנוזל אוויר עם רמה בינונית בבית לימבוס, כדי למנוע תמרה של האפיתל המרכזי.

5. התמרה adenoviral של תאים בתרבית לימבלית

  1. שמירה על תרבויות LESC מועשר בטווח הבינוני עם 10 ng / ml EGF (ראה 3.5) על צלחות פלסטיק מצופה בתערובת FCL ברמה של 0.5 מיקרוגרם / 2 ס"מ.
  2. Transduce תאים בתרבית שהגיעו 70-80% confluency עם AV מחסה הגן חלבון פלואורסצנטי ירוק (AV-GFP) או shRNA-GFP-מקושקשות AV במגוון של ריבוי של זיהום (משרד הפנים: 1-300 pfu / תא) , בטווח הבינוני עם 2 ng / ml EGF. בצעו את transduction עבור 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס בהיקף מינימלי (0.2 מ"ל) ואחריו 20 שעות ב 0.5 מ"ל בינוני. Sildenafil מפעיל התחבורה caveolin אינו נחוץ עבור התמרה תרבית תאים.
  3. השתמש באחת ריאגנטים הבאים המאפשרים AV מחייב פני התא כדי לשפר את היעילות התמרה AV: או polycations מגיב התמרה (1 מיקרוגרם / מ"ל ​​פולי- L- ליזין או 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​polybrene), או 6 μl / מ"ל ​​( למשל, ViraDuctin), או 20 μl / מ"ל משפר התמרה (למשל, ibiBoost).
  4. לאחר ההחלפה הבינונית עבור אחד ללא AV, דגירת תאים בתרבית למשך 4 ימים, בחממת humidified CO 2 ולהעריך רמת ביטוי GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך.
  5. השתמש assay ריפוי פצע השריטה להעריך נדידת תאים בתרבויות-transduced AV. לגדל את תאי השקופיות הקאמריות multiwell. הפוך את הפצעים בשכבה ידי גירוד תאים בתנועה ליניארית ישר עם pi 200 μlטיפ pette. לאחר ופצעו, לשנות את המדיום עבור אחד טרי כדי להסיר את התאים מנותקים.
  6. לצלם את אבריהם כל יום עם מצלמה דיגיטלית המחוברת מיקרוסקופ הפוכה בהגדלה 4X. רשמו את הזמן שבו הריפוי יושלם (בקצות הפצע באים במגע לאורך הפצע כולו).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הראינו בעבר כי בתרבויות האיברים הקרניות, ההבדלים בביטוי של סמנים סוכרים (למשל, חלבונים בממברנה מרתף integrin α3β1) וריפוי פצעים בין הקרניות הנורמליות סוכרת נשמרים. מערכת תרבות זו הייתה נתון הריפוי הגנטי שמטרתה נרמול רמות סמנים שינה-סוכרת, c-Met, MMP-10, ו cathepsin פ

כאשר האפיתל של הקרנית כולה transduced עם AV-cmet, או AV-shRNA כדי MMP-10 או cathepsin F (בנפרד או בשילוב), ריפוי פצע אפיתל הושלם מהר יותר באופן משמעותי (P <0.03 על ידי מבחן t סטודנטים לזווג לעומת AV-וקטור) מאשר הקרניות בחור AV-transduced וקטור מאותו תורמים 16,17. AV-cmet הקטין את זמן ההחלמה בחצי, אשר לא היה שונה באופן משמעותי מן הריפוי של הקרניות הנורמליות (figuמחדש 1). AV-shM10 ו AV-shCF היתה השפעה קטנה יותר. עם זאת, שילוב של AV-cmet עם AV-shM10 ו AV-shCF (קומבו) הפיק את האפקט החזק לחלוטין נרמול פעמים ריפוי אפיתל (איור 1). צמצום זה זמן החלמה לווה הדפוסים המנורמלים של (קרום מרתף integrin) סוכרת גזע סמני תא קרניות סוכרת 8,16,17.

תאי גזע אפיתל הם הפצע הגדול ריפוי משתתפים 4. לכן, בדקנו האם ריפוי גנטי לימבלית מיקוד תא תאי גזע יהיה מועיל עבור הקרניות סוכרתית. לשם כך, רק את החלקים לימבלית של קרניות הסוכרת היו transduced ידי AV-cmet או קומבו וגדול, 8.5 פצעי מ"מ נוצרו. קרניות transduced AV-cmet נרפאו מהר יותר באופן משמעותי (P <0.001 על ידי מבחן t מזווג Student) מאשר וקטור AV transduced קרני בחור (איוריור 2). טיפול קומבו הביא לאותה התוצאה 18. ריפוי גנטי הגדילה את הביטוי של סמנים שהודחק סוכרת, כגון α3β1 integrin ורכיב קרום במרתף nidogen-1 (איור 3, עמודות משמאל, קומבו). חשוב לציין, כמו התמרה הקרנית כולה 8,17, טיפול הגן לימבלית עם או AV-cmet או קומבו הוביל ביטוי מוגבר משמעותי של סמנים המשוערת LESC כולל K15 ו ΔNp63α, לעומת קרניות transduced וקטור AV (איור 3 , עמודות מימין, הן נפגשו ג ו קומבו). נתונים אלו תמכו את התפקיד של נורמליזציה בתאי גזע לריפוי הפצע המואץ על ריפוי גנטי של קרניות סוכרות ולהראות את הכדאיות של גישתנו לטיפול במחלת קרנית סוכרתית.

אנו סומכים החל לבחון את השפעות הריפוי הגנטי בתאי אפיתל limbal תרבותיים מועשר LESC. התרבויותשל תאי אפיתל limbal הנורמלים סוכרת הוקמו מוכתם עבור סמני LESC משוערים. תאים רבים מוכתמים חיובי (איור 4). העוצמת מכתים בתרבויות הסוכרת הייתה חלשה באופן עקבי מאשר ההתרבויות הנורמליות (K15 לראות כדוגמא באיור 4), אשר היו דומה מאוד למצב הסוכר לעומת נורמלי vivo לשעבר קרניות 8. ניסויים אלה תוקפים בתרביות התאים להשיג גם מתאים הריפוי הגנטי.

ניסויים ראשוניים עם קו תא אפיתל קרני-הנציח טלומרז (ראה 23) הראו כי התאים היו transduced בקלות על ידי בונת AV הזמינה (מידע לא מוצג כאן). עם זאת, התרבויות לימבלית העיקריות הוכיחו להיות הרבה יותר רגיש לעומס הנגיפי ו / או מגיב התמרה, הדבר מחייב אופטימיזציה של פרוטוקול התמרה. התמר התא לימבלית התרבותית ידיAV-GFP (האיור 5) תלוי הריבוי של זיהום (משרד הפנים, טווח 30-300 pfu / תא) וכתוצאה מכך לרמה גבוהה למדי של תמרה ב גבוהה מואה (ביטוי של GFP> תאי 80%). עם זאת, משרד הפנים הגבוה היה גם רעיל, גרימת מוות של תאים או נדידת תאים נפגעת קשות אל פצעי השריטה לאחר 3-4 ימים של תמרה (איור 6). במשרד הפנים הנמוך (10-30 pfu / תא), תמרת AV מיוצרת פחות או אין השפעה ציטוטוקסית, אבל הבאתי מספר ירד תאים להביע GFP (5-15%).

אנחנו הבאים ניסינו להגביר את היעילות התמר מבלי להתפשר כדאיויות תא באמצעות ריאגנטים משפרים התמרו כי בדרך כלל להקל על AV מחייב פני התא. הם הראו שיפורי יעילות שונים התמרה תא אפיתל limbal ידי AV ב משרד הפנים 10-30. polycations השני, פולי- L- ליזין, ו polybrene, היו רעילים היעיל ביותרוכתוצאה מכך להגדיל 3-4 של פי מספר התאים GFP חיובי (איור 7, בשורה העליונה). ibiBoost היה גם יעיל אך מעט רעיל, ViraDuctin היה יעיל למדי רעיל (איור 7, בשורה תחתונה). לכן, polycations להציע דרך בטוחה ויעילה כדי להגביר את הגן הביטוי הרב-ממדי התמרה AV ויש להשתמש בהם עבור ביטוי גנים ולפצוע ניסויים ריפוי.

איור 1
איור 1: תמרת גן c-Met מוביל לירידה משמעותית פצע בקרנית אפיתל זמן החלמה (ממוצע ± SEM). יתר על כן, ריפוי גנטי משולב (קומבו) במתן מחסה AV ג-נפגשו גנים shRNAs כדי MMP-10 וגנים cathepsin F לחלוטין מנרמל זמן ריפוי הפצע אפיתל. (ערכי p) משמעות הוקמו על ידי מבחן t סטודנטים לזווג בהשוואת respectiv טיפולי וקטור דואר. ברים מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: ריפוי של 8.5 מ"מ פצעים אפיתל בזוג קרניות סוכרתיות. בשורה עליונה, קרנית transduced וקטור; הריפוי הושלם ב -8 ימים. שורה תחתונה, AV-cmet transduced קרני עמית; הריפוי הושלם ב 5 ימים. חצים מראים פצע (W) קצה. *, החלק הלא-נרפא (גם לראות בהגדלה גבוהה כמו הבלעה), עם keratocytes סטרומה apoptosed בצורת עכביש. הם גלויים עד שכבת האפיתל גדל על גבי אותם. בר = 50 מיקרומטר. בניגוד שלב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ove_content "FO: keep-together.within-page =" 1 "> איור 3
איור 3: Immunostaining סעיפים קרניים סוכרתיים עבור סמנים שונים לאחר ריפוי הגנטי לימבלית. שני AV-cmet וטיפולים קומבו לגרום מכתים לימבלית גדל במידה ניכרת עבור סמנים סוכרים (α3β1 integrin ו nidogen-1) וסמנים תאים גזע משוערים (K15 ו ΔNp63α). חצים על לוחות-1 nidogen לסמן קרום במרתף אפיתל קרני. בר = 30 מיקרומטר. דואר, אפיתל; ים, stroma. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: מכתים Immunocytochemical של תרבויות אפיתל limbal עיקריות עבור K15 סמן משוער LESC. בשורה עליונה, תרבות נורמלית; רוב sho תאים מכתים חזק w עבור K15. שורה תחתונה, תרבות סוכרת; רוב התאים להראות מכתים חלש בלבד. הפנלים התקינים מוצגים עם counterstaining הגרעיני DAPI. בתאים הבריאים סוכרתיים צולמו עם זמן החשיפה אותה. בר = 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: רמת-ביטוי של GFP בתאי אפיתל limbal transduced תלוי הפנים של-GFP AV: (א) 30 pfu / תא; (ב) 120 pfu / תא; (ג) 300 pfu / תא 3 ימים של תמרה. תמונות של תאי חיים מוצגות. בר = 300 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

class = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> איור 6
איור 6: נדידת תאים מושפעת לרעה על ידי הגדלת ריכוז של AV, כפי שהיא מתגלה על ידי מבחן פצע שריטה: (א) שליטה; (ב) 20 pfu / תא; (ג) 80 pfu / תא; (ד) 120 pfu / תא. תמונות של תאי חיים מוצגות. בר = 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
איור 7: תאי אפיתל limbal transduced עם AV-GFP 30 pfu / תא. (א) שליטה; (ב) פולי- L- ליזין; (ג, ד) מגיב תמרה; 5 ימים של תמרה. ג מגיב תמרהaused אפקט ציטוטוקסי משמעותי שמוביל עיגול ומות תא (ד, לעומת שלב). תמונות של תאי חיים מוצגות. בר = 400 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הקרנית שנראית רקמות אידיאליות עבור ריפוי גנטי בשל המיקום פני השטח שלו שבו למסירת הגן, כמו גם להערכת השפעות היעילות בצד, קלה. עם זאת, תרגום קליני של גישה חזקה זה עדיין איטי בשל מידע נדיר על גורמים גנטיים של המחלות הקרניות ואת מטרות הריפוי הגנטי 24. סיבוכים סוכרים כולל שינויים בקרנית עלולים להיות אפיגנטיים בעיקר בטבע, אשר מיתרגם זיכרון מטבולי 9. מסיבה זו, הרקמות הסוכרות והתאים לשמר הליקויים שלהם לשעבר vivo ו ניתן ללמוד בתרבות האיברים ורקמות. כמו כן, סוכרת גורמת לשינויים ספציפיים רמות ביטוי גני הדפוסים שעשויים להיות מתוקן על ידי הריפוי הגנטי. זיהינו מספר סמנים שינו באפיתל הקרנית הסוכרת כולל 5,6,8 תא תאי גזע, והשתמשתי תרבויות איבר הקרניות אדם 7,8 לנרמל ידיריפוי גנטי ביטוי הסמן וריפוי פצע אפיתל נפגע בתוך הקרנית הסוכרתית.

בחרנו AV כזרוע למסירת הגן בשל ביטוי transgene החזק שלה, טבעה הלא שילוב, סלקטיביות שלה עבור תאי אפיתל, אשר הם איכויות מעולות לאלה של הנגיף קשור-adeno (AAV) 25. תמרת AV של תרבויות איבר הקרניות יש כמה שלבים קריטיים. הקרניות צריכות להיות מועברות למעבדה בתוך 48 לאחר מות hr, כדי למזער את ההפסד של האפיתל המתרחשת במהלך האחסון. כדי להגביר את ספיגת ויראלי, חשוב להוסיף מאיצי תחבורה caveolae, כגון sildenafil, במהלך התמרה 21. כאשר אימות השפעת התמרה על ביטוי החלבון, השימוש מספר סמנים מומלץ (איור 3), כסמנים תאי גזע ספציפי אינם מזוהים באופן סופי. בעת ביצוע הפצעים אפיתל, יש הכרח להשתמש cheמיכל טרי עקב מצבם הבלתי היציב של הקרום במרתף סוכרת אפיתל וכתוצאה מכך הניתוק שלה במהלך גירוד ידני. ניטור יומי זהיר של תהליך הריפוי נדרש עם קריטריונים אובייקטיביים של ריפוי, כגון היעלמות keratocytes subepithelial מתה מן העין כאשר האפיתל ששב ומגדל עליהם (איור 2). לבסוף, בשל כמה AV ו / או רעילות GFP לתאי לימבלית העיקרי, חשוב להוריד את מינון ויראלי, בעת ובעונה אחת באמצעות מאיצי התמרה רעילים, כגון polycations, כדי להבטיח התמרה יעילה ובטוחה (איורים 5 - 7).

מערכת הריפוי הגנטית עשויה להיות שונה כדי להשתמש קרניות איבר תרבותי חיה. הם הרבה יותר זולים מאשר אדם, יכולים להתקבל כתוצאת כמויות על בסיס קבוע, והוא עשוי להיות מתאים להקרנה, למשל, של תרופות ריפוי-ויסות פצע. עם זאת, קרניות האדם מציעות מגוון אפשרויות רחבות יותר פוטנציאלי עבורהמחקר בשל שפע של חומרים כימיים, במיוחד נוגדנים. במקרה של הקרנת סמי קרניות חיה הלא סוכרתיות, את הטריה עשויה להתבצע באופן מכאני. אם נוגדן עבור סמן מסוים לא עובד טוב בחלק קרניות אדם, זה יכול להיות בגלל השתנות הפרט ו / או משך המחלה או חומרתה. במקרה זה, בחינת סמנים אחרים עשויים להיות מומלץ. היכולת של n-heptanol להסרת התאים עלולה להפחית באופן משמעותי לאורך זמן, ככל הנראה בשל החמצון במהלך האחסון. אם זה קורה, חדשות, בעבר סגור, בקבוקון ייתכן שיהיה צורך בשימוש. אם עובד עם קרניות האדם היקרות, סיבוב שני של הטריה עשוי להיות ניסיון. יש Sildenafil זמן מחצית חיים קצרים בתמיסות מימיות; ולכן, זה חייב להיות מוכן טרי בכל פעם תמרה קרנית מתבצעת. ההצלחה של תאים culturing לימבלית עשוי להיות תלוי גיל התורם; תאי מתורמים צעירים בדרך כלל לגדול טוב יותר. סוכן ריפוי גנטי יחיד לא יכול לעורר signifאפקט icant; במקרה זה, שילוב של סוכנים כאלה עשויים להיות 17 אופטימלית. אם התאים הקרניים העיקריים להראות סימנים של רעילות, חשוב להפחית את ויראלי polycation (למשל, פולי- L- ליזין) במינונים למזער השפעה רעילה תוך השמירה התמרו יעיל.

למרות תרבויות איבר סוכרת לשכפל סימנים רבים של המחלה ועל ביטוי גנים שהשתנו, הם denervated וחסרים את אספקת תאי מערכת החיסון, אשר עשויים להשפיע על ריפוי הפצע תאי גזע. מבחינה זו, במודלים של בעלי החיים עשויים להציע כמה יתרונות, אך החיות אינן לשכפל את מלוא הספקטרום של סימני מחלה בבני אדם. יעדי הריפוי גנטי האחרים קיימים לנרמל קרניות סוכרת ביעילות. דוגמא מטרות כאלה עשויה להיות microRNA, במיוחד, מיר-146a או mir-424 23. השילובים של שינויי גן המטרה בשימוש עם העיכוב של מבוקש microRNA פוטנציאלי עלולים לייצר השפעה חיובית יותר חזקה. Anothאה הגבלה כולל ההכרח דגירה ארוכה יחסית של הקרנית עם AV מנוהל מקומי (למשל, בצורה של טיפות עיניים) כדי להבטיח ספיגת ויראלי מקסימלית. זה עלול להוות בעיה במרפאת, למרות מקליטת העפעפיים יכולים לסייע בהארכת הדגירה. השימוש של ריכוז נמוך של sildenafil בפתרון ויראלי יכול להאיץ את ספיגת AV. השפעת תמרת AV היא חולפת, אשר עשוי להגביל את פוטנציאל הריפוי של הריפוי הגנטי מבוסס AV. למרות שזה נמשך מספיק זמן כדי לתקן את האטת ריפוי פצע הסוכרת, מתמשך נורמליזציה של תאי גזע אפיתל עשוי לדרוש השפעה לאורך זמן רב יותר, כגון המסופקת על ידי הריפוי הגנטי מבוסס AAV 24. יצוין כי immunogenicity היה חסרון רציני של וקטורי AV מוקדם. עם זאת, AV רקומביננטי מהדור החדש כולל וירוסים "gutless" חופשי במידה רבה של תופעת לוואי זו, הגדלת סיכוייהם להיות translati החזקכלי רכב ריפוי גנטי onal 26.

מאפננים מולקולה קטנה של מסלולים שונים שעשויים להיות חשובים עבור ריפוי הפצע 16,17,21, 27-30 משמשים מודלים ניסיוניים המרפאה. עם זאת, הם אינם ממוקדים לסוג תא מסוים, עשוי להיות השפעות שונות בתאים שונים, ועשוי לפעול רק על היבטים מסוימים של המחלה הקרנית סוכרת 31,32. טיפול הגן מציע אפשרות לשנות את ביטוי הגנים בכיוון רצוי תאים ספציפיים, אשר השיגו בעבודה זו transducing לתאי האפיתל הוא באמצעות ביטוי יתר הגן (c-Met) והשתקה (MMP-10 ו F cathepsin). גישה זו גם מאפשרת ויסות הביטוי של גני סמן מחלה ספציפיים, בזה אחר זה או בצירופי 5,6. הניסויים שלנו הראו כי גם במקרה של שילוב של שלושה AVS מחסה מאפנן ביטוי גנים שונים, כל שלושת הגנים הושפעו כצפוי, ואתהטיפול היה יעיל יותר כאשר כל AV שימש לבד 17.

בשנת keratopathy סוכרתית חמורה עם מומים אפיתל מתמשך או ריפוי אפיתל שלם על vitrectomy או photocoagulation לייזר, תחליף של תאי גזע limbal מתפקדת עשוי להוות אלטרנטיבה ריפוי גנטי. במקרים אלה, תאי אפיתל limbal מתורבתים והרחיבו על ריפוי גנטי במבחנה ניתן להשתיל על הקרניות החולות. הנתונים שלנו מראים כי תאי לימבלית תרבותי מן הקרניות הסוכרות להראות הבדלים דומים ביטוי סמן תא גזע כמו קרניות vivo לשעבר הפכו אותם למטרות טובות עבור הריפוי הגנטי. עם זאת, טיפול זה צריך להיות מותאם, בשל הרגישות הגבוהה של תאים כאלה כדי מגיבים עומס transfection ויראלי בשימוש. הצלחנו להראות כי ריאגנטים transfection קטיוני הבטיחו אספקה ​​יעילה ובטוחה עם ביטוי גבוה של גן של עניין האפיתל של הקרנית סוכרת תרבותי. Tתוצאות hese עשויות לסלול את הדרך עבור ריפוי גנטי מוצלח של במבחנה המורחבת LESC למטרות ההשתלה בעתיד במקרים של keratopathy הסוכרתית החמורה. בגלל מחסור תורשתי רכש LESC קשור גם להפחתת עצבים קרניים דומים סוכרת 33,34, ההשתלה של תרבויות LESC מועשרות בריאות על הקרניות החולות עלולה להקל על נוירופתיה הסוכרתית הקרנית גם כן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
minimum essential medium Thermo Fisher Scientific 11095-080
Optisol-GS  Bausch & Lomb 50006-OPT
ABAM antibiotic-antimycotic mixture Thermo Fisher Scientific 15240062
calf skin collagen  Sigma-Aldrich  C9791
agar, tissue culture grade Sigma-Aldrich  A1296
n-heptanol Sigma-Aldrich  72954-5ML-F
O.C.T. compound  VWR International 25608-930
Dispase II  Roche Applied Science 4942078001
keratinocyte serum-free medium (KSFM)  Thermo Fisher Scientific 17005042
EpiLife medium with calcium Thermo Fisher Scientific MEPI500CA
N2 medium supplement, 100x Thermo Fisher Scientific 17502-048
B27 medium supplement, 50x Thermo Fisher Scientific 17504-044
human keratinocyte growth supplement, 100x Thermo Fisher Scientific S-001-5
trypsin 0.25% - EDTA 0.02% with phenol red Thermo Fisher Scientific 25200056
trypsin 0.25% with phenol red Thermo Fisher Scientific 15050065
soybean trypsin inhibitor  Sigma-Aldrich  T6414
fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 26140079
insulin-transferrin-selenite supplement (ITS) Sigma-Aldrich  I3146-5ML
antibody to keratin 14 Santa Cruz Biotechnology sc-53253
antibody to keratin 15 Santa Cruz Biotechnology sc-47697
antibody to keratin 17 Santa Cruz Biotechnology SC-58726
antibody to ΔNp63α Santa Cruz Biotechnology sc-8609
antibody to PAX6 BioLegend PRB-278P-100
antibody to nidogen-1 R&D Systems MAB2570
antibody to integrin α3β1 EMD Millipore MAB1992
human fibronectin BD Biosciences 354008
human laminin Sigma-Aldrich  L4445
human type IV collagen Sigma-Aldrich  C6745-1ML
adenovirus expressing MMP-10 shRNA Capital BioSciences custom made
adenovirus expressing cathepsin F shRNA Capital BioSciences custom made
adenovirus expressing scrambled shRNA and GFP Capital BioSciences custom made
adenovirus expressing c-met OriGene (plasmid) SC323278
adenovirus expressing GFP KeraFAST FVQ002
sildenafil citrate, 25 mg Pfizer from pharmacy
epidermal growth factor  Thermo Fisher Scientific PHG0311
poly-L-lysine Sigma-Aldrich  P4707
polybrene Sigma-Aldrich  107689-10G
ViraDuctin Cell Biolabs AD-200
ibiBoost ibidi, Germany 50301
phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010049
Corning round end spatula  Dow Corning 3005
60 mm Petri dishes Thermo Fisher Scientific 174888
Nunc Lab-Tek II multiwell chamber slides  Sigma-Aldrich C6807
200 μl pipet tips Bioexpress P-1233-200 other suppliers available
inverted microscope  Nikon Diaphot other suppliers/models available
humidified CO2 incubator  Thermo Fisher Scientific 370 (Steri-Cycle) other suppliers/models available
fluorescent microscope Olympus, Japan BX-40 other suppliers/models available
dissecting stereo microscope Leica, Germany S4 E other suppliers/models available

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bikbova, G., Oshitari, T., Tawada, A., Yamamoto, S. Corneal changes in diabetes mellitus. Curr Diabetes Rev. 8 (4), 294-302 (2012).
  2. Calvo-Maroto, A. M., Perez-Cambrodí, R. J., Albarán-Diego, C., Pons, A., Cerviño, A. Optical quality of the diabetic eye: a review. Eye (Lond). 28 (11), 1271-1280 (2014).
  3. Tripathy, K., Chawla, R., Sharma, Y. R., Venkatesh, P., Vohra, R. Corneal changes in diabetes mellitus. DOS Times. 20 (5), 55-58 (2015).
  4. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Prog Retin Eye Res. 49, 17-45 (2015).
  5. Saghizadeh, M., et al. Overexpression of matrix metalloproteinase-10 and matrix metalloproteinase-3 in human diabetic corneas: a possible mechanism of basement membrane and integrin alterations. Am J Pathol. 158 (2), 723-734 (2001).
  6. Saghizadeh, M., et al. Proteinase and growth factor alterations revealed by gene microarray analysis of human diabetic corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (10), 3604-3615 (2005).
  7. Kabosova, A., Kramerov, A. A., Aoki, A. M., Murphy, G., Zieske, J. D., Ljubimov, A. V. Human diabetic corneas preserve wound healing, basement membrane, integrin and MMP-10 differences from normal corneas in organ culture. Exp Eye Res. 77 (2), 211-217 (2003).
  8. Saghizadeh, M., et al. Alterations of epithelial stem cell marker patterns in human diabetic corneas and effects of c-met gene therapy. Mol Vis. 17, 2177-2190 (2011).
  9. Kowluru, R. A., Kowluru, A., Mishra, M., Kumar, B. Oxidative stress and epigenetic modifications in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 40-61 (2015).
  10. Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. J Cell Sci. 111 (Pt 19), 2867-2875 (1998).
  11. Lu, L., Reinach, P., Kao, W. W. Corneal epithelial wound healing. Exp Biol Med. 226 (7), 653-664 (2001).
  12. Rama, P., et al. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. N Engl J Med. 363 (2), 147-155 (2010).
  13. Di Girolamo, N., et al. Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea. Stem Cells. 48 (1), 203-225 (2014).
  14. Amitai-Lange, A., et al. Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
  15. Di Girolamo, N. Moving epithelia: Tracking the fate of mammalian limbal epithelial stem cells. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 203-225 (2015).
  16. Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-met gene. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (4), 1970-1980 (2010).
  17. Saghizadeh, M., et al. Enhanced wound healing, kinase and stem cell marker expression in diabetic organ-cultured human corneas upon MMP-10 and cathepsin F gene silencing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8172-8180 (2013).
  18. Saghizadeh, M., Dib, C. M., Brunken, W. J., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and stem cell marker patterns in organ-cultured human diabetic corneas by gene therapy of limbal cells. Exp Eye Res. 129 (Dec), 66-73 (2014).
  19. Hatchell, D. L., et al. Damage to the epithelial basement membrane in the corneas of diabetic rabbits. Arch Ophthalmol. 101 (3), 469-471 (1983).
  20. Chung, J. H., Kim, W. K., Lee, J. S., Pae, Y. S., Kim, H. J. Effect of topical Na-hyaluronan on hemidesmosome formation in n-heptanol-induced corneal injury. Ophthalmic Res. 30 (2), 96-100 (1998).
  21. Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Res Bull. 81 (2-3), 262-272 (2010).
  22. Sareen, D., et al. Differentiation of human limbal-derived induced pluripotent stem cells into limbal-like epithelium. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1002-1012 (2014).
  23. Funari, V. A., et al. Differentially expressed wound healing-related microRNAs in the human diabetic cornea. PLoS One. 8 (12), e84425 (2013).
  24. Mohan, R. R., Rodier, J. T., Sharma, A. Corneal gene therapy: basic science and translational perspective. Ocul Surf. 11 (3), 150-164 (2013).
  25. Liu, J., et al. Different tropism of adenoviruses and adeno-associated viruses to corneal cells: implications for corneal gene therapy. Mol Vis. 14, 2087-2096 (2008).
  26. Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4 (5), 346-358 (2003).
  27. Sharma, G. D., He, J., Bazan, H. E. P38 and ERK1/2 coordinate cellular migration and proliferation in epithelial wound healing: evidence of cross-talk activation between MAP kinase cascades. J Biol Chem. 278 (24), 21989-21997 (2003).
  28. Saika, S., et al. Role of p38 MAP kinase in regulation of cell migration and proliferation in healing corneal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (1), 100-109 (2004).
  29. Xu, K. P., Li, Y., Ljubimov, A. V., Yu, F. S. High glucose suppresses epidermal growth factor receptor/phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway and attenuates corneal epithelial wound healing. Diabetes. 58 (5), 1077-1085 (2009).
  30. Xu, K., Yu, F. S. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3301-3308 (2011).
  31. Takamura, Y., et al. Aldose reductase inhibitor counteracts the enhanced expression of matrix metalloproteinase-10 and improves corneal wound healing in galactose-fed rats. Mol Vis. 19, 2477-2486 (2013).
  32. Byun, Y. S., Kang, B., Yoo, Y. S., Joo, C. K. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves corneal epithelial innervation and wound healing in diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1948-1955 (2015).
  33. Deng, S. X., et al. Characterization of limbal stem cell deficiency by in vivo laser scanning confocal microscopy: a microstructural approach. Arch Ophthalmol. 130 (4), 440-445 (2012).
  34. Lagali, N., et al. In vivo morphology of the limbal palisades of Vogt correlates with progressive stem cell deficiency in aniridia-related keratopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5333-5342 (2013).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 110 קרנית סוכרת ריפוי גנטי אדנו MMP-10 F cathepsin c-Met תאי גזע limbal תרבות איבר polycations shRNA ריפוי פצעים תרבית תאים
תרפיה adenoviral ג&#39;ין עבור סוכרתית keratopathy: השפעות על ריפוי פצע גזע ביטוי נייד מרקר ב קרניות אדם איברים בתרבית תאים לימבלית אפיתל
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kramerov, A. A., Saghizadeh, M.,… More

Kramerov, A. A., Saghizadeh, M., Ljubimov, A. V. Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (110), e54058, doi:10.3791/54058 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter