Summary
Selettivamente l'etichetta fluorescente GnRH-I, -II e -III derivati sono strumenti affidabili per il monitoraggio e la quantificazione loro assorbimento cellulare. Questo manoscritto introduce esperimenti di visualizzare, quantificare e confrontare l'efficienza di assorbimento di questi coniugati GnRH in diverse linee cellulari.
Abstract
analoghi del GnRH sono efficaci frazioni di targeting e in grado di fornire agenti antitumorali selettivamente nelle cellule tumorali maligne che i recettori del GnRH altamente espresso. Tuttavia, l'analisi quantitativa di assorbimento cellulare GnRH analoghi 'ei tipi di cellule indagati in sistemi di drug delivery GnRH-based sono attualmente limitati. In precedenza introdotto, fluorescente selettivamente etichettato GnRH I, -II e -III derivati fornire grande rilevabilità, e hanno gli immobili chimici per esperimenti riproducibili e robusti. Abbiamo anche trovato che i metodi appropriati up-to-date con questi analoghi del GnRH etichettati potrebbero offrire nuove informazioni sui sistemi di somministrazione dei farmaci a base di GnRH. Questo manoscritto introduce alcuni esperimenti semplici e veloci per quanto riguarda l'assorbimento cellulare di [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-II e [Lys 8 (CIC)] - GnRH -III sulla EBC-1 (polmone), la BxPC-3 (pancreas) e sul Detroit-562- (faringe) maligno tumor cellule. Parallelamente a queste coniugati GnRH-FITC, il livello della superficie cellulare dei recettori GnRH-I è stato esaminato anche su queste linee cellulari, prima e dopo il trattamento GnRH dal microscopio confocale a scansione laser. L'assorbimento cellulare di coniugati GnRH-FITC è stato quantificato con la fluorescenza-attivato l'ordinamento delle cellule. In questi esperimenti è stata osservata piccole differenze tra analoghi del GnRH e le principali differenze tra i tipi di cellule. Le differenze significative tra le linee cellulari sono correlati con il loro livello distinto di recettori di superficie delle cellule GnRH-I. Gli esperimenti introdotti contengono metodi pratici per visualizzare, quantificare e confrontare l'efficienza di assorbimento di coniugati GnRH-FITC in un tempo e modo dipendente dalla concentrazione su varie colture cellulari aderenti. Questi risultati potrebbero prevedere il drug targeting efficienza dei coniugati GnRH sulla data coltura cellulare, e di offrire una buona base per ulteriori esperimenti in esame dei sistemi di somministrazione dei farmaci a base di GnRH.
Introduction
Sistemi di drug delivery mirati a base di peptidi sono diventati un rapido sviluppo e la zona promettente nella terapia del cancro negli ultimi anni 1, 2. Gonadotropina umana di tipo rilasciando recettore dell'ormone I (GnRH-IR) si trova principalmente nella ghiandola pituitaria, ma è presente anche in molti altri tessuti che sono responsabili per l'auto-riproduzione 3. GnRH-IR si esprime anche in un certo numero di tessuti tumorali, collegate o indipendenti per il sistema riproduttivo 4, 5. L'elevata espressione di GnRH-IR in diverse cellule tumorali maligne rispetto ai tessuti sani prevede la possibilità per la terapia mirata 5, 6.
Molti dell'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH) analoghi sono stati sviluppati negli ultimi decenni, che potrebbero essere utilizzati come target porzionif "> 7, 8, 9. Questi peptidi sono in grado di rilasciare agenti antitumorali con elevata selettività in cellule tumorali maligne che over-esprimono GnRH-IR 6. Diversi GnRH farmaci anti-tumorali coniugati con elevata selettività e migliore efficienza rispetto al corrispondente coniugato droga libera sono stati segnalati 7, 8, 9.
Precedenti pubblicazioni su peptidi GnRH e dei loro recettori hanno riferito che il GnRH-IR può assumere diverse conformazioni che hanno selettività diverso per GnRH analoghi della 10. Il GnRH-IR altamente variabile ha vie di segnalazione complesse e varie sono dotati di diversa attività contro i loro ligandi naturali e artificiali 11. Questi fatti fanno indagini di sistemi basati su GnRH impegnativo. D'altra parte, la y possiedono potenziale terapeutico promettente. Diversi esperimenti con peptidi radiomarcati GnRH sono stati precedentemente riportati 12, 13, 14, 15, ma esperimenti in cui sono stati usati gli analoghi del GnRH fluorescente sono ancora limitate. Mentre marcatura radioattiva offre alta sensibilità, marcatura fluorescente ha diversi altri vantaggi, ad esempio la maneggevolezza e la capacità di colorazione di contrasto con differenti fluorofori. Tre analoghi del GnRH comuni che sono stati usati con successo per somministrazione di farmaci sono i [D-Lys 6] -GnRH-I, [D-Lys 6] -GnRH-II e III-GnRH, ma l'efficacia di questi peptidi come porzioni di targeting è raramente rispetto 16, 17. D'altro canto, i risultati di esperimenti separati in cui sono stati utilizzati differenti cellule tumorali e analoghi GnRH è varia.
S copi "> Sulla base di queste considerazioni, si concentra sul tumore targeting e potenziale drug delivery di questi peptidi GnRH, e così sintetizzato e caratterizzato [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC )] - GnRH-II e [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III coniugati peptide 18 Questi analoghi sono selettivamente etichettati con FITC sulla catena laterale di loro (rapporto peptide-FITC Lys o D-Lys 1: 1 in ogni. coniugato). l'idea era che l'etichettatura fluorescente selettivo in grado di offrire nuove informazioni su questi peptidi, e permette loro buon monitoraggio e la quantificazione affidabile. questi coniugati hanno una manipolazione sicura e rilevabilità affidabile, che rendono più facile per confrontare il loro tumore efficienza targeting e la proiezione di numerosi tipi di cellule tumorali maligne. speriamo che fino a esperimenti data con questi coniugati peptide potrebbe contribuire allo sviluppo del cancro romanzo mira coniugati GnRH-droga, e contribuire ad individuare nuove tar terapeuticoottiene pure.Il presente manoscritto dimostra alcuni esperimenti ben riproducibili e veloci con coniugati GnRH-FITC. L'espressione superficie cellulare di GnRH-R è una condizione determinante per quanto riguarda l'assorbimento del GnRH, quindi abbiamo studiato contemporaneamente il livello della superficie cellulare di GnRH-IR sulle linee cellulari testate. Abbiamo visualizzato il coniugati GnRH-IR e GnRH-FITC da confocale a scansione laser microscopia (CLSM) e quantificato l'assorbimento cellulare di coniugati GnRH-FITC utilizzando celle a fluorescenza-attivato (FACS).
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Protocol
1. Preparazione di colture cellulari e reagenti
- Mantenere le colture cellulari in terreno raccomandato dal produttore, supplementato con 10% (v / v) di siero fetale bovino e antibiotici (chiamato mezzo completo). Mantenere il matraccio di coltura cellulare in un umidificata, 5% un'atmosfera incubatore CO 2 a 37 ° C. Seguire la proliferazione e la confluenza delle cellule mediante microscopio invertito (utilizzando 10X obiettivo contrasto di fase).
- Quando le cellule raggiungono un adeguato confluenza, rimuovere il supporto, e lavare la cultura con 2-3 ml, soluzione fisiologica sterile tampone fosfato (PBS). Rimuovere il PBS e aggiungere 0,5 ml, 0,25% soluzione di tripsina-EDTA sterili per la coltura cellulare e incubare a 37 ° C finché le cellule staccano (circa 10 min).
- Sospendere le cellule in 3-4 ml sterile terreno completo per fermare tripsina e trasferirli in una provetta da centrifuga sterile. Centrifugare le cellule a 150 xg per 4 minuti a temperatura ambiente (RT). Eliminare con cura il surnatante e sospendere la pEllet in 2-3 ml di sterile terreno completo.
- Togliere 100 ml di sospensione cellulare e mescolare con 100 ml 0,4% (m / V) trypan blu soluzione, a macchiare le cellule morte. Carico 10 ml di questa miscela in un emocitometro e determinare il numero di cellule vitali di microscopio invertito.
- Diluire la quantità richiesta di sospensione cellulare preparato secondo il punto 1.3 a 10 mL con sterile terreno completo, contenente 4 x 10 4 cellule / mL.
- Aggiungere 250 ml di sospensione cellulare (preparata al punto 1.5) per pozzo (10 4 cellule / pozzetto) in sette pozzi del primo fondo di vetro da 8 pozzetti vetrino microscopico. Utilizzare questa diapositiva nel metodo assorbimento GnRH.
- Aggiungere 250 ml di sospensione cellulare (preparata al punto 1.5) per pozzo (10 4 cellule / pozzetto) in cinque pozzi della seconda slitta 8-bene microscopica. Questa diapositiva verrà utilizzato nel metodo di espressione GnRH-IR.
- Aggiungere 1 ml di sospensione cellulare (preparata al punto 1.5) per bene (4 x 10 4 cellule / pozzetto) in sette wells di un 12-pozzetti. Questa piastra sarà utilizzata nel metodo di quantificazione GnRH.
- Lasciate che le cellule aderiscono sui due preparati microscopici e la piastra. Incubare in un umidificata, 5% un'atmosfera incubatore CO 2 a 37 ° C per 48 h.
- Dopo l'incubazione controllare le cellule microscopio invertito (usando 10 volte obiettivo contrasto di fase). Se le cellule sono sane e attaccato, continuare con i seguenti passaggi.
- Preparare 10 soluzione madre mM GnRH-FITC in dimetilsolfossido (DMSO) da ciascuno dei tre coniugati 18. (Usare queste concentrazioni di diluizione: 16.43 mg / mL [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, 16.97 mg / mL [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-II e 16.47 mg / mL [Lys 8 ( FITC)] - GnRH-III) Conservare queste soluzioni madre in un luogo buio a temperatura ambiente e utilizzarli entro poche settimane.
- Diluire 1,7 ml ciascuno dei tre 10 soluzioni madre mM GnRH-FITC in 1,7 ml terreno completo. Agitare queste soluzioni. (These sono il 10 micron GnRH-FITC trattamento dei media.) Diluire 150 ml ciascuna delle tre 10 micron GnRH-FITC medio trattamento a 1,35 ml di mezzo completo. Agitare queste soluzioni così (questi sono i 1 micron GnRH-FITC medio trattamento).
NOTA: Tutti i GnRH-FITC terreno contenente il trattamento deve essere protetto dalla luce e utilizzata entro pochi h. - Preriscaldare il sei GnRH-FITC medio trattamento (preparata al punto 1.12) e 4 ml di terreno completo a 37 ° C.
- Diluire 3 ml di 5 mm soluzione sonda fluorescente (di contrasto nucleare menzionata nella lista dei materiali) in 3 ml di PBS a 5 micron. Questa soluzione deve essere protetta dalla luce, tenerlo a RT e usarla entro poche ore.
2. Microscopia confocale a scansione laser (CLSM)
- GnRH metodo di assorbimento
- Prendere la prima diapositiva microscopica preparata al punto 1.6 e pipettare il terreno completo da ciascuno dei sette bene. Aggiungere 250 ml di preriscaldata Medi completoum nel primo pozzo. Utilizzare questo come un controllo negativo. Aggiungere 250 microlitri della preriscaldato GnRH-FITC trattamento supporto (da 1.13) per ciascuno dei prossimi sei pozzetti (3 pozzetti con 1 mM e 3 con 10 pM). Incubare il vetrino in una umidificata, 5% un'atmosfera incubatore CO 2 a 37 ° C per 5 ore.
- Pipetta fuori il medium da ogni pozzetto e lavare le cellule con 250 microlitri di PBS. Aggiungere 250 ml di soluzione di fissaggio (10% formalina neutra tamponata) in ciascun pozzetto e incubare il vetrino a temperatura ambiente, per 10 minuti.
- Pipettare la soluzione di fissaggio da ciascun pozzetto e lavare le cellule con 250 microlitri di PBS. Aggiungere 250 ml di PBS contenente 5 mM soluzione sonda fluorescente preparata al punto 1.14 in ciascun pozzetto e incubare il vetrino a temperatura ambiente, per 10 minuti.
- Pipettare la soluzione sonda fluorescente da ogni pozzetto e lavare le cellule due volte con 250 microlitri di PBS con attenzione. Aggiungere 3-4 gocce di mezzo di montaggio in tutti i pozzetti, finalmente. Conservare il vetrino al buio a RT, fino alla imaging.
- Metodo di espressione GnRH-IR
- Prendere la seconda slitta microscopica 8-ben preparato al punto 1.7 e pipettare il terreno completo da ciascuno dei cinque pozzi.
- Aggiungere 250 ml di terreno completo preriscaldato nel primo pozzo, utilizzare questo controllo come negativo. Aggiungere 250 ml di terreno completo preriscaldato nella seconda bene anche, e usare questa espressione per esaminare GnRH-IR prima del trattamento GnRH.
- Aggiungere 250 ml ciascuno dei tre preriscaldato 10 micron GnRH-FITC supporti trattamento nei prossimi tre pozzi. Utilizzare questi pozzi per pretrattare le cellule con coniugati GnRH-FITC prima di esaminare l'espressione GnRH-IR. Incubare il vetrino in una umidificata, 5% un'atmosfera incubatore CO 2 a 37 ° C per 1 h.
- Pipettare il mezzo trattamento da ciascuno dei tre pozzi che verranno utilizzati per esaminare l'espressione GnRH-IR dopo il trattamento GnRH e lavare questi pozzetti con 250 ml di terreno completo preriscaldato. Aggiungere 250ml di mezzo completo preriscaldato in ciascuno dei tre pozzi. Incubare il vetrino in una umidificata, 5% un'atmosfera incubatore CO 2 a 37 ° C per 1 h.
- Pipettare il mezzo da ciascuno dei cinque pozzetti e lavare le cellule con 250 microlitri di PBS. Aggiungere 250 ml di soluzione di fissaggio in ciascun pozzetto e incubare il vetrino a temperatura ambiente, per 10 minuti.
- Pipettare la soluzione di fissaggio da ciascun pozzetto e lavare le cellule con 250 ml di PBS. Aggiungere 250 ml di PBS contenente albumina 5% di siero bovino (BSA) soluzione di bloccaggio in ogni pozzetto e incubare il vetrino a temperatura ambiente, per 1 ora.
- Diluire 10 ml di anticorpo primario GnRH-IR in 1 ml di PBS (1: 100 ratio). Tenerlo a RT e usarla entro poche ore.
- Pipettare la soluzione bloccante BSA da ogni bene, tranne il controllo negativo (primo pozzo). Lavare le cellule con 250 microlitri di PBS (ad eccezione del controllo negativo). Aggiungere 250 ml di PBS contenente GnRH-IR anticorpo primario pronto al passo 2.2.7 in each pozzetto (ad eccezione del controllo negativo). Incubare il vetrino a temperatura ambiente, per 1 ora, in un luogo buio.
- Diluire 2,5 ml di Alexa 546 anticorpo secondario marcato a 1,25 ml di PBS (1: 500 ratio).
NOTA: Questa soluzione deve essere protetta dalla luce, tenerlo a temperatura ambiente e usarla entro poche ore. - Pipettare soluzioni da ciascuno dei cinque pozzetti e lavare le cellule con 250 microlitri di PBS. Aggiungere 250 ml di PBS contenente AF 546 marcato anticorpo secondario pronto al passo 2.2.9 in tutti i pozzetti. Incubare il vetrino a temperatura ambiente, per 1 ora al buio.
- Pipettare la soluzione da ciascun pozzetto e lavare le cellule con 250 microlitri di PBS. Aggiungere 250 ml di PBS contenente 5 mM soluzione sonda fluorescente preparata al punto 1.14 in ciascun pozzetto e incubare il vetrino per 10 minuti, a temperatura ambiente.
- Pipettare la soluzione sonda fluorescente da ogni pozzetto e lavare le cellule due volte con 250 microlitri di PBS con attenzione. Aggiungere 3-4 gocce di mezzo di montaggio in tutti i pozzetti, dopo. Tenere il vetrino nel buioa RT fino immagini microscopiche.
- Imaging
- Immagine le cellule confocale invertito microscopio a scansione laser (utilizzando 63X obiettivo ad immersione)
- Utilizzare le seguenti lunghezze d'onda di eccitazione / emissione. coniugati GnRH: 488/514 nm, Alexa 546 anticorpo marcato: 488/546 nm (utilizzare solo per il metodo di espressione GnRH-IR), sonda fluorescente DRAQ5: 633/680 nm.
- Impostare i parametri di imaging utilizzando le cellule di controllo negativo. Utilizzare questi parametri per celle di immagine trattata (figura 3). Re-regolare i parametri di imaging su ciascun vetrino microscopico all'inizio dell'analisi. Ottimizzare ed esportare le immagini con il software fornito dal produttore, se necessario.
- Immagine le cellule confocale invertito microscopio a scansione laser (utilizzando 63X obiettivo ad immersione)
3. cellulare fluorescenza-attivato Sorting (FACS)
- Metodo di quantificazione GnRH
- Prendere il piatto preparato al punto 1.8 e pipettare il mezzo completo da EAch dei sette pozzi. Aggiungere 1 ml di terreno completo preriscaldato nel primo pozzo. Utilizzare questo come un controllo negativo. Aggiungere 1 ml ciascuna delle sei preriscaldato trattamento dei media (3 pozzi con 1 micron e 3 pozzi con 10 micron) nei prossimi sei pozzi. Incubare la piastra in una umidificata, 5% un'atmosfera incubatore CO 2 a 37 ° C per 5 ore.
- Pipetta fuori il medium da ogni pozzetto. Lavare le cellule due volte con 2 ml di PBS con attenzione. Aggiungere 500 ml di soluzione di tripsina-EDTA in ogni pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C finché le cellule staccano (circa 10 min).
- Aggiungere 1 ml di terreno completo in ciascun pozzetto per arrestare tripsina. Agitare la piastra. Sospendere le cellule delicatamente con una pipetta, e trasferire la sospensione da ogni pozzetto in tubi FACS. Centrifugare le provette a 150 xg per 4 minuti, a 4 ° C.
- Riversa il surnatante con cura, con una sola mossa. Aggiungere 500 ml di PBS ghiacciato in ciascuna provetta FACS e delicatamente risospendere le cellule. Mantenere i tubi in ghiaccio fino alla finedell'esperimento.
- Analisi e calcolo
- Analizzare le cellule mediante citometria di flusso. Per l'eccitazione, usare 488 nm di lunghezza d'onda del laser ad argon e per il rilevamento di usare 530 nm di lunghezza d'onda. Impostare il citofluorimetro parametri eseguendo le cellule di controllo negativo. Utilizzare questi parametri per analizzare cellule trattate (Figura 4A). Valutare i dati con il software del produttore, determinare i valori di intensità fluorescente mediana (MFI), e calcolare i valori di MFI relativi.
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Representative Results
Le immagini ottenute mediante scansione laser confocale microscopio (CLSM) offrono informazioni spettacolare circa l'assorbimento di coniugati GnRH-FITC sulla data coltura cellulare in un tempo e concentrazione modo dipendente. In parallelo con questi coniugati GnRH-FITC, la presenza del GnRH-IR sulla superficie cellulare è anche verificabile dall'esperimento CLSM. Inoltre, utilizzando una sonda fluorescente colorazione DNA rosso lontano, è possibile colorazione di contrasto nuclei delle cellule oltre GnRH e GnRH-IR. Tuttavia, mentre l'immagine confocale non è quantificabile, il semplice metodo "GnRH uptake" può facilmente valutare se le cellule testate contengono maggiore o minore quantità di coniugati GnRH-FITC. I coniugati applicate GnRH-FITC, le loro concentrazioni, e il tempo del trattamento sono variabili in questo metodo, come necessario. Come mostrato nella Figura 1 diverse cellule tumorali contengono diversi livelli di GnRH-FITC in maniera dipendente dalla concentrazione. L'avanzato "metodo di espressione GnRH-IR" descrive la visualizzazione della superficie cellulare GnRH-IR mediante immunocitochimica, prima e dopo il trattamento GnRH-FITC. Nella prima parte di questo metodo (prima del trattamento GnRH-FITC), visualizziamo GnRH-IR mediante immunocitochimica, senza trattamento GnRH-FITC. Nella seconda parte di questo metodo (dopo il trattamento GnRH-FITC), trattiamo cellule per 1 h con 10 pM GnRH-FITC. Dopo il trattamento, abbiamo incubare le cellule nel mezzo completo per ulteriori 1 h e visualizzare GnRH-IR mediante immunocitochimica. Come mostrato in Figura 2A, diverse cellule tumorali presentano diversi livelli di GnRH-IR sulla loro superficie prima del trattamento GnRH-FITC. Come mostrato nella Figura 2B, dopo il trattamento GnRH-FITC, il GnRH-IR cellule esprimenti mantenere (Detroit-562) Livello GnRH-IR (EBC-1) o aumento sulle loro membrane. A questo punto, notare che in precedenza confermato che BxCellule PC-3 esprimono anche GnRH-IR, ma non presentano sulla loro membrana 18. GnRH-IR può essere visualizzato all'interno delle BxPC-3 celle da immunocitochimica se le loro membrane sono permeabilizzate. Questo fenomeno spiega il GnRH relativamente minore efficienza di captazione BxPC-3 celle. Sulla base di queste affermazioni ci concentriamo solo sulla superficie delle cellule GnRH-IR qui. Confrontando la figura 1 alla figura 2 conferma che il livello della superficie cellulare GnRH-IR correla con la quantità di GnRH-FITC nelle celle corrispondenti. Inoltre, Figura 3C chiarisce che GnRH-FITC viene internalizzato nelle cellule causa la localizzazione di GnRH-FITC è separato dal segnale di superficie cellulare GnRH-I-Rafter 1 h di trattamento GnRH-FITC. Concludiamo che il "metodo espressione GnRH-IR" supporta le informazioni ottenute dal "metodo di assorbimento GnRH".
E 'importante utilizzare insieme ben regolatoTings durante l'imaging. Come illustrato in figura 3A alla lunghezza d'onda di emissione di FITC (514 nm) e il fluoroforo marcato anticorpo secondario (546 nm), cellule di controllo negativo non trattate hanno anche un leggero autofluorescenza. Questa fluorescenza indesiderato può fornire risultati falsi positivi. In tal modo, all'inizio di imaging è importante regolare l'intensità di fluorescenza delle cellule di controllo come mostrato nella Figura 3B. Si prevede che si osserverà chiaro segnale dei nuclei alla lunghezza d'onda di emissione della colorazione nucleare (680 nm), con il segnale fluorescente alle altre due lunghezze d'onda è solo visibile o vicino a zero. Tutti gli altri campioni di cellule devono essere ripreso con questi parametri ben regolata e fissata. In questo modo, il segnale osservato a 514 nm è derivato dal segnale di soli FITC-GnRH, a 546 nm dal segnale di GnRH-IR particolarmente ea 680 nm dal segnale di nuclei, come mostrato in Figura 3C. Immagini potrebbero essere fiNE a punto dopo la formazione immagine utilizzando il software, se necessario.
Citometria a flusso esperimenti offrono informazioni quantificabili circa la quantità di coniugati GnRH-FITC che sono state prese dalle cellule. I coniugati applicate GnRH-FITC, le loro concentrazioni e il tempo del trattamento sono variabili in questo metodo, come necessario. Le cellule non trattate sono utilizzati come controllo negativo per la regolazione del flusso citometria parametri e determinare la loro intensità di fluorescenza media (MFI) all'inizio dell'analisi. Come illustrato nella Figura 4A MFI è stata determinata per ciascun campione utilizzando gli stessi parametri. I valori delle IFM relativi vengono calcolati a partire dai valori MFI utilizzando la formula di calcolo in figura 4B. Usando questa formula, il valore MFI relativo di cellule di controllo è sempre zero. I valori di MFI relativi calcolati quantificano l'intensità fluorescente coniugati GnRH-FITC, che sono proporzionali alla loro unconcentrazioni verage nelle celle. Come illustrato in figura 5, con questi dati, si può dimostrare e confrontare come efficientemente queste cellule tumorali occupano i coniugati GnRH-FITC. Così, i risultati ottenuti mediante citometria di flusso completano e supportano le immagini acquisite al microscopio confocale.
Figura 1: le immagini confocale del trattato e il [Lys 8 (CIC)] - GnRH-III trattata cellule tumorali. macchia blu: nuclei; macchia verde: [Lys 8 (CIC)] - GnRH-III. Queste immagini sono ottenute utilizzando il "metodo assorbimento GnRH". (A) I segnali di fluorescenza delle cellule non trattate sono regolate quasi a zero a 514 nm (verde) su ciascuna linea cellulare. La sonda fluorescente rosso lontano DRAQ5 serve a colorare i nuclei delle cellule. (B) Dopo aver applicato le impostazioni, il cancro del polmone EBC-1 e l'umano Detroit-562le cellule tumorali della faringe mostrano rilevabile, ma a basso segnale a 514 nm (verde) dopo il trattamento con 5 h 1 micron [Lys 8 (CIC)] - GnRH-III. (C) Dopo il trattamento 5 h con 10 pM [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III, ognuna delle tre linee cellulari segnale più alto fluorescente presente. I risultati di questo esperimento suggeriscono che i BxPC-3 cellule tumorali pancreatiche presero GnRH-FITC con molta minore efficienza rispetto alle altre due linee di cellule che sono facilmente targeting per coniugati GnRH. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: immagini confocale di superficie delle cellule GnRH-IR, prima e dopo [D-Lys 6 (FITC)] - Trattamento GnRH-I. macchia blu: nuclei; macchia verde: [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I; macchia rossa : GnRH-IR. Queste immagini vengono generati utilizzando il "metodo espressione GnRH-IR". (A) Prima del trattamento GnRH-FITC, BxPC-3 celle non hanno GnRH-IR sulla membrana, tuttavia EBC-1 le cellule mostrano elevata, e di alcuni Detroit-562 cellule mostrano moderato livello di GnRH-IR. (B) Dopo il trattamento GnRH-FITC, BxPC-3 celle ancora non presentano GnRH-IR sulla loro membrana. cellule EBC-1 mantengono la loro espressione GnRH-IR e GnRH-FITC appare dentro di loro. Detroit-562 cellule sembrano essere esibendo più alto livello di GnRH-IR dopo il trattamento e occupano GnRH-FITC, pure. Questo esperimento rivela che i diversi tipi di cellule tumorali maligne presentano diversi livelli di GnRH-IR sulla loro superficie, e l'assorbimento GnRH-FITC sembra essere strettamente legato alla superficie cellulare espressione GnRH-IR. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: immagini confocale di cellule EBC-1 di cancro ai polmoni. macchia blu: nuclei; macchia verde: [Lys 8 (CIC)] - GnRH-III; macchia rossa: GnRH-IR. Queste immagini sono state effettuate dal "metodo di espressione GnRH-IR". (A) cellule di controllo negativo non trattata (senza GnRH-FITC e Alexa 546) hanno fluorescenza rilevabile e indesiderato a 514 nm e 546 nm, utilizzando le impostazioni dello strumento sovra-amplificati. (B) Regolazione delle impostazioni dello strumento sulle cellule di controllo negativo non trattate, il verde (514nm) e il segnale rosso (546 nm) è vicino allo zero. (C) parametri regolati traducono in segnali chiari e affidabili per il GnRH-FITC trattata e GnRH-IR cellule colorate. Dopo il trattamento GnRH-FITC, localizzazione di GnRH-FITC (verde) è separata dalla superficie cellulare GnRH-IR (rosso).529fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Valutazione della citometria a flusso di dati. (A) Istogramma della greggia e trattati Detroit-562 cellule. valori di MFI dei campioni di cellule sono determinati dal istogramma. L'asse x rappresenta la intensità di fluorescenza delle cellule, e l'asse y rappresenta i conteggi. Linea nera: MFI prima del trattamento GnRH-FITC; verde linea tratteggiata: MFI dopo il trattamento 5 h con 1 mM [Lys 8 (CIC)] - GnRH-III; linea rossa tratteggiata: MFI dopo il trattamento 5 h con 10 micron [Lys 8 (CIC)] - GnRH-III. (B) Formula di calcolo dei valori delle IFM relativi. I valori delle IFM relativi vengono calcolati a partire dai valori MFI. Usando questo calcolo, il valore MFI relativa del campione di controllo non trattato è sempre zero. il relat valori ive MFI dei campioni trattati rappresentano la quantità di coniugati GnRH-FITC che sono all'interno delle cellule. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: i valori relativi MFI di cellule tumorali dopo il trattamento 5 h con 1 mM di coniugati GnRH-FITC. I valori delle IFM relativi sono comparabili e definiscono il modo efficiente i tipi di cellule dato potrebbe richiedere fino analoghi del GnRH. Le cellule GnRH-IR non esibendo BxPC-3 contengono solo tracce di questi analoghi del GnRH. Il GnRH-IR che esprimono EBC-1 le cellule del cancro del polmone contengono moderato e le cellule tumorali della faringe Detroit-562 contengono elevate quantità di analoghi del GnRH. I risultati sono presentati come media ± SD, N = 3."_blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Gli esperimenti descritti nel presente documento utilizzare analoghi del GnRH selettivamente etichettati per lo screening aderenti colture cellulari in vitro. La microscopia confocale e citometria a flusso metodi sono adatti per il monitoraggio e la quantificazione l'assorbimento cellulare di questi coniugati GnRH-FITC in un tempo e concentrazione modo dipendente. Questi esperimenti hanno i seguenti passaggi critici: 1) mantenere una cultura di cellule sane sterili; 2) peptidi GnRH devono essere di alta qualità; 3) Le concentrazioni ragionevoli e tempi di incubazione devono essere rispettate; 4) trattamento e lavaggio passi; 5) ben regolato le impostazioni dello strumento.
Le cellule sono mantenute in terreno raccomandato dal produttore supplementato con 10% (V / V) di siero fetale bovino e antibiotici (terreno completo). Le cellule devono essere conservati e gestiti in un ambiente sterile fino a quando le fasi di trattamento (con coniugati GnRH-FITC). Prima gli esperimenti, controllare le cellule utilizzando un microscopio invertito. Essi dovrebbero essere in buona salute, Allegato e deve raggiungere le quantità richieste.
È importante utilizzare peptidi GnRH con alta qualità e purezza. Abbiamo sintetizzato questi peptidi e purificata per oltre il 98% 18. Il peptide può essere conservato a -25 ° C in frigorifero come polvere liofilizzata. Le 10 soluzioni madre mM GnRH-FITC in DMSO devono essere conservati in un luogo buio a temperatura ambiente e consumati nel giro di poche settimane. Abbiamo studiato la stabilità di questi coniugati e abbiamo trovato che sono stabili in DMSO e la loro intensità di fluorescenza vengono mantenute dopo 1 mese di corretta conservazione. La concentrazione di coniugati GnRH-FITC e il tempo dei trattamenti sono variabili in questi esperimenti, che offre grandi vantaggi, ma con alcune limitazioni (vedi sotto). Le concentrazioni applicate e tempi di incubazione in questo protocollo sono solo raccomandazioni, ma forniscono una buona base per gli esperimenti iniziali.
esperimenti CLSM richiedono recidereAl fasi di lavaggio. Questi passaggi devono essere eseguiti con cura. Non trasferire il liquido direttamente sulle cellule. Piuttosto, utilizzare il lato o l'angolo dei pozzi per questo scopo. Questo può ridurre al minimo il lavaggio fuori e perdere le cellule aderito. Si raccomanda inoltre di evitare la luce diretta durante l'intero esperimento, in quanto si può desensibilizzare i campioni fluorescenti (effetto photobleaching). Mantenere i campioni trattati in un luogo buio e coperto con un foglio di alluminio durante l'esperimento. Sulla base dei risultati precedenti, abbiamo notato che la concentrazione DMSO finale nei mezzi trattamento applicato è trascurabile (0,1% (V / V) DMSO nei mezzi trattamento 10 pM) e non ha alcun effetto sui risultati, terreno completo così DMSO-libero è anche adatto come controllo negativo.
E 'importante utilizzare i parametri dello strumento ben adattati durante gli esperimenti CLSM e FACS. Questi parametri devono essere ricalibrato su ogni tipo di cellula, prima che entrambe le analisi. Nell'esperimento CLSM, il SIintensità segnal di immagini confocali dipende dai seguenti parametri: intensità del laser, il guadagno del rivelatore e offset e dimensioni pinhole. Durante la regolazione di questi parametri, utilizzare la potenza del laser più basso per produrre un'immagine accettabile ed evitare photobleaching. Impostare i parametri di imaging per regolare la fluorescenza delle cellule non colorate controllo negativo quasi a zero (Figura 3B) di fondo. celle di immagine trattati con questi parametri regolati per evitare risultati falsi positivi. Ulteriori segnali emessi dalle cellule trattate a 514 nm e 546 nm contiene le informazioni richieste su GnRH o GnRH-IR. Questi passaggi richiedono esperienza negli esperimenti CLSM. Nell'esperimento FACS, creare un grafico standard di forward scatter-side scatter (scala lineare) e tensioni impostate per regolare la popolazione di cellule giorno principale al centro della trama. Disegnare una regione intorno a cellule viventi. Creare un istogramma, impostare ascisse al canale uno (FL1-530 nm, scala logaritmica) e impostare la regione precedentemente definito come un cancelloper questo istogramma. Impostare tensione FL1 per portare il segnale di cellule di controllo negativo non colorate sotto 10 1 (Figura 4A). Analizzare le cellule trattate con questi parametri regolati.
Inoltre, è importante controllare lo stato micoplasma delle colture cellulari di volta in volta. Diversi test sono disponibili per questo scopo. In caso di positività micoplasma, scartare le cellule e iniziare a lavorare con una nuova cultura. Si raccomanda di usare una miscela antibiotica nel mezzo di coltura che è ottimizzato per prevenire micoplasma. La concentrazione applicata di coniugati GnRH-FITC, e il tempo di trattamenti sono variabili in questi esperimenti, tuttavia applicando concentrazioni basse e tempi di incubazione brevi può causare segnali troppo deboli per il rilevamento della fluorescenza.
Quando l'imaging del GnRH-IR in parallelo con analoghi del GnRH, si raccomanda maggiore concentrazione GnRH-FITC (10 micron è ottimale). La ragione per la maggiore concentrazioneè il breve tempo di incubazione (1 ora) e il segnale relativamente elevata fluorescenza dell'anticorpo marcato rispetto ai coniugati GnRH-FITC. D'altra parte, una scarsa sovrapposizione tra le due emissioni coloranti fluorescenti (514 nm e 546 nm) è stato trovato, che si verifica solo a 546 nm ed è derivato dal segnale di coniugati GnRH-FITC. Tuttavia, il segnale fluorescente relativamente elevato di Alexa 546 ei parametri ben adattati potrebbe minimizzare questo effetto, come mostrato nella Figura 3. Un'altra possibile soluzione per evitare la sovrapposizione, si applica anticorpo marcato secondaria che ha lunghezza d'onda differente di eccitazione e / o spettro di emissione meglio separato rispetto a FITC (se i parametri tecnici CLSM permettono). Questa possibilità offre grande vantaggio per il metodo CLSM, che consente l'utilizzo di sonde fluorescenti opzionali in parallelo con coniugati GnRH-FITC. Ad esempio, queste sonde fluorescenti alternative potrebbero essere utilizzati per la controcolorazione altri organelli come necessario.
La concentrazione applicata di coniugati GnRH-FITC presenta le seguenti limitazioni. Limite massimo di concentrazione di coniugati GnRH-FITC si basa sulla loro solubilità 18. Questi valori sono i seguenti in PBS a temperatura ambiente: GnRH-I: 90 micron; GnRH-II: 40 micron; GnRH-III: 200 micron. D'altra parte, in precedenti esperimenti abbiamo supposto che l'assorbimento di questi peptidi GnRH potrebbe avvenire da recettori diversi recettori GnRH-I umane; questo assorbimento sembra essere più significativo a concentrazioni più elevate (superiori a 10 pM) 18. Il limite inferiore di coniugati GnRH-FITC si basa su una varietà di parametri, ma in impostazioni ideali è di circa 1 pM per esperimenti CLMS. Abbiamo scoperto che il flusso offre citometria migliore sensibilità di microscopia confocale. Nelle impostazioni ideali, il limite di quantificazione dei coniugati GnRH-FITC potrebbe essere inferiore a 1 micron. Il limite di rilevazione o la quantificazione potrebbeessere differente in ogni esperimento, perché sono dipendenti dal tipo di cellula e tempo di incubazione. Si noti che i dati ottenuti mediante FACS è più affidabile CLSM, perché esso rileva migliaia di cellule per campione e il segnale medio di cellule viene calcolato. Tuttavia, nel protocollo, FACS non fornisce informazioni sulla localizzazione cellulare di coniugati GnRH-FITC e l'espressione superficie cellulare di GnRH-IR. Sulla base di queste considerazioni abbiamo concludere che, il CLSM e gli esperimenti FACS hanno vantaggi e si completano a vicenda. D'altra parte, elevato contenuto di analisi di immagine potrebbe essere un interessante e una buona alternativa a FACS e analisi CLSM.
In sintesi, i dati ottenuti da questi esperimenti confermano che ciascuno dei tre coniugati GnRH-FITC può entrare nelle cellule che esprimono superficie cellulare GnRH-IR. Questi analoghi GnRH sono simili Targeting potenza alle stesse concentrazioni. Tuttavia, il livello di GnRH-IR sulla superficie di diversi cancellule CER è altamente variabile. I risultati calcolati a partire dai dati di citometria a flusso di analisi permette il confronto delle linee cellulari o analoghi del GnRH. Allo stesso tempo, le immagini ottenute mediante microscopia confocale potrebbero rivelare il livello di superficie cellulare espressione GnRH-IR e confermare che tali coniugati sono internalizzati nelle cellule. Sulla base di questi risultati, si può confermare che gli esperimenti introdotti contengono metodi pratici e variabili per lo studio di sistemi di somministrazione dei farmaci a base di GnRH e offrono una buona base per ulteriori esperimenti.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EBC-1 | JCRB Cell Bank | JCRB0820 | Human lung squamous cell carcinoma |
| BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Human pancreatic adenocarcinoma |
| Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Human pharyngeal carcinoma |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Lonza | BE12-702F | Culture medium for BxPC-3 cells |
| Eagle's Minimum Essential Medium | Lonza | BE12-611F | Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0.1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells |
| Fetal Bovine Serum | Euro Clone | ECS0180L | Complements the culture medium |
| MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Complements the culture medium (antibiotics) |
| Standard Line Cell Culture Flasks | VWR | 10062-872 | Provide consistent, sterile growth environment for cells |
| Trypsin-EDTA Mixture | Lonza | BE17-161E | Remove attached cells |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solvent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to counting cells |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| [Lys8(FITC)]-GnRH-III | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| glass bottom 8-well microscopic slide | Ibidi | 80826 | Use in CLSM experiment |
| Corning Costar cell culture plate, 12 well | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Use in FACS experiment |
| Fixing solution (10% neutral buffered formalin) | Bio-Optica | 01V60P | Fix adherent cells |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Prevent the nonspecific binding of the antibodies |
| GnRHR Antibody | Proteintech | 19950-1-AP | Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody |
| Fluorescent probe solution (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Counterstain nuclei |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Use in CLSM experiment, preserving fluorescence |
| Inverted microscope | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Check the phenotype and confluency of cell cultures |
| Inverted confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM-710 | Use in CLSM experiment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Use in FACS experiment |
References
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