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Cancer Research

इन विट्रो इमेजिंग और fluorescently लेबल GnRH analogues के ड्रग लक्ष्य निर्धारण क्षमता की मात्रा का ठहराव में

Published: March 21, 2017 doi: 10.3791/55529
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 3, 2
1MTA-SE Pathobiochemistry Research Group, Semmelweis University, 2Department of Medical Chemistry, Molecular Biology and Pathobiochemistry, Semmelweis University, 3MTA-ELTE Research Group of Peptide Chemistry, Eötvös Loránd University

Summary

चुनिंदा लेबल फ्लोरोसेंट GnRH-मैं, द्वितीय और -III डेरिवेटिव नज़र रखने के लिए विश्वसनीय उपकरण और उनके सेलुलर तेज बढ़ाता हैं। यह पांडुलिपि, कल्पना यों और विभिन्न सेल लाइनों में इन GnRH conjugates के तेज दक्षता तुलना करने के लिए प्रयोगों का परिचय।

Abstract

GnRH analogues प्रभावी निशाना बना moieties और चुनिंदा घातक ट्यूमर कोशिकाओं जो अत्यधिक एक्सप्रेस GnRH रिसेप्टर्स में कैंसर विरोधी एजेंटों देने में सक्षम हैं। हालांकि, GnRH analogues 'सेलुलर तेज की मात्रात्मक विश्लेषण और GnRH आधारित दवा वितरण प्रणाली में जांच सेल प्रकार वर्तमान में सीमित कर रहे हैं। इससे पहले शुरू की, चुनिंदा लेबल फ्लोरोसेंट GnRH मैं, द्वितीय और -III डेरिवेटिव महान detectability प्रदान करते हैं, और वे प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और मजबूत प्रयोगों के लिए उपयुक्त रासायनिक गुण होते हैं। हम यह भी पाया है कि इन लेबल GnRH analogues के साथ उचित अप-टू-डेट तरीकों GnRH आधारित दवा वितरण प्रणाली के बारे में उपन्यास जानकारी दे सकता है। GnRH-मैं, [डी-लिस 6 (FITC)] - - GnRH-द्वितीय और [लिस 8 (FITC)] - GnRH इस पांडुलिपि की [डी-लिस 6 (FITC)] सेलुलर तेज के बारे में कुछ सरल और तेज प्रयोगों का परिचय -III ईबीसी -1 (फेफड़ों) पर, BxPC-3 (अग्न्याशय) और डेट्रायट 562- (ग्रसनी) पर घातक टीumor कोशिकाओं। इन GnRH-FITC conjugates के साथ समानांतर में, GnRH-मैं रिसेप्टर्स की कोशिका की सतह के स्तर भी पहले और confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा GnRH उपचार के बाद इन सेल लाइनों पर जांच की गई थी। GnRH-FITC conjugates के सेलुलर तेज प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई द्वारा मात्रा गया था। इन प्रयोगों में GnRH analogues और प्रकार की कोशिकाओं के बीच प्रमुख मतभेद के बीच मामूली अंतर पाया गया है। सेल लाइनों के बीच महत्वपूर्ण अंतर कोशिका की सतह GnRH-मैं रिसेप्टर्स के अपने अलग-अलग स्तर के साथ सहसंबद्ध होते हैं। पेश किया प्रयोगों, कल्पना यों और एक समय और विभिन्न पक्षपाती सेल संस्कृतियों पर एकाग्रता पर निर्भर ढंग से GnRH-FITC conjugates के तेज दक्षता की तुलना करने के व्यावहारिक तरीके होते हैं। इन परिणामों दिया सेल संस्कृति पर GnRH conjugates की दवा को निशाना दक्षता की भविष्यवाणी, और GnRH आधारित दवा वितरण प्रणाली की परीक्षा में आगे के प्रयोगों के लिए एक अच्छा आधार दे सकता है।

Introduction

पेप्टाइड आधार पर लक्षित दवा वितरण प्रणाली में पिछले कुछ वर्षों में 1, 2 से अधिक एक तेजी से विकसित और कैंसर के उपचार में होनहार क्षेत्र बन गए हैं। मानव गोनाडोट्रोपिन हार्मोन जारी रिसेप्टर प्रकार मैं (GnRH आईआर) मुख्य रूप से पिट्यूटरी ग्रंथि में स्थित है, लेकिन यह भी कई अन्य ऊतकों जो स्वयं प्रजनन 3 के लिए जिम्मेदार हैं में मौजूद है। GnRH आईआर भी प्रजनन प्रणाली 4, 5 से संबंधित या असंबद्ध कैंसर के ऊतकों की एक संख्या में व्यक्त किया जाता है। उच्च स्वस्थ ऊतकों के साथ तुलना में कई घातक ट्यूमर कोशिकाओं पर GnRH आईआर की अभिव्यक्ति लक्षित चिकित्सा 5, 6 के लिए एक अवसर प्रदान करता है।

कई गोनाडोट्रोपिन हार्मोन जारी (GnRH) analogues पिछले कुछ दशकों में, जो moieties को निशाना बनाने के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है में विकसित किया गया हैएफ "> 7, 8, 9। इन पेप्टाइड्स घातक ट्यूमर कोशिकाओं में उच्च चयनात्मकता के साथ विरोधी एजेंटों देने में सक्षम हैं जो ओवर-द एक्सप्रेस GnRH आईआर 6। उच्च चयनात्मकता और से इसी unconjugated बेहतर दक्षता के साथ कई GnRH संयुग्मित विरोधी ट्यूमर दवाओं नि: शुल्क दवा 7 सूचित किया गया है, 8, 9।

GnRH पेप्टाइड्स और उनके रिसेप्टर्स के बारे में पिछले प्रकाशनों की रिपोर्ट है कि GnRH आईआर विभिन्न रचना जो विभिन्न चयनात्मकता GnRH analogues के लिए 10 है ग्रहण कर सकते हैं। अत्यधिक चर GnRH आईआर जटिल और विभिन्न संकेत दे रास्ते उनके प्राकृतिक और कृत्रिम ligands 11 के खिलाफ विभिन्न गतिविधियों के साथ संपन्न हो गया है। इन तथ्यों GnRH आधारित प्रणालियों की जांच चुनौतीपूर्ण बना। दूसरी ओर, Y होनहार चिकित्सीय क्षमता के पास है। Radiolabeled GnRH पेप्टाइड्स के साथ कई प्रयोगों में पहले से सूचित किया गया 12, 13, 14, 15, लेकिन प्रयोगों में जो fluorescently लेबल GnRH analogues इस्तेमाल किया गया अभी भी सीमित हैं। जबकि रेडियोधर्मी लेबलिंग उच्च संवेदनशीलता प्रदान करता है, फ्लोरोसेंट लेबलिंग कई अन्य लाभ, उदाहरण के लिए आसान हैंडलिंग, और विभिन्न fluorophores साथ counterstain करने की क्षमता है। तीन आम GnRH analogues जो सफलतापूर्वक दवा वितरण के लिए इस्तेमाल किया गया है [डी-लिस 6] हैं -GnRH-मैं, [डी-लिस 6] -GnRH-द्वितीय और GnRH III, लेकिन निशाना बना moieties के रूप में इन पेप्टाइड्स की प्रभावशीलता है शायद ही कभी, 17 16 की तुलना में। दूसरी ओर, अलग प्रयोगों से परिणाम, जिसमें विभिन्न कैंसर कोशिकाओं और GnRH analogues इस्तेमाल किया गया विविध है।

ntent "> इन विचारों के आधार पर हमने ट्यूमर को निशाना बनाने और इन GnRH पेप्टाइड्स के दवा वितरण क्षमता पर ध्यान केंद्रित किया, और इस तरह संश्लेषित और [डी-लिस 6 (FITC)] विशेषता - GnRH-मैं, [डी-लिस 6 (FITC )] - GnRH-द्वितीय और [लिस 8 (FITC)] - GnRH-III पेप्टाइड conjugates 18 इन analogues चुनिंदा उनके लिस या डी-Lys (पेप्टाइड FITC अनुपात के पक्ष श्रृंखला 1 पर FITC के साथ लेबल रहे हैं: 1 प्रत्येक पर। साधना)। विचार था कि चयनात्मक फ्लोरोसेंट लेबलिंग इन पेप्टाइड्स के बारे में उपन्यास के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं, और उनके अच्छे ट्रैकिंग और विश्वसनीय मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है। ये conjugates सुरक्षित हैंडलिंग और विश्वसनीय detectability है, जो इसे आसानी से अपने ट्यूमर को निशाना दक्षता तुलना करने के लिए बना है, और घातक ट्यूमर कोशिकाओं के कई प्रकार की स्क्रीनिंग। हमें उम्मीद है कि अप करने के लिए इन पेप्टाइड conjugates के साथ तारीख प्रयोगों GnRH दवा conjugates को निशाना उपन्यास कैंसर के विकास में योगदान कर सकता है, और नए चिकित्सीय टार की पहचान करने में मददके रूप में अच्छी तरह से हो जाता है।

वर्तमान पांडुलिपि GnRH-FITC conjugates के साथ कुछ अच्छी तरह से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और तेजी से प्रयोगों को दर्शाता है। GnRH-आर की कोशिका की सतह अभिव्यक्ति GnRH तेज के बारे में एक निर्धारक हालत है, इसलिए हम एक साथ परीक्षण किया सेल लाइनों पर GnRH आईआर की कोशिका की सतह के स्तर की जांच की। हम लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग (CLSM) द्वारा GnRH आईआर और GnRH-FITC conjugates कल्पना और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग GnRH-FITC conjugates के सेलुलर तेज मात्रा।

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Protocol

1. सेल संस्कृतियों और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. निर्माता की सिफारिश माध्यम में सेल संस्कृतियों, 10% (वी / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं (बुलाया पूरा मध्यम) के साथ पूरक बनाए रखें। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified, 5% सीओ 2 माहौल इनक्यूबेटर में सेल संवर्धन कुप्पी रखें। प्रसार और उलटा माइक्रोस्कोप से कोशिकाओं की confluency का पालन करें (10X चरण विपरीत उद्देश्य का उपयोग)।
  2. जब कोशिकाओं को पर्याप्त confluency तक पहुँचने, मध्यम हटाने, और 2-3 एमएल, बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ संस्कृति धो लें। पीबीएस निकालें और सेल संस्कृति के लिए 0.5 एमएल, बाँझ 0.25% trypsin EDTA समाधान जोड़ने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं जब तक कोशिकाओं को अलग (लगभग 10 मिनट)।
  3. trypsin रोकने के लिए और उन्हें एक बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए 3-4 एमएल बाँझ पूरा मध्यम में कोशिकाओं को निलंबित। (आरटी) कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए 150 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला ध्यान त्यागें और पी निलंबित2-3 एमएल बाँझ पूरा मध्यम में Ellet।
  4. सेल निलंबन के 100 μL बाहर ले लो और 100 μL 0.4% (एम / वी) trypan नीले समाधान के साथ मिश्रण, मृत कोशिकाओं दाग। लोड एक hemocytometer में इस मिश्रण के 10 μL और उलटा माइक्रोस्कोप से व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण।
  5. सेल निलंबन के लिए आवश्यक राशि बाँझ पूरा मध्यम के साथ 10 एमएल के लिए 1.3 चरण में तैयार, 4 एक्स 10 4 सेल / एमएल युक्त पतला।
  6. सेल निलंबन (1.5 चरण में तैयार) अच्छी तरह से प्रति के 250 μL जोड़ें (10 4 सेल / अच्छी तरह से) पहले गिलास नीचे 8 अच्छी तरह से सूक्ष्म स्लाइड के सात कुओं में। GnRH तेज विधि में इस स्लाइड का प्रयोग करें।
  7. सेल निलंबन (1.5 चरण में तैयार) अच्छी तरह से प्रति के 250 μL जोड़ें (10 4 सेल / अच्छी तरह से) दूसरे 8 अच्छी तरह से सूक्ष्म स्लाइड के पांच कुओं में। इस स्लाइड GnRH आईआर अभिव्यक्ति पद्धति में इस्तेमाल किया जाएगा।
  8. जोड़े 1 सेल निलंबन (1.5 चरण में तैयार) अच्छी तरह से प्रति एमएल (4 एक्स 10 4 सेल / अच्छी तरह से) सात wel में12 अच्छी तरह से थाली की रास। यह प्लेट GnRH मात्रा का ठहराव विधि में इस्तेमाल किया जाएगा।
  9. कोशिकाओं दो सूक्ष्म स्लाइड और थाली पर पालन करते हैं। 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified, 5% सीओ 2 माहौल इनक्यूबेटर में उन्हें सेते हैं।
  10. ऊष्मायन के बाद (10X चरण विपरीत उद्देश्य का उपयोग) उलटा माइक्रोस्कोप से कोशिकाओं की जाँच करें। कोशिकाओं को स्वस्थ और संलग्न हैं, तो निम्न चरणों के साथ जारी है।
  11. तीन conjugates 18 में से प्रत्येक से डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में 10 मिमी GnRH-FITC शेयर समाधान तैयार है। (इन कमजोर पड़ने सांद्रता का उपयोग करें: 16.43 माइक्रोग्राम / μL [डी-लिस 6 (FITC)] - GnRH-मैं, 16.97 माइक्रोग्राम / μL [डी-लिस 6 (FITC)] - GnRH-द्वितीय और 16.47 माइक्रोग्राम / μL [लिस 8 ( FITC)] - GnRH III) आरटी पर एक अंधेरी जगह में इन स्टॉक समाधान रखें और कुछ ही हफ्तों के भीतर अप का उपयोग करें।
  12. 1.7 μL 1.7 एमएल पूरा मध्यम में तीन 10 मिमी GnRH-FITC स्टॉक समाधान के प्रत्येक पतला। इन समाधान हिला। (thesई 10 माइक्रोन के GnRH-FITC मीडिया इलाज कर रहे हैं।) 1.35 एमएल पूरा मध्यम में 150 μL तीन 10 माइक्रोन के GnRH-FITC इलाज के मध्यम से प्रत्येक पतला। इन समाधान हिला के रूप में अच्छी तरह से (इन 1 माइक्रोन GnRH-FITC इलाज मध्यम) कर रहे हैं।
    नोट: सभी GnRH-FITC इलाज मध्यम युक्त प्रकाश से सुरक्षित है और कुछ ही घंटे के भीतर किया जाना चाहिए।
  13. छह GnRH-FITC इलाज मध्यम (1.12 कदम में तैयार) और 4 एमएल पूरा मध्यम 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पहले से गरम।
  14. 5 मिमी फ्लोरोसेंट जांच समाधान के 3 μL 5 माइक्रोन के लिए 3 एमएल पीबीएस में (परमाणु counterstain सामग्री सूची में उल्लिखित) पतला। यह समाधान प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए, आरटी पर इसे रखना और इसे उपयोग करने के कुछ ही घंटों के भीतर।

2. Confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग लेजर (CLSM)

  1. GnRH तेज विधि
    1. पहले सूक्ष्म स्लाइड 1.6 चरण में तैयार रखना और अच्छी तरह से सात में से प्रत्येक से पूरा मध्यम बाहर पिपेट। preheated पूरा दवा के 250 μL जोड़ेपहले अच्छी तरह से में उम। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस का प्रयोग करें। (1 माइक्रोन और 3 के साथ 10 माइक्रोन के साथ 3 कुओं) अगले छह कुओं में से प्रत्येक के लिए (1.13) से मीडिया के इलाज preheated GnRH-FITC के 250 μL जोड़ें। 5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified, 5% सीओ 2 माहौल इनक्यूबेटर में स्लाइड सेते हैं।
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से मध्यम बाहर पिपेट और 250 μL पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। 10 मिनट के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक में समाधान फिक्सिंग (10% तटस्थ बफर formalin) के 250 μL जोड़ें और आरटी पर स्लाइड सेते हैं।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से फिक्सिंग समाधान बाहर पिपेट और 250 μL पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। 10 मिनट के लिए पीबीएस 5 सुक्ष्ममापी फ्लोरोसेंट जांच समाधान अच्छी तरह से प्रत्येक में कदम 1.14 में तैयार युक्त के 250 μL जोड़ें और आरटी पर स्लाइड सेते हैं।
    4. अच्छी तरह से प्रत्येक से फ्लोरोसेंट जांच समाधान बाहर पिपेट, और ध्यान से 250 μL पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें। अंत में प्रत्येक कुएं में बढ़ते मध्यम के 3-4 बूँदें जोड़ें। इमेजिंग तक, आरटी पर अंधेरे में स्लाइड रखें।
    5. GnRH आईआर अभिव्यक्ति विधि
      1. दूसरी 8 अच्छी तरह से सूक्ष्म स्लाइड कदम 1.7 में तैयार रखना और पांच कुओं में से प्रत्येक से पूरा मध्यम बाहर पिपेट।
      2. preheated पूरा मध्यम के 250 μL पहले अच्छी तरह से में जोड़ने, इस रूप में नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करें। preheated पूरा मध्यम के 250 μL दूसरे को अच्छी तरह से में भी जोड़ें, और इस का उपयोग GnRH इलाज से पहले GnRH आईआर अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए।
      3. 250 μL तीन preheated 10 माइक्रोन GnRH-FITC इलाज मीडिया में से प्रत्येक के लिए अगले तीन कुओं में जोड़ें। GnRH आईआर अभिव्यक्ति की जांच से पहले GnRH-FITC conjugates के साथ कोशिकाओं pretreat करने के लिए इन कुओं का प्रयोग करें। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified, 5% सीओ 2 माहौल इनक्यूबेटर में स्लाइड सेते हैं।
      4. तीन कुओं जो GnRH उपचार के बाद GnRH आईआर अभिव्यक्ति की जांच करने और preheated पूरा मध्यम के 250 μL के साथ इन कुओं को धोने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा में से प्रत्येक से इलाज मध्यम बाहर पिपेट। 250 जोड़ेके μL तीन कुओं में से प्रत्येक में पूरा मध्यम छोड़ देते हैं। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified, 5% सीओ 2 माहौल इनक्यूबेटर में स्लाइड सेते हैं।
      5. पांच कुओं में से प्रत्येक से मध्यम बाहर पिपेट और 250 μL पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। 10 मिनट के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक में समाधान फिक्सिंग के 250 μL जोड़ें और आरटी पर स्लाइड सेते हैं।
      6. प्रत्येक अच्छी तरह से फिक्सिंग समाधान बाहर पिपेट और पीबीएस के 250 μL के साथ कोशिकाओं को धो लें। 1 घंटे के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक में 5% से युक्त गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) अवरुद्ध समाधान पीबीएस के 250 μL जोड़ें और आरटी पर स्लाइड सेते हैं।
      7. (: 100 अनुपात 1) 1 मिलीलीटर पीबीएस में GnRH आईआर प्राथमिक एंटीबॉडी के 10 μL पतला। यह आरटी पर रखें और इसका इस्तेमाल कुछ ही घंटों के भीतर।
      8. नकारात्मक नियंत्रण (पहले अच्छी तरह से) को छोड़कर हर अच्छी तरह से बीएसए अवरुद्ध समाधान बाहर पिपेट। (नकारात्मक नियंत्रण में अच्छी तरह से छोड़कर) 250 μL पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। 250 पीबीएस GnRH आईआर प्राथमिक पूर्वी वायु कमान में कदम 2.2.7 में तैयार एंटीबॉडी युक्त μL जोड़ेज अच्छी तरह से (नकारात्मक नियंत्रण को छोड़कर)। आरटी पर स्लाइड सेते हैं, 1 घंटे के लिए, एक अंधेरी जगह में।
      9. (: 500 अनुपात 1) 1.25 एमएल पीबीएस में एलेक्सा 546 लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के 2.5 μL पतला।
        नोट: यह समाधान, प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए यह आरटी पर रखने के लिए और इसे उपयोग करने के कुछ ही घंटों के भीतर।
      10. पांच कुओं में से प्रत्येक से बाहर समाधान पिपेट और 250 μL पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। पीबीएस के 250 μL प्रत्येक कुएं में कदम 2.2.9 में तैयार वायुसेना 546 लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी युक्त जोड़ें। आरटी पर स्लाइड सेते हैं, अंधेरे में 1 घंटे के लिए।
      11. प्रत्येक अच्छी तरह से समाधान बाहर पिपेट और 250 μL पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। पीबीएस 5 सुक्ष्ममापी फ्लोरोसेंट जांच समाधान अच्छी तरह से प्रत्येक में कदम 1.14 में तैयार युक्त के 250 μL जोड़ें और 10 मिनट के लिए स्लाइड सेते हैं, आरटी पर।
      12. प्रत्येक अच्छी तरह से फ्लोरोसेंट जांच समाधान बाहर पिपेट और ध्यान से 250 μL पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें। बाद में प्रत्येक कुएं में बढ़ते मीडिया की 3-4 बूँदें जोड़ें। अंधेरे में स्लाइड रखेंआरटी पर सूक्ष्म इमेजिंग तक।
    6. इमेजिंग
      1. छवि उल्टे लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग द्वारा कोशिकाओं (63X तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग)
        1. निम्नलिखित / उत्तेजना उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का प्रयोग करें। GnRH conjugates: 488/514 एनएम, एलेक्सा 546 लेबल एंटीबॉडी: 488/546 एनएम (केवल GnRH आईआर अभिव्यक्ति विधि के लिए उपयोग), Draq5 फ्लोरोसेंट जांच: 633/680 एनएम।
        2. नकारात्मक नियंत्रण कोशिकाओं का उपयोग इमेजिंग पैरामीटर सेट करें। छवि की इलाज किया कोशिकाओं को इन मानकों (चित्रा 3) का प्रयोग करें। फिर से समायोजित प्रत्येक सूक्ष्म स्लाइड विश्लेषण की शुरुआत में पर इमेजिंग मापदंडों। यदि आवश्यक हो तो निर्माता द्वारा प्रदान की सॉफ्टवेयर के साथ ठीक धुन और निर्यात छवियों।

    3. प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटनी (FACS)

    1. GnRH मात्रा का ठहराव विधि
      1. प्लेट कदम 1.8 में तैयार रखना और ईए से पूरा मध्यम बाहर पिपेटसात कुओं की चर्चा। preheated पूरा मध्यम के 1 एमएल पहले अच्छी तरह से जोड़ें। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस का प्रयोग करें। जोड़े 1 एमएल छह अगले छह कुओं में मीडिया (1 माइक्रोन और 10 माइक्रोन के साथ 3 कुओं के साथ 3 कुओं) के इलाज के लिए छोड़ देते में से प्रत्येक। 5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified, 5% सीओ 2 माहौल इनक्यूबेटर में थाली सेते हैं।
      2. प्रत्येक अच्छी तरह से मध्यम बाहर पिपेट। कोशिकाओं 2 एमएल पीबीएस के साथ दो बार ध्यान से धो लें। trypsin EDTA के समाधान के 500 μL प्रत्येक कुओं में जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं जब तक कोशिकाओं को अलग (लगभग 10 मिनट)।
      3. trypsin को रोकने के लिए प्रत्येक में पूरा मध्यम के 1 एमएल जोड़ें अच्छी तरह से। थाली हिला। एक विंदुक के साथ धीरे कोशिकाओं निलंबित, और FACS ट्यूबों में प्रत्येक अच्छी तरह से निलंबन हस्तांतरण। 4 मिनट के लिए 150 XG पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र, 4 डिग्री सेल्सियस पर।
      4. ध्यान से supernatants बाहर डालो, एक कदम के साथ। कोशिकाओं को फिर से निलंबित प्रत्येक FACS ट्यूब में ठंडा पीबीएस के 500 μL जोड़ें और धीरे। अंत तक बर्फ पर ट्यूबों रखेंप्रयोग के।
    2. विश्लेषण और गणना
      1. प्रवाह cytometry द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण। उत्तेजना के लिए, 488 एनएम आर्गन लेजर तरंग दैर्ध्य का उपयोग करें और पता लगाने के लिए 530 एनएम तरंगदैर्ध्य का उपयोग करें। नकारात्मक नियंत्रण कक्षों को चलाने के द्वारा मापदंडों के प्रवाह को निर्धारित करें। इन मानकों का प्रयोग इलाज किया कोशिकाओं (चित्रा 4 ए) का विश्लेषण करने के लिए। निर्माता के सॉफ्टवेयर के साथ डेटा का मूल्यांकन, मंझला फ्लोरोसेंट तीव्रता (एमएफआई) मूल्यों का निर्धारण, और रिश्तेदार एमएफआई मूल्यों की गणना।

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Representative Results

लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग (CLSM) से प्राप्त छवियों एक समय और एकाग्रता निर्भर तरीके से दिया सेल संस्कृति पर GnRH-FITC conjugates के तेज के बारे में शानदार जानकारी प्रदान करते हैं। इन GnRH-FITC conjugates के साथ समानांतर में, कोशिका की सतह पर GnRH आईआर की उपस्थिति भी CLSM प्रयोग द्वारा प्रमाण है। इसके अलावा, एक दूर लाल डीएनए धुंधला फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करके, यह संभव GnRH और GnRH आईआर इसके अलावा कोशिकाओं के नाभिक counterstain है। हालांकि, जबकि confocal छवि quantifiable नहीं है, सरल "GnRH तेज विधि" आसानी से अनुमान कर सकते हैं कि क्या परीक्षण किया कोशिकाओं GnRH-FITC conjugates के अधिक या कम मात्रा में होते हैं। लागू किया GnRH-FITC conjugates, उनके सांद्रता, और उपचार के समय के रूप में की जरूरत है, इस विधि में चर रहे हैं। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 1 विभिन्न कैंसर की कोशिकाओं को एक एकाग्रता निर्भर तरीके से GnRH-FITC के विभिन्न स्तर होते हैं। उन्नत "GnRH आईआर अभिव्यक्ति विधि", immunocytochemistry द्वारा कोशिका की सतह GnRH आईआर के दृश्य का वर्णन पहले और GnRH-FITC उपचार के बाद। इस विधि (GnRH-FITC इलाज से पहले) के पहले भाग में, हम immunocytochemistry द्वारा GnRH आईआर कल्पना, GnRH-FITC इलाज के बिना। इस विधि (GnRH-FITC उपचार के बाद) के दूसरे भाग में, हम 10 माइक्रोन GnRH-FITC के साथ 1 घंटे के लिए कोशिकाओं का इलाज। उपचार के बाद, हम आगे 1 घंटे के लिए पूरा मध्यम में कोशिकाओं को सेते हैं और immunocytochemistry द्वारा GnRH आईआर कल्पना। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 2A, विभिन्न कैंसर कोशिकाओं GnRH-FITC इलाज से पहले उनकी सतह पर GnRH आईआर के विभिन्न स्तरों दिखा रहे हैं। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 2 बी, GnRH-FITC उपचार के बाद, GnRH आईआर कोशिकाओं को व्यक्त (ईबीसी -1) या वृद्धि (डेट्रायट 562) GnRH आईआर उनके झिल्ली पर स्तर को बनाए रखने। इस बिंदु पर ध्यान दें, हम पहले से इस बात की पुष्टि करता है कि Bxपीसी-3 कोशिकाओं को भी अभिव्यक्त GnRH आईआर, लेकिन उनके झिल्ली 18 पर यह मौजूद नहीं है। GnRH आईआर immunocytochemistry द्वारा BxPC -3 कोशिकाओं के अंदर देखे जा सकते हैं, अगर उनके झिल्ली permeabilized रहे हैं। इस घटना BxPC -3 कोशिकाओं की अपेक्षाकृत कम GnRH तेज दक्षता बताते हैं। इन बयान के आधार पर हम यहाँ कोशिका की सतह GnRH आईआर पर ही ध्यान देते हैं। तुलना चित्रा 1 2 पुष्टि की है कि कोशिका की सतह GnRH आईआर का स्तर इसी कोशिकाओं में GnRH-FITC की राशि के साथ संबद्ध आंकड़ा। इसके अलावा, चित्रा -3 सी स्पष्ट किया है कि GnRH-FITC कोशिकाओं में क्योंकि GnRH-FITC के स्थानीयकरण GnRH-FITC उपचार की कोशिका की सतह GnRH-मैं-मांझी 1 घंटा की संकेत से अलग किया जाता है भाँति है। हम निष्कर्ष है कि "GnRH आईआर अभिव्यक्ति विधि" सूचना "GnRH तेज विधि" से प्राप्त समर्थन करता है।

यह अच्छी तरह से समायोजित सेट का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण हैइमेजिंग के दौरान सी चीज़ें। जैसा कि FITC (514 एनएम) और fluorophore लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी (546 एनएम) के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य में चित्रा 3 ए में सचित्र, इलाज नकारात्मक नियंत्रण कोशिकाओं को भी एक मामूली autofluorescence है। यह अवांछित प्रतिदीप्ति झूठी सकारात्मक परिणाम प्रदान कर सकते हैं। इस प्रकार, इमेजिंग की शुरुआत में यह रूप में चित्रा 3 बी में दिखाया नियंत्रण कक्षों पर प्रतिदीप्ति तीव्रता को समायोजित करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह उम्मीद है कि एक दो अन्य तरंग दैर्ध्य में परमाणु दाग ​​(680 एनएम) के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य में नाभिक के स्पष्ट संकेत का पालन करेंगे, फ्लोरोसेंट संकेत के साथ सिर्फ दृश्य या शून्य के पास है। अन्य सभी सेल के नमूने इन अच्छी तरह से समायोजित और तय मानकों के साथ imaged किया जाना चाहिए। इस तरह, 514 एनएम पर मनाया संकेत GnRH आईआर विशेष रूप से और नाभिक के संकेत से 680 एनएम के संकेत से केवल FITC-GnRH के संकेत से ली गई है, 546 एनएम के रूप में चित्रा -3 सी में दिखाया गया है। छवियाँ फाई हो सकता हैइमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर यदि आवश्यक हो तो बाद NE-देखते।

प्रवाह cytometry प्रयोगों GnRH-FITC conjugates की राशि है जो कोशिकाओं द्वारा लिया गया था के बारे में मात्रात्मक जानकारी प्रदान करते हैं। लागू किया GnRH-FITC conjugates, उनके सांद्रता और उपचार के समय भी जरूरत के रूप में, इस विधि में चर रहे हैं। अनुपचारित कोशिकाओं प्रवाह मानकों cytometry और विश्लेषण की शुरुआत में उनकी औसत फ्लोरोसेंट तीव्रता (एमएफआई) निर्धारित करने के लिए एडजस्ट करने के लिए के रूप में नकारात्मक नियंत्रण किया जाता है। चित्रा -4 ए पर सचित्र के रूप में एमएफआई एक ही मापदंड का उपयोग कर प्रत्येक नमूने के लिए निर्धारित किया गया था। रिश्तेदार एमएफआई मूल्यों चित्रा 4 बी में गणना सूत्र का उपयोग एमएफआई मूल्यों से गणना कर रहे हैं। इस सूत्र का उपयोग करना, नियंत्रण कक्षों के रिश्तेदार एमएफआई मूल्य हमेशा शून्य है। गणना की रिश्तेदार एमएफआई मूल्यों GnRH-FITC conjugates, जो उनके एक के लिए आनुपातिक हैं के फ्लोरोसेंट तीव्रता योंकोशिकाओं में verage सांद्रता। जैसा कि चित्र में सचित्र 5, इन आंकड़ों के साथ, एक प्रदर्शन और तुलना कैसे कुशलतापूर्वक इन कैंसर की कोशिकाओं को GnRH-FITC conjugates लग सकता है। इस प्रकार, प्रवाह से प्राप्त परिणामों cytometry के पूरक हैं और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा अधिग्रहीत छवियों का समर्थन।

आकृति 1
चित्रा 1: इलाज और [लिस 8 (FITC)] के Confocal छवियों - GnRH-III कैंसर की कोशिकाओं का इलाज किया। ब्लू दाग: नाभिक; हरे रंग के दाग: [लिस 8 (FITC)] - GnRH-III। इन छवियों "GnRH तेज विधि" का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं। (ए) अनुपचारित कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति संकेतों प्रत्येक कोशिका लाइन पर 514 एनएम (हरा) पर शून्य के पास करने के लिए समायोजित कर रहे हैं। Draq5 दूर लाल फ्लोरोसेंट जांच कोशिकाओं के नाभिक दाग प्रयोग किया जाता है। (बी) सेटिंग्स, ईबीसी -1 फेफड़ों के कैंसर और डेट्रायट 562 मानव लगाने के बादग्रसनी कैंसर की कोशिकाओं को पहचाने जाने दिखा, लेकिन 514 एनएम (हरा) 1 माइक्रोन [लिस 8 (FITC)] के साथ 5 घंटे के इलाज के बाद कम से कम संकेत - GnRH-III। (सी) 10 माइक्रोन के साथ 5 घंटे के इलाज के बाद [लिस 8 (FITC)] - GnRH-तृतीय, तीन सेल लाइनों में से प्रत्येक के वर्तमान उच्च फ्लोरोसेंट संकेत। इस प्रयोग के परिणाम से संकेत मिलता है कि BxPC -3 अग्नाशय कैंसर की कोशिकाओं को अन्य दो सेल लाइनों है कि आसानी से GnRH conjugates द्वारा लक्षित करने योग्य हैं की तुलना में काफी कम दक्षता के साथ GnRH-FITC लिया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: कोशिका की सतह GnRH आईआर पहले और बाद में [डी-लिस 6 (FITC)] के Confocal छवियों - GnRH-मैं इलाज। ब्लू दाग: नाभिक; हरे रंग के दाग: [डी-लिस 6 (FITC)] - GnRH-मैं; लाल दाग : GnRH आईआर। इन छवियों "GnRH आईआर अभिव्यक्ति विधि" का उपयोग उत्पन्न कर रहे हैं। (ए) GnRH-FITC इलाज से पहले, BxPC-3 कोशिकाओं GnRH आईआर झिल्ली पर, नहीं है हालांकि ईबीसी-1 कोशिकाओं उच्च प्रदर्शन, और कुछ डेट्रायट 562 कोशिकाओं GnRH आईआर के मध्यम स्तर दिखा रहे हैं। (बी) GnRH-FITC उपचार के बाद, BxPC-3 कोशिकाओं को अभी भी अपने झिल्ली पर GnRH आईआर प्रदर्शन नहीं करते। EBC-1 कोशिकाओं को अपनी GnRH आईआर अभिव्यक्ति और GnRH-FITC उन के अंदर प्रकट होता है बनाए रखें। डेट्रायट 562 ​​कोशिकाओं के इलाज के बाद GnRH आईआर के उच्च स्तर का प्रदर्शन होने लगते हैं और वे भी GnRH-FITC हाथ में ले लिया। इस प्रयोग से पता चलता है कि घातक ट्यूमर कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार उनकी सतह पर GnRH आईआर के विभिन्न स्तर दिखा रहे हैं, और GnRH-FITC तेज बारीकी से कोशिका की सतह GnRH आईआर अभिव्यक्ति से संबंधित होने लगता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

_content "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> चित्र तीन
चित्रा 3: ईबीसी -1 फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं के confocal छवियों। ब्लू दाग: नाभिक; हरे रंग के दाग: [लिस 8 (FITC)] - GnRH-III; लाल दाग: GnRH आईआर। इन छवियों "GnRH आईआर अभिव्यक्ति विधि" द्वारा किया जाता है। (ए) अनुपचारित नकारात्मक नियंत्रण कोशिकाओं (GnRH FITC और एलेक्सा 546 के बिना) 514 एनएम और 546 एनएम पर पहचाने जाने और अवांछित प्रतिदीप्ति जब से अधिक प्रवर्धित साधन सेटिंग्स का उपयोग किया है। (बी) के इलाज नकारात्मक नियंत्रण कक्षों पर साधन सेटिंग्स का समायोजन, ग्रीन (514nm) और लाल (546 एनएम) संकेत शून्य के पास है। (सी) समायोजित मापदंडों के GnRH-FITC इलाज और GnRH आईआर दाग कोशिकाओं के लिए स्पष्ट और विश्वसनीय संकेतों में परिणाम। GnRH-FITC उपचार के बाद, GnRH-FITC (हरा) का स्थानीयकरण कोशिका की सतह GnRH आईआर (लाल) से अलग है।529fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: प्रवाह cytometry डेटा का मूल्यांकन। (ए) इलाज और इलाज डेट्रायट 562 कोशिकाओं के हिस्टोग्राम। सेल के नमूने की एमएफआई मूल्यों हिस्टोग्राम से निर्धारित होते हैं। एक्स अक्ष कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट तीव्रता को दर्शाया गया है, और y अक्ष में गिना जाता है दर्शाया गया है। काले पंक्ति: GnRH-FITC इलाज से पहले एमएफआई; हरी बिंदीदार रेखा: 1 माइक्रोन [लिस 8 (FITC)] के साथ 5 घंटे के इलाज के बाद एमएफआई - GnRH-III; GnRH-III - 10 माइक्रोन [लिस 8 (FITC)] के साथ 5 घंटे के इलाज के बाद एमएफआई: लाल रेखा धराशायी। (बी) के रिश्तेदार एमएफआई मूल्यों की गणना सूत्र। रिश्तेदार एमएफआई मूल्यों एमएफआई मूल्यों से गणना कर रहे हैं। इस गणना का उपयोग करना, अनुपचारित नियंत्रण नमूना के रिश्तेदार एमएफआई मूल्य हमेशा शून्य है। relat इलाज के नमूने की Ive एमएफआई मूल्यों GnRH-FITC conjugates जो कोशिकाओं के अंदर हैं की राशि का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: GnRH-FITC conjugates के 1 माइक्रोन के साथ 5 घंटे के इलाज के बाद कैंसर कोशिकाओं के रिश्तेदार एमएफआई मूल्यों। सापेक्ष एमएफआई मूल्यों तुलना कर रहे हैं और कैसे परिभाषित कुशलता को देखते हुए सेल प्रकार GnRH analogues समय लग सकता है। GnRH आईआर गैर-प्रदर्शन BxPC-3 कोशिकाओं इन GnRH analogues के ही निशान होते हैं। GnRH आईआर ईबीसी -1 फेफड़ों के कैंसर कोशिकाओं को व्यक्त उदारवादी होते हैं और डेट्रायट 562 ​​ग्रसनी कैंसर की कोशिकाओं को GnRH analogues के उच्च मात्रा में होते हैं। परिणाम, एन = 3 के रूप में मतलब ± एसडी प्रस्तुत कर रहे हैं।"_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

प्रयोगों यहाँ बताया स्क्रीनिंग पक्षपाती के लिए चुनिंदा लेबल GnRH analogues का उपयोग इन विट्रो में सेल संस्कृतियों। Confocal माइक्रोस्कोपी और cytometry तरीकों पर नज़र रखने के लिए उपयुक्त है और एक समय और एकाग्रता निर्भर तरीके से इन GnRH-FITC conjugates के सेलुलर तेज बढ़ाता हैं प्रवाह। इन प्रयोगों निम्नलिखित महत्वपूर्ण कदम है: 1) एक बाँझ, स्वस्थ कोशिका संस्कृति को बनाए रखने; 2) GnRH पेप्टाइड्स उच्च गुणवत्ता का होना चाहिए; 3) उचित सांद्रता और ऊष्मायन बार पालन किया जाना चाहिए; 4) के इलाज और धोने कदम; 5) साधन सेटिंग्स अच्छी तरह से समायोजित।

प्रकोष्ठों निर्माता की सिफारिश की 10% के साथ पूरक मध्यम (वी / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं (पूरा मध्यम) में रखा जाता है। प्रकोष्ठों रखा जाना चाहिए और (GnRH-FITC conjugates) के साथ इलाज के कदम जब तक एक बाँझ वातावरण में संभाला। प्रयोगों से पहले, एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कोशिकाओं की जाँच करें। वे स्वस्थ होना चाहिएसंलग्न हैं और आवश्यक मात्रा तक पहुँचने चाहिए।

यह उच्च गुणवत्ता और शुद्धता के साथ GnRH पेप्टाइड्स का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। हम इन पेप्टाइड्स संश्लेषित और उन्हें% 18 98 से अधिक के लिए शुद्ध। पेप्टाइड एक lyophilized पाउडर के रूप में एक रेफ्रिजरेटर में -25 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। 10 DMSO में मिमी GnRH-FITC स्टॉक समाधान कमरे के तापमान पर एक अंधेरी जगह में रखा है और कुछ ही हफ्तों के भीतर किया जाना चाहिए। हम इन conjugates की स्थिरता की जांच की और पाया कि वे DMSO में स्थिर हैं और उनके प्रतिदीप्ति तीव्रता उचित भंडारण के 1 महीने के बाद रखा जाता है। GnRH-FITC conjugates की एकाग्रता और उपचार के समय इन प्रयोगों, जो महान लाभ प्रदान करता है में चर रहे हैं, लेकिन कुछ सीमाओं के साथ (नीचे देखें)। लागू किया सांद्रता और इस प्रोटोकॉल में ऊष्मायन बार केवल सिफारिशें की हैं, लेकिन वे प्रारंभिक प्रयोगों के लिए एक अच्छा आधार प्रदान करते हैं।

CLSM प्रयोगों तोड़ की आवश्यकता होती हैअल धोने कदम। इन चरणों का ध्यानपूर्वक बाहर किया जाना चाहिए। कोशिकाओं पर सीधे तरल हस्तांतरण नहीं है। बल्कि, पक्ष या इस उद्देश्य के लिए कुओं के कोने का उपयोग करें। इस बंद धोने और पालन कोशिकाओं को खोने को कम कर सकते हैं। यह भी रूप में यह फ्लोरोसेंट नमूने (photobleaching प्रभाव) असंवेदनशील कर सकते हैं, पूरे प्रयोग के दौरान प्रत्यक्ष प्रकाश से बचने के लिए सिफारिश की है। एक अंधेरी जगह में इलाज के नमूने रखें या प्रयोग के दौरान एल्यूमीनियम पन्नी के एक टुकड़े के साथ कवर किया। पिछले निष्कर्ष के आधार पर हमने देखा है कि लागू इलाज मीडिया में अंतिम DMSO एकाग्रता नगण्य (0.1% (वी / वी) 10 माइक्रोन के इलाज के मीडिया में DMSO) और परिणामों पर कोई प्रभाव नहीं है, जिससे DMSO मुक्त पूरा मध्यम है नकारात्मक नियंत्रण के रूप में भी उपयुक्त है।

यह CLSM और FACS प्रयोगों के दौरान अच्छी तरह से समायोजित साधन मापदंडों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। इन मानकों, हर कोशिका प्रकार पर फिर से calibrated किया जा करने के लिए पहले दोनों का विश्लेषण करती है की जरूरत है। CLSM प्रयोग में, Siलेजर तीव्रता, डिटेक्टर लाभ और ऑफसेट, और पिनहोल आकार: confocal छवियों के gnal तीव्रता निम्नलिखित मानकों पर निर्भर करता है। जब इन मानकों का समायोजन, सबसे कम लेजर शक्ति का उपयोग एक स्वीकार्य छवि का उत्पादन और photobleaching से बचने के लिए। निकट शून्य (चित्रा 3 बी) को बेदाग नकारात्मक नियंत्रण कक्षों की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति समायोजित करने के लिए इमेजिंग पैरामीटर सेट करें। इन मानकों के साथ समायोजित छवि इलाज किया कोशिकाओं झूठी सकारात्मक परिणाम से बचने के लिए। अतिरिक्त संकेतों 514 एनएम और 546 एनएम पर इलाज कोशिकाओं GnRH या GnRH आईआर के बारे में आवश्यक जानकारी होती है से उत्सर्जित। ये कदम CLSM प्रयोगों में अनुभव की आवश्यकता होती है। FACS प्रयोग में, एक मानक आगे तितर बितर-पक्ष तितर बितर साजिश (रैखिक पैमाने) और सेट voltages साजिश के बीच में मुख्य रहने वाले सेल की आबादी को समायोजित करने के लिए पैदा करते हैं। जीवित कोशिकाओं के चारों ओर एक क्षेत्र ड्रा। एक हिस्टोग्राम बनाने, सेट भुज एक (FL1-530 एनएम, लघुगणकीय पैमाने) चैनल के लिए और एक गेट के रूप में पहले से परिभाषित क्षेत्र सेटइस हिस्टोग्राम के लिए। 10 1 (चित्रा -4 ए) के तहत बेदाग नकारात्मक नियंत्रण कक्षों के संकेत लाने के लिए FL1 वोल्टेज सेट। इन मानकों को समायोजित के साथ इलाज किया कोशिकाओं का विश्लेषण।

इसके अलावा, यह समय समय पर सेल संस्कृतियों के माइकोप्लाज्मा की स्थिति की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है। विभिन्न assays इस उद्देश्य के लिए उपलब्ध हैं। माइकोप्लाज्मा सकारात्मकता के मामले में, कोशिकाओं को त्यागने और एक नई संस्कृति के साथ काम करना शुरू करते हैं। यह संस्कृति के माध्यम से जो माइकोप्लाज्मा को रोकने के लिए अनुकूलित है में एक एंटीबायोटिक मिश्रण का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। GnRH-FITC conjugates के लिए आवेदन किया एकाग्रता, और उपचार के समय इन प्रयोगों में चर रहे हैं, लेकिन कम मात्रा और कम ऊष्मायन बार आवेदन करने प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए भी कमजोर संकेतों में परिणाम सकता है।

GnRH analogues के साथ समानांतर में GnRH आईआर जब इमेजिंग, उच्च GnRH-FITC एकाग्रता की सिफारिश की है (10 माइक्रोन के इष्टतम है)। उच्च एकाग्रता के लिए कारणलघु ऊष्मायन समय (1 घंटा) और GnRH-FITC conjugates की तुलना में लेबल एंटीबॉडी के अपेक्षाकृत उच्च प्रतिदीप्ति संकेत है। दूसरी ओर, दो फ्लोरोसेंट रंजक उत्सर्जन (514 एनएम और एनएम 546) के बीच एक मामूली ओवरलैप मिला था, जो केवल 546 एनएम पर होता है और GnRH-FITC conjugates के संकेत से ली गई है। हालांकि, एलेक्सा 546 और अच्छी तरह से समायोजित मापदंडों के अपेक्षाकृत उच्च फ्लोरोसेंट संकेत के रूप में चित्रा 3 में प्रदर्शन किया, इस प्रभाव को कम कर सकता है। ओवरलैप से बचने के लिए एक अन्य संभावित समाधान, माध्यमिक एंटीबॉडी जो विभिन्न उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और / या बेहतर अलग उत्सर्जन स्पेक्ट्रम FITC की तुलना में (अगर CLSM तकनीकी मानकों यह अनुमति) है लेबल लागू है। इस संभावना CLSM विधि है, जो GnRH-FITC conjugates के साथ समानांतर में वैकल्पिक फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग सक्षम बनाता है के लिए महान लाभ प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, इन वैकल्पिक फ्लोरोसेंट जांच अन्य अंगों counterstaining के रूप में की जरूरत के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

GnRH-FITC conjugates के लिए आवेदन किया एकाग्रता निम्नलिखित सीमाएँ हैं। GnRH-FITC conjugates की अधिकतम सीमा में एकाग्रता उनकी घुलनशीलता 18 पर आधारित है। इन मूल्यों को कमरे के तापमान पर पीबीएस में निम्नलिखित हैं: GnRH-मैं: 90 माइक्रोन के; GnRH-द्वितीय: 40 माइक्रोन के; GnRH III: 200 माइक्रोन। दूसरी ओर, पिछले प्रयोगों में हम माना जाता है कि इन GnRH पेप्टाइड्स की तेज मानव GnRH-मैं रिसेप्टर्स के अलावा अन्य रिसेप्टर्स द्वारा जगह ले सकता है; इस तेज 18 (10 माइक्रोन से ऊपर) उच्च सांद्रता में और अधिक महत्वपूर्ण हो रहा है। GnRH-FITC conjugates के निचले सीमा का पता लगाने मानकों की एक किस्म पर आधारित है, लेकिन आदर्श सेटिंग्स में यह CLMS प्रयोगों के लिए लगभग 1 माइक्रोन है। हम उस से फ्लो confocal माइक्रोस्कोपी की तुलना में बेहतर संवेदनशीलता प्रदान करता पाया। आदर्श सेटिंग्स में, GnRH-FITC conjugates की मात्रा का ठहराव सीमा से कम 1 माइक्रोन हो सकता है। पता लगाने या मात्रा का ठहराव की सीमा सकता हैहर प्रयोग में अलग-अलग हो सकता है, क्योंकि वे सेल प्रकार और ऊष्मायन समय पर निर्भर हैं। ध्यान दें कि FACS द्वारा प्राप्त आंकड़ों, क्योंकि यह नमूना प्रति कोशिकाओं के हजारों का पता लगाता है और कोशिकाओं की औसत संकेत गणना की जाती है CLSM की तुलना में अधिक विश्वसनीय है। हालांकि, प्रोटोकॉल में, FACS GnRH-FITC conjugates के सेलुलर स्थानीयकरण और GnRH आईआर की कोशिका की सतह अभिव्यक्ति के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है। इन विचारों के आधार पर हम निष्कर्ष है कि, CLSM और FACS प्रयोगों अलग फायदे हैं, और वे एक दूसरे के पूरक हैं। दूसरी ओर, उच्च सामग्री छवि विश्लेषण एक दिलचस्प और FACS और CLSM विश्लेषण के लिए एक अच्छा विकल्प हो सकता है।

सारांश में, डेटा इन प्रयोगों से प्राप्त पुष्टि करते हैं कि तीन GnRH-FITC conjugates के प्रत्येक कोशिकाओं जो कोशिका की सतह GnRH आईआर एक्सप्रेस में प्रवेश कर सकते हैं। ये GnRH अनुरूप ही सांद्रता में समान लक्ष्य-निर्धारण शक्ति है। हालांकि, विभिन्न सकता है की सतह पर GnRH आईआर स्तरप्रमाणपत्र कोशिकाओं को अत्यधिक चर रहा है। गणना प्रवाह cytometry विश्लेषण के डेटा से परिणाम सेल लाइनों या GnRH analogues के तुलना में सक्षम बनाता है। इसी समय, confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त छवियों कोशिका की सतह GnRH आईआर अभिव्यक्ति के स्तर का पता चलता है और इस बात की पुष्टि है कि इन कोशिकाओं में conjugates भाँति रहे हैं सकता है। इन परिणामों के आधार पर, एक की पुष्टि कर सकते हैं कि शुरू प्रयोगों GnRH आधारित दवा वितरण प्रणाली की जांच के लिए व्यावहारिक और चर तरीकों होते हैं और आगे के प्रयोगों के लिए एक अच्छा आधार प्रदान करते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
EBC-1 JCRB Cell Bank JCRB0820 Human lung squamous cell carcinoma
BxPC-3 ATCC CRL-1687 Human pancreatic adenocarcinoma
Detroit-562 ATCC CCL-138 Human pharyngeal carcinoma
RPMI-1640 Medium with L-glutamine Lonza BE12-702F Culture medium for BxPC-3 cells
Eagle's Minimum Essential Medium Lonza BE12-611F Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0.1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells
Fetal Bovine Serum Euro Clone ECS0180L Complements the culture medium
MycoZap Plus-CL  Lonza VZA-2012 Complements the culture medium (antibiotics)
Standard Line Cell Culture Flasks VWR 10062-872 Provide consistent, sterile growth environment for cells
Trypsin-EDTA Mixture  Lonza BE17-161E Remove attached cells
Phosphate Buffered Saline (PBS) Lonza BE17-516F Solvent
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418-100ML Solvent
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061 Used to counting cells
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I made by us - Purity ≥98% (HPLC)
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II made by us - Purity ≥98% (HPLC)
[Lys8(FITC)]-GnRH-III made by us - Purity ≥98% (HPLC)
glass bottom 8-well microscopic slide Ibidi 80826 Use in CLSM experiment
Corning Costar cell culture plate, 12 well Sigma-Aldrich CLS3513-50EA Use in FACS experiment
Fixing solution (10% neutral buffered formalin) Bio-Optica 01V60P Fix adherent cells
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-10G Prevent the nonspecific binding of the antibodies
GnRHR Antibody Proteintech 19950-1-AP Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors
Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate Thermo Fisher Scientific A11035 Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody
Fluorescent probe solution (Draq5) Thermo Fisher Scientific 62254 Counterstain nuclei
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Sigma-Aldrich F4680-25ML Use in CLSM experiment, preserving fluorescence
Inverted microscope Elektro-Optika Ltd.  Alpha XDS-2T Check the phenotype and confluency of cell cultures
Inverted confocal laser scanning microscope Zeiss LSM-710 Use in CLSM experiment
Flow cytometer BD Biosciences BD FACSCalibur Use in FACS experiment

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कैंसर रिसर्च अंक 121 लक्षित चिकित्सा कैंसर ट्यूमर सेल साधना confocal माइक्रोस्कोपी GnRH FITC FACS CLSM
<em>इन विट्रो</em> इमेजिंग और fluorescently लेबल GnRH analogues के ड्रग लक्ष्य निर्धारण क्षमता की मात्रा का ठहराव <em>में</em>
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Murányi, J., Varga, A., Gurbi,… More

Murányi, J., Varga, A., Gurbi, B., Gyulavári, P., Mező, G., Vántus, T. In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues. J. Vis. Exp. (121), e55529, doi:10.3791/55529 (2017).

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