Summary
選択的に標識された蛍光のGnRH-I、-IIおよび-III誘導体は、それらの細胞への取り込みを追跡し、定量化するための信頼性の高いツールです。本稿では、可視化、定量化、および種々の細胞株におけるこれらのGnRHの結合体の取り込み効率を比較するための実験を紹介します。
Abstract
GnRH類似体は、ターゲティング部分、効果的かつ高度にGnRH受容体を発現する悪性腫瘍細胞に選択的に抗癌剤を送達することができます。しかしながら、GnRH類似体」細胞取り込みの定量分析とのGnRHに基づく薬物送達系で調べた細胞型は現在制限されています。先に紹介した、選択的に標識された蛍光のGnRH I、-IIおよび-III誘導体は素晴らしい検出性を提供し、彼らは再現性と堅牢な実験に適した化学的特性を有しています。我々はまた、これらの標識されたGnRH類似体との適切な最新の方法は、のGnRHに基づく薬物送達システムに関する新たな情報を提供できることを見出しました。 GnRH-I、[D-Lysの6（FITC）] - -のGnRH-IIおよび[Lysの8（FITC）] -のGnRHこの原稿は、[D-Lysの6（FITC）]の細胞への取り込みに関するいくつかの簡単かつ迅速に実験を紹介しますEBC-1（肺）に-III、たBxPC-3（膵臓）、デトロイト-562-（咽頭）に悪性トンumor細胞。これらのGnRH-FITCコンジュゲートと並行して、のGnRH-I受容体の細胞表面レベルはまた、共焦点レーザー走査顕微鏡でのGnRH処理前後のこれらの細胞系で調べました。 GnRH-FITCコンジュゲートの細胞取り込みは、蛍光活性化細胞ソーティングにより定量しました。これらの実験でのGnRH類似体および細胞型間の主な相違点間のわずかな違いが観察されました。細胞株の間で有意差は、細胞表面のGnRH-I受容体のそれらの異なるレベルと相関しています。導入された実験では、可視化、定量化、およびさまざまな接着細胞培養物に対する時間および濃度依存的にのGnRH-FITC複合体の取り込み効率を比較するために実用的なメソッドが含まれています。これらの結果は、与えられた細胞培養上のGnRH結合体の薬物ターゲティング効率を予測し、のGnRHに基づく薬物送達システムの検査でさらなる実験のための良い基盤を提供することができます。
Introduction
ペプチドに基づく標的化薬物送達システムは、過去数年1、2にわたって癌治療で急速に発展し、有望な領域となっています。ヒトゴナドトロピン放出ホルモン受容体I型（たGnRH-IR）は、主に脳下垂体に位置するだけでなく、自己再生3を担当しているいくつかの他の組織中に存在します。 GnRH-IRはまた、生殖系4,5に関連または関係のない、癌組織の数で表されます。健常組織と比較して、いくつかの悪性腫瘍細胞上のGnRH-IRの高発現は、標的治療5、6のための機会を提供しています。
多くのゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）類似体は、標的化部分として使用することができる最後の数十年に開発されていますF "> 7、8、9。これらのペプチドは、その過剰発現のGnRH-IR 6悪性腫瘍細胞に選択性の高い抗がん剤を送達することができます。対応する非コンジュゲートよりも高い選択性と優れた効率性を有するいくつかのGnRH結合抗腫瘍薬遊離薬物は、7、8、9を報告されています。
GnRHペプチドとその受容体についての前の出版物はのGnRH-IRはのGnRHは10を類似体に対して異なる選択性を有する様々な立体配座をとることができることを報告しました。非常に可変性のGnRH-IRは、複雑で多様なシグナル伝達経路は、それらの天然と人工のリガンド11に対して異なるアクティビティに恵まれているしています。これらの事実は挑戦のGnRHベースのシステムの調査を行います。一方、 Yは、有望な治療可能性を有します。放射性標識のGnRHペプチドといくつかの実験は、以前に12、13、14、15に報告されたが、蛍光標識されたGnRH類似体が使用された実験はまだ限られている。し放射性標識は高感度を提供していますが、蛍光標識は、いくつかの他の利点、例えば扱いやすく、かつ異なる蛍光体で対比染色する能力を持っています。正常薬物送達のために使用されている3つの一般的なGnRH類似体は、ターゲティング部分として、[D-Lysで6] -GnRH-I、[D-Lysで6] -GnRH-IIとのGnRH-III、これらのペプチドの有効性であるですめったに16、17を比較しません。一方、別の癌細胞およびGnRH類似体が使用された別個の実験からの結果は、多様です。
これらの考察に基づいてntentは">は、これらのGnRHペプチドの腫瘍標的薬物送達の可能性に焦点を当て、それによって合成し、[D-Lysの6（FITC）]特徴付け-のGnRH-I、[D-Lysの6（FITCを）] -のGnRH-IIおよび[Lysの8（FITC）] -のGnRH-IIIペプチド結合体18これらの類似体が選択的にLysまたはD-Lysの側鎖（ペプチド-FITC比1にFITCで標識されています。それぞれに1。コンジュゲート）。アイデアは、選択的蛍光標識は、これらのペプチドについての新たな情報を提供し、それらの良好なトラッキングと信頼性の定量化を可能にすることができるということでした。これらのコンジュゲートは、それが簡単に彼らの腫瘍標的効率を比較することを可能にする安全な取り扱いと信頼性の高い検出能を、持っている、と悪性腫瘍細胞の多くのタイプのスクリーニング。我々は、これらのペプチド複合体とアップへの日付の実験はのGnRH - 薬物複合体を標的とする新たな癌の発展に貢献し、新たな治療タールを識別するために助けることができることを願っています同様になります。現在の原稿はのGnRH-FITCコンジュゲートといくつかのよく再現性と高速実験を示しています。 GnRH-Rの細胞表面発現は、したがって、我々は、同時に試験した細胞株でのGnRH-IRの細胞表面レベルを調べ、のGnRH取り込みに関して決定的な条件です。我々は、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）によってのGnRH-IRとのGnRH-FITC複合体を可視化し、蛍光活性化セルソーティング（FACS）を用いたGnRH-FITCコンジュゲートの細胞取り込みを定量化しました。
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Protocol
細胞培養および試薬の調製
- 10％（v / v）のウシ胎児血清および抗生物質（と呼ばれる完全培地）を補充し、製造業者の推奨する培地中で細胞培養物を維持します。 37℃で加湿し、5％CO 2雰囲気のインキュベーター中で細胞培養フラスコを保管してください。 （10X位相差対物レンズを使用して）倒立顕微鏡で細胞の増殖および密集度に従ってください。
- 細胞が適切なコンフルエンシーに達したとき、培地を除去し、2-3 mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で培養物を洗浄します。 PBSを削除し、細胞培養物に0.5 mLを、無菌の0.25％トリプシン-EDTA溶液を追加し、細胞が（約10分）を切り離すまで37℃でインキュベートします。
- トリプシンを停止し、滅菌遠心管にそれらを転送するために3-4 mLの滅菌、完全培地中の細胞を一時停止します。室温（RT）で4分間、150×gで細胞を遠心します。慎重に上清を捨て、Pを一時停止2-3 mLの滅菌完全培地中でエレト。
- 100μLの細胞懸濁液を取り出し、100μLの0.4％（M / V）トリパンブルー溶液と混合し、死細胞を染色します。血球計数器にロードし、この混合物の10μLをし、倒立顕微鏡により生細胞の数を決定します。
- 4×10 4細胞/ mLを含む無菌の完全培地で10 mLにステップ1.3で調製した細胞懸濁液の必要量を、希釈します。
- 第一のガラス底8ウェル顕微鏡スライドの7ウェルにウェル当たり（ステップ1.5で調製した）細胞懸濁液250μLを加える（10 4細胞/ウェル）。 GnRH取り込み方法でこのスライドを使用してください。
- 第8ウェル顕微鏡スライドの5ウェルにウェル当たり（ステップ1.5で調製した）細胞懸濁液250μLを加える（10 4細胞/ウェル）。このスライドのGnRH-IR発現方法で使用されます。
- 7 WELにウェル当たり（ステップ1.5で調製した）細胞懸濁液の1ミリリットル（4×10 4細胞/ウェル）を追加します12ウェルプレートのLS。このプレートのGnRH定量方法に使用されます。
- 細胞は、2つの顕微鏡スライドプレートに付着してみましょう。 48時間37℃で加湿5％CO 2雰囲気のインキュベーター中でそれらを培養します。
- インキュベーション後（10X位相差対物レンズを使用して）倒立顕微鏡で細胞を確認してください。細胞が健康で取り付けられている場合は、次の手順に進みます。
- 3コンジュゲート18のそれぞれからのジメチルスルホキシド（DMSO）中の10mMのGnRH-FITCストック溶液を準備します。 （これらの希釈濃度を使用してください：16.43μgの/μL[D-Lysの6（FITC）] -のGnRH-I、16.97μgの/μL[D-Lysの6（FITC）] -のGnRH-II及び16.47μgの/μL[リス8（ FITC）] - のGnRH-III）、室温で暗所でこれらのストック溶液を維持し、数週間以内にそれらを使用します。
- 1.7μL1.7 mLの完全培地中で3の10mMのGnRH-FITCストック溶液のそれぞれを希釈します。これらのソリューションを振ります。 （THESeは、10μMのGnRH-FITCは、メディアを処理することがあります。）3、10μMのGnRH-FITCのそれぞれが1.35 mLの完全培地で培地を処理する150μLに希釈します。 （これらは1μMのGnRH-FITC媒体を治療している）だけでなく、これらのソリューションを振ります。
注：処理培地を含むすべてのGnRH-FITCは、光から保護し、数時間以内に使い切るべきです。 - 37°Cまでの6のGnRH-FITC処理培地（ステップ1.12で調製した）および4 mLの完全培地を予熱。
- 5μMに3 mLのPBS中の5mMの3μL蛍光プローブ溶液（物質一覧に記載された核の対比）を希釈します。この溶液を室温でそれを維持し、数時間以内にそれを使用し、光から保護されるべきです。
2.共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）
- GnRH取り込み方法
- ステップ1.6で調製した第1顕微鏡のスライドを取り、よく7のそれぞれから完全培地をピペット。予熱完了メディの250μLを追加umの最初のウェルに。ネガティブコントロールとして、これを使用してください。次の6ウェル（10μMと1μMおよび3で3ウェル）のそれぞれに（1.13から）メディアを治療予熱したGnRH-FITCの250μLを追加します。 5時間37℃で加湿し、5％CO 2雰囲気のインキュベーター中でスライドをインキュベートします。
- 各ウェルから培地をピペットで250μLのPBSで細胞を洗浄。 10分間、各ウェルに固定液（10％中性緩衝ホルマリン）の250μLを加え、室温でスライドをインキュベートします。
- 各ウェルからの定着液をピペットで250μLのPBSで細胞を洗浄。 10分間、各ウェルにステップ1.14で調製した5μM蛍光プローブ溶液を含むPBSの250μLを加え、室温でスライドをインキュベートします。
- 各ウェルからの蛍光プローブ溶液をピペットし、慎重に250μLのPBSで2回細胞を洗浄します。最後に、各ウェルに封入剤の3-4滴を追加します。イメージングまで、室温で暗所でスライドを保管してください。
- GnRH-IR発現方法
- ステップ1.7で調製した第8ウェル顕微鏡スライドを取り、5ウェルのそれぞれから完全培地をピペット。
- この陰性対照として使用し、第一のウェルに予熱した完全培地の250μLを追加します。あまりにも第2のウェルに予熱した完全培地の250μLを追加し、のGnRH処理前のGnRH-IRの発現を調べるためにこれを使用します。
- 次の3つのウェルに250μL3予熱した10μMのGnRH-FITC治療メディアのそれぞれを追加します。 GnRH-IR発現を調べる前のGnRH-FITC結合体で細胞を前処理するためにこれらのウェルを使用してください。 1時間37℃で加湿し、5％CO 2雰囲気のインキュベーター中でスライドをインキュベートします。
- GnRH治療後のGnRH-IRの発現を検査し、予熱した完全培地の250μLでこれらのウェルを洗浄するために使用される3つのウェルのそれぞれから治療培地をピペット。 250を追加します。3つのウェルのそれぞれに予熱した完全培地μL。 1時間37℃で加湿し、5％CO 2雰囲気のインキュベーター中でスライドをインキュベートします。
- 5各ウェルから培地をピペットで250μLのPBSで細胞を洗浄。 10分間、各ウェルに固定溶液の250μLを加え、室温でスライドをインキュベートします。
- 各ウェルからの定着液をピペットのPBS 250μLで細胞を洗浄。各ウェルにブロッキング溶液を5％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBS 250μLを加え、室温でスライドをインキュベートし、1時間。
- （：100比1）1 mLのPBS中のGnRH-IR一次抗体の10μLを希釈します。 RTでそれを維持し、数時間以内にそれを使用します。
- ネガティブコントロール（第一のウェル）を除く各ウェルからBSAブロッキング溶液をピペットで。 （陰性対照ウェルを除く）250μLのPBSで細胞を洗浄。 EACにステップ2.2.7で製造したGnRH-IR一次抗体を含むPBS250μLのを追加します。（ネガティブコントロールを除く）時間も。暗い場所で、1時間、室温でスライドをインキュベートします。
- （：500比1）1.25 mLのPBSでアレクサ546標識二次抗体の2.5μLに希釈します。
注：このソリューションは、光から保護し、室温でそれを維持し、数時間以内にそれを使用する必要があります。 - 5ウェルのそれぞれのソリューションをピペット250μLのPBSで細胞を洗浄。各ウェルにステップ2.2.9で製造したAF 546標識二次抗体を含むPBS250μLのを追加します。暗所で1時間、室温でスライドをインキュベートします。
- 各ウェルからの溶液をピペットで250μLのPBSで細胞を洗浄。各ウェルにステップ1.14で調製した5μM蛍光プローブ溶液を含むPBSの250μLを加え、室温で、10分間、スライドをインキュベートします。
- 各ウェルからの蛍光プローブ溶液をピペットで、慎重に250μLのPBSで2回細胞を洗浄します。その後、各ウェルに取り付けメディアの3-4滴を追加します。暗所でスライドを保ちますRTで顕微鏡イメージングまで。
- イメージング
- 画像（63X油浸対物レンズを使用して）、反転共焦点レーザー走査顕微鏡により細胞
- 以下の励起/発光波長を使用してください。 GnRH結合体：514分の488 nmで、アレクサ546標識抗体：546分の488 nmの（唯一のGnRH-IR表現方法のために使用）、DRAQ5蛍光プローブ：680分の633 nmの。
- 陰性対照細胞を用いた撮像パラメータを設定します。これらのパラメータは、画像処理した細胞（ 図3）に使用します。分析の開始時に各顕微鏡スライド上の撮像パラメータを再調整します。必要な場合は、メーカーが提供するソフトウェアとの微調整と輸出の画像。
- 画像（63X油浸対物レンズを使用して）、反転共焦点レーザー走査顕微鏡により細胞
3.蛍光活性化細胞選別（FACS）
- GnRH定量法
- ステップ1.8で調製したプレートを取り、EAからの完全培地をピペット7井戸のCH。最初のウェルに予熱した完全培地の1 mLを加え。ネガティブコントロールとして、これを使用してください。追加1 mLの次の6ウェルに培地（1μMおよび10μMで3ウェルとの3ウェル）を治療する予熱6の各。 5時間37℃で加湿し、5％CO 2雰囲気のインキュベーターでプレートをインキュベートします。
- 各ウェルから培地をピペット。慎重に2 mLのPBSで細胞を2回洗浄します。各ウェルにトリプシンEDTA溶液500μLを追加します。細胞は（約10分）デタッチするまで、37℃でプレートをインキュベートします。
- トリプシンを停止するには、各ウェルに、完全培地1mlを加えます。プレートを振ります。ピペットで穏やかに細胞を懸濁し、FACSチューブに各ウェルからサスペンションを転送します。 4℃で、4分間、150×gでチューブを遠心。
- 一手で、慎重に上清を注ぎます。各FACSチューブに氷冷PBSの500μLを加え、穏やかに細胞を再懸濁。最後まで氷上でチューブを保ちます実験の。
- 分析と計算
- フローサイトメトリーにより細胞を分析します。励起のため、488nmのアルゴンレーザーの波長を使用して、検出のために530nmの波長を使用します。ネガティブコントロール細胞を実行することにより、パラメータフローサイトメーターを設定します。処理した細胞（ 図4A）を分析するためにこれらのパラメータを使用します。 、メーカーのソフトウェアを使用してデータを評価し、中央値蛍光強度（MFI）値を決定し、相対的なMFI値を計算します。
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Representative Results
共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）によって得られた画像は、時間および濃度依存的な様式で与えられた細胞培養上のGnRH-FITC複合体の取り込みについての見事な情報を提供します。これらのGnRH-FITCコンジュゲートと並行して、細胞表面上のGnRH-IRの存在は、CLSM実験によって検証可能です。また、遠赤DNA染色の蛍光プローブを用いることにより、のGnRHとのGnRH-IR以外の細胞の核を対比染色することが可能です。共焦点画像は、定量化はないがしかし、単純な「のGnRH取り込み方法は、「容易に試験された細胞は、のGnRH-FITCコンジュゲートのより高いまたはより低い量を含むかどうかを推定することができます。必要に応じて適用されたGnRH-FITC複合体、それらの濃度、および治療の時間は、この方法では可変です。 図1に示すように、異なる癌細胞は濃度依存的様式でのGnRH-FITCの異なるレベルを含みます。 高度な "のGnRH-IRの発現方法は、「前とのGnRH-FITC処理後、免疫細胞化学により、細胞表面のGnRH-IRの可視化を記載しています。 （たGnRH-FITC処理前）、このメソッドの最初の部分では、我々はのGnRH-FITC処理なし、免疫細胞化学によってのGnRH-IRを可視化します。 （たGnRH-FITC処理後の）この方法の第二部では、10μMのGnRH-FITCで1時間細胞を処理します。治療後、我々はさらに1時間、完全培地中で細胞をインキュベートし、免疫細胞化学によってのGnRH-IRを可視化します。 図2Aに示すように、異なる癌細胞のGnRH-FITCの処理前に表面上のGnRH-IRの異なるレベルを示します。 図2Bに示すように、のGnRH-FITC処理後、細胞を発現のGnRH-IRは、それらの膜上（EBC-1）または増加（デトロイト562）のGnRH-IRのレベルを維持します。この時点で、我々は以前にBxのことを確認したことに注意してくださいPC-3細胞はまたのGnRH-IRを発現するが、それらの膜18上にそれを提示しないでください。その膜を透過性にされた場合のGnRH-IRは、免疫細胞化学によりたBxPC-3細胞内で可視化することができます。この現象たBxPC-3細胞の比較的低いのGnRH取り込み効率を説明します。これらの文に基づいて、我々はここで、細胞表面のGnRH-IRのみに焦点を当てます。 図2に図1を比較すると、細胞表面のGnRH-IRのレベルは対応するセル内のGnRH-FITCの量と相関すること。確認しますまた、 図3Cは、のGnRH-FITCの局在をのGnRH-FITC処理の細胞表面のGnRH-I-ラフター1時間の信号から分離されるためのGnRH-FITCは、細胞内に内在化されることを明確にしています。我々は、「のGnRH-IR発現方法は ""のGnRH取り込み法」から得られた情報をサポートしていることを結論付けています。
よく調整されたセットを使用することが重要です撮影時リント。 FITC（514nmで）およびフルオロフォア標識された二次抗体（546 nm）での発光波長で、図3（a）に示すように、未処理の陰性対照細胞もわずかな自己蛍光を有しています。この望ましくない蛍光は、偽陽性の結果を提供することができます。これにより、撮影開始時には、 図3Bに示すように、コントロール細胞の蛍光強度を調整することが重要です。他の二つの波長での蛍光シグナルがちょうど可視またはゼロに近いと1は、核染色（680 nm）での発光波長で核のクリア信号を観測することが期待されます。他のすべての細胞サンプルは、これらのよく調整し、固定パラメータで画像化されるべきです。この方法では、514 nmで観測された信号は、 図3Cに示すように、核の信号から、特に680 nmでのGnRH-IRの信号から546 nmで、唯一のFITC-GnRHの信号から導出されます。画像はFiのかもしれません必要に応じてソフトウェアを使用して撮影した後、NE-調整されました。
実験は、細胞に取り込まれたのGnRH-FITCコンジュゲートの量についての定量化情報を提供するフローサイトメトリー。必要に応じて適用されたGnRH-FITC複合体、それらの濃度および処理時間は、この方法でも可変です。未処理の細胞をフローサイトメトリーのパラメータを調整するための陰性対照として使用され、分析の開始時に、それらの中央値蛍光強度（MFI）を決定します。 図4Aに示すように、MFIは、同じパラメータを使用して、各サンプルについて決定しました。相対MFI値は、図4（b）の計算式を用いてMFI値から算出されます。この式を用いて、対照細胞の相対MFI値は常にゼロです。算出した相対MFI値は、そのAに比例するのGnRH-FITC複合体の蛍光強度を定量化細胞内verage濃度。 図5に示すように、これらのデータを用いて、1は実証し、これらの癌細胞はのGnRH-FITCコンジュゲートを取る方法を効率的に比較することができます。このように、流れによって得られた結果は、フローサイトメトリー、共焦点顕微鏡によって取得された画像を補完し、サポートしています。
図1：共焦点未処理の画像と[リジン8（FITC）] -のGnRH-IIIは、癌細胞を処理しました。ブルー染色：核;緑色の染色：[リス8（FITC）] -のGnRH-III。これらの画像は、「のGnRH取り込み法」を用いて得られます。 （A）未処理の細胞の蛍光シグナルを、各細胞株の514ナノメートル（緑）においてほぼゼロに調整されます。 DRAQ5遠赤色蛍光プローブは、細胞の核を染色するために使用されます。設定を適用した後、（B）、EBC-1肺癌およびデトロイト562ヒトGnRH-III -咽頭癌細胞は、1μM[リス8（FITC）]で5時間処理した後、514 nmの（緑）で検出可能で示すが、低信号。 10μMで5時間処理した後、（C）のLys 8（FITC）] -のGnRH-III、3つの細胞株の各々本高い蛍光シグナル。この実験の結果は、のGnRH結合体により、容易に標的化可能である他の2つの細胞株と比較したBxPC-3膵臓癌細胞がはるかに低い効率でのGnRH-FITCを取り上げたことを示唆しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：前後の細胞表面のGnRH-IRの共焦点画像[D-Lysの6（FITC）] -のGnRH-I処理。ブルー染色：核;緑色の染色：[D-Lysの6（FITC）] -のGnRH-I;赤い染み ：のGnRH-IR。これらの画像は、「のGnRH-IR発現法」を用いて生成されます。 （A）のGnRH-FITCの処理の前に、のBxPC-3細胞は、しかし、膜上のGnRH-IRを持っていないEBC-1細胞は、高い展示、および特定のデトロイト-562細胞はのGnRH-IRの適度なレベルを示します。 （B）のGnRH-FITC処理後、のBxPC-3細胞は、まだ彼らの膜上のGnRH-IRを示しません。 EBC-1細胞は、それらのGnRH-IR発現とのGnRH-FITCは、それらの内側に表示されます維持します。デトロイト-562細胞は、治療後のGnRH-IRより高いレベルを示していると思われると、彼らは同様に、のGnRH-FITCを取ります。この実験は、悪性腫瘍細胞の異なる種類は、それらの表面上のGnRH-IRの異なるレベルを示すことが明らかとのGnRH-FITCの取り込みは、厳密に細胞表面のGnRH-IRの発現に関連すると思われます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：EBC-1肺癌細胞の共焦点画像。ブルー染色：核;緑色の染色：[リス8（FITC）] -のGnRH-III;赤い染み：のGnRH-IR。これらの画像は、「のGnRH-IR発現法」により製造されます。過増幅機器設定を使用している場合（A）未処理の陰性対照細胞（たGnRH-FITCおよびAlexa 546なし）は514 nmおよび546 nmで検出可能と望ましくない蛍光を持っています。 （B）未処理の陰性対照細胞、緑色（514nm）と赤（546 nm）の信号に機器の設定の調整はゼロに近いです。 （C）調整パラメータが処理されたGnRH-FITCとのGnRH-IR染色された細胞のための明確かつ信頼性のシグナルが発生します。 GnRH-FITC処理後、のGnRH-FITC（緑色）の局在化は、細胞表面のGnRH-IR（赤）から分離されます。529fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：データフローサイトメトリーの評価。未処理および処理デトロイト-562細胞の（A）ヒストグラム。細胞試料のMFI値は、ヒストグラムから決定されます。 X軸は細胞の蛍光強度を示し、y軸はカウントを示します。黒線：のGnRH-FITC処理前のMFI。緑の破線：1μM[リス8（FITC）]で5時間処理後のMFI -のGnRH-III; GnRH-III - 10μM[リス8（FITC）]で5時間処理した後、MFI：赤破線。 （B）相対MFI値の計算式。相対MFI値は、MFI値から算出されます。この計算を使用して、未処理の対照試料の相対MFI値は常にゼロです。 relat処理されたサンプルのIVE MFI値は細胞内にあるのGnRH-FITCコンジュゲートの量を表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：のGnRH-FITCコンジュゲートの1μMで5時間処理後の癌細胞の相対的なMFI値。相対MFI値は同等であり、与えられた細胞型がGnRH類似体を取る可能性がどのように効率的に定義します。 GnRH-IR非発揮たBxPC-3細胞は、これらのGnRH類似体の痕跡のみが含まれています。 EBC-1肺癌細胞を発現のGnRH-IRは、中程度含まれており、デトロイト562咽頭癌細胞は、GnRH類似体の高い量を含みます。結果は、N = 3、平均値±SDとして提示されています。"_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
本明細書に記載した実験は、付着スクリーニングするために選択的に標識されたGnRH類似体を使用します インビトロでの細胞培養物。共焦点顕微鏡および方法は追跡と時間および濃度依存的にこれらのGnRH-FITCコンジュゲートの細胞取り込みを定量化するのに適しているフローサイトメトリー。これらの実験は、以下の重要なステップがあります：1）無菌、健康な細胞培養を維持します。 2）のGnRHペプチドは、高品質のものでなければなりません。 3）合理的な濃度およびインキュベーション時間に従わなければなりません。 4）処理及び洗浄工程; 5）機器の設定をよく調整しました。
細胞を、10％（V / V）ウシ胎児血清および抗生物質（完全培地）を補充し、製造業者の推奨培地中で維持されています。細胞は（たGnRH-FITCコンジュゲートでの）処理工程まで保持し、無菌環境で処理する必要があります。実験の前に、倒立顕微鏡を用いて細胞を確認してください。彼らは健康でなければなりません、取り付けられており、必要な量に到達しなければなりません。
高品質および純度でのGnRHペプチドを使用することが重要です。私たちは、これらのペプチドを合成し、98％以上18にそれらを精製しました。ペプチドは、凍結乾燥粉末として冷蔵庫中-25℃で保存することができます。 DMSO中10mMのGnRH-FITCストック溶液は、室温で暗所に保管し、数週間以内に、最大使用する必要があります。我々は、これらの複合体の安定性を調査し、それらはDMSOに安定であり、それらの蛍光強度は、適切なストレージの1ヶ月後に維持されることを見出しました。 GnRH-FITCコンジュゲートの濃度および治療の時間は、大きな利点を提供するこれらの実験で可変であるが、一定の制限と（下記参照します）。このプロトコルで適用される濃度およびインキュベーション時間は推奨されているが、彼らは最初の実験のための良好な基礎を提供します。
CLSM実験を断つを必要らの洗浄工程。これらの手順は慎重に行うべきです。細胞に直接液体転送しないでください。むしろ、この目的のために側またはウェルの角を使用しています。これは、オフに洗浄し、付着した細胞を失う最小限に抑えることができます。それは蛍光サンプル（光退色効果）を脱感作することができますようにまた、実験全体の間に直接光を避けることをお勧めします。暗い場所で処理されたサンプルを維持するか、実験中のアルミホイルの切れ端で覆われて。以前の知見に基づいて、我々は、適用処理媒体中の最終DMSO濃度は無視できる（メディア処理10μM0.1％（V / V）DMSO）であり、結果には影響を与えないことにより、DMSOを含まない完全培地であることに気づいまた、ネガティブコントロールとして適して。
CLSMおよびFACS実験中によく調整機器パラメータを使用することが重要です。これらのパラメータは、両方の分析の前に、すべての細胞型に再較正する必要があります。 CLSMの実験では、SIレーザー強度、検出器のゲインとオフセット、およびピンホールサイズ：共焦点画像のgnal強度は、次のパラメータに依存します。これらのパラメータを調整する場合、許容可能な画像を生成し、光退色を避けるために、最も低いレーザーパワーを使用しています。ゼロ付近（ 図3B）に染色されていない陰性対照細胞のバックグラウンド蛍光を調整する撮像パラメータを設定します。これらの調整パラメータを用いて画像処理した細胞は、偽陽性の結果を避けるために。 GnRHかのGnRH-IRに関する必要な情報が含まれているnmの514 nmおよび546で処理した細胞から放出された追加の信号。これらのステップは、CLSM実験の経験が必要です。 FACS実験では、標準的な前方散乱側の散布図（リニアスケール）を作成し、プロットの中央にメインの生きた細胞集団を調整するために電圧を設定。生きた細胞の周囲の領域を描画します。ヒストグラムを作成し、1（FL1-530 nmで、対数スケール）を流すように横軸を設定し、ゲートとして以前に定義された領域を設定しますこのヒストグラムのために。 10 1（ 図4A）の下で染色されていない陰性対照細胞の信号をもたらすためにFL1電圧を設定します。これらの調整パラメータで処理した細胞を分析します。
さらに、時間から時間に細胞培養物のマイコプラズマの状態を確認することが重要です。様々なアッセイがこの目的のために利用可能です。マイコプラズマ陽性の場合には、セルを廃棄し、新しい文化で作業を開始。マイコプラズマを防止するために最適化された培地中で抗生物質の混合物を使用することをお勧めします。 GnRH-FITCコンジュゲートの適用濃度、および治療の時間は、しかし、蛍光検出のためにあまりにも弱い信号をもたらす可能性が低濃度と短いインキュベーション時間を適用し、これらの実験で可変です。
GnRH類似体と並列でのGnRH-IRを画像化すると、高いのGnRH-FITC濃度が推奨される（10μMが最適です）。高濃度の理由短いインキュベーション時間（1時間）とのGnRH-FITCコンジュゲートと比較して、標識された抗体の比較的高い蛍光シグナルです。一方、二つの蛍光色素の排出（514 nmおよび546 nm）の間のマイナーな重なりは、546 nmで発生したGnRH-FITCコンジュゲートの信号から導出され、発見されました。 図3に示されているようしかし、アレクサ546、よく調整されたパラメータの比較的高い蛍光シグナルは、この影響を最小限に抑えることができました。重複を避けるために、別の可能な解決策は、FITC（CLSM技術パラメータがこれを許可した場合）と比較して、異なる励起波長および/またはより良好な分離発光スペクトルを有する標識された二次抗体を適用することです。この可能性はのGnRH-FITCコンジュゲートと並行して任意の蛍光プローブを使用して可能にCLSM法、のために大きな利点を提供しています。例えば、これらの代替の蛍光プローブは、必要に応じて他の細胞小器官を対比するために使用することができます。
GnRH-FITCコンジュゲートの適用濃度は、次の制限があります。 GnRH-FITCコンジュゲートの最大濃度限度は、それらの溶解度18に基づいています。 GnRH-I：これらの値は、室温でPBS中に、以下の通りである90μM; GnRH-II：40μM; GnRH-III：200μM。一方、前回の実験で、我々はこれらのGnRHペプチドの取り込みは、人間のGnRH-I受容体以外の受容体によって起こり得ることを想定しました。この取り込みは18（10μM以上）高濃度でより重要であると思われます。 GnRH-FITC複合体の検出下限は、様々なパラメータに基づいていますが、理想的な設定ではCLMS実験では約1μMです。我々は、フローサイトメトリーは、共焦点顕微鏡法よりも優れた感度を提供していることがわかりました。理想的な設定で、のGnRH-FITC結合体の定量限界は1μMより低くなる可能性があります。検出または定量化の限界でしこれらは細胞型およびインキュベーション時間に依存しているため、すべての実験で異なります。それはサンプルあたりの細胞の数千人を検出し、セルの平均信号が計算されるため、FACSによって得られたデータは、CLSMよりも信頼性があることに注意してください。ただし、プロトコルには、FACSはのGnRH-FITCコンジュゲートの細胞内局在とのGnRH-IRの細胞表面発現についての情報を提供していません。我々は結論これらの考慮事項に基づいて、CLSM及びFACS実験は、明確な利点を有し、それらは互いに補完します。一方、含有量が高い画像解析が興味深く、FACSおよびCLSM分析のための良い代替である可能性があります。
要約すると、これらの実験から得られたデータは、3回のGnRH-FITCコンジュゲートのそれぞれは、細胞表面のGnRH-IRを発現する細胞に入ることができることを確認します。これらのGnRH類似体は、同じ濃度で同様の標的効力を有します。しかし、異なる缶の表面に、のGnRH-IRレベルCER細胞は非常に可変です。フローサイトメトリー解析のデータから計算された結果は、細胞株またはGnRH類似体の比較を可能にします。同時に、共焦点顕微鏡により得られた画像は、細胞表面のGnRH-IR発現のレベルを明らかにし、これらの結合体は、細胞内に内在化されることが確認できました。これらの結果に基づいて、一方が導入された実験は、のGnRH基づく薬物送達系の研究のための実用的かつ可変の方法を含み、さらなる実験のための良好な基礎を提供することを確認することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EBC-1 | JCRB Cell Bank | JCRB0820 | Human lung squamous cell carcinoma |
| BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Human pancreatic adenocarcinoma |
| Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Human pharyngeal carcinoma |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Lonza | BE12-702F | Culture medium for BxPC-3 cells |
| Eagle's Minimum Essential Medium | Lonza | BE12-611F | Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0.1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells |
| Fetal Bovine Serum | Euro Clone | ECS0180L | Complements the culture medium |
| MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Complements the culture medium (antibiotics) |
| Standard Line Cell Culture Flasks | VWR | 10062-872 | Provide consistent, sterile growth environment for cells |
| Trypsin-EDTA Mixture | Lonza | BE17-161E | Remove attached cells |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solvent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to counting cells |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| [Lys8(FITC)]-GnRH-III | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| glass bottom 8-well microscopic slide | Ibidi | 80826 | Use in CLSM experiment |
| Corning Costar cell culture plate, 12 well | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Use in FACS experiment |
| Fixing solution (10% neutral buffered formalin) | Bio-Optica | 01V60P | Fix adherent cells |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Prevent the nonspecific binding of the antibodies |
| GnRHR Antibody | Proteintech | 19950-1-AP | Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody |
| Fluorescent probe solution (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Counterstain nuclei |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Use in CLSM experiment, preserving fluorescence |
| Inverted microscope | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Check the phenotype and confluency of cell cultures |
| Inverted confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM-710 | Use in CLSM experiment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Use in FACS experiment |
References
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